KR101367512B1

KR101367512B1 - 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101367512B1
Application number: KR1020120056913A
Authority: KR
Inventors: 이준구; 김동명
Original assignee: 인타글리오주식회사
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2014-02-28
Also published as: KR20130133560A

Abstract

본 발명은 항산화 기능과 항노화 활성을 가지면서 항균력이 우수한 천연 방부제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제 조성물 및 그 제조방법, 그리고 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제 조성물 및 그 제조방법 {Natural preservative composition comprising fermented extract of Rhododendron mucronulatum and manufacturing method thereof}

방부제는 화장품, 의약품, 생활용품, 식품 등 다양한 제품군의 품질을 장기간 유지하기 위해 필수적이고, 특히 유통기간이 비교적 길고 기름이나 물이 주성분으로 구성되어 있으며 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체 및 단백질 등으로 조성된 화장품의 경우는 더욱 필수적이다.

그러나, 화장품, 의약품에 범용적으로 사용되는 화학적 방부제인 파라벤류의 방부제는 피부 알러지(Andera Countti 등, Contact Dermatitis, 1997, 37;35~36)와 환경호르몬으로서의 작용 가능성(Edwin 등, Toxicology and Applied Pharmacology, 1998, 153;12-19) 및 내성균을 유발하는 문제점을 불러 일으킨다.또한, 생활필수품으로 사용되는 화장품의 특성과 관련하여 체내 축적과 알러지 반응의 주요 원인으로도 보고된 바도 있다.

이러한 문제점들로 인하여 제품의 안전성과 경제성이 우수한 천연방부제에 대한 연구가 지속되고 있으며, 그 결과로 향신료, 우유 및 어류 등의 식품류, 정유, 한약재 등으로부터 많은 천연 항균성 물질이 보고되었다. 이러한 항균성 물질은 페놀릭(phenolic), 폴리페놀(polyphenol), 퀴닌(quinine), 플라본(flavone), 플라보노이드(flavonoid), 플라보놀(flavonol), 탄닌(tannin), 쿠마린(coumarin), 테르페노이드(terpenoid), 알카노이드(alkaloid), 레세틴(lectin), 폴리펩타이드(polypeptide) 등으로 분류될 수 있다.

식물 유래 천연 물질의 항균력에 대한 작용 기작은 모두 밝혀지지 않았지만, 테르페노이드와 페놀릭은 미생물의 세포막을 파괴하는 기작을 통해 항균작용을 지닌다고 보고되었고, 페놀과 플라보노이드는 미생물의 대사작용에 필수적인 물질에 결합함으로써 미생물의 성장을 억제한다고 알려져 있다. 또한 쿠마린과 알카노이드는 유전자 수준에서 미생물의 성장을 억제한다고 알려져 있고 페놀릭 화합물(phenolic compound)은 낮은 수용성에도 불구하고 하이드로실 그룹(hydroxyl group)에 대해 항균활성이 높으며, 모노테르페넨(monoterpene)류는 미생물 세포벽과 세포막에 대한 투과속도와 관계가 깊어 미생물의 세포막 구조 투과벽을 파괴함으로써 살균효과를 나타낸다고 한다(Mihee Cho 등, Food Science and Industry, 2005, Vol. 38-2).

최근에는 미생물 유래의 천연 항균물질 탐색에 대한 연구도 활발히 진행되고 있는데 이 중 유산균이 생성해 낸 항균성 펩타이드(peptide) 또는 단백질인 박테리오신(bacteriocin)이 가장 대표적이며, 이들은 인체에 섭취되면 소화기관 내에 존재하는 단백질 가수분해 효소에 의해 분해되므로 장내 유익균에 영향을 주지 않고, 잔류성이 없어 식품 등의 천연 보존제로 각광을 받고 있다.

