CN1899318A - 一种组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组合物，所述的组合物质量组成如下：冬虫夏草20～80％，隐孔菌20～80％。冬虫夏草与隐孔菌也可以各自的发酵培养物来代替。本发明所述的组合物可有效抑制肺纤维化、心血管组织纤维化；所述组合物抗组织纤维化的效果明显超出目前广泛应用的抗组织纤维化药物——干扰素γ；所述的组合物在冬虫夏草和隐孔菌组合应用时对博莱霉素所致肺纤维化及高血压引起的心血管组织纤维化的抑制作用，比单独应用冬虫夏草或隐孔菌有更好的效果，而且没有发现任何毒副作用，具有巨大的开发前景。

Description

一种组合物及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种组合物及其在制备预防和治疗组织纤维化药物中的应用。

(二)背景技术

组织纤维化(tissue fibrosis)是许多不同组织损伤的共同后果，也是多种严重威胁人类健康疾病的基本病理改变。事实上组织纤维化累及人体几乎所有器官和系统，是许多疾病致残、致死的主要原因。据有关统计资料证明，美国因各种疾病而致死的病人中，接近45％可以归于组织纤维化疾病。的确，组织纤维化在人体各主要器官疾病的发生和发展过程中起着重要作用。例如心血管组织纤维化在高血压和心力衰竭引起心血管组织重构中发挥了重要作用，也是动脉粥样硬化的主要原因之一；内外源致病原可以引起肝纤维化，如B型和C型病毒性肝炎、血吸虫肝病、慢性酒精性肝病和非酒精性脂肪肝已经成为世界性的肝纤维化原因；许多急慢性肾脏疾病都与组织纤维化发生发展密切相关，特别是糖尿病肾病和高血压引起的肾纤维化改变；多种免疫和自身免疫疾病例如关节炎、全身硬化症和系统性红斑狼疮也有组织纤维化的改变。

研究表明，组织损伤后的愈合过程可以分为组织再生和组织纤维化两个阶段，前者主要包括组织损伤引起的炎症反应和正常组织愈合过程，后者主要是由于局部各种生物活性因子引起的结缔组织过度增生的瘢痕化过程。这两个阶段分别是由不同分子调节的，也是可分离的病理过程。全身和局部免疫系统在引起、维持和抑制组织纤维化过程中发挥了关键作用。免疫系统可以分为先天性免疫系统和获得性免疫系统。先天性免疫系统是人体对内源性和外源性致病原产生免疫应答和急性炎症反应的第一道防线。先天性免疫系统主要由补体、多形核细胞(单核-巨噬细胞、肥大细胞)、天然杀伤细胞(NK)和树突状细胞(DC)等组成。获得性免疫系统主要由白细胞和淋巴细胞介导，包括体液免疫反应和细胞免疫反应。体液免疫反应由B淋巴细胞分泌的抗体介导，细胞免疫由T淋巴细胞分泌的细胞因子介导。T细胞包括细胞毒T(Tc)、帮助T(Th)和调节T(Tr)细胞。根据识别抗原递呈细胞表面I型或II型MHC分子结合抗原的不同，T细胞可以分为CD₈ ⁺和CD₄ ⁺两种亚型。根据产生不同细胞因子，CD₄ ⁺T细胞可以再分Th1、Th2和天然杀伤T细胞(NK-T)。在这个领域，一个重要的进展是，先天性免疫系统的几个成分通过不同的机制促使抗原递呈细胞特别是树突状细胞(DC)成熟，决定了获得性免疫系统中B淋巴细胞发育和T淋巴细胞分泌的Th1、Th2细胞因子的极化方向。获得性免疫反应的Th1或Th2细胞因子极化方向是组织纤维化和组织重构的关键因素。例如，组织损伤后，先天性免疫系统的重要成份NK细胞被激活。活化的NK细胞分泌IFN-γ促进抗原递呈细胞DC发育，使获得性免疫反应朝Th1方向发展。这种Th1极化方向有利于组织损伤的修复和再生；反之，如果Th细胞朝向Th2方向发展，则促进组织纤维化和组织重构的发生。的确，临床应用IFN-γ治疗肺纤维增生性疾病已经获得了令人鼓舞的初步结果。可以预期，先天性免疫系统和获得性免疫系统相互作用的研究将会导致发现抗组织纤维化新药靶，为开发高效低毒的抗纤维化药物提供巨大机会。

