CN105733969A

CN105733969A - 一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的培养基及培养方法

Info

Publication number: CN105733969A
Application number: CN201610322671.9A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 罗海艳; 胡兴
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2016-05-17
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2016-07-06

Abstract

本发明公开一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的培养基及培养方法。步骤简述如下：向配制的液体无机盐基础培养基中加入经粉碎的富含纤维素物质，培养基经高温灭菌冷却至室温，向培养液中加入少量微量元素和生长因子，将经活化的茯苓菌丝接种到上含有不超过三角瓶体积10%的培养基中，室温下培养至菌丝体长满三角瓶瓶底，按1：50左右比例将菌丝体再转接到基它含有培养液的三角瓶中，室温下培养2周，过滤得茯苓菌丝体和培养液，培养液用3，5?二硝基水杨酸测定菌液中的纤维酶达120 IU/ml以上。本方法以简单无机盐和纤维类物质为培养基，在室温下无需摇床或就获得了茯苓菌丝体和高活性纤维素酶的培养液，既有利于苓菌丝体的高效生产和富含纤维素废弃物的利用，又可以节约能源和资源。

Description

一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的液体培养基及其培养方法，具体来说，涉及一种以简单无机盐和富含纤维素废弃物为培养基主要成分，无需摇床和恒温培养，可以快速培养茯苓菌丝体并获得含有高浓度纤维素酶的培养液，利用该方法，既有利于富含纤维素废弃物的利用开发，又节约了能源和资源。

背景技术

茯苓，俗称云苓、松苓、茯灵等，其原生物为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，多寄生于马尾松或赤松的根部。茯苓是一种在中药方剂里应用范围最广的真菌，药理研究亦证实其茯苓萃取物具有消炎、免疫调节、止吐、抗氧化、抗肿瘤、镇静、利尿及降血糖等作用。茯苓是著名的家种大宗中药材，现代医学研究：茯苓能增强机体免疫功能，并有明显的抗肿瘤及保肝脏作用。茯苓有效成分的研究中，研究得最多的就是茯苓多糖，即茯苓次聚糖，它具有抗肿瘤活性，其衍生物羧甲基茯苓糖已被证明具免疫促进及抗肿瘤作用，而U-茯苓多糖和羟乙基茯苓多糖则可抑制小鼠肉瘤细胞生长、调节免疫系统功能；其次是茯苓的三萜类化合物，可抑制癌细胞增生，目前的研究发现茯苓三萜类化合物还具有抗炎、抗肿瘤细胞生成及诱生集落刺激因子等作用。目前，茯苓种植需要大量的松树和土地，而种植所得到的茯苓提取多糖和萜类需要经去除泥沙、皮和霉变部分，再经切块粉碎后才能进行提取。从种植茯苓到前期加工，都需要大量的资源和能源消耗。不同产地生产的茯苓在品质上有很大差异，也影响到了茯苓产品的质量控制。因此，目前不少研究者以液体发酵发来培养得到茯苓菌体，但液体培养基组成中含有大量的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖，为获得大量茯苓菌丝体，往往采用补料发酵培养的方法，且需要控制温度和供氧，耗电量高，因此并不经济环保。

茯苓以松根为“食”，因此必然能分泌产生在量分解松材的酶类，如纤维素和木质素等。纤维素是大自然生物量最高的有机质，利用富含纤维素类物质为主要成分，在无需摇床或发酵罐，无需恒温控制的情况下获得大量茯苓菌丝体及发酵液，从中回收具有深入开发价值的茯苓菌丝体和广泛应用价值的纤维素酶，不仅能大大减少对松林、能源的消耗及土地资源的占用，有利于节约能源和资源。因此，开发一种可以高效且廉价培养茯苓菌丝体的培养基及其培养方法，同时还可以获得具有重要应用价值的纤维素酶，减少资源浪费并节约能源，有利于茯苓活性成分深加工产业的健康和可持续发展。

发明内容

基于此，本发明提供一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的液体培养基及其培养方法，利用本方法，可以实现利用廉价无机盐培养基，在无需摇床或发酵罐的条件下，以富含纤维素的物质（以纸屑纤维为例进行说明）为唯一碳源，可以快速培养茯苓菌丝体并获得含有高浓度纤维素酶的培养液。利用该方法，可以获得大量的茯苓菌丝体和富含纤维素酶的培养液，节约了能源和资源，又有利于纤维类废弃物的利用开发。

解决上述问题的技术方案如下：

一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的液体培养基及其培养方法主要包括以下步骤：

（1）无机盐基础培养基的配制：主要成分为（质量体积比）磷酸钾(1-2%)和磷酸(0.2-1%)；

（2）微量元素及生长因子溶液的配制：主要成分为：Fe²+(1-2mol/L)Cu²⁺(10-40mmol/L)、Zn²⁺(2-20mmol/L)、Mo²⁺(50-200mmol/L)、Mn²⁺(20-50mmol/L)、Bo₃ ^-(2-40μmol/L)、I^-(1-10μmol/L)、生物素（40mg/L）、复合维素B(10mg/L)；

