CN117683074A - 蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法 - Google Patents
蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117683074A CN117683074A CN202311708170.0A CN202311708170A CN117683074A CN 117683074 A CN117683074 A CN 117683074A CN 202311708170 A CN202311708170 A CN 202311708170A CN 117683074 A CN117683074 A CN 117683074A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- inhibitor
- bacillus cereus
- edta
- protein
- protease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 title abstract description 10
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 title abstract description 10
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 25
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 47
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 21
- 239000002893 slag Substances 0.000 abstract description 12
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 12
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 6
- 239000002131 composite material Substances 0.000 abstract description 6
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 abstract description 6
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 abstract 2
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 7
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 5
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 5
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 5
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 235000019710 soybean protein Nutrition 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHWNNYZBHZIQQV-UHFFFAOYSA-L calcium;disodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)azaniumyl]ethyl-(carboxylatomethyl)azaniumyl]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Ca+2].[O-]C(=O)C[NH+](CC([O-])=O)CC[NH+](CC([O-])=O)CC([O-])=O SHWNNYZBHZIQQV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 241001645733 Bacillus pacificus Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 229930187719 Soyasaponin Natural products 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002515 isoflavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229960000414 sodium fluoride Drugs 0.000 description 1
- 229960002901 sodium glycerophosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- REULQIKBNNDNDX-UHFFFAOYSA-M sodium;2,3-dihydroxypropyl hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OCC(O)COP(O)([O-])=O REULQIKBNNDNDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法。本发明公开了蛋白酶的抑制剂及其在提高乳清废水的蛋白渣产量中的应用。研究表明，蜡样芽孢杆菌从乳清水气浮渣中分离，具有较高的蛋白酶活性，其存在严重影响了蛋白渣的产量，氟化钠和EDTA‑2Na对该菌蛋白酶活性抑制较强烈，抑制率分别达到56.13％和52.21％，但是钙离子对该菌株抑制率达到80％以上，利用钙离子、锰离子和EDTA制备成复合抑制剂，将该抑制剂应用于乳清废水蛋白渣的提取工艺，用量少，蛋白酶活性受到严重抑制，酶活为0U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法。
背景技术
大豆分离蛋白和豆制品加工过程中会产生大量的大豆乳清废水，据研究，每生产1吨大豆分离蛋白产品，会产生大约30～35m3的大豆乳清水。大豆乳清水含有丰富的有机物，其主要成分是小分子水溶性蛋白质、蔗糖、无机盐，另外还含有少量的大豆低聚糖、淀粉酶、细胞色素、异黄酮类化合物、大豆皂甙、植酸等营养物质。大豆分离蛋白的用量和适用领域逐年增加，不可避免地增加了大豆乳清废水的产生量，这类乳清废水干物质含量低，利用困难，目前我公司主要采用预处理和生化处理相结合的方式进行处置。乳清废水经过“气浮+板框”提取出一半的悬浮物，剩余废水经过厌氧发酵后再利用好氧发酵，将其中的有机成分通过微生物分解，达到排放标准后排放到城市污水管网中，而提取的悬浮物经过干燥等步骤最终成为饲料原料-蛋白渣，该蛋白渣蛋白含量＞45％，水分＜13％，是一种优质的蛋白原料。经过近几年的研究发现，每年夏天气浮浮渣较粘，碟螺效果差，导致蛋白渣的产量较低，对浮渣进行菌群分析，发现浮渣中杆菌较多，经过检测发现蛋白酶活性较高达到2.0U/mL以上。
芽孢杆菌在自然界中分布广泛，一般为好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，胞内可产生圆形、椭圆形或柱状的内生芽孢。芽孢壁中有皮质层，对热、紫外线和离子辐射及抗菌素具有很高的抗性，可以耐受饲料加工、储藏、耐酸、高温、耐挤压等，芽孢杆菌具有较强的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶能力，在蛋白加工废水处理领域，芽孢杆菌的存在造成蛋白产量较低，需要改变条件或加入抑制剂抑制蛋白酶活性。
蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。金属离子在蛋白酶水解大豆分离蛋白的过程中起到重要作用，有些金属离子起到抑制作用，降低大豆寡肽得率，有些金属离子起到促进作用，提升大豆寡肽得率。对于大豆分离蛋白废水处理厂，抑制蛋白酶活性，将有利于提高蛋白渣产量，提高企业的经济效益。因此，提供一种抑制蛋白酶活性、提高蛋白渣产量的方法具有重要的显示意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法，首先从乳清水中分离出产蛋白酶的主要菌株，然后对菌进行分析和研究，最后提供菌株的抑制条件和抑制剂的制备方法，达到抑制蛋白酶活，提高蛋白渣产量的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了用于抑制蛋白酶的抑制剂，包括：
(I)、Ca2+和Mn2+；或
(II)、Mn2+和EDTA；或
(III)、Ca2+、Mn2+和EDTA；
所述蛋白酶包括蜡样芽孢杆菌产生的蛋白酶。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抑制剂中所述蜡样芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.28513。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抑制剂包括：
(I)、CaCl2和MnCl2；或
(II)、MnCl2和EDTA；或
(III)、CaCl2、MnCl2和EDTA。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抑制剂中，所述CaCl2与所述MnCl2的重量比为11:20。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抑制剂中，所述MnCl2与所述EDTA的重量比为50:73。
在本发明的一些具体实施方案中，上述抑制剂中，所述EDTA、所述CaCl2与所述MnCl2的重量比为146:55:100。
本发明还提供了上述抑制剂在提高乳清废水的蛋白渣产量中的应用。
本发明还提供了提取蛋白渣的方法，包括：取上述抑制剂与乳清废水混合，分离蛋白渣。
在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中：
所述EDTA在所述抑制剂中的浓度为14.6g/L；和/或
所述CaCl2在所述抑制剂中的浓度为5.5g/L；和/或
所述MnCl2在所述抑制剂中的浓度为10g/L；和/或
所述抑制剂与所述乳清废水的体积比为2‰。
本发明还提供了蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其保藏编号为CGMCCNo.28513。
本发明还提供了上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在分解蛋白中的应用。
本发明还提供了微生物菌剂，包括上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，以及可接受的辅料或助剂。
本发明的方法有如下效果：