大量研究证明：真菌类提取物一般都具有明显的免疫调节作用；它们或者增加某些免疫反应功能或者抑制某些免疫反应功能。例如，冬虫夏草发酵培养物既可以增强免疫反应，也可以抑制免疫反应而作为器官移植辅助药物。根据发明人前期研究工作，发现冬虫夏草发酵培养物是一个Th1免疫反应增强物。另一方面，冬虫夏草发酵培养物已经被发现不同程度地抑制各种不同病因引起的肝纤维化、肾纤维化，但作用机制仍然不清楚。另外，隐孔菌发酵培养物也具有明显免疫调节作用。进一步研究发现隐孔菌发酵培养物明显阻断Th2免疫反应作用，具有显著抗过敏、抗哮喘的作用(过敏和哮喘都是Th2免疫反应过度引起的疾病)。根据上述发现和理论，已经在几种组织纤维化的动物模型上展开了研究工作。经过大量实验研究，发现冬虫夏草发酵培养物和隐孔菌发酵培养物能非常有效地抑制博莱霉素所致肺纤维化、高血压引起的心血管组织纤维化。这两种天然产物有效成分组合后抗组织纤维化的效果明显超出目前广泛应用的抗组织纤维化药物——干扰素γ，而且没有发现任何毒副作用。初步结果完全符合上述理论，提示这个冬虫夏草发酵培养物和隐孔菌发酵培养物复方可能是治疗许多组织纤维化的有效药物，具有巨大的开发前景。

(三)发明内容

本发明既是为了提供一种冬虫夏草发酵培养物和隐孔菌发酵培养物复配的组合物，以及这种组合物在制备预防和治疗组织纤维化药物中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种组合物，所述的组合物质量组成如下：冬虫夏草20～80％，隐孔菌20～80％。

进一步，所述的组合物质量组成如下：冬虫夏草菌发酵培养物20～80％，隐孔菌发酵培养物20～80％。

所述冬虫夏草菌发酵培养物即蝙蝠蛾被毛孢Hiresutella hepialiChen et Shen sp.Nov.(1980)和同种异名--中国被毛孢Hiresutellasinensis Lu，Guo，Yu et Zeng.(1989)的发酵培养物。所述隐孔菌发酵培养物即隐孔菌Crytoporus volvatus(Peck.)Hubbara.包括中华隐孔菌Crytoporus sinensis H.Wu & M.Zang发酵培养物。

所述的冬虫夏草菌发酵培养物为下列之一或下列两者的任意组合：

(1)冬虫夏草菌发酵菌丝体；(2)冬虫夏草菌发酵液。

所述的隐孔菌发酵培养物为下列之一或下列两者的任意组合：(1)隐孔菌发酵菌丝体；(2)隐孔菌发酵液。

具体的，上述发酵培养物均可经提取浓缩干燥后制成粉末。所述的组合物质量组成如下：发酵冬虫夏草粉末20～80％，发酵隐孔粉末20～80％。

优选的，所述的组合物质量组成如下：发酵冬虫夏草粉末50％，发酵隐孔菌粉末50％。

隐孔菌粉末制备步骤如下：

(1)菌种活化：将4℃条件下保存的隐孔菌菌种，通过无菌操作移植到以下培养基中，在真菌常规培养温度下培养3～10天，

培养基组分和重量百分含量为(％)：

葡萄糖            0.5～2.0

麦芽糖            0.5～2

蛋白胨            0.1～0.2

酵母粉            0.5～1

KH₂PO₄         0.1～0.4

MgSO₄·7H₂O    0.01～0.5

维生素B₁         0.05～0.1

琼脂              2.2～3.0

pH             4.5～5.0

其余成分为水

(2)摇瓶培养：将上述活化的隐孔菌菌丝移入内装150～200mL下述培养液的500mL三角烧瓶中、在振荡频率为100～200rpm、温度为20～30℃条件下在摇床中振荡培养6天；如需加大种量可再将菌丝液移入内装750mL下述培养液的3000mL三角烧瓶中、在振荡频率为100～200rpm、温度为20～30℃条件下在摇床中振荡培养2～5天。

培养液组分和质量(％)为：

葡萄糖            0.5～2.0

麦芽糖            0.5～2

蛋白胨            0.1～0.2

酵母粉            0.5～1

KH₂PO₄         0.1～0.4

MgSO₄·7H₂O    0.01～0.5

维生素B₁         0.05～0.1

pH                4.5～5.0

其余成分为水

(3)液体发酵培养：在各种容量规格的发酵罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量3～10％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.1～1.0(v/v/分钟)、叶轮搅拌速度为100～200rpm、罐压大于0.05kg/cm²，温度20～30℃条件下发酵1～10天。

