CN103484403A

CN103484403A - 从泥鳅体内筛选的溶藻菌及利用其去除铜绿微囊藻的方法

Info

Publication number: CN103484403A
Application number: CN201310411120.6A
Authority: CN
Inventors: 张文艺; 李仁霞; 陈雪珍; 冯国勇; 陈晶
Original assignee: Changzhou University
Current assignee: Yancheng high tech Zone Investment Group Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN103484403B

Abstract

本发明从泥鳅体内筛选的溶藻菌及利用其去除铜绿微囊藻的方法，属于蓝藻处理的微生物学技术领域。提供了溶藻细菌铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，保藏编号为CGMCCNo.7517。本发明还提供了利用溶藻细菌降解铜绿微囊藻的方法.本发明以食藻泥鳅的内脏及组织液为分离源，铜绿微囊藻为试验源，分离得到溶藻菌LR5。在最佳条件下，溶藻菌LR5对铜绿微囊藻192h去除率可达98.95%，溶藻效果非常理想，同时将食藻的泥鳅作为高效溶藻菌筛选的新的菌种来源。

Description

从泥鳅体内筛选的溶藻菌及利用其去除铜绿微囊藻的方法

技术领域

本发明属于蓝藻处理的微生物学领域，具体涉及一种利用从食藻泥鳅体内筛选的溶藻菌去除铜绿微囊藻的方法。

背景技术

近年来，随着经济的快速发展，大量含N、P等元素的污水排放入自然水体，带来严重的水环境污染问题，在滇池、巢湖和太湖等重要水源区蓝藻水华年年爆发，同时藻细胞的生长死亡还会伴有藻毒素的释放，严重影响生态环境及居民饮用水的安全。

目前，蓝藻处理主要采用物理法、化学法和生物法。物理法有机械打捞法、气浮法、稀释法等，短时间内可对小型水域起到比较好的除藻效果，但是需要大量的人力、物力及财力的投入，且治标不治本。化学法主要是通过向水体投加杀藻剂或絮凝剂，该方法见效快，但是药效结束后蓝藻依然会大肆生长，同时化学药剂的加入可能会对水生动植物造成伤害，还会通过食物链进入人体，有带来二次污染的潜在问题。常规的生物法主要是通过种植高等水生植物、放养滤食性鱼类、设置人工浮岛等方式进行生物控藻，生态无二次污染，取得了比较好的处理效果。但是水生动植物的生长受周期和季节的限制，且处理成本较高，如何寻找一种更为高效的生物控藻法意义重大。

近年来，很多学者研究表明，水体中蓝藻的死亡与溶藻菌的存在有着重要联系。《中国农学通报》（2009）第25卷第20期267-271页报道了王海玉等从滇池水样中分离出1株红色细菌W-04，并将其与微囊藻毒素进行共培养，当菌藻体积比为10:100时，第8天使藻细胞残存数为0。专利号为201210276032.5的专利，张文艺等(即本发明人)从黄化藻液中筛选到的一株溶藻菌TL，在投菌量为菌藻体积比≥1：10，光循环（光照周期12 h：12 h）的条件下，96h时菌株对铜绿微囊藻去除效率可达到62.45%以上。虽然目前已有不少关于溶藻菌的研究报道，但一般都是从蓝藻频发的水体或底泥中筛选，菌种的来源较为单一。

泥鳅作为一种食藻性鱼类，其胃中的食物团里含有大量硅藻、绿藻、蓝藻、棵藻、丝状藻等。专利号为201210266572.5的专利，张文艺等(即本发明人)，将泥鳅养殖在一定浓度的奶牛场粪便发酵液中，利用泥鳅在缺氧环境，可食用与其共生的蓝藻、丝状藻等微生物的生活习性，不另外投加泥鳅饵料，即可对养殖池中的总磷的削减量为每亩7.2×10⁴-1.15×10⁵mg；对氨氮的削减量为每亩2.45×10⁵-3.95×10⁵mg，从而达到净化奶牛场粪便发酵液的目的。因此可以推断：食藻性鱼类的泥鳅内脏中可能含有可以溶解藻类的细菌。本发明以太湖流域的野生泥鳅作为溶藻细菌的分离源，经富集培养后筛选出能够降解铜绿微囊藻的菌株。