1、实验表明废水气浮渣pH偏酸性，溶解氧含量较高，悬浮物含量较高，镜检发现气浮渣中含有非常多的长杆菌，蛋白渣产量较低可能与杆菌有关，经鉴定发现杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；
2、对废水中的蜡样芽孢杆菌进行实验，结果发现：1)蜡样芽孢杆菌随转速的提高呈现先降低后升高的趋势，在100rpm时蛋白酶活性越低；2)氟化钠和EDTA-2Na对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活性抑制率达到50％以上；3)Ca2+，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，Mn2+等金属离子对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活有抑制作用，其中Ca2+抑制率超过80％，Fe3+，Mn2+次之。
3、利用EDTA、氯化钙和氯化锰制备复合抑制剂，往气浮渣中蛋白酶酶活性为3.53U/mL的废水中加入复合抑制剂后，蛋白酶活降为-0.64U/mL，蛋白酶抑制率超过100％，表明复合抑制剂能显著提高蛋白渣的产量。
生物保藏说明
生物材料：LBSW23-02，分类命名：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2023年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.28513。
本发明中所述LBSW23-02或GJFL-8即为上述保藏编号为CGMCC No.28513的菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示气浮渣镜检菌落形态；
图2示菌液蛋白酶活性检测；
图3示菌落形态；
图4示显微镜下菌株形态；
图5示蜡样芽孢杆菌菌落数量检测。
具体实施方式
本发明公开了蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了蜡样芽孢杆菌的抑制条件和抑制剂的制备方法：
进一步的，所述抑制条件包括：所述蜡样芽孢杆菌含量低于1.0％(v/v)。
进一步的，所述抑制条件包括：所述蜡样芽孢杆菌的转速不超过100rpm。
进一步的，所述抑制条件包括：所述蜡样芽孢杆菌抑制剂为EDTA-2Na和氟化钠。
更进一步的，所述抑制条件包括：所述蜡样芽孢杆菌抑制剂EDTA-2Na和氟化钠浓度为2mmol/L。
进一步的，所述抑制条件包括：所述蜡样芽孢杆菌金属抑制剂为Ca2+、Fe3+和Mn2+。
更进一步的，所述抑制条件包括：所述蜡样芽孢杆菌金属抑制剂的浓度为5mmol/L。
进一步的，所述抑制剂制备方法包括：所述抑制剂由包括以下组分的原料制备而成：EDTA 14.6重量份，CaCl2 5.5重量份，MnCl2 10重量份。
进一步的，所述抑制剂的应用包括：所述抑制剂的添加量为2‰。
进一步的，所述的抑制剂的应用包括：乳清水中加入所述抑制剂蛋白酶活性为0U/mL。
本发明所述的乳清废水包括采用“碱溶酸沉”工艺制备的大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白生产过程中产生的废水。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：乳清废水气浮渣指标检测
对取回的气浮渣进行指标检测，利用溶氧仪(哈希)检测溶氧，pH计检测pH，悬浮物参照GB11901-1989悬浮物的测定。
微生物样本制片步骤如下：1)涂片取洁净的载玻片1张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一滴无菌水，用接种环在火焰旁从培养基上挑取少量菌体与水混合。用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层；2)干燥放在桌面上，待其自然干燥；3)固定将已干燥的涂片标本向上，在火焰上通过3～4次固定；4)染色在涂片上滴加0.1％的吕氏碱性美蓝染液1～2滴，使其布满涂菌部分，染色1分钟；5)冲洗斜置玻片，倾去染液。用水轻轻冲去染液，至流水变清；6)吸干用吸水纸轻轻吸去玻片上的水分，干燥后镜检。
通过表1和图1可以看出气浮渣pH偏酸性，溶解氧含量较高，悬浮物含量较高，镜检发现气浮渣中含有非常多的长杆菌，产量较低可能与这些杆菌有关。
表1：气浮渣指标检测
| 名称 | pH | 溶解氧(mg/L) | 悬浮物(mg/L) | 游离氨基酸(g/L) | 粗蛋白(％) |
| 气浮渣1 | 3.42 | 0.56 | 26050 | 3.75 | 3.26 |
取气浮渣200mL放入500mL三角瓶中，37℃150rpm震荡培养24小时，取样检测游离氨基酸含量和粗蛋白含量，游离氨基酸检测方法参照GB/T8314-2013茶游离氨基酸总量的测定；粗蛋白检测参照GB/T 6432-2018饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法。结果如表2所示气浮渣经过24小时培养后，pH升高，溶解氧降低，悬浮物减少，游离氨基酸增加，表明杆菌实现增长，并产生分解蛋白质的蛋白酶，导致悬浮物减少，游离氨基酸增加。
表2：气浮渣培养后指标检测
| 名称 | pH | 溶解氧(mg/L) | 悬浮物(mg/L) | 游离氨基酸(g/L) | 粗蛋白(％) |
| 气浮渣2 | 4.25 | 0.20 | 24960 | 5.76 | 3.17 |
实施例2：芽孢杆菌筛选
