CN115584334B - 屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用。本发明提供了保藏编号为CGMCC No.25299的屎肠球菌(Enterococcus faecium)，该菌株筛选自乳清废水，在MRS琼脂培养基中呈1～1.5mm的圆形或椭圆形的白色光滑不透明菌落；电镜下菌体为球型，成对或链状排列，革兰氏阳性菌。本发明的屎肠球菌呈弱酸性，生长迅速，对乳清废水酸化、臭味产生具有较好的抑制作用，能够广泛应用于高蛋白废水的酸化、异味解决方面，对环境保护具有重要意义。

Description

屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用。
背景技术
大豆分离蛋白和豆制品加工过程中会产生大量的大豆乳清废水，据研究，每生产1吨大豆分离蛋白产品，会产生大约30～35m3的大豆乳清水。大豆乳清水含有丰富的有机物，其主要成分是小分子水溶性蛋白质、蔗糖、无机盐，另外还含有少量的大豆低聚糖、淀粉酶、细胞色素、异黄酮类化合物、大豆皂甙、植酸等营养物质。大豆分离蛋白的用量和适用领域逐年增加，不可避免地增加了大豆乳清废水的产生量，这类乳清废水干物质含量低，利用困难，目前主要处理手段为预处理和生化处理相结合。乳清废水经过“气浮+板框”处理掉一半的悬浮物，剩余废水经过厌氧发酵后再利用好氧发酵，将其中的有机成分通过微生物分解，达到排放标准后排放到城市污水管网中。由于乳清废水中蛋白质含量相对比较高，每年4月或11月份，乳清水都会酸化产生异味，酸味较重，而且会有明显的臭味，气味通过生物除臭工艺去除大大增加了成本，并且对板框后滤渣的产量影响较大，因此需要一种绿色环保的工艺解决其酸化、异味问题。
屎肠球菌(Enterococcus faecium、)是人及动物肠道中一种常见微生物菌群，它是一种乳酸菌，能抑制一些菌氨的产生，这一特性主要是由屎肠球菌的酶构成决定的，屎肠球菌与氨产生相关的尿酶、氨基酸脱氨酶的种类少且酶活性低，而与NH4 +同化相关的谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶(GS)的活性比较高，这为屎肠球菌抑制酸化、异味创造可能。
关于屎肠球菌的研究比较多，多数还集中在发酵培养和制备方面，在应用方面也主要集中在微生物饲料添加剂和微生态制剂，屎肠球菌以及由其制备的复合微生态制剂等，目前还没有关于屎肠球菌在大豆乳清废水处理领域方面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用。
本发明提供了屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用。本发明分离的屎肠球菌，能有效抑制乳清废水的酸化、异味产生等环保问题，突破只能靠吸收异味的现有处理工艺局限，从根本上解决异味问题。另外，微生物除臭方法比化学方法更加安全、环保，效果更好，因此在高蛋白废水异味处理中具有广阔的应用空间。本发明的屎肠球菌呈弱酸性，生长迅速，对乳清废水酸化、臭味产生具有较好的抑制作用，能够广泛应用于高蛋白废水的酸化、异味解决方面，对环境保护具有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了屎肠球菌(Enterococcus faecium)，其保藏编号为CGMCCNo.25299。
本发明还提供了所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)在抑制乳清废水酸化和/或去除异味中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)的添加量不低于5％(v/v)；所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)活菌数为1.0×109～2.0×109cfu/mL；
所述屎肠球菌接种于大豆乳清废水后的培养温度为40℃。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)在制备抑制乳清废水酸化和/或去除异味的微生物菌剂中的应用。
本发明还提供了微生物菌剂，包括所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)以及可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了所述微生物菌剂的制备方法，所述微生物菌剂为液体菌剂时，其制备方法包括：挑取所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于培养基中培养；
所述培养包括制备液体种子、种子发酵或发酵培养中的一种或多种；
所述微生物菌剂为固体菌剂时，其制备方法包括：取所述发酵培养获得的菌液与甘油和/或硅藻土混合，离心，冷冻干燥获得菌粉；