培养液组分和重量百分含量(％)为：

葡萄糖            2.5～3.5

麦芽糖            0.5～2

玉米粉            0.3

蛋白胨            0.5

酵母粉            0.5～1

KH₂PO₄         0.1～0.4

MgSO₄·7H₂O    0.01～0.5

维生素B₁         0.05～0.1

pH                4.5～5.0

其余成分为水

(4)将上述发酵罐内的隐孔菌发酵产物采用常规过滤方法过滤得到菌丝体和发酵液上清液。菌丝体或/和发酵液匀可做为本发明的组分，所得菌丝体与发酵液可各自单独或混合或提取制成发酵隐孔菌粉末。隐孔菌菌丝体滤饼烘干，粉碎，过筛，得到颗粒小于60目的隐孔菌菌粉。发酵上清液浓缩至稠膏状，加入或不加入，上述所得粉末，混匀，烘干、粉碎，或经提取，喷雾成即得所述的发酵隐孔菌粉末。

发酵冬虫夏草粉末制备步骤如下：

中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被毛孢在液体培养基上发酵，获得发酵上清液、菌丝体及其中的各种代谢物：发酵方法为依次斜面菌种培养、摇瓶种子培养、一级、二级、或三级种子罐培养、液体发酵罐中通气培养，10～18℃、pH6.0～7.5分别培养30～60、10、6、6、6、6～12天。液体培养基(重量百分比)为：碳源0.5～5％，氮源0.2～5％、微量元素、维生素少许，其余为水分，发酵过程中通入无菌空气。发酵完毕后固液分离得到菌丝体和发酵滤液。菌丝体和发酵滤液匀可作为本发明的组合物，也可将发酵滤液浓缩后与菌丝体混合、匀浆、也可经提取、喷雾干燥得所述的发酵冬虫夏草粉末。

所述的冬虫夏草与隐孔菌组合物、冬虫夏草菌发酵与隐孔菌发酵培养物组合物均可应用于制备预防和治疗组织纤维化药物。

所述的预防和治疗组织纤维化药物用于治疗博莱霉素所致肺纤维化。

所述的预防和治疗组织纤维化药物应用于治疗高血压引起的心血管组织纤维化。

所述的组合物每日有效给药剂量为：动物给药量为0.1～15g/kg体重，折算成人的给药量0.1～60g/kg体重。即对于受体来说，组合物每日有效给药剂量为：0.1～60g/kg体重。

本发明所述的组合物及其应用的有益效果主要体现在：(1)所述组合物可有效抑制博莱霉素所致肺纤维化、高血压引起的心血管组织纤维化；(2)本发明所述组合物抗组织纤维化的效果明显超出目前广泛应用的抗组织纤维化药物——干扰素γ；(3)本发明所述的组合物在冬虫夏草和隐孔菌组合应用时对博莱霉素所致肺纤维化及高血压引起的心血管组织纤维化的抑制作用，比单独应用冬虫夏草或隐孔菌有更好的效果，而且没有发现任何毒副作用，具有巨大的开发前景。

(四)附图说明

图1为博莱霉素所致小鼠肺纤维化和各种药物治疗的作用(Masson’s染色)；A为正常组28天后组织病理切片图，B为模型组28天后组织病理切片图，C为干扰素组28天后组织病理切片图，D为组合物组即冬虫夏草和隐孔菌组合物28天后组织病理切片图，E为地塞米松组治疗两周停药一周后组织病理切片图，F为地塞米松组治疗两周停药两周后组织病理切片图；

图2为各种药物对高血压大鼠生存率的影响；其中CY为组合物，CHC为冬虫夏草发酵物，YK为隐孔菌发酵物，DEX为地塞米松，IFN为干扰素(以下同)。

图3为各种药物对高血压大鼠心血管组织纤维化的影响；A：正常组心肌组织(×100)；B：模型组心肌组织(×100)，；C：阳性对照组心肌组织(×100)，；D：冬虫夏草和隐孔菌组合物(CY)治疗组心肌组织(×100)；E：正常组胸主动脉(×400)；F：模型组胸主动脉(×400)；G：阳性对照组胸主动脉(×400)；H：冬虫夏草和隐孔菌组合物(CY)治疗组胸主动脉(×400)。

图4为各种药物对高血压大鼠体重以及心脏指数、左心室指数和脾脏指数的调节作用。A心脏指数；B左心室指数；C体重变化；D脾脏指数。

图5为各种药物对高血压大鼠血流动力学功能的调节作用；*，与空白组比较p＜0.05；**，与空白组比较p＜0.01；***，与空白组比较p＜0.001。

图6为对高血压大鼠心肌TGF-b1 mRNA表达水平的调节作用(CY为组合物的TGF-b1 mRNA表达水平，GAPDH为内控指标)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：发酵隐孔菌粉末制备

