CN105502688B - 一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法 - Google Patents

一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境微生物修复领域，公开了一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法。该方法利用铜绿假单胞菌的发酵液对处于对数生长期的铜绿微囊藻进行溶藻，再利用血红密孔菌孢子液对溶藻后体系中残余的微囊藻毒素进行降解，达到除藻及其代谢产物降解同步解决的目的。该方法简便、成本低，在发酵时间为48h，溶藻时间为7d，降解时间为7d时，溶藻效果达到83.31％，微囊藻毒素的降解效率达到67.63％，达到了除藻及其代谢产物降解问题同步解决的目标。实际应用价值高，为解决湖泊水库水富营养化和饮用水深度治理问题提供参考。

Description

一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法
技术领域
本发明属于环境微生物修复领域，特别涉及一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法。
背景技术
目前世界上淡水湖泊蓝藻水华爆发的频率和严重程度都呈现迅猛增长的趋势。我国几乎所有水体都或多或少遭受到氮、磷的污染，从而导致不同程度的富营养化现象，蓝藻水华现象频繁爆发。蓝藻水华爆发使水体溶解氧下降，危害水生动植物生长，严重影响湖泊水体的生态环境，影响饮用水的水质。其中某些蓝藻在爆发期间随着藻细胞的死亡劈裂，会释放出微囊藻毒素，微囊藻毒素以溶解态的形式存在于水体中，会严重危害动物和人类健康。在目前发现的约80多种微囊藻毒素中，含量最多、毒性最强的是MC-LR，世界卫生组织(WHO)及我国《生活饮用水卫生规范》均将饮用水中MC-LR标准限值设定为1.0μg·L-1。
在除藻及藻毒素去除的实际应用中，物理化学方法因其较高的运行成本、容易造成二次污染等诸多问题，不能成为控藻及藻毒素去除的首选技术。生物法除藻及降解藻毒素具有环境友好性和低成本性，因而成为水体富营养化修复的最安全、经济、有效途径。有报道称自然界存在的某些病毒、细菌、放线菌及真菌具有高效的溶藻能力，溶藻微生物主要通过直接溶藻方式或分泌溶藻活性物质间接杀死和溶解藻细胞两种方式进行，迄今为止已分离获得的溶藻微生物主要有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、鞘氨醇菌属(Sphingomonassp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)和分支杆菌属(Mycobacterium sp.)等。同时国内外研究工作者也分离鉴定出能够高效降解MC-LR的菌株。
目前微生物降解藻毒素的研究主要集中于高效降解MC-LR的细菌类菌株的筛选、环境因素影响、作用机理以及具体应用等，对真菌降解MC-LR的研究甚少。有研究发现白腐真菌菌株能够抑制铜绿微囊藻的生长，但这些研究中均未涉及到白腐真菌对MC-LR有降解效果。此外，目前大部分研究针对的是单一的除藻或是降解藻毒素，联合微生物同时进行除藻和残余藻毒素的降解方面的研究还很欠缺。利用微生物对微囊藻进行溶藻后，胞内的藻毒素也将会被释放出来，这就需要藻毒素降解菌配合进行藻毒素的降解，达到除藻及其代谢产物解毒问题同步解决的目标。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法。
本发明另一目的在于提供上述方法在富营养化水体的水华控制和水体应急除藻方面的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，利用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的发酵液对处于对数生长期的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)进行溶藻，再利用血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)孢子液对溶藻后体系中残余的微囊藻毒素进行降解，达到除藻及其代谢产物降解同步解决的目的。
上述方法包括以下具体步骤：
(1)将斜面保存的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，得到铜绿假单胞菌母液；
(2)将步骤(1)中培养的铜绿假单胞菌母液按1％的接种量投加至发酵培养基中进行摇床扩大培养，离心分离得铜绿假单胞菌的发酵液；
