CN111235052A - 一株嗜热地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株嗜热地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株嗜热地衣芽孢杆菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明从生物发酵行业脱水污泥生物干化高温期55℃污泥中分离、纯化、筛选出在高温条件下具有胞外聚合物降解功能的嗜热地衣芽孢杆菌，将其在固体培养基培养至对数期后接种至LB肉汤培养基中1～2d，形成稳定的菌种群落，将嗜热地衣芽孢杆菌菌液接种至生物发酵行业脱水污泥的混合堆体中，接种量为脱水污泥的18wt％～22wt％，在具有保温通风作用反应器中反应8d，接种菌剂处理水分去除率相较于空白组(8.54％)增高至38.59％，提高4.52倍，升温效果较空白组提高16.2％，水分去除能力显著提高。

Description

一株嗜热地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一株嗜热地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
用玉米发酵法生产发酵制品的废水中的多糖和蛋白质等溶解性有机物(DOM)含量很高，COD高达20000mg/L。经过厌氧-好氧处理之后，COD仍高于200mg/L，导致二沉池污泥的上清液有机物浓度高于市政污泥。此外生物发酵行业污泥的挥发分含量高于市政污泥，表明固体颗粒中的有机质成分高于市政污泥。脱水污泥通过由浓缩污泥添加3‰CPAM后经过板框压滤后含水率为80％左右，含水率80.85％±0.59％、脂类物质含量12.82％(VS)，易水解类物质占63.65％(VS)、污泥初始结合水为22.93g/(g·DM)，胞外聚合物中蛋白质总量(24.98mg/(g VS))是多糖总量(6.24mg/(g VS))的4.00倍，其中Slime-EPS、LB-EPS、TB-EPS多糖含量分别为1.29mg/(g VS)、 1.19mg/(g VS)、3.76mg/(g VS)，Slime-EPS、LB-EPS、TB-EPS蛋白质含量分别为4.04mg/(g VS)、4.23mg/(g VS)、16.71mg/(g VS)，污泥TOC/TN为4.63±0.02。高糖类及蛋白类等物质导致生物发酵行业脱水污泥剩余水分很难进一步去除，给后续的处理处置和运输带来了很大困难，因此需要在污泥处置前进行预处理以降低污泥含水率。
目前脱水污泥干化的方式有很多，比如直接热干化、间接热干化、水热干化等物理方法，太阳能热干化、生物干化等生物法。目前生物发酵行业浓缩污泥多采用聚丙烯酰胺作为污泥调理剂，虽然效果显著但存在费用高、投加量大的问题，且存在易浸出，导致二次污染的情况。生物干化利用微生物的生长繁殖代谢活动产生的热量，蒸发污泥中的水分，具有安全高效、回收利用率高的优点，而成为备受关注的环境友好型的技术方法。
中国专利公开号CN104891759A的专利公开了一株用于污泥高温脱水剂，其中包括9种不同的细菌微生物，通过添加不同比例菌剂及碳酸钙、玉米粉等作为辅料于污泥中，污泥水分去除率能够提高30％左右。但混合菌剂中微生物种类复杂并且添加了外源菌剂和其他辅料，不同微生物之间的协同拮抗作用并不清晰，污泥中有机质降解情况同样未详细说明。
发明内容
为解决高糖类及蛋白类等物质导致生物发酵行业脱水污泥剩余水分很难进一步去除的问题，本发明提供一株具有胞外聚合物降解功能的嗜热地衣芽孢杆菌以及所述嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一株具有胞外聚合物降解功能的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，于2019年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC NO.18735。
本发明将菌株的16SrDNA测序，在GeneBank的比对结果显示，与地衣芽孢杆菌的16SrDNA基因的相似性达到99％以上。结合菌体形态特征的鉴定结果,将菌株确定为嗜热地衣芽孢杆菌。
所述嗜热地衣芽孢杆菌的鉴定：
1、菌体形态特征如下：细菌颜色均成灰白，中等大小、不透明、质地干燥等特性，形状不规则且边缘为裂叶性，在3～40h内为指数生长时期，于45h时菌液浓度约为109个/mL。
2、菌体的生理生化鉴定：
(1)革兰氏染色法：将筛选菌种进行革兰氏染色，结果：该菌种为革兰氏阳性菌。
(2)有机物降解性分析：
用接种环挑取少量待测菌划“+”字型，55℃恒温培养2～5d，滴加碘液于划线处，菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，表明该菌可以产生淀粉酶。
将培养18～24h的待测菌穿测接种于培养基中，同时做未接种对照组。55℃恒温培养2d、4d，产生液化现象，表明该菌能够降解蛋白质。
用接种环挑取待测菌种划线，55℃恒温培养2～5d；经过刚果红染色，酒精脱色，菌株周围出现透明水解圈的菌种，表明能够降解纤维素。