步骤如下：

(1)菌种活化：将4℃条件下保存的隐孔菌菌种，通过无菌操作移植到以下培养基中，在真菌常规培养温度下培养8天，

培养基组分和重量百分含量为(％)：

葡萄糖            0.6

麦芽糖            1.5

蛋白胨            0.1

酵母粉            0.8

KH₂PO₄         0.1

MgSO₄·7H₂O    0.05

维生素B₁         0.07

琼脂              2.7

pH                4.8

其余成分为水

(2)摇瓶培养：将上述活化的隐孔菌菌丝移入内装200mL下述培养液的500mL三角烧瓶中、在振荡频率为200rpm、温度为20～30℃条件下在摇床中振荡培养6天；

培养液组分和质量(％)为：

葡萄糖             0.7

麦芽糖             1.6

蛋白胨             0.2

酵母粉             1

KH₂PO₄          0.1

MgSO₄·7H₂O     0.05

维生素B₁          0.1

pH                 5.0

其余成分为水

(3)液体发酵培养：在20L发酵罐中装14L的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量3％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.1～1.0(v/v/分钟)、叶轮搅拌速度为200rpm、罐压大于0.05kg/cm²，温度20～30℃条件下发酵10天。

培养液组分和重量百分含量(％)为：

葡萄糖              3.0

麦芽糖              1.8

玉米粉              0.3

蛋白胨              0.5

酵母粉              1

KH₂PO₄           0.1

MgSO₄·7H₂O      0.05

维生素B₁           0.05

pH                  4.5

其余成分为水

(4)将上述发酵罐内的隐孔菌发酵产物采用常规过滤方法过滤得到菌丝体和发酵液上清。隐孔菌菌丝体滤饼在80～90℃条件下烘干，粉碎，过筛，得到颗粒小于60目的隐孔菌菌粉；发酵上清液70～80℃旋转蒸发浓缩至密度为1.4克/毫升，再加热浓缩至稠膏状，加入上述所得菌粉，搅拌均匀，烘干、粉碎，过60目筛，即得所述的发酵隐孔菌粉末。

实施例2：发酵冬虫夏草粉末制备

中国冬虫夏草无性世代菌种蝙蝠蛾被毛孢在液体培养基上发酵，获得发酵上清液、菌丝体及其中的各种代谢物：发酵方法为依次斜面菌种培养、摇瓶种子培养、一级、二级种子罐培养、液体发酵罐中通气培养，10～18℃、pH6.0～7.5分别培养50、10、6、6、10天。

液体培养基(重量百分比)为：蚕蛹粉2.0％，蛋白胨1.5％，玉米粉1.8％，蔗糖1.6％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，其余为水分，发酵过程中通入无菌空气。

发酵完毕后固液分离，得到菌丝体和发酵液，发酵液再进行膜分离得到富含有效成分的发酵滤液，发酵滤液浓缩后与菌丝体混合、匀浆、喷雾干燥，即得所述的发酵冬虫夏草粉末。

实施例3：

配方：

实施例2所得发酵冬虫夏草粉末      5000g

实施例1所得发酵隐孔菌粉末        5000g；

上述发酵冬虫夏草菌粉与发酵隐孔菌粉混合均匀，即得所述的组合物。

实施例4：

配方：

冬虫夏草            2000g

隐孔菌              2000g；

方法：冬虫夏草购自青海原产地，隐孔菌采自浙江杭州地区松木林中，经外观鉴定为野生药材，分别粉碎，混合，再磨粉得过80目粉末，即得所述的组合物。

实施例5：

配方：

按实施例2方法所得发酵冬虫夏草粉末        8000g

按实施例1方法所得发酵隐孔菌粉末          4000g；

上述发酵冬虫夏草菌粉与发酵隐孔菌粉混合均匀，即得所述的组合物。

实施例6：

配方：

按实施例2方法所得发酵冬虫夏草粉末        2000g

按实施例1方法所得发酵隐孔菌粉末          8000g；

上述发酵冬虫夏草粉末与发酵隐孔菌粉末混合均匀，即得所述的组合物。

实施例7：

配方：

按实施例2方法所得发酵冬虫夏草粉末        8000g

按实施例1方法所得发酵隐孔菌粉末          2000g；

上述发酵冬虫夏草粉末与发酵隐孔菌粉末混合均匀，即得所述的组合物。

实施例8：

配方：

按实施例2方法所得发酵冬虫夏草粉末        4000g

按实施例1方法所得发酵隐孔菌粉末          8000g；

上述发酵冬虫夏草粉末与发酵隐孔菌粉末混合均匀，即得所述的组合物。

实施例9：预防和逆转博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化

一.简述：博莱霉素诱导的肺纤维化是一个经典的动物模型。博来霉素(BLM)是从链霉菌属中一个产抗生素的菌株中提取出的一组糖肽类，是一种癌症化疗制剂，常用于制作动物肺纤维化模型。目前认为BLM能和亚铁离子形成BLM Fe²⁺复合物，在O₂存在下，这一复合物能为氧分子提供电子，形成过氧化物和游离羟基等中间体产物，使DNA的脱氧核糖产生自由基。大量的自由基对肺组织产生脂质过氧化损伤，促进成纤维细胞等增生、增殖，使肺泡间质发生纤维化。