그러나 대부분의 천연 방부제는 원료 자체의 안정성이 떨어질 수 있으며 합성 방부제에 비하여 다량 첨가해야 하는 문제점이 있고 박테리오신은 항균작용의 범위가 좁기 때문에 천연 방부제로서의 사용에 제한을 받는다. 이와 같은 문제로 천연 방부제인 편백 추출물인 히노키티올(Hinokitiol), 목련 추출물인 메그노놀 (Megnonol), 자몽종자추출물 DF-100 등의 극히 일부만이 상용화되고 있다. 이중에서 가장 제품개발이 앞선 DF-100의 경우에 항균력은 DF-100에 포함된 유기산 및 합성보존료인 벤제토늄 클로라이드 때문인 것으로 알려져 있으며, 그외 다른 천연항균제 등은 경제성이 낮거나 좁은 항균스펙트럼 또는 물성에 의한 사용범위의 제한성 등의 문제를 가지고 있어 보다 진보되고 제품화 개발이 가능한 천연 방부제가 절실한 실정이다.

한편, 진달래(Rhododendron mucronulatum)는 진달래과에 속하는 낙엽 관목으로, 잎에는 안드로메도톡신, 아잘레아틴, 아잘레인, 아비쿨라린, 히페로시드, 쿠에르세틴, 타닌질, 정유, 우르솔산, 바닐린산, 시린가산이 있으며, 꽃과 가지에도 안드로메도톡신이 존재하는 것으로 알려져 있다. 진달래의 줄기와 잎은 화혈, 산어의 효능이 있고, 토혈, 장풍하혈, 이질, 혈붕, 타박상을 치료하고 관절염, 신경통, 담결리는데 사용되어 왔다.

또한, 대한민국 특허등록 제10-0776695호는 진달래 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 치료 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 특허공개 제2008-57414호는 진달래 뿌리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부자극 완화용 화장료 조성물을, 특허등록 제10-0829722호는 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 방지용 화장료 조성물 및 피부염증 완화용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

한편 상기의 진달래 발효 추출물을 함유한 천연 방부제 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 개시된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 진달래 추출물을 유산균으로 발효시켜 생성된 진달래 발효 추출물이 항균력, 항산화 및 항노화 기능이 우수함을 확인하고 천연 방부제로서 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제10-0396184호(2003.08.27. 공고) 한국등록특허 제10-0829722호(2008.05.15. 공고)

본 발명의 하나의 목적은 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 천연 방부제 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 천연 방부제 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본원에서 용어, "진달래 추출물" 은 진달래로부터 얻은 추출물을 의미한다. 추출 방법은 통상의 추출법을 사용할 수 있으며, 추출 용매에 의한 추출, 초임계 유체 추출, 초음파 추출, 열수 추출 등의 방법을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일예로, 유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 진달래 건고물에 에탄올, 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액을 분쇄물의 10배 가량 가하여 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 약 60~90℃ 정도의 온도로 1~2일간 가열하여 추출물을 얻고 여과하여 감압농축시킨 후 농축추출액을 얻을 수 있다. 그리고 이 농축 추출액 무게의 2~3배에 해당하는 정제수를 가한 다음 에틸아세테이트, 메칠렌클로라이드 등의 비극성용매를 3~5배 중량으로 첨가하고 강하게 진탕한 후 상층인 비극성용매층을 분리하여 감압농축후 최종 건분말을 얻을 수 있다. 상기 방법과 같은 통상의 추출법에 의해 추출하며 사용하는 유기용매는 메탄올, 에틸아세테이트, 에탄올, 클로로포름, 부탄올, 아세톤과 또는 그들과 정제수의 혼합용매 중 택 1할 수 있다. 또한 효과적인 추출을 위해 염화나트륨을 이용하여 탄닌을 미리 제거할 수 있으며 추출조건은 가열이 아닌 실온에서 2-7일간 침적시켜두는 것도 가능하다.

또 다른 예로, 본 발명의 진달래 추출물은 초임계 추출기술을 사용하여 추출할 수 있다. 초임계 추출은 캐리어 가스로 이산화탄소를 사용하고 임계점 이상의 초고압을 이용하여 진달래 추출물을 추출하는 것을 말한다. 이러한 초임계 추출법은 기존 열 추출이나 용매 추출과는 달리 저온에서 초고압으로 식물의 필요한 성분만을 고농도로 추출하는 방법으로 진달래가 가지는 방부 활성 성분들을 파괴하지 않고 추출할 수 있으며, 유기 용매 대신 인체에 무해한 이산화탄소를 이용하기 때문에 피부에 독성도 없다. 초임계 추출방법의 예시로, 진달래 건고물을 초임계 추출장치에 채운 후 70∼90℃, 4,000∼6,000 PSI 압력으로 이산화탄소로 1차 추출한 다음 이산화탄소 100 부피부에 대해 2∼20(v/v)%의 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 알카리성 공용매 1∼20 중량부를 반응기에서 혼합하여 추출한 다음 컬럼크로마토그래피를 사용하여 선택적인 진달래 추출물 분획을 얻을 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제 조성물은 진달래의 초임계 추출물을 유산균으로 발효시켜 생성된 것인 천연 방부제 조성물이다.