(3)取血红密孔菌孢子液接种到培养基上培养，洗脱保存，得血红密孔菌孢子液；
(4)将步骤(2)中得到的铜绿假单胞菌的发酵液投加到含铜绿微囊藻的溶液中培养，进行溶藻实验，将所得藻溶液分离纯化得MC-LR；
(5)取步骤(3)中得到的血红密孔菌孢子液和步骤(4)中得到的MC-LR投加到培养基中，形成MC-LR降解体系，进行降解实验。
步骤(1)中所述的液体培养基的组成为：牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；琼脂粉15g；蒸馏水1000mL；pH为7.2；该培养基使用前可根据需要在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30min。
步骤(1)中所述的培养的条件为：培养温度为37℃，培养时间为1～2d；
步骤(2)中所述的发酵培养基的组成为：牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；蒸馏水1000mL；pH为7.0～7.2；该发酵培养基使用前可根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30min。
步骤(2)中所述的摇床扩大培养的条件为：摇床培养温度为30℃，摇床转速为130～150r/min，培养时间为24～60h。
步骤(2)中所述的离心分离是指在8000r/min的速度下离心8min，收集上清液。
步骤(3)中所述的培养基的组成为：马铃薯浸取液1000mL，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B10.02g，琼脂20g，PH为6.0。
优选的，上述的马铃薯浸取液由以下方法制备得到：将200g去皮的马铃薯切块，加1000mL水煮沸30min，过滤定容至1000mL。
步骤(3)中所述的培养指平板培养，培养温度为30℃，培养时间为1～2d。
步骤(3)中所述的洗脱保存是指用无菌水将平板培养基上的血红密孔菌孢子冲下来，过2层经灭菌过的纱布，保存在灭菌后的空三角瓶中待用。
步骤(3)中所得血红密孔菌孢子液的OD600为0.8～1.0。
步骤(4)中所述的含铜绿微囊藻的溶液的OD680为0.6～1.0。
步骤(4)中所用的铜绿假单胞菌的发酵液与含铜绿微囊藻的溶液的体积比为2～10％。
步骤(4)中所述的培养的条件为：在恒温光照培养箱中以温度25±1℃，光照强度为2000lux，光照:黑暗(时间比)为14h:10h的条件下培养，每天摇动2～3次，培养1～7天。
步骤(4)中所述的分离纯化是指将所得藻溶液于8000r/min离心5min收集上清液，用pH为7.0的PBS洗涤沉淀并离心，合并上清液，待水分全部蒸发后得MC-LR。
步骤(5)中所述的培养基的组成为：葡萄糖5g，L-天冬酰胺0.2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.1g，微量元素1mL(NaCl 5mg·L-1，ZnSO4·7H2O 1mg·L-1，AlK(SO4)20.2mg·L-1，H3BO30.2mg·L-1，NaMoO4·2H2O 0.2mg·L-1，盐酸硫胺1mg·L-1,CuSO4·5H2O 2mg·L-1)，双蒸水1000mL，该培养基使用前可根据要求在高压灭菌锅中于115℃条件下灭菌30min。
步骤(5)中所述的MC-LR降解体系中MC-LR的浓度为1.0～2.0mg/L。
步骤(5)中所用的血红密孔菌孢子液与MC-LR降解体系的体积比为1:(10～40)。
步骤(5)中所述的降解是指在摇床温度为28～30℃、摇床转速为150r/min的条件下降解1～7d。
步骤(5)中降解完成后，将反应后的溶液过0.22μm的微孔滤膜，装于进样瓶中上机检测MC-LR浓度。
上述的方法在富营养化水体的水华控制和水体应急除藻方面的应用。
本发明的机理为：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)能分泌某种溶藻活性物质对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)进行溶解，经鉴定，铜绿假单胞菌的溶藻活性物质为菌体分泌的胞外物质；MC-LR作为铜绿微囊藻的次生代谢产物，被分泌到细胞外或是随着藻细胞的死亡破裂而释放到环境中，严重危害动物和人类的健康，血红密孔菌(P.sanguineus)具有能高效降解MC-LR的功能。本发明将铜绿假单胞菌发酵液投加到铜绿微囊藻中进行溶藻处理，再利用血红密孔菌对体系中残余的MC-LR高效降解来达到同步除藻及其代谢产物—藻毒素解毒的目的。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明提供了一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，该方法的原料成本低、简单易行、实际应用价值高，且在使用过程中不会对环境造成污染，能够以较低的投入获得较大的经济效益。为水体富营养化蓝藻水华及藻毒素污染问题提供了一种高效、经济、环保的微生物修复方法。
