CN109321475A - 一种冬虫夏草菌丝体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：(1)接种培养；(2)种子罐培养；(3)发酵罐培养；(4)离心；(5)超低温真空干燥。本发明一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，工艺简单，易于实现，培养周期短，并且通过对培养基的成分进行筛选优化，得到的冬虫夏草菌丝体活性成分含量高，具有极高的营养价值。
Description
技术领域
本发明涉及食品科学技术领域，具体涉及一种冬虫夏草菌丝体的制备方法。
背景技术
冬虫夏草属真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科的虫草属。具益精气、补虚损、止咳化痰功效。有免疫调节、抗肿瘤、升白细胞、降血压、抗衰老、抗疲劳、调节内分泌、抑菌、抗病毒等多种药理作用，自古以来被视为珍贵的滋补强壮中药材。它是由麦角菌科虫草属的冬虫夏草真菌即蝙蝠蛾被毛孢寄生于高山草甸土中的蝙蝠蛾幼虫，使幼虫僵化，在适宜条件下，夏季由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成(即冬虫夏草真菌的子实体与僵虫菌丝核(幼虫尸体)构成的复合体)。它主要产于我国青海、西藏、四川、云南、甘肃等省区海拔3500-5000m的高寒地带和雪山草原。现代研究表明，人工虫草菌丝体与天然冬虫夏草具有相似的化学成分、药理作用和临床疗效，且毒性比天然小，这为人工培养虫草菌丝体代替天然冬虫夏草提供了依据。
蝙蝠蛾被毛孢，是从新鲜“冬虫夏草”中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草的蝙蝠蛾被毛孢菌种，该菌种经中华人民共和国卫生部批准列入了“可用于保健食品的真菌菌种名单”，是天然“冬虫夏草”人工替代品，具有“补肺益肾，止血化痰功能。用于久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛”。现代医学发现，还具有镇静、抗惊厥、降压、改善心肌缺血、抗衰老、提高免疫力、双向调节人体内分泌、抗排异和抗肺癌、淋巴癌、肝癌的作用，其药用价值越来越引起国内外药学界的重视。目前市场上含有蝙蝠蛾被毛孢菌粉的药品有百令胶囊、百令片、百令颗粒、百令咀嚼片。含有蝙蝠蛾被毛孢菌粉的保健食品有蝙蝠蛾被毛孢菌粉、蝙蝠蛾被毛孢菌丝胶囊等。现有技术中冬虫夏草菌丝体的培养周期长，冬虫夏草菌丝体的质量参差不齐，活性成分含量偏低，不具备天然虫草的功效。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，培养周期短，得到的冬虫夏草菌丝体活性成分含量高，具有极高的营养价值。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养；
(2)种子罐培养；
(3)发酵罐培养；
(4)离心；
(5)超低温真空干燥。
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入800-1200mL锥形瓶培养基，在120-125℃灭菌20-30分钟，冷却至20-30℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在18-25℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为30-35wt％，摇床转速为150-180转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基80-120L，在120-125℃灭菌20-30分钟，冷却至20-30℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为18-25℃，搅拌速度为160-200转/分条件下培养8-12天，发酵过程中罐压0.04-0.06MPa，无菌空气的通气量为(0.5-1)vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1000-1300L，在120-125℃灭菌20-30分钟，冷却至20-30℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为18-25℃，搅拌速度为160-200转/分条件下培养8-12天，发酵过程中罐压0.04-0.06MPa，无菌空气的通气量为(0.5-1)vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在3000-5000转/分离心20-30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.01-0.03MPa，温度为30-40℃干燥至恒重，粉碎，过60-100目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述无菌空气的通气量为每分钟内通过单位体积培养基的无菌空气的体积，如：发酵罐内培养基的体积为3m3，每分钟通入1.5m3的无菌空气，则通气比为3:1.5＝1：0.5，通气量为0.5vvm。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁4-8份、营养粉2-6份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.1-0.5份、磷酸二氢钾0.02-0.08份、硫酸镁0.02-0.06份、麦饭石水120-180份。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁4-8份、营养粉2-6份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.1-0.5份、磷酸二氢钾0.02-0.08份、硫酸镁0.02-0.06份、苦参提取液0.5-1份、麦饭石水120-180份。
所述营养粉为猴头菇提取物和/或鸡蛋蛋白粉。
优选地，所述营养粉为猴头菇提取物和鸡蛋蛋白粉的混合物，其中所述猴头菇提取物和鸡蛋蛋白粉的质量比为(1-5)：(1-5)。
