CN105087426A - 一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，以菌剂工业化液体发酵和固体发酵两套发酵系统为平台，建立从种子液培养，菌体的液体—固体复合发酵，发酵物的干燥与粉碎，包装的产品生产工艺流程，提出了溶解颤藻蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵生产的系统解决方案，并形成了相关菌剂产品。该方法既保留了液体发酵方式的高效和高纯度的特点，又兼顾了固体发酵方式的低成本效应，降低了菌剂的生产成本。同时，还保证未因工业化的规模生产使其溶藻特性和其他生态特性受到影响，菌剂产品可用于养殖池塘防控蓝藻水华使用。

Description

一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法

技术领域

本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法。

背景技术

随着水产养殖业迅猛发展，养殖水体富营养化日益加剧，导致蓝藻大量繁殖，蓝藻水华高频率爆发(曹煜成等，2007)。蓝藻会大量耗氧且能释放蓝藻毒素，败坏水质，造成水生动物中毒死亡，对水环境和养殖效益造成巨大影响(彭聪聪等，2011)。有研究表明，利用溶藻菌可特异性地抑制有害微藻，达到优化水体微藻群落的效果(王祥荣等，2010)。当前该领域的研究热点还主要为针对海洋赤潮和湖沼水华的有害微藻种类的特性与治理等方面，YANG等筛选了溶解赤潮中肋骨条藻(Skeletonemaostatum)的溶藻菌SK-5(YANGetal,2013)，THEERASAK等筛选了杀灭引起蓝藻水华的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的放线菌(THEERASAKetal,2013)，但有关运用溶藻菌抑制池塘水体有害微藻的研究少见报道(TEEYAPORNetal,2012)。

池塘环境与开放性水体的环境差异巨大，在微藻优势种群结构、水体营养水平、人工技术措施等方面的差别致使针对开放性水域的相关研究无法直接借鉴到养殖生产应用中。对此，曹煜成等选用筛得的一株池塘蓝藻溶藻菌—蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CZBC1(曹煜成等，ZL201310203745.3)，蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，广泛存在于环境中，目前已被应用于医药、农业生产等领域(李煜等，2012；李侠等，2001)。阳钢等通过向水体泼洒蜡样芽孢杆菌BC-1有效提高了刺参的生长速度(阳钢，2012)，何鉴尧等筛得两株蜡样芽孢杆菌L7和L8对螺旋鞘丝藻均有显著地控制效果(何鉴尧，2008)。曹煜成等筛得的蜡样芽孢杆菌CZBC1经实验室生态学试验证实，其具有适应广温、广盐、耐高pH和低耗氧的特性，可以通过直接或间接机制溶解浮游颤藻、绿色颤藻、小颤藻等有害蓝藻，具有良好的颤藻溶解专一性，对其他优良绿藻和硅藻等无溶解效应，并且对养殖对虾也无不良影响，适宜池塘水产养殖生产应用(曹煜成，2014)。

目前针对蜡样芽孢杆菌CZBC1菌剂的工业化液体—固体复合发酵生产方法还未见报道。虽然有学者就蜡样芽孢杆菌发酵工艺、溶藻菌发酵条件优化等进行过报道(王海云等，一株蜡样芽胞杆菌及其制备方法、应用，申请号201410223612.7；朱杰等，芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，申请号201210308126.6；孙梅等，一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用，申请号201310413693.2；荣小军等，一种蜡样芽孢杆菌及其制剂和应用，申请号201010602326.3；叶姜瑜等，响应曲面法优化溶藻细菌发酵条件的研究，2011；许珂等，溶藻细菌W5培养条件优化及发酵培养)，但其中研究的溶藻菌并非上述蜡样芽孢杆菌，并且蜡样芽孢杆菌也不是所有菌株都具有溶藻特性的，加之有不少有关溶藻菌发酵研究的报道多为研究性质，仍未达到菌剂的工业化发酵生产的需求，也未见相关菌剂的工业化生产产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，该方法确实了液体发酵和固体发酵的工艺参数，一方面保证该方法可满足蜡样芽孢杆菌制剂产品的工业化液体—固体发酵生产需求，另一方面保证形成的蜡样芽孢杆菌制剂产品并未因工业化和规模化的生产致使其溶藻特性和生长特性受到影响，仍具有良好的颤藻溶解专一性，对优良绿藻和硅藻无溶解效应，对养殖对虾也无不良影响，菌剂产品可用于养殖生产应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，包括以下步骤：