附图说明
图1为不同发酵时间下的铜绿假单胞菌发酵液在不同的溶藻时间下的溶藻效果图。
图2为发酵培养48h的铜绿假单胞菌发酵液溶藻5d后的藻细胞透射电镜图。
图3为不同溶藻处理条件下的胞外残余MC-LR浓度。
图4为血红密孔菌孢子液对MC-LR的降解示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)在文献“Aerobic biotransformation ofdecabromodiphenyl ether(PBDE-209)by Pseudomonas aeruginosa[J].Chemosphere,2013,93:1487-1493.”中公开。
实施例中血红密孔菌(P.sanguineus)孢子液购自于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC 5.00815))。
实施例中铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)购买于中国科学院武汉水生生物研究所，藻种号为FACHB905。藻种经活化后，采用BG11培养基(蒸馏水:1L；NaNO3:1.5g；K2HPO4:0.04g；MgSO4·7H2O:0.075g；CaCl2·7H2O:0.036g；Na2CO3:0.02g；柠檬酸:0.006g；柠檬酸铁:0.006g；EDTA Na2:0.001g；微量元素溶液:1mL(H3BO4:2.86g/L；MnCl2·4H2O:1.86g/L；ZnSO4·7H2O:0.22g/L；Na2MoO4·2H2O:0.39g/L；CuSO4·5H2O:0.08g/L；Co(NO3)2·6H2O:0.05g/L)培养，得含铜绿微囊藻的溶液。
实施例中其它试剂均可从市场购得。
MC-LR的分析检测条件为：高效液相色谱法(HPLC)，色谱柱为Agilent C18柱(250nm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇:水(0.05％三氟乙酸)＝66:34(V:V)，流速为1mL·min-1，柱温为30℃，检测波长为238nm，进样量为20μL。
实施例1：铜绿假单胞菌的发酵液的制备
(1)将培养基(牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；琼脂粉15g；蒸馏水1000mL；pH为7.2)在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30min后，将斜面保存的铜绿假单胞菌接种至液体培养基上培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，培养好后于4℃冰箱保存待用；
(2)将发酵培养基(牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；蒸馏水1000mL；pH为7.2)在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30min后，将培养好的铜绿假单胞菌母液按1％的接种量接种至该液体发酵培养基中进行活化，在摇床培养温度为30℃，摇床转速为150r/min的条件下分别摇床扩大培养24h、36h、48h、60h，将所得培养液在8000r/min的速度下离心8min收集上清液，得不同发酵时间的发酵液；
实施例2：血红密孔菌孢子液的制备
取血红密孔菌孢子液400μL接种到平板培养基(马铃薯浸取液1000mL(去皮200g，切块加1000mL水煮沸30min)，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B10.02g，琼脂20g，PH为6.0)上培养，培养温度为30℃，培养时间为48h；
用无菌水将平板上的血红密孔菌孢子冲下来，经2层灭菌过的纱布过滤后，保存在灭菌后的空三角瓶中，确保血红密孔菌孢子液OD600为0.9，将得到的血红密孔菌孢子液保存在4℃冰箱中待用；
实施例3：铜绿假单胞菌的发酵液的溶藻性能研究