所述猴头菇提取物由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将猴头菇在40-60℃干燥至恒重，粉碎，过60-100目筛，得到猴头菇粉，将5-10份猴头菇粉和100-150份水混合，以100-300转/分搅拌5-10分钟，再加入0.02-0.06份酸性蛋白酶和0.05-0.1份纤维素酶，用质量分数为10％的盐酸调节pH为3.5-4.5，再在35-45℃以100-300转/分搅拌1-3小时，得到酶解液，将酶解液在90-100℃保温5-10分钟，然后以3000-5000转/分离心10-20分钟，上清液减压浓缩至40℃的密度为1.08-1.12g/mL，再喷雾干燥，得到猴头菇提取物。
所述马铃薯汁由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将马铃薯去皮，去芽眼，用破碎机破碎后得到马铃薯渣，将8-12份马铃薯渣和30-50份水混合，在90-100℃保温40-60分钟，采用200-300目滤布过滤，得到马铃薯汁。
所述麦饭石水由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将1份麦饭石和20-40份水混合，在20-30℃静置20-30分钟，再超声处理10-20分钟，采用800目滤布过滤，滤液为麦饭石水，所述超声处理的条件为：超声温度40-60℃、超声频率25-35KHz，超声功率100-150W。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过20-50目筛，得到苦参粉，将5-10份苦参粉和60-100份水混合，加入0.01-0.1份的混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为5.5-6.5，在40-50℃以100-300转/分搅拌1-3小时，得到酶解液；
(2)酶解液在85-95℃回流提取60-90分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入40-80份水，在85-95℃回流提取40-60分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，减压浓缩至50℃的密度为1.08-1.12g/mL，得到苦参提取液。
所述混合酶为70-80wt％的纤维素酶和20-30wt％α-淀粉酶的混合物。
本发明一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，工艺简单，易于实现，培养周期短，并且通过对培养基的成分进行筛选优化，得到的冬虫夏草菌丝体活性成分含量高，具有极高的营养价值。
具体实施方式
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
α-淀粉酶，武汉佰兴生物科技有限公司提供，酶活5万U/g。
纤维素酶，武汉佰兴生物科技有限公司提供，酶活5万U/g。
酸性蛋白酶，南宁东恒华道生物科技有限公司提供，酶活5万U/g
麦饭石，采用温县鸿宇活性炭厂提供的的麦饭石，粒径100目。
苦参，豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根。亳州百川药业有限公司提供，产地：吉林。
葡萄糖，采用湖南万顺心生物科技有限公司提供的食品级葡萄糖。
蛋白胨，郑州市伟丰生物科技有限公司提供。
磷酸二氢钾，廊坊鹏彩精细化工有限公司提供，医药级。
硫酸镁，廊坊鹏彩精细化工有限公司提供的七水硫酸镁，医药级。
猴头菇，真菌类担子菌纲多孔菌目齿菌科猴头菌Hericium erinaceus
(Bull.ex Fr.)Pers.的子实体。西畴县香光药材有限公司提供，产地：云南。
鸡蛋蛋白粉，武汉佰兴生物技术有限公司提供的鸡蛋蛋白粉。
蝙蝠蛾被毛孢菌种，购买自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种编号：14017。
破碎机，采用靖江市特威机械设备厂生产的水果破碎机，型号PS，破碎粒度为5-8mm。
虫草素和腺苷含量测定：参照郭涛、张龙等《不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定》进行测试。
虫草多糖和虫草酸含量测定：参照朱明伟、温鲁等《不同培养液对蛹虫草多糖及虫草酸含量的影响》进行测试。
实施例1
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、麦饭石水150份。
所述营养粉为鸡蛋蛋白粉。
所述马铃薯汁由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将马铃薯去皮，去芽眼，用破碎机破碎后得到马铃薯渣，将10份马铃薯渣和40份水混合，在95℃保温50分钟，采用300目滤布过滤，得到马铃薯汁。
所述麦饭石水由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将1份麦饭石和30份水混合，在25℃静置25分钟，再超声处理15分钟，采用800目滤布过滤，滤液为麦饭石水，所述超声处理的条件为：超声温度50℃、超声频率30KHz，超声功率120W。
对比例1
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、水150份。
所述营养粉为鸡蛋蛋白粉。
所述马铃薯汁由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将马铃薯去皮，去芽眼，用破碎机破碎后得到马铃薯渣，将10份马铃薯渣和40份水混合，在95℃保温50分钟，采用300目滤布过滤，得到马铃薯汁。
实施例2
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、苦参提取液0.6份、麦饭石水150份。
所述营养粉为鸡蛋蛋白粉。
所述马铃薯汁的制备方法同实施例1。