所述培养基包括MRS培养基、种子罐培养基或发酵培养基中的一种或多种；
所述MRS培养基包括葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.12g/L，吐温-80 1mL/L，琼脂粉1.8％(固体)，pH＝6.2～7.0；
所述种子罐培养基包括所述MRS培养基和消泡剂15mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵培养采用的培养基包括红糖6％(v/v)，磷酸二氢钾0.04％(v/v)，蛋白胨0.1％(v/v)，酵母粉0.1％(v/v)，糖蜜10％(v/v)，消泡剂0.03％(v/v)，pH＝6.2～6.8；和/或
所述制备液体种子的培养温度为37℃，培养至生长对数期；和/或
所述种子发酵的搅拌速度为60～80rpm，温度为37℃，厌氧发酵，压力为0.05MPa，发酵周期为8～12h；和/或
所述发酵培养的搅拌速度为60～80rpm，温度为37℃，厌氧发酵，压力为0.05MPa，周期为24h；和/或
所述菌液的菌体数量为4.5×109cfu/mL；和/或
所述甘油加入量为0.5～1％(v/v)；和/或
所述硅藻土加入量为1～3％(w/w)；和/或
所述离心为8000rpm，时间为5min；和/或
所述冷冻干燥的温度为-55℃，时间为24h；和/或
所述菌粉的有效活菌数为2.0×1010cfu/g。
本发明还提供了所述制备方法制得的微生物菌剂。
本发明还提供了所述微生物菌剂在抑制乳清废水酸化和/或去除异味中的应用。
本发明还提供了抑制乳清废水酸化和/或去除异味的方法，包括在乳清废水中接种所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)和/或所述微生物菌剂的步骤。
本发明提供的屎肠球菌能有效抑制乳清废水的酸化、异味产生等环保问题，突破只能靠吸收异味的现有处理工艺局限，从根本上解决异味问题。另外，微生物除臭方法比化学方法更加安全、环保，效果更好，因此在高蛋白废水异味处理中具有广阔的应用空间。本发明的屎肠球菌呈弱酸性，生长迅速，对乳清废水酸化、臭味产生具有较好的抑制作用，能够广泛应用于高蛋白废水的酸化、异味解决方面，对环境保护具有重要意义。
生物保藏说明
生物材料：LBSW22-03，分类命名：屎肠球菌(Enterococcus faecium)，于2022年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25299。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2中菌株LBSW22-03在平板上的菌落形态；
图2示实施例2中菌株LBSW22-03在显微镜下的形态；
图3示实施例4中异味大豆乳清废水组(未加屎肠球菌)和5％屎肠球菌处理组大豆乳清废水(无异味)的HPLC有机酸检测图谱；其中，A：异味大豆乳清废水组(未加屎肠球菌)；B：5％屎肠球菌处理组大豆乳清废水；箭头分别为丙酸和丁酸的出峰；
图4示实施例4中酸化过程菌落数量变化；其中，A：酸化过程对照组的菌落数量；B：酸化过程试验组的菌落数量。
具体实施方式
本发明公开了屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种屎肠球菌，达到有效抑制乳清废水酸化和异味产生的目的。
为实现上述目的，本发明从乳清废水中筛选分离获得一株乳酸菌，经鉴定为屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种名称：LBSW22-03，保藏编号为CGMCC No.25299，保藏日期为2022年07月14日。
所述的保藏编号为CGMCC No.25299屎肠球菌LBSW22-03显微镜下细胞呈椭圆形或球形，无芽孢，无鞭毛；菌株革兰氏染色呈阳性，兼性厌氧；菌株在37℃恒温培养箱中培养24h，可形成表面光滑、有凸起、边缘整齐的乳白色菌落，菌落直径为1～1.5mm。
本发明提供一种屎肠球菌LBSW22-03在乳清废水酸化异味解决中的应用：
所述应用，其特征在于，所述屎肠球菌的生物菌剂制备方法为：
将保藏编号为CGMCC No.25299的屎肠球菌接种至MRS培养基中，于37℃恒温箱中厌氧培养至菌株生长的对数期；以1％的接种量接入50L种子罐，厌氧发酵8～12h后转入300L发酵培养基中，在温度37℃，厌氧发酵24h；
进一步的，所述制备方法，其特征在于，还包括将所制备液体微生物菌剂添加硅藻土和轻质碳酸钙制备成固体微生物菌剂。
进一步的，所述制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分的原料制备而成：红糖6％，磷酸二氢钾0.04％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，糖蜜10％，消泡剂0.03％，pH＝6.2～6.8.