主要试剂和药品：

干扰素γ(IFNγ)：购自上海克隆生物高技术有限公司；

地塞米松磷酸钠注射液：购自天津金耀氨基酸有限公司，批号0407031；

冬虫夏草发酵物：实施例2制得的发酵冬虫夏草粉末；

隐孔菌发酵物：实施例1制得的发酵隐孔菌粉末；

实施例3所得组合物；

实施例4所得组合物。

二.实验方法：取雄性C57BL/6(周龄6～8周)小鼠，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，气管内注射博莱霉素(3U/kg)，以尽量小的创伤切开颈部皮肤，穿刺气管后使用微量进样器气管内注入约50μl博来霉素，迅速地直立并翻转动物，以便使博来霉素均匀地进入左右肺叶。

假手术组气管内注射等量的生理盐水；共设8组，详细方案见表1。分别通过五个时间点：3天、7天、14天、21天、28天了解博莱霉素所致肺纤维化的病理特点，观察抗炎药物地塞米松、抗纤维化药物干扰素γ以及本发明组合物对博莱霉素所致肺纤维化不同病程的药物疗效。

表1：本发明组合物对博莱霉素所致肺纤维化不同病程的药效学研究

组别	剂量(连续14天)	溶剂
			假手术组(Con，n＝33)	等量溶剂(p.o.)	H2O
模型组(Mod，n＝33)	等量溶剂(p.o.)	H2O
			地塞米松组(DS，n＝33)	3mg/kg((i.p.)	生理盐水
干扰素γ组(IFN-γn＝33)	15万U/kg(i.p.)	生理盐水
			冬虫夏草发酵物组(CFC，n＝33)	3g/kg(p.o.)，每日分两次给药	H2O
隐孔菌发酵物组(CFS，n＝33)	3g/kg(p.o.)，每日分两次给药	H2O
			组合物一组(CFX1，n＝33)	实施例3所得组合物3.0g/kg(p.o.)	H2O
组合物二组(CFX2，n＝33)	实施例4所得组合物3.0g/kg(p.o.)	H2O

三.实验结果：用平均值±SD表示，使用方差分析ANOVA，各组比较后有差异后选择适宜的检验方法进行多组样本均值的两两比较。统计学分析的结果p＜0.05认为有显著差异，p＜0.01认为有非常显著性差异。

(1)博莱霉素所致小鼠肺纤维化和药物治疗作用的病理学检查结果

气管注射博莱霉素可引起明显的肺纤维化(见表2，图1)。在4周的观察期内，肺纤维化表现出明显的阶段特征：炎症反应阶段和纤维化形成及发展阶段。病理结果显示，炎症反应阶段大约持续2周，以第一周表现最为明显：造模后3天动物肺泡壁水肿、增宽、变厚，毛细血管扩张，充血，肺泡腔内巨噬细胞增多，可见中性粒及嗜酸性粒细胞浸润；造模后7天，肺泡炎症达高峰，肺泡腔内可见大量炎性细胞渗出，肺泡巨噬细胞和间质单核细胞数目显著增加；造模后14天仍然有个别动物发生灶性炎细胞浸润。纤维化期大约在7天左右开始：造模后7天，动物肺泡间隔增厚，肺间质和肺泡壁出现纤维母细胞和肌纤维母细胞增生；造模后第14天，肺泡间隔内成纤维细胞明显增多，基质明显增多，肺泡结构破坏、萎陷；造模后21天，肺泡间隔纤维化更加明显，肺泡腔变狭小，肺组织大片纤维组织增生；造模后28天肺纤维化程度进一步加重，成纤维细胞大量增生，纤维组织呈条索样分布，出现肺泡结构进一步破坏甚至肺泡结构消失。