所述麦饭石水的制备方法同实施例1。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过40目筛，得到苦参粉，将8份苦参粉和80份水混合，加入0.05份的混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为6.0，在45℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液；
(2)酶解液在90℃回流提取80分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入60份水，在90℃回流提取50分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，在绝对压强为0.02MPa、温度为50℃减压浓缩至50℃的密度为1.10g/mL，得到苦参提取液。
所述混合酶为75wt％的纤维素酶和25wt％α-淀粉酶的混合物。
实施例3
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、苦参提取液0.6份、麦饭石水150份。
所述营养粉为鸡蛋蛋白粉。
所述马铃薯汁的制备方法同实施例1。
所述麦饭石水的制备方法同实施例1。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：将苦参粉碎，过40目筛，得到苦参粉，将8份苦参粉和80份水混合，在90℃回流提取80分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入60份水，在90℃回流提取50分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，在绝对压强为0.02MPa、温度为50℃减压浓缩至50℃的密度为1.10g/mL，得到苦参提取液。
实施例4
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、苦参提取液0.6份、麦饭石水150份。
所述营养粉为鸡蛋蛋白粉。
所述马铃薯汁的制备方法同实施例1。
所述麦饭石水的制备方法同实施例1。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过40目筛，得到苦参粉，将8份苦参粉和80份水混合，加入0.05份的纤维素酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为6.0，在45℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液；
(2)酶解液在90℃回流提取80分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入60份水，在90℃回流提取50分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，在绝对压强为0.02MPa、温度为50℃减压浓缩至50℃的密度为1.10g/mL，得到苦参提取液。
实施例5
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、苦参提取液0.6份、麦饭石水150份。
所述营养粉为鸡蛋蛋白粉。
所述马铃薯汁的制备方法同实施例1。
所述麦饭石水的制备方法同实施例1。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过40目筛，得到苦参粉，将8份苦参粉和80份水混合，加入0.05份的α-淀粉酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为6.0，在45℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液；
(2)酶解液在90℃回流提取80分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入60份水，在90℃回流提取50分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，在绝对压强为0.02MPa、温度为50℃减压浓缩至50℃的密度为1.10g/mL，得到苦参提取液。
实施例6
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、苦参提取液0.6份、麦饭石水150份。
所述营养粉为猴头菇提取物。
所述猴头菇提取物由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将猴头菇在50℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到猴头菇粉，将8份猴头菇粉和120份水混合，以200转/分搅拌8分钟，再加入0.04份酸性蛋白酶和0.06份纤维素酶，用质量分数为10％的盐酸调节pH为4.0，再在40℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液，将酶解液在95℃保温6分钟，然后以4000转/分离心20分钟，上清液在绝对压强为0.02MPa、温度为40℃减压浓缩至40℃的密度为1.10g/mL，再喷雾干燥，得到猴头菇提取物，所述喷雾干燥的条件为：进风温度为170℃，出风温度为90℃。
所述马铃薯汁由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将马铃薯去皮，去芽眼，用破碎机破碎后得到马铃薯渣，将10份马铃薯渣和40份水混合，在95℃保温50分钟，采用300目滤布过滤，得到马铃薯汁。
所述麦饭石水由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将1份麦饭石和30份水混合，在25℃静置25分钟，再超声处理15分钟，采用800目滤布过滤，滤液为麦饭石水，所述超声处理的条件为：超声温度50℃、超声频率30KHz，超声功率120W。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过40目筛，得到苦参粉，将8份苦参粉和80份水混合，加入0.05份的混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为6.0，在45℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液；
