CN108949943B - 一种利用its2序列鉴定活血丹品种的方法 - Google Patents

一种利用its2序列鉴定活血丹品种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，包括以下步骤：步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出样品的DNA；步骤2，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增；步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列；步骤4，基于得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。本发明鉴定活血丹品种的方法通过改良干药材DNA提取方法和特异性PCR扩增反应条件，为活血丹药材的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中药材中准确快速地检测出活血丹及其易混品，提高了检测的准确度，适于广泛推广应用。

Description

一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法
技术领域
本发明属于植物品种鉴定方法技术领域，具体涉及一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法。
背景技术
活血丹(Glechoma longituba(Nakai)Kupr.)为唇形科多年生草本植物，又名连钱草、地钱儿、遍地金钱、透骨风、过墙风、九里香等，茎高10～20cm、四棱形；叶对生、圆形或肾形；轮伞花序腋生，每轮有花2～6朵；小坚果，果期4～5月。活血丹喜阴湿，生长于林间草地、河畔或田野等地。其干燥地上部分入药，药材名为连钱草(《中国药典》(2010年版)收录)，主产于江苏、浙江一带，性微寒，味辛，入肝、肾、膀胱经，有清热解毒、利尿通淋、散瘀消肿的功能，主治胆囊炎、胆结石、肾结石、黄疸型肝炎等症。
活血丹属植物约有8种，广泛分布于欧、亚大陆温带地区，南北美洲有栽培。我国有5种2变种(中国植物志)，即活血丹Glechoma longituba(Nakai) Kupr.，据《中国植物志》记载，活血丹除青海、甘肃、新疆及西藏外，全国各地均产；白透骨消Glechoma biondiana(Diels)C.Y.Wu et C.Chen.，分布于陕西、甘肃、河南、河北；欧活血丹Glechoma hederaceaL.，在我国产于新疆一带，国外产于北欧、西欧、中欧各国；日本活血丹Glechoma grandis(A. Gray)Kupr.，国内产于江苏、中国 台湾，国外产于日本；大花活血丹Glechomasinograndis C.Y.Wu，别名大筋草，产于云南一带，海拔2000～2900m。变种为无毛白透骨消Glechoma biondiana(Diels)C.Y.Wu et C.Chen var. glabrescens C.Y.Wu&C.Chen，国内分布于甘肃、陕西、河北等省区；狭萼白透骨消G.biondiana var.angustituba C.Y.Wu etC.Chen分布于湖北、四川，海拔1200～1650m。
由于活血丹与其同属植物的植株形态相似，传统的形态学手段不能保证基源鉴定的准确性。活血丹及其易混药材的鉴别对于植物资源保护及用药安全都具有重要的意义。随着分子生物学的发展，条形码技术作为一种前沿的分子标记技术应用于多种中药材鉴别上。本发明以ITS2序列为条形码，运用生物信息学的方法准确鉴别活血丹及其同属植物，为条形码技术在活血丹鉴定中的应用提供理论及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，解决了现有鉴定方法准确度低的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，包括以下步骤：
步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的 DNA；
步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；
步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列；
步骤4，基于步骤3得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。
本发明的特征还在于，
步骤1具体为：
步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理
取待鉴定活血丹干叶片3-4片于离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；
步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中加入550uL的CTAB，置于65℃干浴加热至少30min，加热期间颠倒混匀后放置10min，冷却至室温；
步骤1.3，在步骤1.2的溶液中加入450uL的酚氯仿，涡旋振荡，14000rpm 条件下离心10min分层，得到上层液体；
步骤1.4，吸取450uL步骤1.3的上层液体至离心管，加入与上层液体等体积的氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min，静置分层得到上清液；
步骤1.5，吸取步骤1.4中300uL的上清液至离心管，加入与上清液等体积的预冷至-20℃的异丙醇，上下解倒混匀后，放置于温度-20℃条件下至少10min，随后14000rpm条件下离心10min，静置，去掉上层清液，得到下层白色沉淀；
步骤1.6，在步骤1.5的下层白色沉淀中加入500uL预冷至-20℃的体积分数为70％的乙醇，轻弹管壁，悬浮沉淀，14000rpm条件下离心2min，静置分层，再次去掉上层清液，下层沉淀于室温条件下挥发乙醇至干燥；
步骤1.7，在步骤1.6干燥的下层沉淀加入80ul TE，于14000rpm条件下离心1min，并于4℃保存，得到待鉴定活血丹样品的DNA，备用。
步骤2中PCR扩增的反应体系为：
2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物ITS2F和ITS3R均选用浓度10umol/L 各1ul，步骤1得到的DNA 1ul，ddH2O 9.5ul。
步骤2中PCR扩增的反应条件为：
温度94℃，变性2min；温度94℃变性30s，温度56℃退火30s，温度 72℃延伸45s，40个循环；温度72℃延伸2min。
PCR反应扩增引物为：
ITS2F：5’-ATCGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，
ITS2R：5’-ATCGGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。