在山东省滨州市博兴县某污水处理厂中，乳清废水经过“气浮+板框”工艺将乳清废水中的蛋白渣提取出来，但是每年夏天尤其是6～8月，蛋白渣产量较低，经过研究发现气浮渣较粘，叠螺效率较差，因此本发明人挑选较粘气浮渣样品，显微镜镜检发现里面含有非常多的杆状芽孢杆菌，因此分离样品中的菌落，步骤如下：取10g较粘气浮渣加入到90mL带玻璃珠的无菌水中，摇床中震荡30min，继续在超净工作台梯度稀释至10^5，取100微升涂布在LB平板上，37℃恒温培养箱中培养24小时，在超净工作台中挑取形态大小不同的单克隆到15mL新鲜的LB液体培养基中，35℃恒温培养箱中培养24小时，每株菌保藏甘油管3管，剩余菌液备用。
杆菌功能初筛：对获得菌液进行涂片观察，在显微镜下挑选出形状为杆菌的菌液进行后续操作，对杆菌进行蛋白酶活性检测-福林酚法，检测步骤如下：1)对照组和实验组分别取菌液1mL放入40℃预热2分钟；2)对照组加三氯乙酸2mL，实验组加酪素溶液1mL，摇匀，40℃保温10分钟；3)对照组加酪素溶液1mL，实验组加三氯乙酸2mL，摇匀，40℃保温10分钟，过滤；4)分别取滤液1mL，加入碳酸钠溶液5mL，后加入福林酚使用液1mL，置于40℃水浴中显色20min；5)用分光光度计于波长680nm处测吸光度，从标准曲线上查找氨基酸含量；以水代替发酵液进行4)、5)的操作作为参比液。
通过镜检和蛋白酶活性检测，共分离菌5株，其中编号GJFL-8蛋白酶活活性最高(如表3、图2所示)。将所筛得GJFL-8菌株于LB平板划线，37℃恒温培养箱中培养24h，可形成圆形或椭圆形的白色光滑不透明菌落，菌落形态如图3所示，显微镜下菌体为直杆状，成对或链状排列，革兰氏阳性菌，形态如图4所示，后送华大基因(湖北，武汉)测序。经过BLAST比对，结果显示其与Bacillus cereus、Bacillus pacificus和Bacillus sp.同源，后对其进行生理生化指标检测：该菌能使淀粉水解，甲基红实验、硝酸盐还原实验、运动性实验、V-P实验、明胶液化实验和过氧化氢酶实验均呈阳性；能够利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、麦芽糖，但不能利用阿拉伯糖、L-鼠李糖、木糖、乳糖、木糖醇、山梨醇和D-甘露醇，经鉴定该菌株属于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，将其命名为LBSW23-02。
表3
| 名称 | 蛋白酶活性(U/mL) |
| GJFL-5 | 1.04 |
| GJFL-8 | 6.99 |
| LB-3 | 0.71 |
| LB-4 | 0.73 |
| LB-5 | 3.70 |
实施例3：微生物菌剂制备
LB培养基配方为：氯化钠1％，酵母粉0.5％，蛋白胨1％，蒸馏水定容，pH 6.8～7.0，121℃灭菌21min。
菌种活化：在超净工作台中，挑取斜面菌种LBSW23-02至200mL LB液体培养基中，置于37℃震荡摇床中150rpm培养24h；发酵结束后检测菌落数量，检测方法参照GB 4789.2食品微生物学检验菌落数量检测。如图5所示，经过检测蜡样芽孢杆菌LBSW23-02发酵24小时菌落数量为1.27*10^8CFU/mL。
实施例4：蜡样芽孢杆菌抑制条件优化
4.1接种量对蜡样芽孢杆菌的影响
取5个250mL锥形瓶分别加入乳清废水100mL，99mL，98mL，97mL，96mL对应加入培养24小时的实施例3的活化菌种LBSW23-02 0mL，1mL，2mL，3mL，4mL，使接种量分别为0％，1％，2％，3％，4％，以封口膜封口，放入37℃震荡摇床中150rpm培养48小时，培养结束后参照实施例2的步骤检测蛋白酶活性。
经过检测，结果如表4所示，随着接种量的提高蛋白酶活性越来越高，所以要抑制蜡样芽孢杆菌LBSW23-02的生长，溶液中蜡样芽孢杆菌的数量应少于1.27*10^6CFU/mL，接种量少于1％。
表4：接种量对蜡样芽孢杆菌的影响
4.2转速对蜡样芽孢杆菌的影响
取250mL三角瓶10个，分成2组，对照组和实验组，对照组不接菌，实验组接种1％的实施例3的蜡样芽孢杆菌LBSW23-02，总体积为100mL，转速分别设置为静止(0rpm)，50rpm，100rpm，150rpm和200rpm；每个转速里面含有实验组和对照组，培养温度为37℃，时间24小时。培养完成检测发酵液中的氨基酸含量和蛋白酶活性，氨基酸含量检测参照GB/T 8314-2013茶游离氨基酸总量的测定。
结果如表5所示，蜡样芽孢杆菌随转速的提高呈现先降低后升高的趋势，在100rpm时蛋白酶活性越低，因此蜡样芽孢杆菌的抑制条件为转速控制在100rpm。
表5：转速对蜡样芽孢杆菌的影响
实施例5：蜡样芽孢杆菌蛋白酶抑制剂筛选
5.1氨基酸残基抑制剂对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活性的影响
将EDTA-2Na、焦磷酸钠、甘油磷酸钠和氟化钠等试剂溶于蒸馏水中，配置成2mmol/L的溶液，而苯甲基磺酰氟(PMSF)用无水乙醇溶解，同样配成2mmol/L的溶液。用抑制剂处理蜡样芽孢杆菌蛋白酶，观察抑制剂对蛋白酶活性的影响，处理步骤如下：取0.1mL抑制剂与0.9mL实施例3的LBSW23-02发酵液混合，4℃保温30分钟后，取出测定蛋白酶活性。以用蒸馏水代替抑制剂且在4℃保温30分钟后的酶液作为空白对照，蛋白酶活性抑制率计算公式为：
抑制率(％)＝(空白-处理)*100/空白。
结果如表6所示，氟化钠和EDTA-2Na对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活性抑制最强烈达到50％以上，而苯甲基磺酰氟(PMSF)对蛋白酶抑制效果较差。
表6：蛋白酶抑制剂筛选