본원에서 용어, "유산균으로 발효시켜 생성된" 이란 유산균을 이용하여 원재료를 물리적, 화학적인 방법으로 변성 또는 변형시키는 것을 말하며, 자연 하에서는 몇 만년이 걸려야 바뀔 수 있는 것을 단 며칠 또는 몇 개월 만에 원하는 결과물을 얻을 수 있는 분해 과정을 의미한다. 특히 본 발명에서 유산균을 이용한 발효는 외형은 바뀌지 않고 원재료 속에 함유되어 있는 약성이나 성분만을 유산균이 선택적으로 찾아내 섭취하여 배출하는 것을 의미한다.

본원에서 용어, "발효 추출물" 이란 진달래 추출물을 유산균으로 발효시킨 배지에서 발효액 또는 상기 배지에서 유산균 균체를 제거한 여액으로서, 유산균을 이용하여 진달래 추출물을 발효 및 배양한 배지에 포함된 구성성분들을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 천연 방부제 조성물은 진달래 초임계 추출물을 유산균 배양배지에 혼합하고 유산균을 접종 및 발효시켜 생성된 발효액을 포함한다.

본 발명에서의 진달래 발효 추출물은 발효를 통해 얻어진 발효액을 그대로 사용하거나, 또는 발효액을 건조한 후 건조 중량의 1∼20배(부피)의 추출 용매를 부가하여 4∼30℃에서 3∼20일간 침적시켜 유효성분을 추출하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용하고자 하는 유산균은, 바람직하게는 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 혼합 균주이다. 본 발명에서 사용되는 균들은 공지된 균들로서, 한국생명공학연구원의 생물자원센터, Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM), 또는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받아 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 균을 보다 구체적으로 살펴보면, 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium)으로는 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium) ATCC 19634 또는 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium) ATCC 6057 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis)로는 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) ATCC 6057을 사용할 수 있고, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)으로는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) ATCC 10241, 또는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) NCTC 7220 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum)으로는 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum) ATCC 14931, 또는 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum) NCDO 1750 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis)로는 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) ATCC 11454, 또는 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) NCIB 8586 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus)로는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) ATCC 7469, 또는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) KCTC 3326인 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei)로는 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) ATCC 31063, 또는 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) ATCC 15521 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)로는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) ATCC 15521을 사용할 수 있고, 상기 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis)로는 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis) ATCC 51150을 사용할 수 있고, 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum)로는 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum) ATCC 49370을 사용할 수 있고, 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica)로는 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica) ATCC 51523을 사용할 수 있고, 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae)로는 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae) CCUG 11672, 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae) ATCC 11454, 또는 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae) LMG 8162 중에서 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있고, 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus)로는 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) ATCC 33316을 사용할 수 있고, 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici)로는 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici) ATCC 33314을 사용할 수 있고, 상기 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis)로는 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) ATCC 27672을 사용할 수 있고, 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로는 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis) ATCC15697을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제의 제조방법을 살펴보면,

(1) 진달래 추출물을 제조하는 단계;

(2) 상기 진달래 추출물을 유산균 배양배지에 혼합하는 단계; 및

(3) 상기 유산균 배양배지에 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유산균을 접종하고 발효시키는 단계를 포함한다.

단계 (1) 은 진달래 추출물을 제조하는 단계로, 바람직하게는 진달래 초임계 추출물을 제조하는 단계이다. 초임계 유체 추출기술의 적용으로, 진달래 추출물을 기존의 추출방법으로 이룩할 수 없었던 추출물의 생리활성과 물성을 획득할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 흡착, 분별추출, 여과 등의 방법으로 이룩할 수 없었던 생물전환 반응산물의 탈색과 탈취 효과를 획득함으로써 화장품 제조시 진달래 추출물의 색상이나 향취가 제품에 영향을 주지 않도록 하는 장점이 있다.