进一步的，所述应用，其特征在于，所述屎肠球菌的添加量为5％。
进一步的，所述的应用，其特征在于，培养温度控制在40℃。
进一步的，所述的应用，其特征在于，所用污水为大豆乳清废水。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明分离的屎肠球菌，能有效抑制乳清废水的酸化、异味产生等环保问题，突破只能靠吸收异味的现有处理工艺局限，从根本上解决异味问题。另外，微生物除臭方法比化学方法更加安全、环保，效果更好，因此在高蛋白废水异味处理中具有广阔的应用空间。
本发明提供的屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：乳清废水指标检测
所用污水为乳清废水，检测方法如下：
pH的测定采用玻璃电极法(GB 6920-86)，易氧化有机质采用高锰酸钾氧化法(NY/T 2876-2015)，化学需氧量(COD)的测定采用快速消解分光光度法(HJ/T 399-2007)，悬浮物(ss)检测参照国标GB 11901-89水质悬浮物的测定重量法，总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ636-2012)，总磷测定采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)，总钾测定采用火焰光度法(NY/T 2540-2014)。
如表1所示，经过检测，乳清废水预处理前COD和悬浮物含量较高，经过预处理48.0％的COD和47.1％的悬浮物被去除，降低厌氧罐的处理负荷，保证后续处理的稳定运行。
表1污水指标检测
Figure BDA0003922710400000061
实施例2：生物菌株筛选和分离
菌株分离：菌株分离自乳清废水，废水来源于山东省滨州市博兴县某污水处理厂预处理车间。取乳清废水、生活污水等10mL于90mL无菌生理盐水中稀释，并以10倍梯度稀释方式稀释至10-5，将稀释后菌液1mL加入到无菌平板中，倒入冷却至45～50℃含10g/L碳酸钙的MRS固体培养基，冷却后放37℃恒温培养箱中培养24h，在超净工作台中挑取含有透明圈，形态大小不同的单克隆到新鲜的MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱中培养24h，保藏甘油管，剩余菌液备用。
功能初筛：对获得菌液进行功能鉴定，测定方法如下：乳清废水85mL加入10mL的酸化水，再分别接种分离的乳酸菌5mL，同时以蒸馏水5mL作空白对照，37℃恒温培养箱中培养72h，挑选没有臭味的乳清水，并记录乳酸菌编号。
共分离乳酸菌20余株，其中QJ-5效果最好，将所筛得菌株QJ-5于MRS平板划线，37℃恒温培养箱中培养24h，可形成表面光滑、有凸起、边缘整齐的乳白色菌落，菌落直径为1～1.5mm，菌落形态如图1所示，显微镜下细胞呈椭圆形或球形，无芽孢，无鞭毛，显微镜形态如图2所示，属于屎肠球菌(Enterococcus faecium)，将其命名为LBSW22-03。
实施例3：微生物菌剂制备
MRS培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.12g/L，吐温-80 1mL/L，琼脂粉1.8％(固体)蒸馏水余量，pH 6.2～7.0，121℃灭菌20min。
液体种子制备：将保藏编号为CGMCC No.25299的屎肠球菌斜面菌种接种至300mLMRS液体培养基中，置于37℃培养箱中静止培养24h；
50L种子发酵罐：将上述制备好的液体种子按照1％(v/v)的接种量接入装液量为70％的50L种子罐中扩大培养，搅拌速度为60～80rpm，发酵温度为37℃，厌氧发酵，发酵罐保持压力0.05MPa，发酵周期为8～12h；
种子罐培养基配方为MRS培养基，消泡剂15mL，121℃，灭菌30min。