(1)确定蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基和固体发酵的固体培养基；

(2)菌种活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养；

(3)扩大培养：将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行扩大培养，得种子液；

(4)液体发酵：将种子液接种到装有步骤(1)中确定的液体培养基中进行液体发酵培养至芽孢数量达到10¹⁰个/mL以上，得液体发酵后的种子液；

(5)固体发酵：将步骤(4)获得的液体发酵后的种子液接种至步骤(1)中确定的固体培养基中进行固体发酵培养至芽孢数量达到10⁹个/g以上，且芽孢获得率达到90％以上，得固体发酵物；

(6)干燥、粉碎和包装：将步骤(5)获得的固体发酵物经包括干燥、粉碎和包装工序处理后，即制得溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂。

在上述溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法中：

步骤(1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基为在1L水中包括葡萄糖8～10g、玉米淀粉8～10g、酵母膏12～15g、氯化钠4～7g，pH为7.2～7.5。

步骤(1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBC1固体发酵的固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮58～70、豆粕18～25、玉米淀粉2.3～3.5、葡萄糖0.8～1.0、酵母粉1.2～1.5、磷酸二氢钾0.15～0.25、硫酸镁0.04～0.06、碳酸钙1.5～2.0，pH为7.2～7.8。

步骤(2)中将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养时，培养基为营养肉汤固体培养基，营养肉汤固体培养基的pH为6.50～7.20，28～30℃活化培养18～24h。

步骤(3)中将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行扩大培养时，培养基为营养肉汤液体培养基，营养肉汤液体培养基的pH值为6.50～7.20，28～30℃恒温振荡培养18～24h，转速为180～230rpm。

步骤(4)中液体发酵培养时间为18～28h，温度28～30℃。

进一步的：步骤(4)中液体发酵包括：采用500L的发酵罐系统进行液体发酵，以发酵罐容积60～65％的装液量在配料池中配置液体培养基，开启锅炉对发酵罐及管路进行灭菌操作(121℃，20min)，再冷却至接种温度，将实验室显微镜检查合格的摇瓶种子液，接种到500L的发酵罐培养18～28h，取样进行实验室显微镜检查，确认菌种未受杂菌污染，且数量达到10¹⁰cfu/mL以上，将发酵好的种子液注入与处理好的固体发酵培养基充分混合均匀。

步骤(5)中固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数为：充压2.5～3.5min，谷压0.03～0.04MPa，维持9～11min，峰压0.25～0.30MPa维持19～21min，发酵时间为26～30h，发酵温度为28～30℃。

进一步的，步骤(5)中固体发酵包括：配置2吨固体发酵培养基，固体培养基经搅拌机充分搅拌均匀后，以传送带送入蒸煮罐121℃高温蒸煮消毒30min，待冷却至室温后将经液体发酵的种子液接入其中，通过传送带分装至各发酵盘上，分装的厚度控制在30～65cm左右，然后将发酵盘置于20吨的压力脉动式固体反应器进行发酵，发酵过程中以鼓风控温方式，将发酵温度保持与28～30℃左右，压力脉动发酵的参数为：充压3min，谷压0.03MPa，维持10min，峰压0.25MPa维持20min。持续稳定发酵26～30h，取样检查，保证发酵物中的菌种纯化，芽孢数量达到10⁹个/g以上，芽孢获得率达到90％以上。