表2：博莱霉素所致小鼠肺纤维化和各种药物治疗的作用

组别	7天	14天	21天	28天
					正常组	-	-	-	2/7(+)
模型组	3/6(+)	4/6(+)	6/6(+)	2/7(++)，3/7(+++)
					DS组	-	1/6(++)	3/6(+++)，1/6(+)	3/7(+)
干扰素组	2/6(+)	2/6(++)	1/6(+)	2/7(+)
					CFC组	3/6(+)，1/6(++)	3/5(+)	4/6(+)	2/7(+)，1/7(++)
CFS组	2/6(+)	3/6(+)	3/6(+)	1/9(+)，1/9(++)
					组合物一组CFX1	1/6(+)，2/6(++)	2/6(+)	1/6(+)	2/9(++)
组合物二组CFX2	2/6(+)，2/6(++)	3/6(+)	2/6(+)	2/9(++)

注1：Masson’s染色评分标准：(a)无纤维化(-)(b)轻度纤维化(+)，纤维化面积小于20％。(c)中度纤维化(++)，纤维化面积在20％到50％。(d)重度纤维化(+++)，纤维化面积超过50％

注2：CFC：冬虫夏草发酵物，CFS：隐孔菌发酵物，CFX1(实施例3所得组合物)：发酵冬虫夏草粉末与发酵隐孔菌粉末1∶1的组合物。CFX2(实施例4所得组合物)：冬虫夏草菌与隐孔菌1∶1的组合物。

注3：以下实施例表中所示与注1、注2相同。

组织病理切片检查显示模型组动物肺泡结构消失，形成严重的肺纤维化(见图1B)。干扰素γ和组合物一组显著地抑制博莱霉素引起的肺纤维化(见图1C，图1D)。地塞米松治疗的动物两周后停药，在停药一周后仍出现大片纤维组织增生(见图1E)，但停药两周后肺组织纤维化程度减轻(见图1F)。

实施例10：抑制高血压诱导的心血管组织重构：

(1)主要试剂和药品：

干扰素γ(IFNγ)：上海克隆生物高技术有限公司

地塞米松磷酸钠注射液：天津金耀氨基酸有限公司，批号0407031冬虫夏草发酵物：与实施例2相同方法制得冬虫夏草发酵物，批号CFC-16-040928

隐孔菌发酵物：与实施例1相同方法制得隐孔菌发酵物，批号CFS-4-100L

实施例3所得组合物。

(2)实验动物：SD大鼠(雄性，220～240g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2002-0003。

(3)实验方法：

①动物分组、造模以及给药情况：

雄性SD大鼠(220～240g)，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠[Kuwahara et al.，2002]。仰位于鼠板固定，剪去手术处皮毛，消毒后腹正中切口，切开皮肤及肌层，切口约1.5-2cm，暴露内脏后，用手指伸入腹腔，腹腔主动脉的搏动，以判断其位置，然后，用浸有生理盐水的消毒纱布将大鼠的胃及肠系膜等推向右侧暴露肾脏及脊柱前腹主动脉，在肾动脉分支上方分离腹主动脉1cm长，用7号注射针头紧贴腹主动脉，平行放置，并将二者一起结扎，然后抽出注射器针头，即可缩窄腹主动脉。术后每天用青霉素5万U/只腹腔注射一周，以免感染。假手术组分离腹主动脉后不结扎。

天然药物对高血压所致心血管组织重构不同病程的治疗作用，共设8组(详细方案见表3)，造模后7天、14天和28天分别处理动物，以检测高血压所致心血管组织重构的发展过程及其过程中免疫系统的改变，检测地塞米松、IFN-γ以及冬虫夏草菌发酵物和隐孔菌发酵物对高血压所致心血管组织重构不同病程的药物疗效。

            表3

组别

剂量

溶剂

假手术组(Con，n＝30)	Sham
			模型组(Mod，n＝36)	AC
IFN-γ组(n＝36)	15万U/kg/day(i.p.)	NS
			冬虫夏草发酵物CFC组(n＝36)	3g/kg/day(p.o.)	H2O
隐孔菌发酵物YK组(n＝36)	3g/kg/day(p.o.)	H2O
			实施例3组合物(n＝36)	3g/kg/day(p.o.)	H2O
Dex组(n＝36)	1mg/kg/day(i.p.)	NS

在给药后的7d，14d，28d分别处理动物。处理动物前，隔夜禁食，称重后腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉大鼠，测量血流动力学指标后颈总动脉取血。分别取出心脏和肾脏，称重后把左心室和肾脏组织分成4份，一份用4％多聚甲醛溶液中固定，作病理组织切片分析；两份迅速置于液氮中，用于蛋白质表达检测；分别取适量左、右另外一份迅速置于RNAwait保存液，检测组织中mRNA的表达。分别取出胸腺和脾脏，称重后迅速置于RNAwait保存液，以检测Th1/Th2相关细胞因子以及TGF-β1等mRNA表达水平。

免疫组织化学结果分析：

利用免疫组织化学方法，分别进行天狼猩红或Masson染色，以观察I、III型胶原的分布以及药物处理的影响；HE染色，观察炎性细胞的浸润；用anti-Brdu、ED-1、IFN-γ、IL-13和TGF-β1的抗体分别检测成纤维细胞增殖、单核细胞浸润和IFN-γ、IL-13和TGF-β1在心肌组织、肾组织和血管组织局部的产生情况。

统计方法：

实验结果用平均值(Mean)±SD表示，使用方差分析ANOVA，各组比较后有差异后选择适宜的检验方法进行多组样本均值的两两比较。统计学分析的结果p＜0.05认为有差异，p＜0.01认为有显著性差异。

(4)实验结果：

①对高血压大鼠生存率的影响：各种药物对高血压大鼠生存的保护作用见图2；

②对高血压大鼠心血管组织纤维化的调节作用：见图3；结扎腹主动脉引发大鼠高血压，14天后处死动物，取其心脏和胸主动脉，经10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，显微照相，分析其纤维增生的改变。A：正常组心肌组织(×100)；B：模型组心肌组织(×100)，与正常组相比，其纤维增生极显著增加(p＜0.001)；C：阳性对照组心肌组织(×100)，与模型组相比，其纤维增生明显减轻(p＜0.01)；D：CY治疗组心肌组织(×100)，与模型组相比，其纤维增生明显减轻(p＜0.01)；E：正常组胸主动脉(×400)；F：模型组胸主动脉(×400)，与正常组相比，其血管肥厚的程度极显著增加(p＜0.001)；G：阳性对照组胸主动脉(×400)，与模型组相比，其血管肥厚的程度明显减轻(p＜0.01)；H：组合物治疗组胸主动脉(×400)，与模型组相比，其血管肥厚的程度明显减轻(p＜0.05)。

③对高血压大鼠体重以及心脏指数、左心室指数和脾脏指数的调节作用：见图4；A心脏指数；B左心室指数；C体重变化；D脾脏指数。

④对高血压大鼠血流动力学功能的调节作用：药物对腹主动脉结扎后不同时间(7天、14天和28天)麻醉状态大鼠主动脉收缩压的影响见图5；*，与空白组比较p＜0.05；**，与空白组比较p＜0.01；***，与空白组比较p＜0.001。

⑤对高血压大鼠心肌TGF-β1 mRNA表达水平的调节作用：给药后7天高血压大鼠心肌TGF-β1 mRNA表达水平的变化见图6。

血流动力学检测结果表明，模型组的血压值在实验后7天即明显高于对照组(p＜0.05)，14天时模型组的血压继续升高(p＜0.001)，28天时趋于稳定(p＜0.01)。阳性对照组和组合物治疗组均未发现显著降血压作用(p＞0.05)(图4)。心脏指数是指每100g大鼠体重中心脏的重量(g)，左心室指数是指左心室重量(g)与全心重量(g)的比值，两者直接反映心脏，尤其是左心室的肥厚程度。IFN-γ组和治疗组均可减少由于高血压造成的心脏指数(图2A)和左心室指数的增加(图2B)。心肌间纤维组织增生是以心肌间纤维细胞增多，灶性纤维组织增生或在心肌小动脉周围纤维组织增生和大片状纤维组织增生为主。结果表明，造模第7天，阳性对照组和组合物治疗组心肌纤维组织增生较轻，与模型模型组相比未见明显差异。第14天和28天，阳性对照组和组合物治疗组心肌纤维组织增生明显减轻(p＜0.01)(图3A～D)。胸主动脉纤维组织增生主要表现在动脉壁中膜，在中膜弹力纤维之间胶原纤维和平滑肌细胞增生，使弹力纤维之间隙变宽，动脉壁中膜增厚。造膜第14天，阳性对照组和组合物治疗组胸主动脉纤维组织增生明显减轻，分别与模型组相比差异非常显著(p＜0.01)或差异显著(p＜0.05)；造膜第28天，阳性对照组和组合物治疗组也显示了类似的治疗效果(图3G～H)。

实施例10：冬虫夏草和隐孔菌组合物(CFX)对博莱霉素所致肺纤维化治疗作用最佳配比实验

组合物最佳配比实验中，共设10组，组别及给药方案见表3。实验方法同实施例8。观察冬虫夏草发酵物和隐孔菌发酵物不同的配比(冬虫夏草发酵物和隐孔菌发酵物的比例分别为1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1)、地塞米松急性炎症期给药(DS1)、地塞米松组长期给药(DS2)、干扰素长期给药(IFN-γ)对博莱霉素所致肺纤维化的作用。