发明内容

本发明的目的在于解决现有溶藻菌的菌种来源较为单一的问题，针对太湖优势藻种铜绿微囊藻而提供的一种从食藻泥鳅内脏及其组织液中筛选具有良好溶藻性能的菌株，并利用其降解铜绿微囊藻的方法。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种从食藻泥鳅内脏及其组织液中分离筛选得到的溶藻菌LR5，经鉴定其为铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa，并于2013年4月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），登记入册编号为CGMCC No.7517。

利用上述溶藻效果最佳的菌株LR5降解铜绿微囊藻的方法，按照下述步骤进行：

从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期，再按照1:2 - 1:20之间不同的菌藻体积比接种对数期的菌液至新鲜铜绿微囊藻液中，初始叶绿素a（Chla）浓度为53.33- 86.18 mg/m³，于温度26℃、光强2500 lux、五种不同光暗周期、四种不同菌液处理方式下于光照培养箱中静置培养，定时手动混匀藻菌液并观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla 剩余含量，考察不同条件下LR5菌液对铜绿微囊藻的降解效果。

本发明所述的五种不同光暗周期分别为：①24h:0h；②0h:24h；③12h:12h；④6h:18h；⑤18h:6h。

本发明所述的四种不同菌液处理方式分别为：①菌液，不作处理；②菌液10000 r/min离心15min后取上清液；③收集②离心后的菌体，经无菌水洗涤3次后制备菌悬液；④将菌液121℃、100 KPa的条件下灭菌25 min。

本发明所述的细菌液体培养基组成如下：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g， NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。该细菌液体培养基主要用于菌株的活化过程。

本发明所述的细菌固体培养基的组成如下：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g， NaCl 5 g，琼脂粉20-24 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。该细菌固体培养基主要用于菌株分离筛选的培养过程。

本发明所述的铜绿微囊藻培养液的组成如下： NaNO₃ 1.5 g，K₂HPO₄ 0.04 g，MgSO₄ 7H₂O 0.075 g，CaCl₂ 2H₂O 0.036 g，柠檬酸 0.006 g，柠檬酸铁铵 0.006 g，EDTA-Na₂ 0.001 g，NaCO₃ 0.02 g，微量元素溶液1 mL，蒸馏水1000 mL，pH 7.1。该培养液主要用于铜绿微囊藻的培养过程。

上述的铜绿微囊藻培养液中的微量溶液：硼酸2.86 g，MnCl₂·4H₂O 1.86 g，ZnSO₄·7H₂O 0.22 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39 g，CuSO₄·5H₂O 0.08 g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.05 g，蒸馏水1000 mL。

上述培养基和溶液均于高压灭菌锅中121℃、100 KPa的条件下灭菌25 min后使用。

作为本发明上述降解铜绿微囊藻方法的一种优选方案：选取培养17 h的LR5菌液，按照1:20的菌藻体积比，接种5 mL菌液至100 mL新鲜铜绿微囊藻液中，初始Chla浓度为62.41 mg/m³，于温度26℃、光强2500 lux、光暗周期12h：12 h的光照培养箱中静置培养192 h，该溶藻菌LR5对铜绿微囊藻的降解效果最佳。

本发明的有益效果：

本发明以食藻泥鳅的内脏及组织液为分离源，铜绿微囊藻为试验源，分离得到溶藻菌LR5。在最佳条件下，溶藻菌LR5对铜绿微囊藻192 h 去除率可达98.95%，溶藻效果非常理想，同时将食藻的泥鳅作为高效溶藻菌筛选的新的菌种来源。

具体实施方式

本发明提供了一种从食藻泥鳅内脏及其组织液中分离筛选溶藻菌的方法，获得1株高效溶藻菌LR5，经鉴定其属于铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa），并于2013年4月26日送交至中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，登记入册编号为CGMCC No.7517，保藏中心将于2013年4月26日起对LR5菌株保存三十年。该保藏中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。具体分离筛选方法，包括如下步骤：

1、选用个体鲜活的食藻泥鳅，在清水中养殖7 d，用蒸馏水漂洗干净。

2、无菌条件下取适量食藻的泥鳅的内脏及其组织液，研磨均匀，按照10 g : 90 mL的比例加入适量无菌水，置于摇床中温度30℃、转速130 r/min振荡18-24 h，得组织匀浆液。

3、将组织匀浆液先通过定性滤纸和孔径0.8 μm的滤膜，再用0.22 μm的微孔滤膜过滤截留其中的细菌，收集0.22 μm滤膜并在无菌条件下剪碎，投加到50 mL的细菌液体培养基中进行富集培养。

