CN110791571B

CN110791571B - 区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的snp标记及其检测方法和应用

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Publication number: CN110791571B
Application number: CN201911119869.7A
Authority: CN
Inventors: 陈廷; 胡超群; 任春华; 王艳红; 张鑫; 李小敏; 江晓; 黄文�
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110791571A

Abstract

本发明公开了区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP标记及其检测方法和应用。其位于凡纳滨对虾Lyz‑i2基因序列的1191位点处，突变类型为G纯合、G与其他三种核苷酸杂合、除G外其他3种核苷酸纯合或杂合。本发明提供了区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP位点，并开发了扩增该SNP位点基因型的四引物，以及检测该SNP基因型的检测方法，利用该方法能够简单、快速、低成本、精准的检测该位点的多态性形式，有利于快速筛选抗哈氏弧菌能力强凡纳滨对虾亲虾个体和选育群体，及维持耐哈氏弧菌凡纳滨对虾抗菌品系。

Description

区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP标记及其检测方法和应用

技术领域

本发明属水产养殖生物技术领域，更具体地说，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种凡纳滨对虾i-2型溶菌酶基因一个引起抗菌能力不同溶菌酶蛋白产生的SNP分子标记，以及四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法检测出该SNP标记基因型的检测方法，和在抗菌亲虾个体鉴定、抗菌对虾群体选育和抗菌对虾品系维持方面的应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，是世界第一养殖对虾品种。在我国，凡纳滨对虾年产量已达到167万吨，占全国养殖对虾总产量83％。然而，近年来频繁暴发的细菌性病害给养殖生产造成了巨大的经济损失；另一方面，细菌性病害的流行和有效防控技术不足也造成了抗菌素的乱用和滥用，产生药物残留、环境污染、抗药性菌株蔓延等诸多负面影响。因此，从种质层面入手，深入发掘和利用凡纳滨对虾的抗菌种质，选育抗菌能力强的优良新品种和筛选抗菌能力强的苗种用于养殖生产，成为细菌性病害防控研发的重点和热点。

随着现代生物技术和遗传学技术在水产领域的快速转化，以性状相关功能基因为基础的分子标记技术成为水产遗传育种的关键技术之一。SNP作为一种遗传标记，具有发生频率高、能稳定遗传、易进行自动化检测等优点，并且在不同物种、不同品种间SNP分布都存在差异。而在水产动物种苗繁育和遗传育种中，SNP标记已运用多年，一些与生长、繁殖及抗病性状等相关的分子标记陆续被筛选到。四引物扩增受阻突变体系PCR是一种新型的SNP检测方法，该方法只需要设计四个特定的引物对模板进行PCR扩增，就能得到一个SNP位点的分型。四引物扩增受阻突变体系PCR既具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、操作繁琐、假阳性等缺点，而且对检测的序列位点无特殊性要求。因此，在育种工作中受到青睐，具有非常广阔的应用前景。

溶菌酶又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。动物中的溶菌酶主要包括三种类型，即c型(chicken或conventional型)、g型(goose型)和i型(invertebrate型)溶菌酶。其中脊椎动物具有c型和g型，而无脊椎动物则具有i型、部分物种具有c型或g型溶菌酶基因。在凡纳滨对虾中，i型溶菌酶包括i-1型溶菌酶(Lyz-i1)和i-2型溶菌酶(Lyz-i2)两个基因，其中i-2型溶菌酶对哈氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)等多种有害养殖海水弧菌具有非常有效的溶解和杀灭作用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP分子标记。

本发明发现凡纳滨对虾个体Lyz-i2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)在1191位点的多态性。该位点位于Lyz-i2基因第二内含子和第三外显子交界(图4)，该位点的多态性会引起Lyz-i2 mRNA转录的选择性剪切，从而编码长短两型Lyz-i2蛋白。其中长型Lyz-i2蛋白的哈氏弧菌溶解能力较弱，短型Lyz-i2蛋白的哈氏弧菌溶解能力较强。该位点为G纯合(G/G)时，编码短型Lyz-i2蛋白；该位点为G与其他3种核苷酸杂合(G/A、G/T、G/C)时，编码长型、短型两个Lyz-i2蛋白；该位点为除G外其他3种核苷酸纯合(A/A、T/T、C/C)，或除G外其他3种核苷酸之间杂合(A/T、A/C、T/C)时，编码长型Lyz-i2蛋白。该SNP位点为G/G基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗哈氏弧菌感染能力，而且该性状在后代中能稳定遗传；该SNP位点为G/A、G/T、G/C基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗哈氏弧菌感染能力，但该性状在后代不能稳定遗传；该SNP位点为A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C基因型的凡纳滨对虾个体，抗哈氏弧菌感染能力的能力较差。