发酵罐发酵：将上述获得的50L发酵罐种子液按照5～10％(v/v)的接种量接入装液量为60～70％的300L发酵罐的培养基中培养，培养条件：搅拌速度为60～80rpm，发酵温度为37℃，厌氧发酵，发酵罐保持压力0.05MPa，发酵周期为24h；发酵结束后经稀释涂布法检测(GB 4789.2-2016)，菌体数量达到4.5×109cfu/mL，将发酵完成后培养液出罐后即得液体菌剂；
发酵培养基配方为：红糖6％(v/v)，磷酸二氢钾0.04％(v/v)，蛋白胨0.1％(v/v)，酵母粉0.1％(v/v)，糖蜜10％(v/v)，消泡剂0.03％(v/v)，pH＝6.2～6.8.
制备获得上述的液体菌剂后，在此基础上还可以获得固体菌剂，其制备方法如下：
发酵结束后，将上述发酵完成后的菌液按照0.5～1％(v/v)加入甘油，按照质量比添加1～3％的硅藻土吸附处理发酵液后，对发酵液以8000rpm进行离心5min、分离得到固体菌体，进行冷冻干燥，冻干条件是温度-55℃，时间24h，处理后获得菌粉，菌粉的含水率控制在5％以下，经稀释涂布法检测(GB 4789.2-2016)有效活菌数为2.0×1010cfu/g。
实施例4：屎肠球菌在乳清废水酸化、异味解决中的应用
4.1屎肠球菌接种量试验
取250mL三角瓶6个，分别加入正常的大豆乳清废水90mL，87.5mL，85mL，80mL，75mL，70mL；酸化发臭的大豆乳清水10mL/瓶，对应的分别加入屎肠球菌LBSW22-03 0mL，2.5mL，5mL，10mL，15mL，20mL，屎肠球菌对应的浓度分别为0％，2.5％，5％，10％，15％，20％，保鲜膜封口，放入40℃培养箱中培养。
结果如表2所示，经过试验，屎肠球菌添加量5％就能够抑制酸化和臭味产生。
表2屎肠球菌接种量对酸化、异味的影响
Figure BDA0003922710400000081
4.2大豆乳清废水处理过程中有机酸的HPLC检测
检测由山东大学微生物技术研究院完成。正常味道的大豆乳清废水为淡淡的酸奶味道，而发臭的大豆乳清废水为脂肪酸腐败的酸臭味。因此，检测正常味道的大豆乳清废水(5％屎肠球菌处理)和发臭的大豆乳清废水(未经屎肠球菌处理)中各有机酸的含量，进一步说明屎肠球菌对臭味有机酸产生的抑制作用。
取大豆乳清废水1mL，13400rpm离心5min，保留上清。用0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测。采用岛津C18色谱柱和紫外检测器(240nm)检测。流动相为含1％三氟乙酸和20％乙腈的水溶液，流速为0.5mL/min，柱温为40℃
各种有机酸的出峰时间如表3所示。如图3所示，发臭的大豆乳清废水(未经屎肠球菌处理)中的丙酸和丁酸峰面积即含量明显高于正常味道的大豆乳清废水(5％屎肠球菌处理)。将丙酸和丁酸混合之后，闻味道发现有明显的脂肪酸腐败的酸臭味，和发臭的大豆乳清废水保持一致。因此，屎肠球菌可抑制大豆乳清废水中丁酸和丙酸的产生，进而抑制酸化异味。
表3 HPLC检测各种有机酸的出峰时间
编号 有机酸 出峰时间
1 顺乌头酸 7.522
2 酮戊二酸 8.35
3 柠檬酸 8.371
4 异柠檬酸 8.417
5 葡萄糖 9.283
6 丙酮酸钠 9.613
7 D-半乳糖 9.848
8 苹果酸 9.885
9 琥珀酸 11.441
10 乳酸 12.283
11 甲酸 13.451
12 富马酸 13.883
13 乙酸钠 14.235
14 丙酸 16.430
15 GABA 17.296
16 丁酸 19.687
4.3酸化过程重要指标的变化趋势
试验用50L带盖塑料桶进行，共设2组，1#桶为对照组，乳清废水42.5L，酸化水5L，蒸馏水2.5L，2#桶试验组，乳清废水42.5L，酸化水5L，屎肠球菌LBSW22-03 2.5L，都密封放在阴凉处。期间取样，检测pH，溶氧(DO)和气味情况。