보다 바람직하게, 본 발명에서 진달래 추출물은 진달래를 나노분쇄기로 분쇄한 다음 초임계 유체 추출 공정에 의하여 제조되는 것이 바람직하며, 나노 입자의 크기는 100 ~ 500nm 범위의 균질화된 입자인 것이 좋다. 나노 추출물을 제조하기 위해서는 진달래의 분말 제조 후 나노 입자화를 시키는 것이 바람직하며, 분말 제조는 나노분쇄기를 이용하여 물리적으로 분쇄함으로써 이루어진다. 초임계 유체 추출 공정은 다른 추출공정에 비하여 입자 내에 독성용매나 계면활성제가 없는 관계로 의약품, 식품, 화장품 등에 널리 사용될 수 있으며, RESS (Rapid Expansion of Supercritical Solutions), GAS (Gas Anti-Solvent), SAS (Supercritical fluid Anti-Solvent), ASES (Aerosol Solvent Extraction System), SEDS (Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids), PGSS (Particles from Gas Saturated Solutions), RPSS (Reactive Precipitaion in Supercritical Solution) 방법을 사용할 수 있다.

상기 단계 (2) 에서는 유산균의 발효를 위하여 진달래 추출물을 유산균 배양배지에 혼합한다. 유산균 배양배지는 당업계에 공지된 통상의 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한 황산마그네슘, 황산망간 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아세트산 나트륨, 스트르산 이암모늄, 염화칼슘, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가하여 pH를 조정할 수 있다. 바람직하게는 유산균 배양배지로 MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) 액체 배지, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등을 사용할 수 있다.

단계 (3)에서 발효란 미생물이 유기물을 분해하면서 변화시키는 전체적인 과정을 통칭하는 것으로서, 이러한 발효과정을 통해서 미생물이 생약 원료 속에 함유되어 있는 유효성분만을 선택적으로 찾아내어 섭취한 뒤 배설하여 대사물질을 만들어내는데 이러한 대사물질을 발효액이라 한다.

유산균 발효를 위한 유산균은 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유산균을 사용될 수 있다. 상기 유산균은 바람직하게는 10¹⁰ ~ 10¹¹CFU/ml로 농축하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 유산균의 배양 및 발효는 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

또한 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포체를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 호기상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 유산균의 배양시의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 35℃ 내지 40℃ 이며, 7시간 내지 40시간 동안 배양하는 것이 바람직하고, 유산균은 바람직하게는 10¹⁰ ~ 10¹¹CFU/ml로 농축하여 사용될 수 있다.

이러한 유산균을 이용한 발효에 의하여, 크기가 커서 피부로 흡수할 수 없는 고분자를 유산균의 작용으로 저분자로 분해하며 분해과정 중 유산균의 각종 효소들에 의하여 유효성분의 활성도를 높이고 미량 성분에 대해서는 획득 수율을 높이는 효과도 있다. 또한 농약, 중금속 등의 독성물질을 분해 또는 불활성화시켜 피부에 유해가 되는 요소를 제거시킬 수 있다. 발효과정을 거치면 유산균은 진달래 추출물을 구성하고 있는 분자를 미세하게 분해하고 소화한 뒤 배설하게 되는데 이때 나오는 물질이 대상물질, 즉 추출물에 해당한다. 본 발명의 발효과정은 저온에서 이루어지므로 유산균을 이용하면 기존의 열수 추출이나 진공 추출 등에서 야기되는 성분의 손실이나 변성이 전혀 없이, 실온에서 원료의 외형은 전혀 손상시키지 않고 유효성분만을 효과적으로 추출해 낼 수 있다.

유산균의 배양 및 발효는 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 방법은 다양한 문헌에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포체를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 호기상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수도 있다. 배양시의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 35℃ 내지 40℃ 이고, 배양시간은 7시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 상기 진달래 추출물은 유산균 배양배지 대비 1 중량% 내지 2 중량% 가 함유된 것이 좋다.