（3）茯苓菌丝的活化：取无机盐基础培养基用氨水调节pH5-6和1%（质量体积比）葡萄糖，于广口三角瓶内封口膜密封（培养液体积不超过三角瓶体积的1/10），121℃湿热灭菌15分钟后冷却至室温，无菌工作台内添加0.1%微量元素及生长因子溶液，将市售茯苓菌种试管斜面生长的茯苓菌丝划成0.5-1平方厘米的菌丝块，接种5-10块菌丝，室温下培养至菌丝体长满三角瓶瓶底；

（4）茯苓菌丝体的扩大培养：取无机盐基础培养基用氨水调节pH5-6，加入1-5%（质量体积比）经粉碎的富含纤维素的物质（以纸屑纤维为例进行说明），按不超过培养瓶体积10%的量加入到培养瓶中，121℃湿热灭菌15分钟后冷却至室温，按1：50左右比例将三角瓶中的活化菌丝体转接到培养瓶中，室温下培养2周左右菌丝体可长满三角瓶瓶底液面；

（5）菌丝体与发酵液的分离：将步骤（4）中的菌丝体和培养液从三角瓶中倒出，8层纱布过滤，分别得到茯苓菌丝体和菌液，

（6）发酵菌液中纤维素酶含量的测定：利用3，5-二硝基水杨酸测定菌液中的纤维酶达120IU/ml(CMC比活力)以上。

在其中一些实施例中，步骤（1）所述的无机盐基础培养基的主要成分为（质量体积比）磷酸钾(1-2%)和磷酸(0.2-1%)。

在其中一些实施例中，步骤（3）所述的调节基础无机盐培养基pH值的物质是氨水，另一加入到培养基中的成分是经粉碎富含纤维素的物质（以纸屑纤维为例进行说明）。

本发明所述的一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的液体培养基及其培养方法具有以下优点：

一是利用廉价的无机盐为基本培养基，以廉价的浓氨水调节pH并充当氮源，因此培养基极其简单和价廉；二是以纤维素类物质为碳源，相比较于葡萄糖等碳源，纤维素随处可得，来源广泛且廉价，更重要的是，葡萄糖在培养基中加入的量不能太高，否则因为渗透压高而抑制菌丝的生长，而纤维素不溶于水，在经济节约的前提下可以按任意比例添加；三是纤维素类物质不但可以作为茯苓菌丝体生长的碳源，并能在其诱导下促使茯苓菌丝源源不断地分泌降解纤维素的纤维素酶；四是本发明所描述的方法无需使用摇床、发酵罐或温控设备，节约了大量的能源和资源；五是较其它液体培养法，本方法可以获得更多的茯苓菌丝。

附图说明

图1是茯茯菌丝体在培养瓶中的生长状况图；图2是茯苓菌丝体的湿重与培养时间关系图；图3培养液中纤维素酶的活力与培养时间关系图。

具体实施方式

本发明茯苓菌购自市售茯苓菌种。培养茯苓菌丝体和获得富含纤维素酶的培养液的具体步骤如下：

（1）纸屑的粉碎：以回收的书本为纤维素的来源原材料，利用碎粉机将其粉碎，过200目的金属网筛，得粉碎的纸屑；

（2）基本无机盐培养基配制：无机盐基础培养基基本组成为磷酸钾(1-2%)和磷酸(0.5-1%)，将无机盐培养基利用浓氨水调节pH至5-6之间。向其中加入1-5%（质量体积比）经步骤（1）粉碎的富含纤维素的物质（以粉碎纸屑为例进行说明），121℃湿热灭菌15分钟后冷却至室温；

（3）微量元素及生长因子溶液的配制：主要成分为：Fe²⁺(1-2mol/L)Cu²⁺(10-40mmol/L)、Zn²⁺(2-20mmol/L)、Mo²⁺(50-200mmol/L)、Mn²⁺(20-50mmol/L)、Bo₃ ^-(2-40μmol/L)、I^-(1-10μmol/L)、生物素（40mg/L）、复合维素B(10mg/L)，0.22微米细菌过滤器过滤除菌，4℃保存备用；