结果如表4，对照组第6天开始变臭，取样检测菌落数量，结果如图4所示，乳清水在酸化过程中，菌落数量增多，对照组的平均菌落数量为9.5×105cfu/mL，pH升高，溶氧(DO)降低，酸化完成臭味较大，而添加屎肠球菌LBSW22-03的试验组只有淡淡的酸味，没有臭味，且平均菌落数量为4.2×105cfu/mL，因此屎肠球菌LBSW22-03能够抑制酸化过程中臭味的产生，也能抑制菌落数量的增多。
表4乳清废水酸化、异味过程中重要指标变化
Figure BDA0003922710400000101
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.屎肠球菌(Enterococcus faecium)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.25299。
2.如权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)在抑制乳清废水酸化和/或去除异味中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)的添加量不低于5％(v/v)；所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)活菌数为1.0×109～2.0×109cfu/mL。
4.如权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)在制备抑制乳清废水酸化和/或去除异味的微生物菌剂中的应用。
5.微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)以及可接受的辅料或助剂。
6.如权利要求5所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂时，其制备方法包括：挑取所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于培养基中培养；
所述培养包括制备液体种子、种子发酵或发酵培养中的一种或多种；
所述微生物菌剂为固体菌剂时，其制备方法包括：取所述发酵培养获得的菌液与甘油和/或硅藻土混合，离心，冷冻干燥获得菌粉。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养采用的培养基包括红糖6％(v/v)，磷酸二氢钾0.04％(v/v)，蛋白胨0.1％(v/v)，酵母粉0.1％(v/v)，糖蜜10％(v/v)，消泡剂0.03％(v/v)，pH＝6.2～6.8；如/或
所述制备液体种子的培养温度为37℃，培养至生长对数期；和/或
所述种子发酵的搅拌速度为60～80rpm，温度为37℃，厌氧发酵，压力为0.05MPa，发酵周期为8～12h；和/或
所述发酵培养的搅拌速度为60～80rpm，温度为37℃，厌氧发酵，压力为0.05MPa，周期为24h；和/或
所述菌液的菌体数量为4.5×109cfu/mL；和/或
所述甘油加入量为0.5～1％(v/v)；和/或
所述硅藻土加入量为1～3％(w/w)；和/或
所述离心为8000rpm，时间为5min；和/或
所述冷冻干燥的温度为-55℃，时间为24h；和/或
所述菌粉的有效活菌数为2.0×1010cfu/g。
8.如权利要求6或7所述制备方法制得的微生物菌剂。
9.如权利要求5或8所述的微生物菌剂在抑制乳清废水酸化和/或去除异味中的应用。
10.抑制乳清废水酸化和/或去除异味的方法，其特征在于，包括在乳清废水中接种如权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)和/或如权利要求5或8所述的微生物菌剂的步骤。
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