将培养至对数期的菌液离心，取上清液以适当蒸馏水稀释，其200μ L加入保温在55℃的装有200μL的2％酪蛋白溶液的离心管中，于55℃水浴保温10min，迅速加入600μL0.4mol/L三氯乙酸终止反应，于室温冷却15min离心取上清液500μL放置于试管中，加入2500μL 0.4mol/L Na2CO3溶液和500μL Folin溶液，混匀后55℃保温 30min，测定试样OD680，在标准曲线中计算酪氨酸的质量。
本发明还提供了一株所述嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用：接种嗜热地衣芽孢杆菌菌液于生物发酵行业脱水污泥中进行生物干化，干化反应8～14d，脱水污泥水分去除能力明显改善。
作为本发明的进一步改进，所述嗜热地衣芽孢杆菌提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力的应用，具体包括以下步骤：
(1)脱水污泥嗜热细菌的分离纯化
将生物发酵行业废水脱水污泥物料进行生物干化升温至55℃时，取适量样品稀释至10～107不同浓度梯度后，分别涂布接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，在55℃恒温培养箱中培养1d，分离得到多种细菌，使用平板划线法分别将不同细菌接种到培养基中培养，重复接种5～ 7次，分离纯化后得到不同形态的细菌，并于4℃冰箱保存。
(2)嗜热细菌的筛选
对纯化出来的细菌进行形态学分析以及生长特性分析，依据生长速度、明胶液化、葡萄糖发酵、淀粉水解、纤维素水解、蛋白酶活等特性，筛选出具有8～15％显著有机质降解功能、蛋白酶活性高(蛋白酶活性上升约30％)的细菌菌株。
(3)菌液制备
将培养至指数生长期的嗜热地衣芽孢杆菌接种至LB肉汤培养基中，在55℃、140～160rpm条件下培养1～2d获得菌液。
(4)接种嗜热细菌于生物发酵行业废水脱水污泥
接种18wt％～22wt％的嗜热地衣芽孢杆菌菌液到经过脱水的生物发酵行业污泥混合堆体中混合均匀，在具有保温通风作用反应器中反应8d，测定水分去除率、升温效果、蛋白质含量和嗜热蛋白酶活性。
作为本发明的进一步改进，步骤(4)中接种20wt％的嗜热地衣芽孢杆菌菌液到固体含量为15％～20％的生物发酵行业脱水污泥混合堆体中混合均匀，在具有保温通风作用反应器中反应8d。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明直接从生物发酵生产企业的脱水污泥中筛选胞外聚合物降解菌嗜热地衣芽孢杆菌，涂布平板接种后在55℃恒温培养箱中1～ 2d，重复纯化5～7次，即可获得纯种菌株，所述菌株生长代谢快，分离纯化周期较短，易于操作，可适应规模化生产。
(2)本发明使用高蛋白降解嗜热细菌提高生物发酵行业废水脱水污泥这类高有机质的发酵类污泥水分去除能力，拓宽了应用领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中嗜热地衣芽孢杆菌显微形态图；
图2为实施例3嗜热地衣芽孢杆菌16S rDNA序列的系统发育树；
图3为实施例5中利用嗜热地衣芽孢杆菌接种生物发酵行业废水脱水污泥的水分去除效果图；
图4为实施例5中利用嗜热地衣芽孢杆菌接种生物发酵行业废水脱水污泥的温度效果图；
图5为实施例5嗜热地衣芽孢杆菌接种生物发酵行业废水脱水污泥蛋白质变化特征图；
图6为实施例5嗜热地衣芽孢杆菌接种生物发酵行业废水脱水污泥蛋白酶活性变化特征图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
实施例1供试污泥样品
本发明所述的具有胞外聚合物降解功能的地衣芽孢杆菌(CGMCC NO.18375)，其菌种来源于某生物发酵行业生产企业污水处理车间氧化沟处理工艺的二沉池，经过浓缩、添加PAM后压滤得到的脱水污泥，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,(邮编100101),保藏编号为CGMCC NO.18735。所述地衣芽孢杆菌提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力的方法，具体实施运行时，供试污泥样品取自于某发酵制品生产企业污水处理车间氧化沟处理工艺的二沉池，经过浓缩、添加PAM后压滤得到的脱水污泥。供试污泥基本特性如表1。
表1供试污泥样品基本特征
含水率(％) 多糖(mg/g VS) 蛋白质 pH
80.26～81.44 6.24 24.98 7～8
实施例2高蛋白降解嗜热细菌的分离纯化
(1)脱水污泥嗜热细菌的分离纯化
将生物发酵行业废水脱水污泥物料进行生物干化升温至55℃时，取适量样品稀释至10～107不同浓度梯度后，分别涂布接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，在55℃恒温培养箱中培养1d，分离得到多种细菌，使用平板划线法分别将不同细菌接种到培养基中培养，重复接种5～ 7次，分离纯化后得到不同形态的细菌，并于4℃冰箱保存。
(2)嗜热细菌的筛选
对纯化出来的细菌进行形态学分析以及生长特性分析，依据生长速度、明胶液化、葡萄糖发酵、淀粉水解、纤维素水解、蛋白酶活等特性，筛选出具有显著有机质降解功能、蛋白酶活性高的细菌菌株。