表4：组合物对博莱霉素所致肺纤维化治疗作用最佳配比实验

组别		剂量		溶剂
					Con(n＝11)	CON	等量溶剂 灌胃p.o.	连续28D	H2O
Mod(n＝12)	MOD	等量溶剂 灌胃p.o.	连续28D	H2O

DS(n＝13)	DS2	0.5mg/kg腹腔注射i.p.	连续28D	生理盐水
					DS(n＝11)	DS1	0.5mg/kg腹腔注射i.p.	最初3天给药	生理盐水
IFNγ(n＝11)	IFN	15万IU/kg腹腔注射i.p.	连续28D	生理盐水
					CFX4(n＝12)	CF4	实施例7组合物(3.0g/kg)p.o.	连续28D	H2O
CFX2(n＝12)	CF2	实施例5组合物(3.0g/kg)p.o.	连续28D	H2O
					CFX(n＝12)	CFX	实施例3组合物(3.0g/kg)p.o.	连续28D	H2O
CFX1(n＝11)	CF1	实施例8组合物(3.0g/kg)p.o.	连续28D	H2O
					CFX0(n＝11)	CF0	实施例6组合物(3.0g/kg)p.o.	连续28D	H2O

注：表中的例：CF4表示冬虫夏草发酵物与隐孔菌发酵物重量为4∶1

              CF2表示冬虫夏草发酵物与隐孔菌发酵物重量为2∶1

              CFX表示冬虫夏草发酵物与隐孔菌发酵物重量为1∶1

              CF1表示冬虫夏草发酵物与隐孔菌发酵物重量为1∶2

              CF0表示冬虫夏草发酵物与隐孔菌发酵物重量为1∶4。

表5：博莱霉素所致小鼠肺纤维化和各种药物治疗的作用

组别	组别	纤维化分级
			假手术组	对照组	1/8(+)
模型组	模型组	3/10(+)，5/10(+++)
			地塞米松长期使用组	DS28	1/9(+)，1/9(++)，1/9(+++)
地塞米松短期使用组	DS3	6/9(+)，1/9(++)
			CFC∶CFS＝4∶1	CFX4	2/11(+)，3/11(++)，1/11(+++)
CFC∶CFS＝2∶1	CFX2	1/11(+)，1/11(++)，2/11(+++)
			CFC∶CFS＝1∶1	CFX	3/11(+)
CFC∶CFS＝1∶4	CFX0	2/11(+)，1/11(++)，2/11(+++)
			CFC∶CFS＝1∶2	CFX1	4/9(+)，2/9(++)

注：1.表中的CFC即冬虫夏草发酵物，CFS即隐孔菌发酵物；2.纤维化程度及死亡率结果提示：CFX组，即发酵冬虫夏草菌粉和发酵隐孔菌粉的重量百分比为1∶1，是一个疗效比较好的配伍组。

Claims (11)

1.一种组合物，其特征在于所述的组合物质量组成如下：

冬虫夏草20～80％

隐孔菌20～80％。

2.一种组合物，其特征在于所述的药物组合物质量组成如下：

冬虫夏草菌发酵培养物20～80％

隐孔菌发酵培养物20～80％。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于所述的冬虫夏草菌发酵培养物为下列之一或下列两者的任意组合：(1)冬虫夏草菌发酵菌丝体；(2)冬虫夏草菌发酵液。

4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于所述的隐孔菌发酵培养物为下列之一或下列两者的任意组合：(1)隐孔菌发酵菌丝体；(2)隐孔菌发酵液。

5.如权利要求2～4之一所述的组合物，其特征在于所述的发酵培养物制成粉末。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于所述的药物组合物质量组成如下：

发酵冬虫夏草粉末20～80％

发酵隐孔菌粉末20～80％。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于所述的药物组合物质量组成如下：

发酵冬虫夏草粉末50％

发酵隐孔菌粉末50％。

8.如权利要求1或2所述的组合物在制备预防和治疗组织纤维化药物中的应用。

9.如权利要求8所述的组合物在制备预防和治疗组织纤维化药物中的应用，其特征在于所述的预防和治疗组织纤维化药物应用于治疗博莱霉素所致肺纤维化。

10.如权利要求8所述的组合物在制备预防和治疗组织纤维化药物中的应用，其特征在于所述的预防和治疗组织纤维化药物应用于治疗高血压引起的心血管组织纤维化。

11.如权利要求8所述的组合物在制备预防和治疗组织纤维化药物中的应用，其特征在于所述组合物每日有效给药剂量为：0.1～60g/kg受体体重。

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