因此，本发明提供了区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP分子标记，其位于凡纳滨对虾Lyz-i2基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的1191位点处，突变类型为G纯合、G与其他三种核苷酸杂合、除G外其他3种核苷酸纯合或杂合；

所述的G纯合为G/G；

所述的G与其他三种核苷酸杂合为G/A、G/T、G/C；

所述的除G外其他3种核苷酸纯合为：A/A、T/T、C/C，所述的除G外其他3种核苷酸之间杂合为：A/T、A/C、T/C。

本发明的第二个目的是提供上述SNP分子标记在制备区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的试剂中应用。该SNP分子标记可以应用在抗哈氏弧菌能力强凡纳滨对虾亲虾个体鉴定、群体选育上，及在耐哈氏弧菌凡纳滨对虾抗菌品系维持上。

本发明的第三个目的是提供一种上述Lyz-i2基因的SNP基因型的检测引物组，其特征在于，

组合一：

正向外侧引物LyzSNPF1、反向外侧引物LyzSNPR1、正向内侧引物LyzSNPF2、反向内侧引物LyzSNPR2；

或组合二：

正向外侧引物LyzSNPF1、反向外侧引物LyzSNPR1、正向内侧引物LyzSNPF3、反向内侧引物LyzSNPR3；

所述引物LyzSNPF1、LyzSNPR1、LyzSNPF2、LyzSNPR2、LyzSNPF3、LyzSNPR3序列为：

LyzSNPF1：5’-GAGACCGTCCGCCGCTACAT-3’

LyzSNPR1：5’-ACCACAAACGACACCCTACCATT-3’

LyzSNPF2：5’-TCAACTCCTCACGCGAGTAG-3’

LyzSNPR2：5’-GCCGTTGCCGTCGCAATCD-3’

LyzSNPF3：5’-TCAACTCCTCACGCGAGTAH-3’

LyzSNPR3：5’-GCCGTTGCCGTCGCAATCC-3’；

其中，D为A、T、G简并，H为A、T、C简并。

本发明的第四个目的是提供一种末端简并的Lyz-i2基因四引物扩增受阻突变体系PCR检测方法，其包括以下步骤：

提取待测凡纳滨对虾的基因组DNA，以基因组DNA为模板利用上述组合一或组合二的引物进行扩增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析：a、当采用组合一的引物时，Lyz-i2的SNP位点G/G基因型表现为835bp、211bp两个条带，G/A、G/T、G/C基因型表现为835bp、211bp、625bp三个条带，A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C基因型表现为835bp、625bp两个条带；b、当采用组合二的引物时，Lyz-i2的SNP位点G/G基因型表现为835bp、625bp两个条带，G/A、G/T、G/C基因型表现为835bp、211bp、625bp三个条带，A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C基因型表现为835bp、211bp两个条带。

本发明提供了区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP位点，并开发了扩增该SNP位点基因型的四引物，以及检测该SNP基因型的检测方法，利用该方法能够简单、快速、低成本、精准的检测该位点的多态性形式，有利于快速筛选抗哈氏弧菌能力强凡纳滨对虾亲虾个体和选育群体，及维持耐哈氏弧菌凡纳滨对虾抗菌品系。

附图说明

图1是利用本发明的末端简并的Lyz-i2基因四引物扩增受阻突变体系区PCR检测方法对凡纳滨对虾Lyz-i2基因1191位点G纯合(G/G)、G杂合(G/A、G/T、G/C)、其他核苷酸纯合或杂合(A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C)基因型鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。

图2是凡纳滨对虾Lyz-i2基因1191位点SNP引起长短两种i-2型溶菌酶蛋白示意图。

图3是凡纳滨对虾长短两种i-2型溶菌酶蛋白对哈氏弧菌杀灭能力差异。

图4是Lyz-i2基因在1191位点的示意图；

图5是长型Lyz-i2蛋白和短型Lyz-i2蛋白纯化后的蛋白电泳图。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

本发明实施例中，PCRAmplification Kit聚合酶购自Takara，G-10琼脂糖够自BioWest，核酸荧光染料、DNAmarker够自GenStar。