4、将富集培养液稀释至适当倍数，采用梯度稀释法涂布于细菌固体培养基上，倒置于30℃恒温箱中进行培养。挑选其中长势较好的单菌落，划线分离培养2-3 d，然后进行纯化培养，继代4-5次，得到可能具有溶藻特性的优势细菌11株，分别命名为LR1-LR11。

5、将11株细菌分别接种到细菌液体培养基中培养至对数期，再加入试验藻液进行溶藻性能判定，能使藻液黄化的细菌即被认为是溶藻菌，进行斜面保存，选取其中溶藻效果最好的一株菌株LR5进行溶藻效果研究。

菌株的分离筛选

1、选用个体鲜活的食藻泥鳅6条，在清水中养殖7 d后用蒸馏水漂洗干净。在超净台上无菌条件下取食藻的泥鳅的前、后肠、肝、肾、脾等内脏组织，研磨均匀，按照10 g : 90 mL的比例，向装有15 g泥鳅内脏及组织液的三角瓶中加入135 mL无菌水，置于摇床中温度30℃、转速130 r/min振荡20 h，得组织匀浆液。

3、将组织匀浆液静置1 h，取上清液首先通过定性滤纸和孔径0.8 μm的滤膜，再用0.22 μm的微孔滤膜过滤截留组织匀浆液的细菌，收集0.22 μm滤膜并在无菌条件下剪碎，投加到装有50 mL的细菌液体培养基的三角瓶中进行富集培养。

4、将富集培养液稀释至10^-6、10^-7和10^-8三个浓度梯度，分别吸取100 μl涂布在细菌固体培养基上，倒置于30℃恒温箱中进行培养。挑选其中长势较好的单菌落，划线分离培养2-3 d，然后进行纯化培养，继代4-5次，得到可能具有溶藻特性的优势细菌11株，分别命名为LR1-LR11。

5、将11株细菌分别接种到细菌液体培养基中培养至对数期，再按照1:10的菌藻体积比，取10mL的菌液至100 mL新鲜铜绿微囊藻藻液中，并以加入无菌水作空白对照，于温度28℃、光强2500 lux、光暗周期12 h：12 h的光照培养箱中静置培养1周进行溶藻性能判定，11株菌120 h对铜绿微囊藻的去除率依次为18.65%、56.35%、61.59%、19.80%、92.59%、38.34%、27.20%、47.57%、56.58%、42.92%、75.27%，全部进行斜面保存，选取其中溶藻效果最好的一株LR5进行溶藻效果研究。经观察，培养2天的LR5生长状况良好，直径为1.88mm，白色，不透明，边缘为锯齿状，表面凸起，具有粘性的圆形菌落，若长期培养产生绿色荧光素。对其进行染色反应极其生理生化特性测定，LR5为革兰氏染色、乙酰甲基醇（V.P）、甲基红（M.R）、淀粉水解、产硫化氢和葡萄糖发酵皆为阴性，接触酶、明胶水解、葡萄糖氧化、41℃生长和硝酸盐还原均为阳性。提取其DNA并经PCR扩增后测定其16S rDNA序列，得到菌株LR5的16S rDNA片段的全序列长度共计1441 bp，经比较，其序列与铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）最为接近，同源性高达99%。经生理生化实验及16S rDNA序列分析，参照第八版伯杰细菌鉴定手册，可将LR5菌株归属于铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）。

以下提供本发明利用上述菌株LR5处理铜绿微囊藻的5个实施例：

实施例1

从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有100 mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期，再按照1:2的菌藻体积比，即接种50 mL菌液至100 mL新鲜铜绿微囊藻液中，初始Chla 浓度为53.33 mg/m³，于温度26℃、光强2500 lux、光暗周期12 h：12 h的光照培养箱中静置培养，早8:00至晚10:00期间每3小时手动混匀藻菌液，并拍照观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla剩余含量。得到菌株LR5对铜绿微囊藻48 h、96 h、144 h、192 h 时的Chla去除率分别为40.41%、51.70%、55.47%、75.08%，有较好的溶藻效果。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于菌藻体积比和处理的铜绿微囊藻液初始Chla 浓度不同。