5.2金属离子对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活性的影响
称取适量试剂，用蒸馏水将氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁，硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、氯化镍、氯化钴等配制成5mmol/L的溶液，备用。同样用金属离子处理蜡样芽孢杆菌蛋白酶，观察金属离子对蛋白酶活性的影响，处理步骤如下：取0.1mL 5mmol/L金属离子溶液与0.9mL实施例3的LBSW23-02发酵液混合，4℃保温30分钟后，取出测定蛋白酶活性。用蒸馏水代替金属离子进行相同实验作为空白对照，计算蛋白酶活性抑制率。
结果如表7所示，Ca2+，Mg2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，Mn2+等金属离子对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活有抑制作用，其中Ca2+抑制率超过80％，Fe3+，Mn2+次之。
表7：金属离子对蛋白酶活性的影响
实施例6：复合抑制剂在提高乳清废水的蛋白渣产量中的应用
利用EDTA、氯化钙和氯化锰制备复合抑制剂，分别称取EDTA 14.6g，氯化钙5.5g，氯化锰10g，温度80℃，溶于热水中定容至1000mL，用同样的方法配制5.5g/L氯化钙、10g/L氯化锰、14.6g/L EDTA、5.5g/L氯化钙+14.6g/LEDTA、10g/L氯化锰+14.6g/L EDTA，分别应用于乳清废水蛋白渣提取中，添加量为2‰(v/v)，空白对照添加相同量的蒸馏水，混合均匀，放入37℃摇床，150rpm震荡30分钟后，取样5mL检测气浮渣中蛋白酶活性，剩余样品继续放在摇床上培养24小时，发酵结束后检测悬浮物含量，蛋白提高率计算公式为：
W(％)＝(C实验-C空白)*100/C空白
C实验实验组悬浮物含量；
C空白空白对照悬浮物含量；
悬浮物检测参照GB 11901-89水质悬浮物的测定重量法。
检测结果如表8所示，气浮渣中蛋白酶酶活性为3.53U/mL，加入复合抑制剂后蛋白酶活为-0.64U/mL，蛋白酶抑制率超过100％，提高蛋白渣的产量10％以上。
表8：复合抑制剂对气浮渣蛋白酶活性的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.蛋白酶的抑制剂，其特征在于，包括：
(I)、Ca2+和Mn2+；或
(II)、Mn2+和EDTA；或
(III)、Ca2+、Mn2+和EDTA；
所述蛋白酶包括蜡样芽孢杆菌产生的蛋白酶。
2.如权利要求要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.28513。
3.如权利要求要求1或2所述的抑制剂，其特征在于，包括：
(I)、CaCl2和MnCl2；或
(II)、MnCl2和EDTA；或
(III)、CaCl2、MnCl2和EDTA。
4.如权利要求要求3所述的抑制剂，其特征在于，包括：
所述CaCl2与所述MnCl2的重量比为11:20；或
所述MnCl2与所述EDTA的重量比为50:73；或
所述EDTA、所述CaCl2与所述MnCl2的重量比为146:55:100。
5.如权利要求1至4任一项所述的抑制剂在提高乳清废水的蛋白渣产量中的应用。
6.提取蛋白渣的方法，其特征在于，包括：取如权利要求1至4任一项所述的抑制剂与乳清废水混合，分离蛋白渣。
7.如权利要求要求6所述的方法，其特征在于：
所述抑制剂为如权利要求3或4所述的抑制剂；
所述CaCl2在所述抑制剂中的浓度为5.5g/L；
所述MnCl2在所述抑制剂中的浓度为10g/L；
所述EDTA在所述抑制剂中的浓度为14.6g/L；
所述抑制剂与所述乳清废水的体积比为2‰。
8.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.28513。
9.如权利要求8所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在分解蛋白中的应用。
10.微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求8所述的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，以及可接受的辅料或助剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311708170.0A CN117683074A (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311708170.0A CN117683074A (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117683074A true CN117683074A (zh) | 2024-03-12 |
Family
ID=90131515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311708170.0A Pending CN117683074A (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117683074A (zh) |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD226156A3 (de) * | 1981-12-30 | 1985-08-14 | Inst F Techn Miikrobiologie | Verfahren zur herstellung einer metalloprotease aus bacillus cereus |