凡纳滨对虾个体Lyz-i2基因序列如SEQ ID NO.1所示(含内含子)，在1191位点呈现多态性。该位点位于Lyz-i2基因第二内含子和第三外显子交界(图4)，该位点的多态性会引起Lyz-i2 mRNA转录的选择性剪切(图2)，从而编码长短两型Lyz-i2蛋白。其中长型Lyz-i2蛋白的哈氏弧菌溶解能力较弱，短型Lyz-i2蛋白的哈氏弧菌溶解能力较强(图3)。该位点为G纯合(G/G)时，编码短型Lyz-i2蛋白；该位点为G与其他3种核苷酸杂合(G/A、G/T、G/C)时，编码长型、短型两个Lyz-i2蛋白；该位点为G外其他3种核苷酸纯合(A/A、T/T、C/C)，或G外其他3种核苷酸之间杂合(A/T、A/C、T/C)时，编码长型Lyz-i2蛋白。

对采用本发明提供方法(实施例2的末端简并的Lyz-i2基因四引物扩增受阻突变体系区PCR检测(确定SNP位点的基因分型))所鉴别的、Lyz-i2基因1191位点分别为G纯合、G杂合型、非G型的凡纳滨对虾个体的肝胰腺总RNA进行反转录，使用引物对(正向：5’-ATGGCACTCGTCAAGCAAGC-3’；反向：5’-CTACGTAGCAGATGGAGAAG-3’)对Lyz-i2cDNA的开放读码框(ORF)进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖电泳和测序。结果显示：Lyz-i2基因1191位点分别为G纯合的个体，获得638bp一个扩增条带，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第81-718位碱基所示；Lyz-i2基因1191位点分别为G杂合的个体，获得492bp(其核苷酸序列如SEQID NO.4的第81-572位碱基所示)、638bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2的第81-718位碱基所示)两个扩增条带；Lyz-i2基因1191位点分别为非G的个体，获得492bp一个扩增条带(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4的第81-572位碱基所示)。其中492bp条带，经测序显示为编码长型Lyz-i2蛋白的序列，638bp由于内含tga密码子发生提前翻译终止，编码端型Lyz-i2蛋白。

所述的短型Lyz-i2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2(Genbank登录号KU500357.1，cDNA序列)的第81-551位碱基序列所示，其编码的短型Lyz-i2蛋白序列如SEQID NO.3所示，所述的长型Lyz-i2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4(cDNA序列)的第81-572位碱基序列所示，其编码的长型Lyz-i2蛋白序列如SEQ ID NO.5所示。

对各G纯合、G与其他三种核苷酸杂合、除G外其他3种核苷酸纯合或杂合的凡纳滨对虾Lyz-i2基因序列测序发现，只有第1191位点处发生了突变，突变类型为G纯合、G与其他三种核苷酸杂合、除G外其他3种核苷酸纯合或杂合；所述的G纯合为G/G；所述的G与其他三种核苷酸杂合为G/A、G/T、G/C；所述的除G外其他3种核苷酸纯合为：A/A、T/T、C/C，所述的除G外其他3种核苷酸之间杂合为：A/T、A/C、T/C，具体位点见图4所示。

实施例2

湛江某对虾养殖场规格8-10cm凡纳滨对虾1000尾，分别取游泳足提取各凡纳滨对虾的基因组DNA(取组织不影响该凡纳滨对虾的存活)，进行末端简并的Lyz-i2基因四引物扩增受阻突变体系区PCR检测(确定SNP位点的基因分型)，具体方法如下：

1、扩增引物：

LyzSNPF1：5’-GAGACCGTCCGCCGCTACAT-3’

LyzSNPR1：5’-ACCACAAACGACACCCTACCATT-3’

LyzSNPF2：5’-TCAACTCCTCACGCGAGTAG-3’；

LyzSNPR2：5’-GCCGTTGCCGTCGCAATCD-3’；

LyzSNPF3：5’-TCAACTCCTCACGCGAGTAH-3’；

LyzSNPR3：5’-GCCGTTGCCGTCGCAATCC-3’；

其中，D为A、T、G简并，H为A、T、C简并。

2、扩增体系：

(1)扩增体系组合一：

(2)扩增体系组合二：

3、PCR扩增反应的程序：

94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。

4、PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析：

PCR产物上样量为5μl，且琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶浓度为2％。结果如图1所示，使用本发明的一种末端简并的Lyz-i2基因四引物扩增受阻突变体系PCR扩增进行鉴定，1)当采用外侧引物和组合一内侧引物(即扩增体系组合一，图1中的组合1)时，Lyz-i2的SNP位点G/G基因型(G纯合基因型)表现为835bp、211bp两个条带，G/A、G/T、G/C基因型(G杂合基因型)表现为835bp、211bp、625bp三个条带，A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C基因型(其他核苷酸纯合或杂合基因型)表现为835bp、625bp两个条带；2)当采用外侧引物和组合二内侧引物(扩增体系组合二，图1中的组合2)时，Lyz-i2的SNP位点G/G基因型表现为835bp、625bp两个条带，G/A、G/T、G/C基因型表现为835bp、211bp、625bp三个条带，A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C基因型表现为835bp、211bp两个条带。由此鉴别获得Lyz-i2基因1191位点G纯合基因型693尾、G杂合基因型111尾、其他核苷酸纯合或杂合基因型196尾。

