CN108504766A - 一种白芍栽培种质鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白芍栽培种质鉴定的方法，研究以安徽道地产亳白芍为主样本，通过基于近缘物种基因组的进行多态性筛选，先用酶切的方法建库，然后上Illumina二代测序仪测序，对读到的序列进行微卫星分析，找出其中SSR重复单元比较多的序列，设计合成M13加尾引物在不同来源药用栽培白芍种质群体样本中进行多态性验证。本发明结构科学合理，使用安全方便，进一步样本验证表明，其中1对引物多态性高、重复性好，可以通过多态性片段长度测序的大小和峰形区分白芍种质来源，为白芍种质种苗的鉴定提供了有效可靠的鉴定依据，为解决品种来源问题提供了一种新的手段。

Description

一种白芍栽培种质鉴定的方法
技术领域
本发明属于白芍种质鉴定技术领域，具体涉及一种白芍栽培种质鉴定的方法。
背景技术
微卫星DNA是指基因组中由短的重复单元(一般为1～6个碱基)组成的DNA串联重复序列，又被称作简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSRs)，广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，而且分布比较均匀，平均每10kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列，再加上SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性，由于SSR的两端有一段保守的DNA序列，根据这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物，对SSR进行PCR扩增。
白芍是我国著名的传统中药，始载于《神农本草经》，列为中品，具有平肝止痛、养血调经和敛阴止汗的功效。中国药典记载白芍来源于芍药科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，目前全国药用芍药主产区为安徽亳州、浙江磐安和四川中江，所产白芍分别习称亳白芍、杭白芍和川白芍，安徽毫州自清代开始种植单瓣花的芍药以供药用，与栽培历史悠久的浙江杭州地区的杭白芍、四川中江的川白芍均为白芍的道地药材来源，此外山东菏泽也有栽培药用白芍.供药用的栽培白芍种质中杭白芍、川白芍、亳白芍均为利用芽头进行根茎繁殖使种质延续。
然而现有的白芍种质种苗的鉴定过程中仍然存在着一些不合理的因素，现有的白芍栽培种质品种来源问题仍然存在很大的不足，如何为白芍种质来源的区分提供了有效可靠的鉴定手段，以及在白芍种质种苗的鉴定中，解决品种来源问题提供新的手段越来越被重视，为此本发明提供一种白芍栽培种质鉴定的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白芍栽培种质鉴定的方法，以解决上述背景技术中提出的现有的白芍种质种苗的鉴定过程中仍然存在着一些不合理的因素，现有的白芍栽培种质品种来源问题仍然存在很大的不足，如何为白芍种质来源的区分提供了有效可靠的鉴定手段，以及在白芍种质种苗的鉴定中，解决品种来源的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种白芍栽培种质鉴定的方法，所述栽培种质鉴定方法如下：
步骤一：选取亳白芍为主样本，杭白芍、川白芍作为验证样本；
步骤二：仪器与试药选择，NAS-99分光光度计、BC-subMIDI电泳槽、BG-Power300C电泳电源、1-14离心机、Verity PCR仪、凝胶成像仪、DHP-9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、HiSeq2500，内切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi-Di去离子甲酰胺、POP-7胶、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；
步骤三：采用改良CTAB法提取样品DNA，凝胶电泳检测质量，用HaeIII酶对主样本DNA进行酶切打断实验，将酶切产物进行5’末端修复，同时对5’末端进行磷酸化修饰，3’末端加A，使之与solexa接头5’端T互补，提高接头连接效率，阻止solexa接头自连，3’和5’端分别修饰完成之后，继续连接solexa测序接头，将连接产物锚定在flowcell上，进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增；
步骤四：将步骤三所述的进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增，增大文库量后上机检测，筛选测序结果，保留重复次数≥5次的序列，剔除载体序列，使用Primer Premier 5.0设计引物；
步骤五：不同引物进行扩增，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μl，降落扩增程序；
步骤六：将步骤五所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后运用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；
步骤七：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；
步骤八：将步骤七所述的筛选后获得6对具有多态性引物TP-M13-SSR所检测的不同药用白芍栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；
步骤九：观察验证原始测序峰图，利用筛选的SSR引物对14份不同白芍种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤五中，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μl，包括primers(5uM)各0.3μl、10×PCR Buffer 1μl、dNTP(10mM)0.8μl、Taq酶(5U/ul)0.12μl、DNA模板1μl以及ddH2O 6.48μl。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤五中，降落扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，起始退火56℃30s，10个循环，每个循环下降1℃，降落至最后的温度50℃30s，再次95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤七中，采用引物Marker18899区分3种不同种质的鉴别度最高，杭白芍扩增后等位基因长度约为374bp，川白芍长度约为368bp和373bp，亳白芍约为371bp和376bp。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明结构科学合理，使用安全方便，利用Illumina二代测序技术筛选和开发微卫星(SSR)分子标记引物并用于不同来源白芍栽培种质的鉴定，所筛选的7对SSR引物在不同白芍栽培种质间显示较好的多态性，进一步样本验证表明，其中1对引物多态性高、重复性好，可以通过多态性片段长度测序的大小和峰形，该方法为白芍种质来源的区分提供了有效可靠的鉴定手段，尤其在白芍种质种苗的鉴定中，为解决品种来源问题提供了一种新的手段。
附图说明
图1为实验用不同来源白芍栽培种质一览表；