步骤(6)中干燥采用流化床干燥，将固体发酵物置于流化床65～70℃烘干至水分10％以下。

步骤(6)中粉碎时粉碎机的孔径为60～100目。

步骤(6)中包装采用防潮铝箔袋进行真空密封包装。

本发明最好对制成的蜡样芽孢杆菌制剂进行质量抽检，产品质量抽检包括：从最终形成的真空包装的溶藻蜡样芽孢杆菌制剂产品中，按1％左右的比例抽取样品检测产品的纯度、芽孢形态与数量。并在实验室测试菌体于水体环境的复活情况，以及对养殖水体中颤藻等有害蓝藻的溶藻效果。确保菌株未因工业化的生产流程影响其生长性能和溶藻特性。抽检结果显示：菌剂产品菌量达到10⁹个/g以上，置于颤藻水体中能有效杀灭和抑制颤藻生长，5～7d内使藻数量至少降低30％以上。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明方法实现了对优选水产养殖池塘蓝藻溶藻菌——蜡样芽孢杆菌CZBC1的工业化液体—固体复合发酵生产，建立了本菌剂从菌种到产品的工业化规模生产的相关工艺；

(2)本发明方法实行液体—固体复合发酵培养，针对生产过程各个阶段实行多层次抽样监测，严格控制产品在每个生产系统的质量，确保菌剂的纯度；

(3)本发明方法通过利用液体—固体复合发酵的方法，既保留了液体发酵方式的高效和高纯度的特点，又兼顾了固体发酵方式的低成本效应，降低了菌剂的生产成本，同时，还保证未因工业化的规模生产使其溶藻特性丢失或发生改变，菌剂产品可用于池塘养殖生产应用，可见，本发明非常适宜工业化的规模生产应用。

附图说明

图1是实施例2中制备的蜡样芽孢杆菌制剂产品干燥包装前的散装粉剂；

图2实施例5中山养殖场未使用本发明菌剂前对虾养殖池塘边的蓝藻水华；

图3是实施例5中山养殖场同一池塘首次使用本发明菌剂3天后对虾养殖池塘蓝藻明显减少，蓝藻数量减少50％～60％以上；

图4是实施例5中山养殖场同一池塘首次用菌5天后再次使用菌剂，二次用菌第4天池塘水体中蓝藻水华完全消失，形成绿藻藻相的水色；

图5是实施例5中茂名电白养殖场未使用本发明菌剂的对虾养殖池塘的蓝藻水华；

图6是实施例5中茂名电白养殖场同一地点使用本发明菌剂的对虾养殖池塘的无蓝藻水华出现，水体形成以硅藻为优势的微藻藻相结构。

具体实施方式

以下实施例用于阐明与实施本发明，属于发明的保护范围，本技术领域的普通技术人员根据以上公开的内容均可实现本发明的目的。

实施例1

本实施例提供的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，包括以下步骤：

(一)确定蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基和固体发酵的固体培养基

利用50L的发酵罐系统平台研究确立后续菌剂工业化液体发酵工艺参数；用容积为0.9立方米的固体发酵盘系统研究确定工业化固体发酵工艺参数。以蜡样芽孢杆菌CZBC1的芽孢形成率和菌剂发酵产品的溶藻效率为核心指标建立和优化相关发酵参数。

其中蜡样芽孢杆菌CZBC1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2013130，具体可参阅申请号为201310203745.3中的专利中所述。

首先，利用单因素试验方法，在基础发酵培养基的基础上，选取不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米浆、玉米淀粉、麸皮、麸皮+糖蜜、可溶性淀粉+玉米浆)，不同的氮源(蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏、硫酸铵、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白+酵母膏)进行培养基优化。其次，在单因素试验的基础上，结合利用响应面试验设计方法，以蜡样芽孢杆菌CZBC1的芽孢形成率和菌剂发酵产品的溶藻效率为核心，选择四个条件(碳源、氮源、培养基pH、培养时间)作为主要因素，各因素分别取5个水平，试验共设计30个试验点，其中24个分析因子，6个中心点进行参数研究。

结果显示，在CZBC1的液体—固体复合发酵过程中的液体培养基配方为：在1L水中包括葡萄糖8～10g、玉米淀粉8～10g、酵母膏12～15g、氯化钠4～7g，pH为7.2～7.5。

固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮58～70、豆粕18～25、玉米淀粉2.3～3.5、葡萄糖0.8～1.0、酵母粉1.2～1.5、磷酸二氢钾0.15～0.25、硫酸镁0.04～0.06、碳酸钙1.5～2.0，pH为7.2～7.8。