哈氏弧菌由中国科学院南海海洋研究所从发光弧菌病凡纳滨对虾肝胰腺分离。菌种于25％甘油-80℃中保存，划线于LB固态培养基培养，接种于LB液态培养基30℃震荡培养24小时。将菌液3000g高速离心10分钟，沉淀菌体用PBS缓冲液冲洗3次后等体积悬浮。菌液浓度通过分光光度计560nm(OD₅₆₀)测定，通过平板涂布实验，确定本哈氏弧菌株浓度为：每OD₅₆₀为1.76*10⁹cfu/mL。1000尾体格大小为8.23±0.34cm凡纳滨对虾经过2周暂养，未发现疾病及死亡症状，对虾在攻毒实验前禁食一天。将凡纳滨对虾置于1m³黑色大塑料桶中，30‰盐度30℃水温饲养。将哈氏弧菌投入到含凡纳滨对虾的黑色大塑料桶中，哈氏弧菌浸浴最终浓度为1.76*10⁶cfu/mL，攻毒过程中死亡个体马上移除防止污染水质，攻毒48小时后计算存活率。通过哈氏弧菌攻毒实验，G纯合基因型存活625尾(存活率90.2％)，G杂合基因型存活97尾(存活率87.4％)，其他核苷酸纯合或杂合基因型存活103尾(存活率52.6％)。表明该SNP位点为G/G基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗哈氏弧菌感染能力；该SNP位点为G/A、G/T、G/C基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗哈氏弧菌感染能力；该SNP位点为A/A、T/T、C/C、A/T、A/C、T/C基因型的凡纳滨对虾个体，抗哈氏弧菌感染能力的能力较差。因此本发明可应用于快速筛选抗哈氏弧菌能力强凡纳滨对虾个体。

实施例2

茂名某对虾种苗场规格20-25cm凡纳滨对虾亲虾，按照实施例1的方法使用本发明所描述一种末端简并的Lyz-i2基因四引物扩增受阻突变体系PCR扩增进行鉴定，分别获得G/G纯合基因型、G/A杂合基因型、A/A纯合基因型亲虾各一对进行繁育。待子一代全同胞家系稚虾生长至3cm，每个家系各取300尾进行哈氏弧菌攻毒实验(同实施例1)。其中，亲本G/G纯合基因型亲虾所产生稚虾存活178尾(59.3％)；亲本G/A杂合基因型亲虾所产生稚虾存活121尾(40.3％)；亲本A/A纯合基因型亲虾所产生稚虾存活73尾(24.3％)。由此可见，该SNP位点为G/G基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗哈氏弧菌感染能力，而且该性状在后代中能稳定遗传；该SNP位点为G/A基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗哈氏弧菌感染能力，但该性状在后代不能稳定遗传；该SNP位点为A/A纯合基因型的凡纳滨对虾个体，抗哈氏弧菌感染能力的能力较差。因此，对该SNP位点为G/G基因型的凡纳滨对虾个体的筛选和鉴定，在抗哈氏弧菌能力强凡纳滨对虾亲虾个体鉴定、群体选育上，及在耐哈氏弧菌凡纳滨对虾抗菌品系维持上，均有非常重要的应用价值。

实施例3：

哈氏弧菌由中国科学院南海海洋研究所从发光弧菌病凡纳滨对虾肝胰腺分离。菌种于25％甘油-80℃中保存，划线于LB固态培养基培养，接种于LB液态培养基30℃震荡培养24小时。将菌液3000g高速离心10分钟，沉淀菌体用PBS缓冲液冲洗3次后等体积悬浮。菌液浓度通过分光光度计560nm(OD560)测定。