| KR20000063545A (ko) * | 2000-07-21 | 2000-11-06 | 옥민 | 신규한 바실러스 속 균주 및 이를 이용한 토양 미생물 제제 |
| US6960465B1 (en) * | 2001-06-27 | 2005-11-01 | Northwestern University | Increased cell resistance to toxic organic substances |
| CN103781904A (zh) * | 2011-09-13 | 2014-05-07 | 奥林巴斯株式会社 | 含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法 |
| CN104745504A (zh) * | 2015-03-06 | 2015-07-01 | 华南理工大学 | 一株深海来源的蜡状芽孢杆菌及其在产中性蛋白酶中的应用 |
| KR20160141267A (ko) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) 균주 및 이의 용도 |
| CN106636043A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-10 | 广州立白企业集团有限公司 | 制备蛋白酶的方法 |
| CN110668665A (zh) * | 2019-08-26 | 2020-01-10 | 西安建筑科技大学 | 一种剩余污泥处理剂的制备方法 |
| CN112126536A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-12-25 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 蜡样芽孢杆菌角蛋白酶的应用及应用方法 |
| CN114874942A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-08-09 | 四川农业大学 | 一株产蛋白酶的蜡样芽胞杆菌及其在大曲中的应用 |
| CN115584334A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-01-10 | 山东绿邦生物科技有限公司 | 屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用 |
| CN116410882A (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-11 | 东北农业大学 | 一株产耐高温蛋白酶的菌株及其蛋白酶的制备方法 |
-
2023
- 2023-12-13 CN CN202311708170.0A patent/CN117683074A/zh active Pending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD226156A3 (de) * | 1981-12-30 | 1985-08-14 | Inst F Techn Miikrobiologie | Verfahren zur herstellung einer metalloprotease aus bacillus cereus |
| KR20000063545A (ko) * | 2000-07-21 | 2000-11-06 | 옥민 | 신규한 바실러스 속 균주 및 이를 이용한 토양 미생물 제제 |
| US6960465B1 (en) * | 2001-06-27 | 2005-11-01 | Northwestern University | Increased cell resistance to toxic organic substances |
| CN103781904A (zh) * | 2011-09-13 | 2014-05-07 | 奥林巴斯株式会社 | 含有胰液成分的生物试样中的蛋白酶的抑制方法 |
| CN104745504A (zh) * | 2015-03-06 | 2015-07-01 | 华南理工大学 | 一株深海来源的蜡状芽孢杆菌及其在产中性蛋白酶中的应用 |
| KR20160141267A (ko) * | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) 균주 및 이의 용도 |
| CN106636043A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-10 | 广州立白企业集团有限公司 | 制备蛋白酶的方法 |
| CN110668665A (zh) * | 2019-08-26 | 2020-01-10 | 西安建筑科技大学 | 一种剩余污泥处理剂的制备方法 |
| CN112126536A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-12-25 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 蜡样芽孢杆菌角蛋白酶的应用及应用方法 |