图2为白芍多态性引物序列及长度一览表；
图3为6对多态性引物TP-M13-SSR所检测的不同药用白芍栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；
图4为利用筛选的SSR引物对14份不同白芍种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小，从上至下依次为亳白芍、川白芍、杭白芍；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种白芍栽培种质鉴定的方法，包括如下步骤：
步骤一：选取亳白芍为主样本，杭白芍、川白芍作为验证样本；
步骤二：仪器与试药选择，NAS-99分光光度计、BC-subMIDI电泳槽、BG-Power300C电泳电源、1-14离心机、Verity PCR仪、凝胶成像仪、DHP-9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、HiSeq2500，内切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi-Di去离子甲酰胺、POP-7胶、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；
步骤三：采用改良CTAB法提取样品DNA，凝胶电泳检测质量，用HaeIII酶对主样本DNA进行酶切打断实验，将酶切产物进行5’末端修复，同时对5’末端进行磷酸化修饰，3’末端加A，使之与solexa接头5’端T互补，提高接头连接效率，阻止solexa接头自连，3’和5’端分别修饰完成之后，继续连接solexa测序接头，将连接产物锚定在flowcell上，进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增；
步骤四：将步骤三所述的进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增，增大文库量后上机检测，筛选测序结果，保留重复次数≥5次的序列，剔除载体序列，使用Primer Premier 5.0设计引物；
步骤五：不同引物进行扩增，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μL，包括primers(5uM)各0.3μL、10×PCR Buffer 1μL、dNTP(10mM)0.8μL、Taq酶(5U/ul)0.12μL、DNA模板1μL以及ddH2O 6.48μL，降落扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，起始退火56℃30s，10个循环，每个循环下降1℃，降落至最后的温度50℃30s，再次95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存；
步骤六：将步骤五所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后运用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；
步骤七：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；
步骤八：将步骤七所述的筛选后获得6对具有多态性引物TP-M13-SSR所检测的不同药用白芍栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；
步骤九：观察验证原始测序峰图，利用筛选的SSR引物对14份不同白芍种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种白芍栽培种质鉴定的方法，其特征在于：所述栽培种质鉴定方法如下：
步骤一：选取亳白芍为主样本，杭白芍、川白芍作为验证样本；
步骤二：仪器与试药选择，NAS-99分光光度计、BC-subMIDI电泳槽、BG-Power300C电泳电源、1-14离心机、Verity PCR仪、凝胶成像仪、DHP-9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、HiSeq2500，内切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi-Di去离子甲酰胺、POP-7胶、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；
步骤三：采用改良CTAB法提取样品DNA，凝胶电泳检测质量，用HaeIII酶对主样本DNA进行酶切打断实验，将酶切产物进行5’末端修复，同时对5’末端进行磷酸化修饰，3’末端加A，使之与solexa接头5’端T互补，提高接头连接效率，阻止solexa接头自连，3’和5’端分别修饰完成之后，继续连接solexa测序接头，将连接产物锚定在flowcell上，进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增；
步骤四：将步骤三所述的进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增，增大文库量后上机检测，筛选测序结果，保留重复次数≥5次的序列，剔除载体序列，使用Primer Premier 5.0设计引物；
步骤五：不同引物进行扩增，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μL，降落扩增程序；
步骤六：将步骤五所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后运用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；
步骤七：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；
步骤八：将步骤七所述的筛选后获得6对具有多态性引物TP-M13-SSR所检测的不同药用白芍栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；
步骤九：观察验证原始测序峰图，利用筛选的SSR引物对14份不同白芍种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。
2.根据权利要求1所述的一种白芍栽培种质鉴定的方法，其特征在于：所述步骤五中，TP-M13-SSR扩增反应体系为10μl，包括primers(5uM)各0.3μl、10×PCR Buffer 1μl、dNTP(10mM)0.8μl、Taq酶(5U/ul)0.12μl、DNA模板1μL以及ddH2O 6.48μl。
3.根据权利要求1所述的一种白芍栽培种质鉴定的方法，其特征在于：所述步骤五中，降落扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，起始退火56℃30s，10个循环，每个循环下降1℃，降落至最后的温度50℃30s，再次95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种白芍栽培种质鉴定的方法，其特征在于：所述步骤七中，采用引物Marker18899区分3种不同种质的鉴别度最高，杭白芍扩增后等位基因长度约为374bp，川白芍长度约为368bp和373bp，亳白芍约为371bp和376bp。
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