再使用PBS(50mM，pH 6.2)重悬制备哈氏弧菌悬浮液，通过分光光度计450nm(OD450)测定，使其OD450为0.6。长型和短型Lyz-i2重组蛋白(短型Lyz-i2蛋白序列如SEQID NO.3所示，长型Lyz-i2蛋白序列如SEQ ID NO.5所示)分别通过大肠杆菌原核表达系统重组表达和离子亲和层析纯化获得，并由PD10脱盐柱脱盐，即是将编码长型和短型Lyz-i2重组蛋白的开放阅读框(所述的短型Lyz-i2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2(Genbank登录号KU500357.1，cDNA序列)的第81-551位碱基序列所示，所述的长型Lyz-i2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4(cDNA序列)的第81-572位碱基序列所示)分别克隆进入表达载体中，然后转化到大肠杆菌进行诱导表达，再经离子亲和层析纯化获得，并由PD10脱盐柱脱盐，即获得长型和短型Lyz-i2重组蛋白(图5)。哈氏弧菌悬浮液分别与20mg长型Lyz-i2重组蛋白或短型Lyz-i2重组蛋白混合，在28℃下孵育，并用酶标仪(Thermo Scientific)以1分钟的间隔在0至30分钟内测量OD450的吸光度。具体结果如图3所示。从图3可以看出长型Lyz-i2蛋白的哈氏弧菌溶解能力较弱，短型Lyz-i2蛋白的哈氏弧菌溶解能力较强。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的SNP标记及其检测方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4494

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

atggcactcg tcaagcaagc gatgatcgcc gtgacggcgg ccgtcatctt cgctctcgtc 60

tatggagaag gagttgaccc caactgcctc gggtgcctgt gcgaggcatc caccaagtgc 120

aacgcctcca cggcctgcca cacgccctac ccaggggcat acttctgcgg acccttcctc 180

atctcatggg catactgggc cgacgcagat aagccaatca ttgagggcga caatgctgac 240

aagcagggag gtatgtacca acgttatata tatatatata tatatattat tatatatata 300

tatataatat atatatatat atatatatat acatatatat ataaattata tatatatata 360

tatataatat atatatatat atatatatat taatatatat atactcacgt gtgtgtgcgc 420

gtgtgcgtgt gtaatatatt taatatatat actgcatata caaagctgtc cttccctcac 480

caaccccttt cctcccgcag ccttcgagcg ctgtgtgcag gacctgtact gcggcgccga 540

gaccgtccgc cgctacatgg ctaaattcct gaacgtatgt attggcgtca cgtctcctca 600

tgtcagggtc tgttcacgga gcatgccaga gacgaaaggg tggggctcat tgtcataact 660

gatggagggg catggagggt gctaacgaac ttattaggag ttaggaggga ggtgttacgg 720

gtatttgata taagggtgtg tttcgcttga actcagcgtg gttgtgataa cttgcgctct 780

ctcctttatt cacccggtgc tgcctaacac acgcccttca aacctgggag tcaacattaa 840

gtgtagttgt tgtttgcact ctgacatgat agatttcctc cacacaatgt agtatttgta 900

tatagtttta attctttttt ccagtttgtt ttctcatata tatatataaa cttttatctc 960

catttcatga tataatctga cattagaaag tgctccttat cgtgaagcac agttcacaag 1020

aagtaaacag agagaaaaat catacttggc tcagccttgc ctgctcagat cgaccgaaag 1080

gcgatcgggt ctgatcgacg cagagaggga cgctggctta gtgtgtttcc tcgtcatatt 1140

tttggactaa ttcctccttt gctgtcactc ctcaactcct cacgcgagta ggattgcgac 1200

ggcaacggcg ctgtgacctg tgtcgacgtg ataaggactc acaaattcgg tcgccaggat 1260

tgcgccagag ccattcctca agatgacaag ttctggtccc agtaccagga gtgcgcgatc 1320

cgcctctccc tccaatggta gggtgtcgtt tgtggtcttc ccccctctcc cttccccctc 1380

tccccctccc tcccccacgg ccaaagcgcc cctttaaccc ttcacataat ccatcgagat 1440

gaaagcataa ttaccccccc acttacactt ggagcaatgg gccttttagg tactttgagg 1500

gatggcatga aataaggaaa tgataaaagc aaaagatgga atacatgtcc atcgacaccc 1560

aaagaatctc aagacataag atttatttta ggataattca accagatgat taaatatcac 1620

acttttagac attcaggtaa aatccttcaa catacacaat gtacatatga ctaaacacag 1680

agcatgcagt gcaagacaga ccgctgtttg ttaacaaagt ctgaaactat taaaaagaca 1740

aagaaaaaca acaaaacaaa tctcaaagaa cctaacaatt aaagagacac gtgcaagaaa 1800

acaggactca ccaggatacc caaaaaggaa tcagaattcc cactgaaacc ttaggaatcc 1860

ttgaggattg aggtaaaaga aaaaaaaatc tatcctatca aaaccacaga atcagttttc 1920

caaatattca gaccattagt gtcgttcaag gttcttggcc caagccccat ttcagaaagc 1980

caggtgtgtg acccccttag cccacacctc tccttccggt cccttcccct aaacatccca 2040

aaaccacgag ataaatcaac taactgggaa ctcacaagcc gtcgcctcaa taaatcaaaa 2100

tcttcgacag ctggaactga cacgacaggg tgattgtgtg tgtatatgtg tgtgtgtgtg 2160

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2220

tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 2280

agagagagag agagagagat agtgtgaatg tgtattcgac cagcaaaaga accaaagacc 2340

attgtatata tctcgctttg ctgctctccg ccaaccctaa aaggaaatgg taaggacagg 2400

gaggcgtttg cgggtaatta taatgataaa agaagacata acgacataat gccgattttt 2460

actttatgtg tgaattacgg gactaaatca ttttttgacg gaacaaaatg accgaccttg 2520

tcactaaaat gaatgtttta actaccaata actaaaatta aaccagtaat atcaatgcta 2580

aaaatcatcc cttttaaact cttgattcaa tctaattgca ggatttaaag agcctaatat 2640

atgcccgttt cccctttttc acttttgtca ctgaatcatt acaattcgtt gtgtaaaagg 2700

gatgataaaa tggagaaagt aaagaataat aataataaga aaataatgca tggaacagct 2760

aaaataaccg gttcgggatg ttatttttgt tattaaaata acgaacggaa actccagtag 2820

acccttcgtg atataacatt aaaacaataa gaattgacca agctggcgat aacaatgatg 2880

attgatgaag attttcccac atagaacaaa agtgaaggtg tgtactggac tttccttgag 2940

catgaagatg acacgggtga tggggaaaac tacggtggat tttatgggca agataacagc 3000

atttggctga ttcagatttc atgcttgact ttaactaacc caaatggtag gtatattccg 3060

cgtttgtttg attgctgcat tttccattta atgcttttaa tgcaatatgg ccttaacggt 3120

atatatatat atatatgtgt gtgcacacac acacacacat atatatatat atgtctgtgt 3180

gtgtgtacat atatatatat atataatata tatattatat atatatatat atatatatat 3240

aatatatgtg tgtgtgtgta tgtatatata tatacatgtg tgttatatat atattatata 3300

tatatatata tatatatata tatatattta tatacatata tatataatat atatatatat 3360

atatatatat atatatatat atgtatggta atagacatac atatatatat atctattaaa 3420

tatgtatata tctatatata taaatatatt catatattaa tagatatatg aatatatata 3480

tatatatata tatatatata tgaatatata atatatatat atatactata aatatatata 3540

tattatntcg ttattaccat tgtcatcatc attactacca tcaccataat cattattact 3600

atcatcacta ttaccatcat catcactacc atcaccatca tcattattac catcactacc 3660

accaccaccc tcccccaccc cctcccacat gcactcacgc cctccgctcg cccacagatc 3720

gactgcaacg gcgacgggac ggtggactgc ctcgactacg cccacatcca catgatgggc 3780

gggtacgggt gcaaggatcc atcggtcaga accaccgact tctataaagt tttcgaaaat 3840

tgttgggatg tagttaacgc ggcttcttct ccatctgcta cgtagagtaa aaggcattat 3900

ataattatat atatagtata atatagtctt taaaaaatcg caaaaataat acgcctgtgg 3960

cccccttgac acgtcgtatc ctgtcagctg actcgttccg gaatccgttt tctttttctt 4020

ttctaattta cctaaagatt gattgagtaa aatctgttcg tcagaggaag tatcgggggt 4080

tctctcaccg ataaagttga ggaattctga acgagtaagc tttctactta tttattttct 4140

ggtttaatga actttcttgt tttatttcgc tgaaagttct cttactcaca aggctttaaa 4200

atggcatcac tattttttct ctctatcttt tggcccaaaa taaacttact gggtttaata 4260

tatttataca gaagggcctg tcagtttaaa ttaaaacgaa aacaatattg gggaaacaga 4320

cctattcaaa ttaaattttc acatttacct tggacattta ggctatttca aaacaactgg 4380

accactctct ttatgttgca tcaaacggaa gcacgagatt taacactttt gtaagagttc 4440

aagttgaagg gttgtcatgt aaagttactt gccttaataa agtattgtga attt 4494

<210> 2

<211> 1361

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

ccgctttgac gatctccgcc ccctcgacag aaccgcgcac gaaggttgac agaagagccg 60

gagccagaga acaggacgcg atggcactcg tcaagcaagc gatgatcgcc gtgacggcgg 120

ccgtcatctt cgctctcgtc tatggagaag gagttgaccc caactgcctc gggtgcctgt 180

gcgaggcatc caccaagtgc aacgcctcca cggcctgcca cacgccctac ccaggggcat 240

acttctgcgg acccttcctc atctcatggg catactgggc cgacgcagat aagccaatca 300

ttgagggcga caatgctgac aagcagggag ccttcgagcg ctgtgtgcag gacctgtact 360

gcggcgccga gaccgtccgc cgctacatgg ctaaattcct gaacgattgc gacggcaacg 420

gcgctgtgac ctgtgtcgac gtgataagga ctcacaaatt cggtcgccag gattgcgcca 480

gagccattcc tcaagatgac aagttctggt cccagtacca ggagtgcgcg atccgcctct 540

ccctccaatg atcgactgca acggcgacgg gacggtggac tgcctcgact acgcccacat 600

ccacatgatg ggcgggtacg ggtgcaagga tccatcggtc agaaccaccg acttctataa 660

agttttcgaa aattgttggg atgtagttaa cgcggcttct tctccatctg ctacgtagag 720

taaaaggcat tatatgatta tatatatagt ataatatagt ctttaaaaaa tcgcaaaaat 780

aatacgcctg tggccccctt gacacgtcgt atcctgtcag ctgactcgtt ccggaatccg 840

ttttcttttt cttttctaat ttacctaaag attgattgag taaaatctgt tcgtcagagg 900

aagtatcggg ggttctctca ccgataaagt tgaggaattc tgaacgagta agctttctac 960

ttatttattt tctggtttaa tgaactttct tgttttattt cgctgaaagt tctcttactc 1020

acaaggcttt aaaatggcat cactattttt tctctctatc ttttggccca aaataaactt 1080

actgggttta atatatttat acagaagggc ctgtcagttt aaattaaaac gaaaacaata 1140

ttggggaaac agacctattc aaattaaatt ttcacattta ccttggacat tttggctatt 1200

tcaaaacaac tggaccactc tctttatgtt gcatcaaacg gaagcacgag atttaacact 1260

tttgtaagag ttcaagttga agggttgtca tgtaaagtta cttgccttaa taaagtattg 1320

tgaatttaaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1361

<210> 3

<211> 156

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 3

Met Ala Leu Val Lys Gln Ala Met Ile Ala Val Thr Ala Ala Val Ile

1 5 10 15

Phe Ala Leu Val Tyr Gly Glu Gly Val Asp Pro Asn Cys Leu Gly Cys

20 25 30

Leu Cys Glu Ala Ser Thr Lys Cys Asn Ala Ser Thr Ala Cys His Thr

35 40 45

Pro Tyr Pro Gly Ala Tyr Phe Cys Gly Pro Phe Leu Ile Ser Trp Ala

50 55 60

Tyr Trp Ala Asp Ala Asp Lys Pro Ile Ile Glu Gly Asp Asn Ala Asp

65 70 75 80

Lys Gln Gly Ala Phe Glu Arg Cys Val Gln Asp Leu Tyr Cys Gly Ala

85 90 95

Glu Thr Val Arg Arg Tyr Met Ala Lys Phe Leu Asn Asp Cys Asp Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Val Thr Cys Val Asp Val Ile Arg Thr His Lys Phe Gly

115 120 125

Arg Gln Asp Cys Ala Arg Ala Ile Pro Gln Asp Asp Lys Phe Trp Ser

130 135 140

Gln Tyr Gln Glu Cys Ala Ile Arg Leu Ser Leu Gln

145 150 155

<210> 4

<211> 1215

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 4

ccgctttgac gatctccgcc ccctcgacag aaccgcgcac gaaggttgac agaagagccg 60

gagccagaga acaggacgcg atggcactcg tcaagcaagc gatgatcgcc gtgacggcgg 120

ccgtcatctt cgctctcgtc tatggagaag gagttgaccc caactgcctc gggtgcctgt 180

gcgaggcatc caccaagtgc aacgcctcca cggcctgcca cacgccctac ccaggggcat 240

acttctgcgg acccttcctc atctcatggg catactgggc ggacgcagat aagccaatca 300

ttgagggcga caatgctgac aagcagggag ccttcgagcg ctgtgtgcag gacctgtact 360

gcggcgccga gaccgtccgc cgctacatgg ctaaattcct gaacatcgac tgcaacggcg 420

acgggacggt ggactgcctc gactacgccc acatccacat gatgggcggg tacgggtgca 480

aggatccatc ggtcagaacc accgacttct ataaagtttt cgaaaattgt tgggatgtag 540

ttaacgcggc ttcttctcca tctgctacgt agagtaaaag gcattatatg attatatata 600

tagtataata tagtctttaa aaaatcgcaa aaataatacg cctgtggccc ccttgacacg 660

tcgtatcctg tcagctgact cgttccggaa tccgttttct ttttcttttc taatttacct 720

aaagattgat tgagtaaaat ctgttcgtca gaggaagtat cgggggttct ctcaccgata 780

aagttgagga attctgaacg agtaagcttt ctacttattt attttctggt ttaatgaact 840

ttcttgtttt atttcgctga aagttctctt actcacaagg ctttaaaatg gcatcactat 900

tttttctctc tatcttttgg cccaaaataa acttactggg tttaatatat ttatacagaa 960

gggcctgtca gtttaaatta aaacgaaaac aatattgggg aaacagacct attcaaatta 1020

aattttcaca tttaccttgg acattttggc tatttcaaaa caactggacc actctcttta 1080

tgttgcatca aacggaagca cgagatttaa cacttttgta agagttcaag ttgaagggtt 1140

gtcatgtaaa gttacttgcc ttaataaagt attgtgaatt taaacaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaa 1215

<210> 5

<211> 163

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 5

Met Ala Leu Val Lys Gln Ala Met Ile Ala Val Thr Ala Ala Val Ile

1 5 10 15

Phe Ala Leu Val Tyr Gly Glu Gly Val Asp Pro Asn Cys Leu Gly Cys

20 25 30

Leu Cys Glu Ala Ser Thr Lys Cys Asn Ala Ser Thr Ala Cys His Thr

35 40 45

Pro Tyr Pro Gly Ala Tyr Phe Cys Gly Pro Phe Leu Ile Ser Trp Ala

50 55 60

Tyr Trp Ala Asp Ala Asp Lys Pro Ile Ile Glu Gly Asp Asn Ala Asp

65 70 75 80

Lys Gln Gly Ala Phe Glu Arg Cys Val Gln Asp Leu Tyr Cys Gly Ala

85 90 95

Glu Thr Val Arg Arg Tyr Met Ala Lys Phe Leu Asn Ile Asp Cys Asn

100 105 110

Gly Asp Gly Thr Val Asp Cys Leu Asp Tyr Ala His Ile His Met Met

115 120 125

Gly Gly Tyr Gly Cys Lys Asp Pro Ser Val Arg Thr Thr Asp Phe Tyr

130 135 140

Lys Val Phe Glu Asn Cys Trp Asp Val Val Asn Ala Ala Ser Ser Pro

145 150 155 160

Ser Ala Thr

Claims

1.鉴别SNP分子标记的产品在制备区分凡纳滨对虾抗哈氏弧菌感染能力的试剂中应用；

所述的SNP分子标记位于凡纳滨对虾Lyz-i2基因序列的1191位点处，突变类型为G纯合、G与其他三种核苷酸杂合、除G外其他3种核苷酸纯合或杂合；

所述的G纯合为G/G；

所述的G与其他三种核苷酸杂合为G/A、G/T、G/C；

所述的除G外其他3种核苷酸纯合为：A/A、T/T、C/C，所述的除G外其他3种核苷酸之间杂合为：A/T、A/C、T/C；

所述的凡纳滨对虾Lyz-i2基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.SNP分子标记在群体选育上或耐哈氏弧菌凡纳滨对虾抗菌品系维持上应用；

所述的G纯合为G/G；

所述的G与其他三种核苷酸杂合为G/A、G/T、G/C；

3.一种Lyz-i2基因的SNP基因型的检测引物组，其特征在于，

组合一：

或组合二：

LyzSNPF1：5’-GAGACCGTCCGCCGCTACAT-3’

LyzSNPR1：5’-ACCACAAACGACACCCTACCATT-3’

LyzSNPF2：5’-TCAACTCCTCACGCGAGTAG-3’

LyzSNPR2：5’-GCCGTTGCCGTCGCAATCD-3’

LyzSNPF3：5’-TCAACTCCTCACGCGAGTAH-3’

LyzSNPR3：5’-GCCGTTGCCGTCGCAATCC-3’；

其中，D为A、T、G简并，H为A、T、C简并。