当采用以上液体培养基和固体培养基发酵培养时，获得的发酵物中的芽孢数量达到10⁹个/g以上，芽孢获得率达95％以上，菌剂产品中的芽孢杆菌在池塘养殖水体中能有效存活，并且对颤藻的溶藻性能良好，以10⁴cfu/mL的用菌浓度即可在72～96h左右使密度为10⁶cells/mL的绿色颤藻数量减少50％以上。

(二)菌剂产品的工业化规模生产工艺

(1)试管培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种接种于装有营养肉汤固体培养基的试管中，培养基pH6.50～7.20，28～30℃温度活化培养18～24h。

(2)摇瓶种子液培养：将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1接种到装有营养肉汤液体培养基的种子罐中，pH6.50～7.20，200rpm，28～30℃恒温振荡培养18～24h。

(3)液体发酵：采用500L的发酵罐系统进行液体发酵，以发酵罐容积60～65％的装液量在配料池中配置液体发酵用液体培养基。液体培养基配方如步骤(一)中所示，开启锅炉对发酵罐及管路进行灭菌操作(121℃，20min)，再冷却至接种温度。将实验室显微镜检查合格的摇瓶种子液，接种到500L的发酵罐培养18～28h，取样进行实验室显微镜检查，确认菌种未受杂菌污染，且数量达到10¹⁰cfu/mL以上，将发酵好的种子液注入与处理好的固体发酵培养基充分混合均匀。

(4)固体发酵：按步骤(一)中确定的固体发酵培养基配方配置2吨的固体发酵培养基。培养基经搅拌机充分搅拌均匀后，以传送带送入蒸煮罐121℃高温蒸煮消毒30min，待冷却至室温25～30℃后将经液体发酵的种子液接入其中，通过传送带分装至各发酵盘上，分装的厚度控制在30～65cm左右，然后将发酵盘置于20吨的压力脉动式固体反应器进行发酵。发酵过程中以鼓风控温方式，将发酵温度保持与28～30℃左右，压力脉动发酵的参数为：充压3min，谷压0.03MPa，维持10min，峰压0.25MPa维持20min。持续稳定发酵26-30h。取样检查，保证发酵物中的菌种纯化，芽孢数量达到10⁹个/g以上，芽孢获得率达到90％以上。

(5)干燥与粉碎包装：发酵好的固体发酵物置于流化床65～70℃烘干至水分10％以下。然后将干燥的菌剂初制品置于粉碎机进行粉碎，粉碎机孔径参数设为60～100目，充分粉碎的芽孢杆菌粉剂经复配稀释(复配稀释是根据市场或客户对产品菌含量的需求，将菌剂与经粉碎的植物性载体或矿物性载体进行复配混合)，以防潮铝箔袋进行真空密封包装，保证包装内产品保持干燥(如图1中所示)，芽孢数量10⁹个/g以上。

(6)产品质量抽检：从最终形成的真空包装的溶藻蜡样芽孢杆菌制剂产品中，按1％左右的比例抽取样品检测产品的纯度、芽孢形态与数量。并在实验室测试菌体于水体环境的复活情况，以及对养殖水体中颤藻等有害蓝藻的溶藻效果。确保菌株未因工业化的生产流程影响其生长性能和溶藻特性。抽检结果显示：菌剂产品菌量达到10⁹个/g以上，置于颤藻水体中能有效杀灭和抑制颤藻生长，5～7d内使藻数量至少降低30％以上。

实施例2

本实施例提供的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，包括以下步骤：

本实施例在广州市花都区中国水产科学研究院南海水产研究所花都微生物工业发酵实验工厂和广州市欣海利生生物科技有限公司进行了生产应用。发酵系统采用了500L的液体发酵系统，以及多个容积0.9立方米发酵盘并联的固体发酵系统。