| CN116410882A (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-11 | 东北农业大学 | 一株产耐高温蛋白酶的菌株及其蛋白酶的制备方法 |
| CN114874942A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-08-09 | 四川农业大学 | 一株产蛋白酶的蜡样芽胞杆菌及其在大曲中的应用 |
| CN115584334A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-01-10 | 山东绿邦生物科技有限公司 | 屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DODDAPANENI, KIRAN KUMAR等: "Purification and characterization of a solvent and detergent-stable novel protease from Bacillus cereus", 《MICROBIOLOGICAL RESEARCH》, vol. 164, no. 04, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 383 - 390, XP026319418, DOI: 10.1016/j.micres.2007.04.005 * |
| 佘新松等: "一株产耐高温蛋白酶蜡样芽胞杆菌的分子鉴定和酶学性质研究", 《核农学报》, vol. 34, no. 08, 17 June 2020 (2020-06-17), pages 1698 - 1704 * |
| 陈营、桂远明、胡光源: "几种离子及有机物对蜡样芽胞杆菌蛋白酶活力的影响", 《中国微生态学杂志》, vol. 13, no. 03, 30 June 2001 (2001-06-30), pages 146 - 148 * |
| 鲁绯;王夫杰;张建;薛文通;: "毛霉固态发酵豆渣条件的研究", 中国酿造, no. 09, 20 September 2007 (2007-09-20), pages 4 - 8 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108676757B (zh) | 一株链霉菌属菌株及其产星孢菌素的应用 | |
| CN102925361B (zh) | 一种afb1降解菌及降解酶 | |
| CN108504592B (zh) | 一株海洋放线菌及其筛选、应用 | |
| CN116855414B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在发酵豆制品中的应用 | |
| CN110184196B (zh) | 一种篮状菌及其应用 | |
| CN110106123B (zh) | 克雷伯氏菌株z3及其在还原六价铬离子中的应用 | |
| CN104450571A (zh) | 一种高效降解蝇蛆蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株 | |
| CN109609388B (zh) | 一种黑曲霉及其应用 | |
| CN117683074A (zh) | 蜡样芽孢杆菌、蛋白酶抑制剂以及提高蛋白渣产量的方法 | |
| CN103555636A (zh) | 一种深红紫链霉菌及其应用 | |
| WO2023016387A1 (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用 | |
| CN114317285B (zh) | 一株米曲霉及其在高盐高氮发酵食品中的应用 | |
| CN116042452A (zh) | 枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108239612B (zh) | 涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其应用 | |
| CN115584334A (zh) | 屎肠球菌及其在大豆乳清废水酸化、异味解决中的应用 | |
| CN115181690A (zh) | 一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| Patil et al. | Optimization of Protease Production by Bacillus isronensis Strain KD3 Isolated from Dairy Industry Effluent. | |
| CN113830902A (zh) | 脱氮副球菌在去除高盐废水中硝态氮中的应用 | |
| CN113151111A (zh) | 肉葡萄球菌ief1018及其应用 | |
| CN116004470B (zh) | 一种硫化螺旋菌sg202及其应用 | |
| CN116064302B (zh) | 底部脱硫弧菌sg127及其应用 | |
| CN114591856B (zh) | 一株产碱性磷酸酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN115072880B (zh) | 一种生物絮凝剂及其应用 | |
| CN115820463B (zh) | 一种基于微生物发酵的铁载体制备方法 | |
| CN116355784B (zh) | 一株产铁载体的微杆菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |