CN108845069A - 一种裂解-气相色谱指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法 - Google Patents

一种裂解-气相色谱指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种裂解‑气相色谱指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法，所述方法为：将已知的浙贝母、川贝母和平贝母粉末装入裂解器中，将裂解器连接气相色谱仪进样口，当裂解器温度达到400‑500℃时进样，经过色谱柱分离得到贝母裂解色谱图，选取特征峰得到特征成分，建立指纹图谱数据库，然后利用统计分析将待鉴别样品归类为浙贝母、川贝母或平贝母。本发明所述的裂解气相色谱采用固体样品直接进样，无溶剂使用，故操作简便，环保；开发裂解色谱法，能够有效节省实验时间、简化实验步骤。

Description

一种裂解-气相色谱指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的 方法
(一)技术领域
本发明涉及一种鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法，特别涉及一种裂解-气相色谱法结合指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法。
(二)背景技术
中药贝母为百合科贝母属(Fritillaria)某些植物的干燥鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的功效，用于痰热咳嗽、痰多胸闷，是治疗气管炎和慢性支气管炎的常用中药。贝母类药材按照功效不同，形成了“川贝”、“浙贝”两大体系，川贝是贝母中药用价值最高的一类，主要生长在横断山区，包括百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przezvalskiiMaxim.、梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.、太白贝母Fritillaria taipaiensisP.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C Hsia van wabuensis(Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wan g et S.C.C h e n的干燥鳞茎；浙贝为百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎，主要生长在海拔高度600米以下的竹林或较荫蔽的地方。平贝产于我国东北地区，为百合科植物平贝母Fritillaria ussuriensisMaxim.的干燥鳞茎，由于贝母类药材资源和价格差异较大，市场上经常出现贝母混淆出售,尤其是多种贝母充当川贝母或混入川贝母出售的现象。因此，建立适当的质量评价方法，有效鉴别贝母种类和控制贝母质量具有重要的学术意义和现实意义。
贝母主要含有脂溶性生物碱和水溶性核苷类物质，此外还有萜类、皂苷、甾体和脂肪酸等多种化学成分，一般认为，生物碱是贝母的主要生物活性成分。目前生物碱的分析方法主要有气相色谱法和液相色谱法，由于生物碱挥发性较差，且大部分异甾体生物碱在结构上缺少共轭键，必须以衍生化方法加上吸光团，使其吸收紫外光或硅烷化，提升其挥发性和检测灵敏度，这就需要复杂样品前处理，消耗大量时间和有机溶剂，较难全面反应贝母化学成分的组成和特征。目前，尚未见到贝母裂解气相色谱结合模式鉴别贝母种类的有关报道，故本发明建立了一种能全面反映贝母分化学组成的裂解色谱分析方法，并结合指纹图谱鉴别贝母的种类，具有重要的学术研究价值及实际应用价值。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种利用裂解气相色谱技术结合指纹图谱模式识别鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法；本发明通过建立贝母的裂解气相色谱分析方法，获得各品种贝母的裂解指纹图谱，结合模式识别对浙贝母、川贝母和平贝母进行鉴别。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种裂解气相色谱法结合指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法，所述方法按照如下步骤进行：
(1)取已知浙贝母、川贝母和平贝母样品，所述的浙贝母、川贝母、平贝母分别取5-6个样品，一共取n个样品，n为整数，15≤n≤18；
(2)分别将所述的样品烘干、研磨，得到各样品的贝母粉末(60-100目)，分别装入裂解器中，将裂解器连接气相色谱仪进样口，当裂解器温度达到400-500℃时进样，经过色谱柱分离检测得到贝母裂解气相色谱图；
所述气相色谱条件为：柱箱升温程序为初温40～50℃，以10～20℃/min速率升到250℃～260℃，保持5～10min；进样口温度为240～300℃，检测器温度为240～300℃，分流比30～50:1；载气为氮气，流速1.0mL/min；
所述裂解器条件：裂解炉温度：400～500℃；裂解器与气相色谱仪接口温度240～300℃；
(3)将待鉴定的贝母样品按照步骤(2)所述的样品检测相同条件进行操作，得到待鉴定的贝母气相色谱图；
(4)取所述n个已知样品的气相色谱图，选取每个样品共有的M个特征成分的特征峰、M为整数，20≤M≤40，并且所述每个样品的M个特征峰的面积达到该样品所有峰总面积的90％，在所述的M个特征峰内，选取一个分离较好，峰面积较大、保留时间居中且相对强度较稳定的峰为参照峰，分别求M个特征成分的特征峰与参照峰的相对峰面积，得到M×n的数据库，输入SPSS统计软件进行主成分分析或聚类分析，得到主成分分析散点图或聚类分析图，并在所述的主成分分析散点图或聚类分析图上确定浙贝母、川贝母或平贝母各自的区域；然后取所述的待鉴定的贝母气相色谱图，分别计算所述M个特征成分的特征峰与所述参照峰的相对峰面积，输入SPSS统计软件进行主成分分析或聚类分析，得到所述待鉴定的贝母主成分分析散点图或聚类分析图，根据统计分析结果将待鉴别样品归类为浙贝母、川贝母或平贝母。
进一步，步骤(4)中，所述主成分分析按以下方法进行：
取n个已知样品的气相色谱图，分别计算出每个已知样品的M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积数据，得到M×n的数据库，输入SPSS统计软件进行主成分分析，提取得到3个主成分为三维主成分，得到每种样品的三维主成分坐标，并由此做出已知样品的三维主成分分析散点图；三维主成分分析散点图上浙贝母、川贝母或平贝母样品分别占三个区域，分别为浙贝母、川贝母或平贝母；
取待鉴别样品的气相色谱图，计算待鉴定样品的M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积的数据，输入SPSS统计软件进行主成分分析，提取得到相应待鉴别样品的三维主成分，根据待鉴别样品的三维主成分坐标在所述三维主成分分析散点图中的位置，若待鉴别样品靠近浙贝母区，鉴定为浙贝母；若待鉴别样品的坐标靠近川贝母区，鉴定为川贝母；若待鉴别样品的坐标靠近平贝母区，鉴定为平贝母。
再进一步，步骤(4)中，所述聚类分析按以下方法进行：
取n个已知样品的气相色谱图，分别计算每个已知样品的M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积数据，得到M×n的数据库，输入SPSS统计软件进行聚类分析，每两样本间用离差平方和Ward’s法连接，以平方欧式距离作为计算方式，输出已知样品的聚类分析图，由图中可知，浙贝母、川贝母或平贝母样品分为三类；
取待鉴别样品的气相色谱图，计算待鉴定样品M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积数据，输入SPSS统计软件进行聚类分析，每两样本间用离差平方和Ward’s法连接，以平方欧式距离作为计算方式，输出所述待鉴别样品聚类分析图，根据待鉴别样品在聚类分析图中的归类位置与所述浙贝母、川贝母或平贝母样品聚为一类的，即将待鉴别样品归类为该贝母样品。
进一步，步骤(2)中，所述裂解器温度达到400～500℃时进样。
进一步，步骤(2)中，优选所述贝母粉末为80-100目的粉末。
再进一步，步骤(2)中，所述贝母粉末按如下方法获得：将贝母干燥鳞茎中肉眼可见的根须等杂质剔除，于60℃下烘干3小时，取出冷却至室温后研磨，过80～100目筛，制成贝母粉末。
本发明所述裂解气相色谱法鉴别贝母品种的方法中，首先采用裂解气相色谱法建立不同品种贝母的指纹图谱，然后确定共有峰，并对其进行标定和特征描述，结合主成分分析和聚类分析对不同品种的贝母进行比较和分类。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：裂解气相色谱采用固体样品直接进样，无溶剂使用，故操作简便，环保；开发裂解色谱法，能够有效节省实验时间、简化实验步骤，结合指纹图谱模式识别可快速鉴别浙贝母、川贝母和平贝母；该检测技术可以推广到贝母更多品种鉴别，对贝母的鉴别具有十分重要的意义。
(四)附图说明
图1为浙贝母不同温度下的裂解气相色谱图；
图2为浙贝母、平贝母和川贝母的裂解气相色谱图；
图3 16个贝母样品的裂解气相色谱图；
图4为浙贝母、川贝母和平贝母主成分分析图。
图5为浙贝母、川贝母和平贝母聚类分析树状图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1裂解温度的选择
(1)仪器与试剂
美国Thermo Trace GC Ultra气相色谱仪，配氢火焰检测器(FID)；日本FrontierPY-2020iD双击式纵型微型炉裂解器。
从浙江、四川、吉林等地药店购买当地浙贝母、川贝母和平贝母饮片，剔除肉眼可见的根须等杂物，研磨，过60-100目筛，制成贝母粉末，备用。样品列表见表1.
(2)实验方法
准确称取浙贝母(ZB1)样品粉末约0.3mg装入样品杯，固定于进样杆后，装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到合适温度(400℃、450℃、500℃)后，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，裂解后的挥发性成分瞬间气化，由载气带入GC进样口，进行气相色谱分析。
美国Thermo Trace GC Ultra气相色谱仪，配氢火焰检测器(FID)；日本FrontierPY-2020iD双击式纵型微型炉裂解器。
气相色谱条件：TRB-5石英毛细管柱(30m×0.25mm i.d.×0.25μm，5％甲基聚硅氧烷)，升温程序：初温50℃，以10℃/min速率升到260℃，保持10min；进样口温度为280℃，检测器温度为280℃，分流比30：1；载气氮气，流速1.0mL/min。
裂解器条件：裂解炉温度：400℃、450℃、500℃；裂解器与气相色谱仪接口温度280℃。
(3)结果与讨论
裂解温度的选择对实验结果十分重要。温度过高，大部分组分都裂解成小分子，无特征性；相反，温度过低，一些组分未能裂解，特征峰过少；而在适当的温度区间内，特征峰的数量和强度均适宜。图1为ZB1样品在400℃、450℃、500℃下的裂解气相色谱图。由图1可见，随着裂解温度由400℃至500℃度，小分子物质峰强度逐渐增强，但450℃裂解，各峰强度相对均匀。因此选择450℃为贝母的较佳裂解温度。
实施例2不同贝母品种的裂解气相色谱分析
美国Thermo Trace GC Ultra气相色谱仪，配氢火焰检测器(FID)；日本FrontierPY-2020iD双击式纵型微型炉裂解器。
气相色谱条件：UA-CW毛细管色谱柱(30m x 0.25mm i.d.x 0.25um,PEG20)，升温程序：初温40℃，以20℃/min速率升到90℃，再以10℃/min速率升到250℃，保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，分流比30：1；载气：氮气，流速1.0mL/min。
裂解器条件：裂解炉温度：450℃；裂解器与气相色谱仪接口温度250℃。
分别准确称取按照实施例1方法制备的浙贝母(ZB1)、川贝母(CB1)、平贝母(PB1)0.3mg，装入样品杯，固定于进样杆后,装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到450℃时，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，裂解后的挥发性成分瞬间气化，由载气带入GC进样口，进行GC分析。
图2是典型的浙贝母、川贝母和平贝母裂解气相色谱图，各贝母样品裂解产生近40个峰，其保留时间一致，但各个色谱峰强度有差异。为了达到所有谱图的共有峰面积达到各自峰面积的90％以上，选取图2(A)中32个峰作为共有峰。
图3是16个贝母样品的裂解气相色谱图。把各个色谱图分三个区域，A区域色谱峰强度低，前4个峰也未分离至基线；B区域色谱峰相对密集，有18个峰，占总共有指纹峰50％以上，所以是贝母的主要指纹区；C区域色谱峰，虽然在峰数上没有B区域多，但是不同种类的贝母在此区有较大差异，是识别的主要特征区之一。由图3可以区分不同品种的贝母，但不够直观尤其是当样品较多时，区分比较麻烦。
实施例3重现性的考察
美国Thermo Trace GC Ultra气相色谱仪，配氢火焰检测器(FID)；日本FrontierPY-2020iD双击式纵型微型炉裂解器。
气相色谱条件：UA-CW毛细管色谱柱(30m x 0.25mm i.d.x 0.25um,PEG20)，升温程序：初温40℃，以20℃/min速率升到90℃，再以10℃/min速率升到250℃，保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，分流比30：1；载气：氮气，流速1.0mL/min。
裂解器条件：裂解炉温度：450℃；裂解器与气相色谱仪接口温度250℃。
分别准确称取5份实施例1方法制备的浙贝母(ZB1)样品0.3mg装入样品杯，固定于进样杆后,装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到450℃时，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，裂解后的挥发性成分瞬间气化，由载气带入GC进样口，进行GC分析。
计算色谱峰调整保留时间和相对峰面积的重现性(用相对标准偏差(RSD)表示)。结果显示，主要裂解色谱峰的保留时间RSD≤0.15％，峰面积的RSD≤4.79％，说明在450℃下裂解0.3mg贝母粉末样品能保证实验结果取得良好的重现性，该方法稳定、可靠。
实施例4指纹图谱模式识别判别浙贝母、川贝母和平贝母
按实施例3中的裂解气相色谱条件分析浙贝母(5个样品)、川贝母(6个样品)、平贝母(5个样品)，得到16个样品的裂解气相色谱图，选取图2(A)中32个峰作为共有峰，16个样品共有峰面积分别占总峰面积的95％以上。选择相对强度较强且较稳定的23号峰为参考峰，设其相对保留时间为1，分别求出在的相对保留时间α和相对峰面积S，见表2。
将表2中16个样品32个共有峰的相对峰面积输入SPSS软件(22.0版本)，调用因子分析，对16个贝母样品的裂解色谱图进行主成分分析。图4为16个样品的主成分分析投影图，标记○为浙贝母样品(ZB1-5)，标记▽为川贝母样品(CB1-6)，标记□为平贝母样品(PB1-5)，前三个方差百分比分别为64.6％、19.0％和4.4％，累计贡献率达88.0％，符合主成分提取时累计贡献率达85％～95％的要求，提取了前三个主成分做了贝母样品主成分三维投影图4。由图可见，5个浙贝样品均能与川贝以及平贝样品明显分开，但是川贝样品与平贝样品比较接近。从主成分三维投影图上看，川贝样品CB-1～CB-5更为接近，平贝样品PB-1、PB-2、PB-4和PB-5聚集在一起。川贝样品CB-6和平贝样品PB-3非常接近。三个品种的贝母样品可基本分开。
将表2中16个样品32个共有峰的相对峰面积输入SPSS软件(22.0版本)进行聚类分析，方法上采用平方Euclidean距离，每两样本间用ward的方法连接，图5为样品的系统聚类分析图，横坐标为临界值，即类间的距离，纵坐标为样品名，由图可见，当临界值为5时，浙贝样品聚为一类，但是川贝和平贝未完全分开，CB-1～CB-5聚为一类，PB-1、PB-2和CB-6聚为一类，PB-3～PB-5聚为一类，说明某些川贝样品与平贝样品极为相似。当临界值为12时，样品分为两大类：浙贝样品、川贝及平贝样品，可见川贝和平贝母存在一定的相似性。
表2 17个贝母样品裂解色谱指纹图谱数据

Claims (6)

1.一种裂解气相色谱法结合指纹图谱鉴别浙贝母、川贝母和平贝母的方法，其特征在于：所述方法按照如下步骤进行制备：
(1)取已知浙贝母、川贝母和平贝母样品，所述的浙贝母、川贝母、平贝母分别取5-6个样品，一共取n个样品，n为整数，15≤n≤18；
(2)分别将所述的样品烘干、研磨，得到各样品的贝母粉末60-100目，分别装入裂解器中，将裂解器连接气相色谱仪进样口，当裂解器温度达到400-500℃时进样，经过极性色谱柱分离检测得到贝母裂解气相色谱图；
所述气相色谱条件为：色谱柱为极性柱；柱箱升温程序为初温40～50℃，以10～20℃/min速率升到250℃，保持5～10min；进样口温度为240～260℃，检测器温度为240～260℃，分流比30～50:1；载气为氮气，流速1.0mL/min；