首先在实验室制作好CZBC1菌种的种子液。该种子液的制备方法同实施例1，以500L的发酵罐进行液体发酵，按罐体容积60％的装液比例在配料池中配置培养基。培养基配方为在1L水中含有葡萄糖10g、玉米淀粉10g、酵母膏15g、氯化钠5g，培养基的初始pH调节至7.2。开启锅炉对发酵罐及管路进行灭菌操作(121℃，20min)，再冷却至接种温度25～30℃。将实验室显微镜检查合格的摇瓶种子液，接种到500L的发酵罐培养28h，取样进行实验室显微镜检查，确认菌种纯化和数量合格后，将种子液注入蒸煮罐，与处理好的固体发酵培养基充分混合均匀。

在进行液体发酵的过程，准备好固体发酵的固体培养基。固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮70、豆粕23、玉米淀粉3.0、葡萄糖1.0、酵母粉1.2、磷酸二氢钾0.2、硫酸镁0.05、碳酸钙2.0，pH为7.5，配置2吨的固体发酵培养基，配置过程中利用石灰水将培养基的初始pH调节至7.5。培养基经搅拌机充分搅拌均匀后，以传送带送入蒸煮罐，121℃高温蒸煮消毒30min。待冷却至室温后，将经液体发酵的种子液接入固体培养基，并通过传送带分装至各发酵盘上，分装的厚度控制在45cm左右，然后将发酵盘置于20吨的压力脉动式固体反应器进行发酵。发酵温度保持在30℃左右，压力脉动发酵的参数为充压3min，谷压0.03MPa，维持10min，峰压0.25MPa维持20min。持续稳定发酵30h。

发酵好的固体发酵物置于流化床65℃烘干至水分10％以下。然后将干燥的菌剂初制品置于粉碎机进行粉碎，粉碎机孔径为100目，充分粉碎的芽孢杆菌粉剂经复配稀释，以防潮铝箔袋进行真空密封包装。

随机取样检查，通过显微镜镜检发酵物中的菌种纯度和数量。结果显示，芽孢数量达到4.2×10⁹个/g，芽孢获得率达到90％以上。在实验室测试菌剂芽孢在池塘水体环境的复活情况，以及对养殖水体中绿色颤藻的溶藻效果。结果显示，菌体在灭菌池塘水体环境能复活生长，以甘露醇多粘菌素卵黄培养基平板法检测，蜡样芽孢杆菌至少可存活7d以上，并且可以有效抑制对虾养殖水体中绿色颤藻的生长，但对绿藻和硅藻等有益微藻无明显影响，在用菌第3～5期间颤藻数量降低60％以上，这表明CZBC1菌株的生长性能和溶藻特性未因工业化液体—固体发酵生产流程而受到影响。

实施例3

与实施例2不同的是，蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基为在1L水中包括葡萄糖8g、玉米淀粉10g、酵母膏12g、氯化钠7g，pH为7.5。

蜡样芽孢杆菌CZBC1固体发酵的固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮58、豆粕25、玉米淀粉2.3、葡萄糖1.0、酵母粉1.2、磷酸二氢钾0.25、硫酸镁0.04、碳酸钙2.0，pH为7.2。

固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数为：充压2.5min，谷压0.04MPa，维持9min，峰压0.30MPa维持19min，发酵时间为26h，发酵温度为28℃。

实施例4

与实施例2不同的是，蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基为在1L水中包括葡萄糖9g、玉米淀粉9g、酵母膏13g、氯化钠4g，pH为7.3。

蜡样芽孢杆菌CZBC1固体发酵的固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮65、豆粕18、玉米淀粉3.5、葡萄糖0.8、酵母粉1.5、磷酸二氢钾0.15、硫酸镁0.06、碳酸钙1.5，pH为7.2。

固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数为：充压3.5min，谷压0.035MPa，维持11min，峰压0.22MPa维持21min，发酵时间为28h，发酵温度为28～30℃。