步骤3中的测序仪具体为ABI3730xl DNA Analyzer测序仪，
步骤3具体操作为：
将得到的rDNA ITS2序列经Seqman软件拼接校对，随后通过隐马尔科夫模型进行ITS2序列注释。
步骤3中rDNA ITS2的序列的基因编码如序列1所示。
步骤4具体为：将步骤3得到的rDNA ITS2序列使用MEGA7.0软件进行数据分析，构建Neighbor-Joining Tree，最后通过对NJ树分析，鉴别活血丹品种。
本发明的有益效果是：本发明一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法通过改良干药材DNA提取方法和特异性PCR扩增反应条件，为活血丹药材的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中药材中准确快速地检测出活血丹及其易混品，提高了检测的准确度，适于广泛推广应用。
附图说明
图1是本发明一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法中活血丹通用引物ITS2F/3R扩增电泳图，
其中从左到右依次为marker条带、陕西红河谷活血丹HHGHXD01、陕西红河谷活血丹HHGHXD02、陕西宁陕县活血丹NSHXD07、陕西宁陕县活血丹NSHXD08、陕西眉县活血丹MXHXD13、陕西眉县活血丹MXHXD14、陕西汉中活血丹HZHXD19、陕西汉中活血丹HZHXD20、control空白阴性对照；
DNAmarker条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp；
图2是本发明通过MEGA7.0建立的活血丹及其易混品Neighor Joining Tree图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
1.样品来源，详见表1。
表1样品来源
Figure BDA0001742927590000051
Figure BDA0001742927590000061
2.待测试样品的DNA提取
步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理
取待鉴定活血丹3片大小相近干叶片于体积1.5mL的离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；
步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中加入550uL的CTAB，置于65℃干浴加热至少30min，加热期间颠倒混匀后放置10min，待冷却至室温；
步骤1.3，在步骤1.2的溶液中加入450uL的酚氯仿，涡旋振荡，14000rpm 条件下离心10min分层，得到上层液体；
步骤1.4，吸取450uL步骤1.3的上层液体至新的1.5mL离心管，加入与上层液体等体积的氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min分层，得到上清液；
步骤1.5，吸取步骤1.4中300uL的上清液至离心管，加入与上清液等体积的预冷至-20℃的异丙醇，上下解倒混匀后，放置于温度-20℃条件下至少10min，随后14000rpm条件下离心10min分层，去掉上层清液，得到下层白色沉淀；
步骤1.6，在步骤1.5的下层白色沉淀中加入500uL预冷至-20℃的体积分数70％的乙醇，轻弹管壁，悬浮沉淀，14000rpm条件下离心2min，静置分层，再次去掉上层清液，下层沉淀于室温条件下挥发乙醇至干燥；
步骤1.7，在步骤1.6干燥的下层沉淀加入80ul TE，于14000rpm条件下离心1min，并于4℃保存，得到待鉴定活血丹样品的DNA，备用。
3、PCR扩增
PCR扩增ITS2序列，按25ul扩增体系进行：2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物ITS2F和ITS3R均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA 1ul， ddH2O 9.5ul。
PCR扩增的反应条件为：温度94℃，变性2min；温度94℃变性30s，温度56℃退火30s，温度72℃延伸45s，40个循环；温度72℃延伸2min。
PCR反应扩增引物为：
ITS2F：5’-ATCGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，
ITS2R：5’-ATCGGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。
4、测序
对步骤2得到的PCR产物，通过ABI3730xl DNA Analyzer测序仪对PCR 产物进行双向测序，得到测序结果。
5、序列拼接、对比、处理
运用Seqman软件进行序列校对、拼接和引物区去除，基于隐马尔可夫模型(HMM)进行ITS2序列注释，使用MEGA7.0进行序列比对、建立NJ 树。
结果如图1所示：其中从左到右依次为marker条带、陕西红河谷活血丹HHGHXD01、陕西红河谷活血丹HHGHXD02、陕西宁陕县活血丹 NSHXD07、陕西宁陕县活血丹NSHXD08、陕西眉县活血丹MXHXD13、陕西眉县活血丹MXHXD14、陕西汉中活血丹HZHXD19、陕西汉中活血丹 HZHXD20、control空白阴性对照；
DNA marker条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp；
图1显示DNA扩增成功，可以测序；
如图2所示，由图可明显看出活血丹及其同属易混品种都分别在不同的支上，可以明显鉴别分开。
本发明鉴定活血丹品种的方法通过改良干药材DNA提取方法和特异性 PCR扩增反应条件，为活血丹药材的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中药材中准确快速地检测出活血丹及其易混品，提高了检测的准确度，适于广泛推广应用。
序列表
<110> 西安医学院
<120> 一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法
<130> 无
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cgcatcgcgt cgccccccct ctccgcgcac agcacggccg aggtggggcg gatattggcc 60
ccccgtgtgc cccggcgcgc ggtcggccca aatgcgatcc cccggcgact cgtgtcgcga 120
caagtggtgg ttgaacatat caattcgccg tcgcgctcct gcgtcgtccg acgggcatca 180
ctgaacgacc caacggtgtt tgtgcacctt cgaccg 216