所述裂解器条件：裂解炉温度：400-500℃；裂解器与气相色谱仪接口温度240～260℃；
(3)将待鉴定的贝母样品按照步骤(2)所述的样品检测相同条件进行操作，得到待鉴定的贝母气相色谱图；
(4)取所述n个已知样品的气相色谱图，选取每个样品共有的M个特征成分的特征峰、M为整数，20≤M≤40，并且所述每个样品的M个特征峰的总面积达到该样品所有峰总面积的90％，在所述的M个特征峰内，选取一个分离较好，峰面积较大、保留时间居中且相对强度较稳定的峰为参照峰，分别求M个特征成分的特征峰与参照峰的相对峰面积，得到M×n的数据库，输入SPSS统计软件进行主成分分析或聚类分析，得到主成分分析散点图或聚类分析图，并在所述的主成分分析散点图或聚类分析图上确定浙贝母、川贝母或平贝母各自的区域；然后取所述的待鉴定的贝母气相色谱图，分别计算所述M个特征成分的特征峰与所述参照峰的相对峰面积，输入SPSS统计软件进行主成分分析或聚类分析，得到所述待鉴定的贝母主成分分析散点图或聚类分析图，根据统计分析结果将待鉴别样品归类为浙贝母、川贝母或平贝母。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述主成分分析按以下方法进行：
取n个已知样品的气相色谱图，分别计算出每个已知样品的M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积数据，得到M×n的数据库，输入SPSS统计软件进行主成分分析，提取得到3个主成分为三维主成分，得到每种样品的三维主成分坐标，并由此做出已知样品的三维主成分分析散点图；三维主成分分析散点图上浙贝母、川贝母或平贝母样品分别占三个区域，分别为浙贝母、川贝母或平贝母；
取待鉴别样品的气相色谱图，计算待鉴定样品的M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积的数据，输入SPSS统计软件进行主成分分析，提取得到相应待鉴别样品的三维主成分，根据待鉴别样品的三维主成分坐标在所述三维主成分分析散点图中的位置与已知浙贝母、川贝母或平贝母样品所在区域最接近的，即为该区域相对应的品种的贝母。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述聚类分析按以下方法进行：
取n个已知样品的气相色谱图，分别计算每个已知样品的M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积数据，得到M×n的数据库，输入SPSS统计软件进行聚类分析，每两样本间用离差平方和Ward’s法连接，以平方欧式距离作为计算方式，输出已知样品的聚类分析图，由图中可知，浙贝母、川贝母或平贝母样品分为三类；
取待鉴别样品的气相色谱图，计算待鉴定样品M个特征成分的特征峰相对于所述参照峰的相对峰面积数据，输入SPSS统计软件进行聚类分析，每两样本间用离差平方和Ward’s法连接，以平方欧式距离作为计算方式，输出所述待鉴别样品聚类分析图，根据待鉴别样品在聚类分析图中的归类位置与所述浙贝母、川贝母或平贝母样品聚为一类的，即将待鉴别样品归类为该贝母样品。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述裂解器温度达到400～500℃时进样。
5.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述贝母粉末为80-100目的粉末。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述贝母粉末按如下方法获得：将贝母干燥鳞茎中肉眼可见的根须等杂质剔除，于60℃下烘干3小时，取出冷却至室温后研磨，过80～100目筛，制成贝母粉末。
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