实施例5

将实施例2方法制备的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂在养殖生产中应用，结果如下：

在广东省的江门市新会区睦州镇和三江镇、中山市民众镇义仓村、茂名市电白区海墩村的半集约化对虾养殖土池、汕尾市红海湾桥仔头村的集约化对虾养殖地膜池进行菌剂产品的应用。在不同地区的对虾养殖场均选择了多口标准化的养殖池塘，在常规对虾养殖技术措施的基础上，养殖全程每7d定期施用溶藻菌制剂，根据天气和水体环境变化实时调整溶藻菌制剂的用法用量。结果显示，溶藻菌制剂对优化养殖水体微藻藻相的效果明显，可有效抑制颤藻、微囊藻等有害蓝藻的生长，促进池塘水体形成以小球藻、栅藻、卵囊藻、角毛藻、小环藻等有益绿藻和硅藻为优势的藻相结构。

其中，茂名市电白区半集约化对虾养殖土池的溶藻菌制剂用菌池塘和对照池塘的微藻优势种情况如下表1所示。

表1溶藻菌CZBC1对对虾养殖池塘中的微藻优势种的影响单位:cell/L

用菌池T1、菌池T2和对照池C1均为茂名市电白区养殖场的半集约化对虾养殖土池。

中山市民众镇义仓村养殖场未使用本发明菌剂前对虾养殖池塘边的蓝藻水华如图2中所示，同一池塘首次使用本发明菌剂3天后对虾养殖池塘蓝藻情况如图3中所示，从图3中可以看出蓝藻明显减少，蓝藻数量减少50％～60％以上，同一池塘首次用菌5天后再次使用菌剂，二次用菌第4天池塘水体中蓝藻情况如图4中所示，从图中可以看出，蓝藻水华完全消失，形成绿藻藻相的水色。

茂名电白养殖场未使用本发明菌剂的对虾养殖池塘的蓝藻水华如图5中所示，同一地点使用本发明菌剂的对虾养殖池塘水体情况如图6中所示，从图6中可以看出，该池塘无蓝藻水华出现，水体形成以硅藻为优势的微藻藻相结构。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是包括以下步骤：

(1)确定蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基和固体发酵的固体培养基；

(2)菌种活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养；

(3)扩大培养：将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行扩大培养，得种子液；

(4)液体发酵：将种子液接种到装有步骤(1)中确定的液体培养基中进行液体发酵培养至芽孢数量达到10¹⁰个/mL以上，得液体发酵后的种子液；

(5)固体发酵：将步骤(4)获得的液体发酵后的种子液接种至步骤(1)中确定的固体培养基中进行固体发酵培养至芽孢数量达到10⁹个/g以上，且芽孢获得率达到90％以上，得固体发酵物；

(6)干燥、粉碎和包装：将步骤(5)获得的固体发酵物经包括干燥、粉碎和包装工序处理后，即制得溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂。

2.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基为在1L水中包括葡萄糖8～10g、玉米淀粉8～10g、酵母膏12～15g、氯化钠4～7g，pH为7.2～7.5。

3.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBC1固体发酵的固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮58～70、豆粕18～25、玉米淀粉2.3～3.5、葡萄糖0.8～1.0、酵母粉1.2～1.5、磷酸二氢钾0.15～0.25、硫酸镁0.04～0.06、碳酸钙1.5～2.0，pH为7.2～7.8。

4.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(2)中将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养时，培养基为营养肉汤固体培养基，营养肉汤固体培养基的pH为6.50～7.20，28～30℃活化培养18～24h。

5.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(3)中将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行扩大培养时，培养基为营养肉汤液体培养基，营养肉汤液体培养基的pH值为6.50～7.20，28～30℃恒温振荡培养18～24h，转速为180～230rpm。

6.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(4)中液体发酵培养时间为18～28h，温度28～30℃。

7.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(4)中液体发酵培养后，取样进行实验室显微镜检查，确认菌种未受杂菌污染，再将获得的液体发酵后的种子液接种至步骤(1)中确定的固体培养基中。

8.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(5)中固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数为：充压2.5～3.5min，谷压0.03～0.04MPa，维持9～11min峰压0.25～0.30MPa维持19～21min，发酵时间为26～30h，发酵温度为28～30℃。

9.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(6)中干燥采用流化床干燥，将固体发酵物置于流化床65～70℃烘干至水分10％以下。

10.根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，其特征是：步骤(6)中粉碎时粉碎机的孔径为60～100目；包装采用防潮铝箔袋进行真空密封包装。