将实施例1中不同发酵培养时间(24h，36h，48h，60h)的铜绿假单胞菌的发酵液按5％(V/V)投加到OD680为0.6(±0.02)的含铜绿微囊藻的溶液中，在25±1℃，光照强度为2000lux，光照:黑暗(时间比)为14h:10h的条件下进行溶藻实验，每天摇动藻液3次，分别培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d后，将所得的藻溶液在8000r/min的速度下离心8min，收集上清液，沉淀用PBS(pH 7.0)洗涤3次，将上清液合并，待水全部蒸发后，用2mL甲醇定容装瓶，上机检测MC-LR浓度。设置未经发酵处理的铜绿假单胞菌菌体为对照组，同时设置在BG11培养基中正常生长未经溶藻处理的铜绿微囊藻(M.aeruginosa)为空白组。
图1为不同发酵时间下的铜绿假单胞菌发酵液在不同的溶藻时间下的溶藻效果图，其中溶藻效率＝(处理组叶绿素a含量-正常生长的藻细胞中叶绿素a含量)/正常生长的藻细胞中叶绿素a含量。叶绿素a的含量可用以下公式计算得到：
其中：V—水样体积(L)；V1—提取液定容后的体积(mL)；δ—比色皿光程；D750、D663、D645、D630—分别为不同波长下的紫外/可见光吸光值。
从图1中可以看出，发酵时间为24～60h的铜绿假单胞菌的发酵液对铜绿微囊藻均有溶藻活性，当发酵时间为48h时，发酵液的溶藻活性最强。铜绿假单胞菌发酵液与含铜绿微囊藻的溶液共培养1d时，溶藻作用不明显，随着溶藻时间的增加，溶藻作用显著增强，当共培养5d后，溶藻效果趋于稳定，共培养到第7d时，48h的发酵液的溶藻效率达到83.31％。
图2为发酵培养48h的铜绿假单胞菌发酵液溶藻5d后的藻细胞透射电镜图，从图2中可以看出，经过铜绿假单胞菌发酵液溶藻5d后，藻细胞胞内结构已全部解体，磷酸颗粒完全降解，类囊体片层解体模糊不清。同时，藻细胞死亡破裂，伴随着大量胞内物质外流，说明铜绿假单胞菌发酵液具有良好的溶藻效果。
图3为不同溶藻处理条件下的胞外残余MC-LR浓度图。从图3中可以发现，经过铜绿假单胞菌菌体和铜绿假单胞菌48h发酵液处理5d后的铜绿微囊藻体系中，其胞外残余MC-LR浓度要低于空白组正常生长的藻细胞胞外残余MC-LR浓度，这是因为铜绿微囊藻产MC-LR主要是在稳定期，而在铜绿微囊藻处于对数期时便投加铜绿假单胞菌对其进行溶藻，经过5d的处理，即使藻细胞死亡破裂，从胞内释放到胞外的MC-LR仍然比正常生长的藻细胞释放的量低。
实施例4：血红密孔菌孢子液在不同降解时间下降解藻毒素的性能
本实施例中的MC-LR降解体系的组成为：葡萄糖5g，L-天冬酰胺0.2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.1g，微量元素1mL(NaCl 5mg·L-1，ZnSO4·7H2O 1mg·L-1，AlK(SO4)20.2mg·L-1，H3BO30.2mg·L-1，NaMoO4·2H2O 0.2mg·L-1，盐酸硫胺1mg·L-1,CuSO4·5H2O 2mg·L-1)，双蒸水1000mL。使用前在高压灭菌锅中于115℃条件下灭菌30min。
取实施例3中分离纯化的MC-LR投加到无机盐培养基中培养，然后加入1mL实施例2中的血红密孔菌孢子液，确保降解体系为20mL，在摇床温度为30℃、摇床转速为150r·min-1的条件下进行摇床降解实验；分别降解1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d。降解完成后，取1mL体系过0.22μm的微孔滤膜，装于进样瓶中上机检测MC-LR浓度。设置灭活的血红密孔菌为对照组。
图4为血红密孔菌孢子液在不同降解时间下对MC-LR的降解示意图，从图中可知，血红密孔菌孢子液对MC-LR有较高的去除效果，在降解6d后去除效果趋于稳定，达到67.63％。灭活的血红密孔菌对MC-LR有一定的吸附作用，培养7d后灭活组对MC-LR去除率仅为15.07％，远低于血红密孔菌对MC-LR的降解效果，说明P.sanguineus对MC-LR的去除主要是降解作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：利用铜绿假单胞菌的发酵液对处于对数生长期的铜绿微囊藻进行溶藻，再利用血红密孔菌孢子液对溶藻后体系中残余的微囊藻毒素进行降解，达到除藻及其代谢产物降解同步解决的目的；该方法包括以下具体步骤：
(1)将斜面保存的铜绿假单胞菌接种到液体培养基上培养，得到铜绿假单胞菌母液；
(2)将步骤(1)中培养的铜绿假单胞菌母液按1％的接种量投加至发酵培养基中进行摇床扩大培养，离心分离得铜绿假单胞菌的发酵液；
(3)将血红密孔菌孢子液接种到培养基上培养，洗脱保存，得血红密孔菌孢子液；