（4）培养茯苓菌丝体及生产纤素酶培养基的配制：向经灭菌冷至室温的步骤（2）的培养基中加入0.01%微量元素与生长因子溶液即可；

（5）茯苓菌丝的活化：取无机盐基础培养基用氨水调节pH5-6，加入1%的葡萄糖（质量体积比），按不超过培养瓶体积10%的量加入到培养瓶中，110℃湿热灭菌30分钟后冷却至室温，加入0.01%微量元素与生长因子溶液，将市售茯苓菌丝斜面的茯苓菌丝切成0.2平方厘米的方块，取10-20块菌丝块，转接到250ml培养瓶中，25℃左右下培养2周左右至菌丝体刚长满三角瓶瓶底液面；

（6）茯苓菌丝体的扩大培养：取培养茯苓菌丝体及生产纤素酶培养基，按不超过培养瓶体积10%的量加入到培养瓶中，121℃湿热灭菌15分钟后冷却至室温，超净工作台内，无菌条件下，将步骤（5）中长满三角瓶瓶底液面的茯苓菌丝体的用无菌手术刀划成不大于0.5平方厘米的碎块并摇匀，按1：50左右的比例将含活化菌丝体块的菌液转接到含茯苓菌丝体及生产纤素酶培养基的培养瓶中，室温下培养。在培养过程中，每隔5天取一瓶拍照，茯苓菌丝体在培养瓶中的长势情况如图1所示（接种前、接种5天、接种10天和接种15天的菌丝生长照片），从图中可以看出，在培养2周左右菌丝体可长满三角瓶瓶底液面。培养基间，每间隔3天取样一瓶，将所取样培养瓶中的茯苓菌丝体用镊子取出，清水将残余碎纸屑洗干净后，压滤法将菌丝体中的培养液去除干净，称量菌体的湿重，结果如图2所示；

（7）发酵菌液中纤维素酶含量的测定（参考标准方法：GB/T23881-2009）：取洗净烘干的10ml刻度试管，编号后按标准方法标准葡萄糖溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至10ml，充分混匀。在540nm波长下，测定各管溶液的吸光度OD值并记录结果。以葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标，以对应的吸光度OD值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线（0、0.5、1、2、3、4、5、10mg/ml）。步骤（6）中的将所取样培养瓶中的茯苓菌丝体用镊子取出后的培养液10000g离心，取发酵液，将发酵液利用pH6.5和PBS稀释20倍，参照标准方法（GB/T23881-2009）加入1%羧甲基纤维素纳（CMC），50℃水浴30分钟后，12000g离心5分钟，取上清利用DNS测定菌液中的纤维酶的酶活，酶活与培养时间的关系如图3所示，结果表明，在培养结束时，发酵注中的纤维素酶的酶活达120IU/ml（CMC比活力）以上；

（8）菌丝体与发酵液的分离：将步骤（6）中的菌丝体和培养液从三角瓶中倒出，8层纱布过滤，分别得到茯苓菌丝体和菌液，茯苓菌丝体可以干燥保存或用于进一步的加工开发；菌液含有大量纤维素酶，经透析和超滤浓缩并真空干燥，即得富含纤维素酶的粗品。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种高效生产茯苓菌丝体和纤维素酶的培养基及培养方法，其特征在于，无需摇床或发酵罐，以无机盐为基础培养基和含纤维素物质为主要原料，在室温下培养，既得到了茯苓菌丝体又获得了富含纤维素酶的培养液，具体来说，本发明主要包括以下步骤：

（1）无机盐基础培养基的主要成分为（质量体积比）：磷酸钾(1-2%)和磷酸(0.5-1%)；

（2）微量元素及生长因子溶液的主要成分为：Fe²+(1-2mol/L)Cu²⁺(10-40mmol/L)、Zn² ⁺(2-20mmol/L)、Mo²⁺(50-200mmol/L)、Mn²⁺(20-50mmol/L)、Bo₃ ^-(2-40μmol/L)、I^-(1-10μmol/L)、生物素（40mg/L）、复合维素B(10mg/L)；

（3）取50ml无机盐基础培养基用氨水调节pH5-6和0.5-2g经粉碎的富含纤维素的物质（以纸屑纤维为例进行说明）于500ml广口三角瓶内封口膜密封，121℃湿热灭菌15分钟后冷却至室温，无菌工作台内添加50μl微量元素及生长因子溶液，将活化的茯苓菌丝划成小于0.5平方厘米的菌丝块，接种1-2%，封口膜密封，室温下，无需发酵罐或摇床、无需温控，自然培养培养至菌丝体长满三角瓶瓶底；

（4）利用纱布过滤，得到茯苓菌丝体和富含纤维素酶的培养液体。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于利用该培养基和培养方法，无需发酵罐或摇床、无需温控，可获得茯苓菌丝体并生产茯苓纤维素酶。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于步骤（1）所述培养基基本组成分为无机盐基础培养基（质量体积比）：磷酸钾(1-2%)、氢氧化钾(1-2%)和氨水。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(3)中培养基组成中的一种重要成分是富含纤维素的物质（以纸屑纤维为例进行说明）。