(2)酶解液在90℃回流提取80分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入60份水，在90℃回流提取50分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，在绝对压强为0.02MPa、温度为50℃减压浓缩至50℃的密度为1.10g/mL，得到苦参提取液。
所述混合酶为75wt％的纤维素酶和25wt％α-淀粉酶的混合物。
得到的冬虫夏草菌丝体的活性成分含量测试结果：虫草多糖65.35mg/g，虫草酸163.21，虫草素7.36mg/g，腺苷10.17mg/g。
实施例7
一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入1000mL锥形瓶培养基，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在20℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为32wt％，摇床转速为160转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基100L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1200L，在121℃灭菌30分钟，冷却至25℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为20℃，搅拌速度为180转/分条件下培养10天，发酵过程中罐压0.05MPa，无菌空气的通气量为0.6vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在4000转/分离心30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.02MPa，温度为35℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁6份、营养粉4份、葡萄糖2份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾0.06份、硫酸镁0.04份、苦参提取液0.6份、麦饭石水150份。
所述营养粉为猴头菇提取物和鸡蛋蛋白粉的混合物，其中所述猴头菇提取物和鸡蛋蛋白粉的质量比为3：1。
所述猴头菇提取物由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将猴头菇在50℃干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得到猴头菇粉，将8份猴头菇粉和120份水混合，以200转/分搅拌8分钟，再加入0.04份酸性蛋白酶和0.06份纤维素酶，用质量分数为10％的盐酸调节pH为4.0，再在40℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液，将酶解液在95℃保温6分钟，然后以4000转/分离心20分钟，上清液在绝对压强为0.02MPa、温度为40℃减压浓缩至40℃的密度为1.10g/mL，再喷雾干燥，得到猴头菇提取物，所述喷雾干燥的条件为：进风温度为170℃，出风温度为90℃。
所述马铃薯汁由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将马铃薯去皮，去芽眼，用破碎机破碎后得到马铃薯渣，将10份马铃薯渣和40份水混合，在95℃保温50分钟，采用300目滤布过滤，得到马铃薯汁。
所述麦饭石水由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将1份麦饭石和30份水混合，在25℃静置25分钟，再超声处理15分钟，采用800目滤布过滤，滤液为麦饭石水，所述超声处理的条件为：超声温度50℃、超声频率30KHz，超声功率120W。
所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过40目筛，得到苦参粉，将8份苦参粉和80份水混合，加入0.05份的混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为6.0，在45℃以200转/分搅拌2小时，得到酶解液；
(2)酶解液在90℃回流提取80分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入60份水，在90℃回流提取50分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，在绝对压强为0.02MPa、温度为50℃减压浓缩至50℃的密度为1.10g/mL，得到苦参提取液。
所述混合酶为75wt％的纤维素酶和25wt％α-淀粉酶的混合物。
得到的冬虫夏草菌丝体的活性成分含量测试结果：虫草多糖79.45mg/g，虫草酸186.64，虫草素8.41mg/g，腺苷12.36mg/g。
测试例1
对实施例得到的冬虫夏草菌丝体中虫草多糖和虫草酸含量进行测试，具体测试结果见表1。
表1冬虫夏草菌丝体虫草多糖和虫草酸含量测试结果表
| 虫草多糖，mg/g | 虫草酸，mg/g | |
| 实施例1 | 48.52 | 141.72 |
| 对比例1 | 35.64 | 117.35 |
| 实施例2 | 63.74 | 165.84 |
| 实施例3 | 52.26 | 148.47 |
| 实施例4 | 56.76 | 154.56 |
| 实施例5 | 54.82 | 151.63 |
测试例2
对实施例得到的冬虫夏草菌丝体中虫草素和腺苷含量进行测试，具体测试结果见表2。
表2冬虫夏草菌丝体虫草素和腺苷含量测试结果表
| 虫草素，mg/g | 腺苷，mg/g | |
| 实施例1 | 6.25 | 8.27 |
| 对比例1 | 4.82 | 7.11 |
| 实施例2 | 7.28 | 9.96 |
| 实施例3 | 6.47 | 8.74 |
| 实施例4 | 6.73 | 9.01 |
| 实施例5 | 6.58 | 8.92 |
实施例1采用麦饭石水，含有多种微量元素，可显著促进冬虫夏草菌丝体的生长，提高各种有益成分的含量。实施例2中添加了苦参提取物，并对苦参提取物的提取方法进行筛选，优选出最佳提取方法，得到的苦参提取物可显著提升冬虫夏草菌丝体中各种有益成分的含量。比较实施例2与实施例3-5，发现采用淀粉酶和纤维素酶具有较好的协同作用。这可能是因为苦参中含有较多淀粉，阻碍有效成分的溶出，淀粉的酶解使纤维素的酶解阻碍程度降低，提高酶解效率。
Claims (9)
1.一种冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种培养；
(2)种子罐培养；
(3)发酵罐培养；
(4)离心；
(5)超低温真空干燥。
2.如权利要求1所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)接种培养：将2000mL锥形瓶装入800-1200mL锥形瓶培养基，在120-125℃灭菌20-30分钟，冷却至20-30℃，在无菌条件下接种蝙蝠蛾被毛孢菌种，在18-25℃恒温摇床上培养至菌丝浓度为30-35wt％，摇床转速为150-180转/分，得到锥形瓶液体菌种培养液；
(2)种子罐培养：在200L发酵罐中装入种子罐培养基80-120L，在120-125℃灭菌20-30分钟，冷却至20-30℃，将锥形瓶液体菌种培养液加入发酵罐中，在温度为18-25℃，搅拌速度为160-200转/分条件下培养8-12天，发酵过程中罐压0.04-0.06MPa，无菌空气的通气量为(0.5-1)vvm，得到种子罐培养液；
(3)发酵罐培养：在2000L的发酵罐中装入发酵罐培养基1000-1300L，在120-125℃灭菌20-30分钟，冷却至20-30℃，将种子罐培养液加入发酵罐中，在温度为18-25℃，搅拌速度为160-200转/分条件下培养8-12天，发酵过程中罐压0.04-0.06MPa，无菌空气的通气量为(0.5-1)vvm，得到发酵罐培养液；
(4)离心：将发酵罐培养液在3000-5000转/分离心20-30分钟，弃上清液，得到沉淀物；
(5)超低温真空干燥：将沉淀物在绝对压强为0.01-0.03MPa，温度为30-40℃干燥至恒重，粉碎，过60-100目筛，得到冬虫夏草菌丝体。
3.如权利要求2所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁4-8份、营养粉2-6份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.1-0.5份、磷酸二氢钾0.02-0.08份、硫酸镁0.02-0.06份、麦饭石水120-180份。
4.如权利要求2所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述锥形瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均由下述重量份的原料混合得到：马铃薯汁4-8份、营养粉2-6份、葡萄糖1-3份、蛋白胨0.1-0.5份、磷酸二氢钾0.02-0.08份、硫酸镁0.02-0.06份、苦参提取液0.5-1份、麦饭石水120-180份。
5.如权利要求3或4所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述营养粉为猴头菇提取物和/或鸡蛋蛋白粉。
6.如权利要求5所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述猴头菇提取物由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将猴头菇在40-60℃干燥至恒重，粉碎，过60-100目筛，得到猴头菇粉，将5-10份猴头菇粉和100-150份水混合，以100-300转/分搅拌5-10分钟，再加入0.02-0.06份酸性蛋白酶和0.05-0.1份纤维素酶，用质量分数为10％的盐酸调节pH为3.5-4.5，再在35-45℃以100-300转/分搅拌1-3小时，得到酶解液，将酶解液在90-100℃保温5-10分钟，然后以3000-5000转/分离心10-20分钟，上清液减压浓缩至40℃的密度为1.08-1.12g/mL，再喷雾干燥，得到猴头菇提取物。
7.如权利要求3或4所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述麦饭石水由下述方法制备得到，所述份均为重量份：将1份麦饭石和20-40份水混合，在20-30℃静置20-30分钟，再超声处理10-20分钟，采用800目滤布过滤，滤液为麦饭石水，所述超声处理的条件为：超声温度40-60℃、超声频率25-35KHz，超声功率100-150W。
8.如权利要求4所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述苦参提取液的制备方法包括以下步骤，所述份均为重量份：
(1)将苦参粉碎，过20-50目筛，得到苦参粉，将5-10份苦参粉和60-100份水混合，加入0.01-0.1份的混合酶，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH为5.5-6.5，在40-50℃以100-300转/分搅拌1-3小时，得到酶解液；
(2)酶解液在85-95℃回流提取60-90分钟，采用300目滤布过滤，得滤液和滤渣，滤渣中加入40-80份水，在85-95℃回流提取40-60分钟，采用300目滤布过滤，合并两次滤液，减压浓缩至50℃的密度为1.08-1.12g/mL，得到苦参提取液。
9.如权利要求8所述的冬虫夏草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述混合酶为70-80wt％的纤维素酶和20-30wt％α-淀粉酶的混合物。
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