(4)将步骤(2)中得到的铜绿假单胞菌的发酵液投加到含铜绿微囊藻的溶液中培养，进行溶藻实验，将所得藻溶液分离纯化得MC-LR；
(5)取步骤(3)中得到的血红密孔菌孢子液和步骤(4)中得到的MC-LR投加到培养基中，形成MC-LR降解体系，进行降解实验；
步骤(5)中所述的血红密孔菌孢子液与MC-LR降解体系的体积比为1:(10～40)；
步骤(3)中所述的培养指平板培养，培养温度为30℃，培养时间为1～2d。
2.根据权利要求1所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的含铜绿微囊藻的溶液的OD680为0.6～1.0；
步骤(4)中所用的铜绿假单胞菌的发酵液与含铜绿微囊藻的溶液的体积比为2～10％；
步骤(4)中所述的培养的条件为：在恒温光照培养箱中以温度25±1℃，光照强度为2000lux，光照与黑暗的时间比为14h:10h的条件下培养，每天摇动2～3次，培养1～7天；
步骤(4)中所述的分离纯化是指将所得藻溶液于8000r/min离心5min收集上清液，用pH为7.0的PBS洗涤沉淀并离心，合并上清液，待水分全部蒸发后得MC-LR。
3.根据权利要求1所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的培养基的组成为：葡萄糖5g，L-天冬酰胺0.2g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·2H2O 0.1g，微量元素1mL，双蒸水1000mL；其中微量元素的成分为：NaCl 5mg·L-1，ZnSO4·7H2O 1mg·L-1，AlK(SO4)2 0.2mg·L-1，H3BO3 0.2mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.2mg·L-1，盐酸硫胺1mg·L-1,CuSO4·5H2O 2mg·L-1；
步骤(5)中所述的培养基使用前在高压灭菌锅中于115℃条件下灭菌30min；
步骤(5)中所述的MC-LR降解体系中MC-LR的浓度为1.0～2.0mg/L；
步骤(5)中所述的降解是指在摇床温度为28～30℃、摇床转速为150r/min的条件下降解1～7d。
4.根据权利要求1所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的液体培养基的组成为：牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；琼脂粉15g；蒸馏水1000mL；pH为7.2；
步骤(1)中所述的液体培养基使用前在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30min；
步骤(1)中所述的培养的条件为：培养温度为37℃，培养时间为1～2d。
5.根据权利要求1所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的发酵培养基的组成为：牛肉膏3g；蛋白胨10g；NaCl 5g；蒸馏水1000mL；pH为7.0～7.2；
步骤(2)中所述的发酵培养基使用前在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌30min；
步骤(2)中所述的摇床扩大培养的条件为：摇床培养温度为30℃，摇床转速为130～150r/min，培养时间为24～60h；
步骤(2)中所述的离心分离指在8000r/min的速度下离心8min，收集上清液。
6.根据权利要求1所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的培养基的组成为：马铃薯浸取液1000mL，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B1 0.02g，琼脂20g，pH为6.0；
步骤(3)中所述的洗脱保存是指用无菌水将平板培养基上的血红密孔菌孢子冲下来，经过2层灭菌过的纱布，保存在灭菌后的空三角瓶中待用；
步骤(3)中所得血红密孔菌孢子液的OD600为0.8～1.0。
7.根据权利要求6所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法，其特征在于：
所述的马铃薯浸取液由以下方法制备得到：将200g去皮的马铃薯切块，加1000mL水煮沸30min，过滤定容至1000mL。
8.根据权利要求1～7任一项所述的利用微生物联合制剂同步溶藻/降解藻毒素的方法在富营养化水体的水华控制和水体应急除藻方面的应用。
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