(3)嗜热细菌的制备
将培养至指数生长期的嗜热地衣芽孢杆菌接种至LB肉汤培养基中，在55℃、140～160rpm条件下培养1～2d获得菌液。
(4)接种嗜热细菌于生物发酵行业废水脱水污泥
接种18wt％～22wt％的嗜热地衣芽孢杆菌菌液到经过生物发酵行业脱水污泥混合堆体中混合均匀，在具有保温通风作用反应器中反应 8d，测定水分去除率、升温效果、蛋白质含量和嗜热蛋白酶活性。
实施例3高蛋白降解嗜热细菌的筛选与鉴定
具体筛选和鉴定方法
(1)葡萄糖发酵
培养基配制：向1000mL的蒸馏水中添加2.0g蛋白胨，5.0g NaCl，0.2g K2HPO4，10g葡萄糖，3mL的1％溴麝香草酚蓝水溶液和8g琼脂。将配制好的培养基的pH调节至7.1左右并进行试管分装，培养基高度约4～5cm，121℃灭菌20min。将生长至对数期的菌种穿刺接种于培养基中，每株菌接4管，其中2管有油封盖(凡士林：液体石蜡＝1:1混合后灭菌)，约加0.5cm～1cm厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作为对照。55℃培养1d、2d、4d、7d观察结果：氧化型产酸-仅开管产酸，氧化作用弱的菌种往往先在上部产碱(1～2d)，后来才稍变酸，发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。
(2)淀粉水解
培养基配制：700mL的蒸馏水中加入10g蛋白胨，5g NaCl，5 g牛肉膏和16g琼脂。将2g可溶性淀粉加到300mL蒸馏水中，先使淀粉在水中溶解并调成糊状，再加入到融化好的培养基中，将配好培养基的pH调至7.2左右，随后121℃灭菌20min。将融化好的培养基冷却至50℃，用接种环挑取少量待测菌划“+”字型，55℃恒温培养 2d～5d，滴加碘液于划线处，如果菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，透明圈越大说明水解能力越强。
(3)明胶液化
培养基配制：向1000mL蒸馏水中加入3g牛肉膏，10g蛋白胨， 5gNaCl和120g明胶。先将蒸馏水加热，随后加入药品，待其完全溶解后停止加热。冷却后进行pH调节，调解pH值至7.2左右，分别装入试管随后112℃灭菌20min。将处于对数增长期的待测菌穿测接种于培养基中，同时做未接种对照组。55℃恒温培养2d、4d，观察液化情况，若产生液化现象为阳性反应，反之为阴性。
(4)纤维素钠
培养基配制：向1000mL蒸馏水中加入2gCMC-Na、2g(NH4) 2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、1g磷酸氢二钾、0.4g刚果红和17g琼脂，调节pH至7.0左右，之后121℃灭菌20min。用接种环挑取待测菌种划线于培养基中，55℃恒温培养2d～5d；经过刚果红染色，酒精脱色，菌株周围出现透明水解圈的菌种为阳性，反之为阴性。
(5)蛋白酶活性
将培养至对数期的菌液离心，取上清液以适当蒸馏水稀释后取 200μL加入事先保温在55℃的装有200μL的2％酪蛋白溶液的离心管中，55℃水浴保温10min，迅速加入600μL0.4mol/L三氯乙酸终止反应，室温冷却15min离心取上清液500μL放置于试管中，加入2.50mL 0.4mol/L Na2CO3溶液和0.5mL Folin溶液，混匀后55℃保温 30min，测定式样OD680，在标准曲线中计算酪氨酸的质量。
(6)16S rDNA基因序列测定
嗜热地衣芽孢杆菌16S rDNA序列的系统发育树如图2所示。
将菌株的16SrDNA测序，在GeneBank的比对结果显示，与地衣芽孢杆菌的16SrDNA基因的相似性达到99％以上。结合菌体形态特征的鉴定结果,将菌株确定为嗜热地衣芽孢杆菌。
经16S rDNA基因序列鉴定，测序拼接结果如下：
AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTAC AAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCT TCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTT AGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTC ATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTC ACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGG ACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTG CCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGT TCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAAT TCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACT ACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGA CCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACA CGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCC GGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCC AATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAG CCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCT TCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCG TCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC GTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTG GTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCT AAAAGCCACCTTTTATGATTGAACCATGCGGTTCAATCAAGCATCCGGTATTAGCCCCG GTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCG CCGCTGACCTAAGGGAGCAA GCTCCCG。
实施例4高蛋白降解嗜热菌的制备
将嗜热地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基培养1～2d，菌落布满培养皿后，通过接种环挑取菌落接种至LB肉汤培养基中，在55℃， 140～160rpm条件下培养1～2d制备接种菌剂
实施例5嗜热地衣芽孢杆菌提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力的评价实验
接种20wt％的嗜热地衣芽孢杆菌菌液到经过生物发酵行业脱水混合堆体中(生物发酵行业脱水污泥：稻草＝2：1，含水率61.94％)，即250g生物发酵行业脱水污泥混合物料接种50g嗜热地衣芽孢杆菌菌液，混合均匀，在具有保温通风作用反应器中反应8d，选取水分去除率、升温效果、蛋白质含量和嗜热蛋白酶活性作为评价水分去除能力的指标。其中水分去除率通过烘干法、升温效果通过温度传感器间断测定、蛋白质含量通过Folin酚法。测定结果如图3～图6所示，结果显示，相较于不接种嗜热地衣芽孢杆菌的对照组，处理之后的生物发酵行业废水脱水污泥的水分去除能力的指标有明显下降，其中水分去除率相较于空白组(8.54％)增高至38.59％，提高4.52倍，升温效果较空白组提高16.2％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株具有胞外聚合物降解功能的嗜热地衣芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO.18735。
2.一株权利要求1所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，包括以下步骤：接种嗜热地衣芽孢杆菌菌液于生物发酵行业脱水污泥中进行生物干化反应，干化反应时间为8～14d。
3.根据权利要求2所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，所述嗜热地衣芽孢杆菌菌液是将固体培养基中的嗜热地衣芽孢杆菌接种至LB液体培养基中，培养2～3d得到的菌液。
4.根据权利要求3所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，液体培养基的培养条件为55℃、140～160rpm。
5.根据权利要求2所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，所述嗜热地衣芽孢杆菌菌液浓度为109个/mL。
6.根据权利要求2所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，嗜热地衣芽孢杆菌菌液的接种量为生物发酵行业废水脱水污泥的18wt％～22wt％。
7.根据权利要求6所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，嗜热地衣芽孢杆菌菌液的接种量为生物发酵行业废水脱水污泥的20wt％。
8.根据权利要求2所述的嗜热地衣芽孢杆菌在提高生物发酵行业废水脱水污泥水分去除能力中的应用，其特征在于，生物发酵行业废水脱水污泥固体含量为15％～20％。
CN201911260573.7A 2019-12-10 2019-12-10 一株嗜热地衣芽孢杆菌及其应用 Pending CN111235052A (zh)

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