从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有100 mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期，再按照1:10的菌藻体积比，即接种10 mL菌液至100 mL新鲜铜绿微囊藻液中，初始Chla 浓度为78.26 mg/m³，于温度26℃、光强2500 lux、光暗周期12 h：12 h的光照培养箱中静置培养，早8:00至晚10:00期间每3小时手动混匀藻菌液，并拍照观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla剩余含量。得到菌株LR5对铜绿微囊藻48 h、96 h、144 h、192 h 时的Chla去除率分别为12.81%、43.32%、63.83%、79.90%，溶藻效果较好。

实施例3

本实施例与实施例1和实施例2的不同之处在于菌藻体积比和处理的铜绿微囊藻液初始Chla 浓度不同。

从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有100 mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期，再按照1:20的菌藻体积比，即接种5 mL菌液至100 mL新鲜铜绿微囊藻液中，初始Chla 浓度为 86.18 mg/m³，于温度26℃、光强2500 lux、光暗周期12 h：12 h的光照培养箱中静置培养，早8:00至晚10:00期间每3小时手动混匀藻菌液，并拍照观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla剩余含量。得到菌株LR5对铜绿微囊藻48 h、96 h、144 h、192 h 时的Chla去除率分别为17.15%、53.92%、80.39%、91.93%，溶藻效果较好。

实施例4

本实施例与实施例1、实施例2和实施例3的不同之处在于处理的铜绿微囊藻液初始Chla 浓度、光暗周期不同，选定菌藻体积比为1:20。

本实施例同时处理5份铜绿微囊藻液，从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有100 mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期，再按照1:20的菌藻体积比，即接种5 mL菌液分别至5个装有100 mL新鲜铜绿微囊藻液的锥形瓶中，初始Chla 浓度分别为62.41 mg/m³、60.10 mg/m³、57.87 mg/m³、59.85 mg/m³和55.43 mg/m³。设置五个锥形瓶中藻菌混合液的光暗周期分别对应为24h:0h、0h:24h、12h:12h、6h:18h和18h:6h。于温度26℃、光强2500 lux的光照培养箱中静置培养，早8:00至晚10:00期间每3小时手动混匀藻菌液，并拍照观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla剩余含量。得到五种不同的光暗周期下菌株LR5对铜绿微囊藻168 h 时的Chla去除率分别为85.47%、87.09%、95.90%、78.22%、91.98%，光暗周期为12h:12h时的溶藻效果最为理想。

实施例5

本实施例与实施例1、实施例2、实施例3和实施4的不同之处在于处理的铜绿微囊藻液初始Chla 浓度、菌液处理方式不同，选定菌藻体积比为1:20、光暗周期为12h:12h。

本实施例同时处理4份铜绿微囊藻液，从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有100 mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期。再按照1:5的菌藻体积比，分别取5mL菌液，作如下四种不同的方式处理：①菌液，不作处理；②菌液10000 r/min离心15min后取上清液；③收集②离心后的菌体，经无菌水洗涤3次后制备菌悬液；④将菌液121℃、100 KPa的条件下灭菌25 min。将上述4种不同方式处理后的菌液加至100 mL新鲜铜绿微囊藻液中，以无菌水做空白，初始Chla 浓度分别为57.89 mg/m³、62.41 mg/m³、56.71 mg/m³、56.82 mg/m³和61.48 mg/m³。于温度26℃、光强2500 lux、光暗周期12 h：12 h的光照培养箱中静置培养，早8:00至晚10:00期间每3小时手动混匀藻菌液，并拍照观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla剩余含量。得到四种不同的菌液处理方式下菌株LR5对铜绿微囊藻168 h 时的Chla去除率分别为94.56%、97.94%、92.82%、88.55%，对菌液离心后取上清液的溶藻效果最好。

Claims

1.溶藻细菌铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa，保藏编号为CGMCC No.7517。

2.利用权利要求1所述的溶藻细菌降解铜绿微囊藻的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

从菌株LR5的斜面培养基中挑取一环菌接入装有细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130 r/min的振荡培养箱中活化培养17 h至对数生长期，再按照1:2 - 1:20之间不同的菌藻体积比接种对数期的菌液至新鲜铜绿微囊藻液中，初始叶绿素a浓度为53.33- 86.18 mg/m³，于温度26℃、光强2500 lux、五种不同光暗周期、四种不同菌液处理方式下的光照培养箱中静置培养，定时手动混匀藻菌液并观察藻菌液的生长情况，每天取样测定Chla 剩余含量，考察不同体积比例的LR5菌液对铜绿微囊藻的降解效果。