Claims (4)

1.一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的DNA；
步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理
取待鉴定活血丹干叶片3-4片于离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；
步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中加入550uL的CTAB，置于65℃干浴加热至少30min，加热期间颠倒混匀后放置10min，冷却至室温；
步骤1.3，在步骤1.2的溶液中加入450uL的酚氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min分层，得到上层液体；
步骤1.4，吸取450uL步骤1.3的上层液体至离心管，加入与上层液体等体积的氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min，静置分层得到上清液；
步骤1.5，吸取步骤1.4中300uL的上清液至离心管，加入与上清液等体积的预冷至-20℃的异丙醇，上下解倒混匀后，放置于温度-20℃条件下至少10min，随后14000rpm条件下离心10min，静置，去掉上层清液，得到下层白色沉淀；
步骤1.6，在步骤1.5的下层白色沉淀中加入500uL预冷至-20℃的体积分数为70％的乙醇，轻弹管壁，悬浮沉淀，14000rpm条件下离心2min，静置分层，再次去掉上层清液，下层沉淀于室温条件下挥发乙醇至干燥；
步骤1.7，在步骤1.6干燥的下层沉淀加入80ul TE，于14000rpm条件下离心1min，并于4℃保存，得到待鉴定活血丹样品的DNA，备用；
步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；
PCR扩增的反应体系为：
2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物ITS2F和ITS3R均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA 1ul，ddH2O 9.5ul；
PCR反应扩增引物为：
ITS2F：5’-ATCGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，
ITS3R：5’-ATCGGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；
步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列，rDNA ITS2的序列的基因编码如序列1所示；
步骤4，基于步骤3得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。
2.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增的反应条件为：
温度94℃，变性2min；温度94℃变性30s，温度56℃退火30s，温度72℃延伸45s，40个循环；温度72℃延伸2min。
3.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序仪具体为ABI3730xl DNA Analyzer测序仪，
步骤3具体操作为：
将得到的rDNA ITS2序列经Seqman软件拼接校对，随后通过隐马尔科夫模型进行ITS2序列注释。
4.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤4具体为：将步骤3得到的rDNA ITS2序列使用MEGA7.0软件进行数据分析，构建Neighbor-Joining Tree，最后通过对NJ树分析，鉴别活血丹品种。
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