배양 종료 후에 배양물과 균체를 분리하기 위해 원심분리 (contrifugation) 또는 여과 (filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 이때, 균체의 제거는 통상적인 균체의 제거를 위한 방법을 통해 유산균 균체가 실질적으로 제거된 것을 나타낸다.

이와 같이 제조된 본 발명의 진달래 발효 추출물은, 그람양성균, 그람음성균, 효모 및 진균 등 다양한 세균에 대하여 항균력을 가짐을 특징으로 한다. 대표적인 예시로, 본 발명의 추출물은 Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Pseudomonas aeroginosa , Candida albicans , Aspergillus fumigatus 을 포함하는 다양한 세균에 대하여 에 대하여 광범위한 항균 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기와 같이 제조된 진달래 발효 추출물이 그람양성균 (Bacillus subtilis ATCC 21770, Staphylococcus aureus ATCC 29213), 그람음성균 (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853), 효모 (Candida albicans ATCC 32354) 및 진균 (Aspergillus fumigatus ATCC 90906) 등 다양한 세균에 대하여 항균력을 가진다는 것을 확인하였고, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분석을 통하여 기존의 방부제인 BHA (Butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene) 및 녹차 폴리페놀보다 더 우수한 항산화력을 가짐을 확인하였으며, 사멸 세포를 다시 활성화시킴으로서 세포기능을 회복시키며 노화 단백질의 활성을 억제하므로 노화억제활성도 가짐을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 진달래 발효 추출물은 식품, 의약품, 화장품 등에서의 다기능성 방부제로서 그리고 사람을 포함한 포유류에서의 노화억제활성의 다기능성 천연 신소재로서 폭넓은 응용이 가능하다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 진달래 발효 추출물을 포함하는 천연 방부제를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 진달래 발효 추출물의 함량은 전체 화장료 조성물에 대하여 각각 0.001 내지 10.0 중량%이고, 바람직하게는 0.1 내지 1 중량%이다. 진달래 발효 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우에는 뚜렷한 항균 효과, 특히 방부 효과를 기대할 수 없고, 진달래 발효 추출물의 함량이 10.0 중량%를 초과하는 경우에는 피부자극을 유발하고 제형이 안정하지 못해 화장료 조성물로서 바람직하지 않을 수 있다.

본 발명의 화장료는 크림류, 팩류, 로션류, 에센스류, 화장수류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 정제수, 보습제, 고급알코올, 고급지방산, 연화제 (emollient), 킬레이트제, 점증제, 영영성분, pH조절제, 향료 등을 임의로 추가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 기존의 화장료 조성물에 비해 방부효과 및 항노화 효과가 증가하는 특징을 갖는다. 기존의 화장료에서 외부로부터 화장품을 오염시키는 미생물의 증식을 억제하여 제품의 변화를 방지하는 목적으로 사용되었던 방부제, 대표적으로 파라옥시안식향산 에스테르와 이미다졸린계 화학방부제는 피부알 러지와 환경호르몬 가능성 및 내성균 유발의 문제를 가지고 있다. 그러나, 본 발명의 화장료 조성물은 이러한 유기 화학 방부제 대신에, 소량으로도 방부효과를 나타내고 항균력이 높고 내성을 유발하지 않으면서 내성균 및 진균류에도 높은 항균력을 보여 광범위한 항균스펙트럼을 나타내는 진달래 발효 추출물을 사용함으로써,기존의 화장료에 비해 안전성과 경제성이 우수한 유리한 효과를 나타낸다.

본 발명의 진달래 발효 추출물은 천연물로부터 제조된 것임에도 불구하고, 항균력이 높고 내성을 유발하지 않으면서 내성균 및 진균류에도 높은 항균력을 보여 광범위한 항균스펙트럼을 나타내며, 적절한 항산화 기능 뿐만 아니라 노화억제활성까지 가지고 있는 천연 소재이다. 따라서, 식품, 의약품, 화장품 등에서의 다기능성 방부제로서 그리고 사람을 포함한 포유류에서의 노화억제활성의 다기능성 천연 신소재로서 폭넓은 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 진달래 발효 추출물의 항산화 활성 평가를 위한 DPPH assay 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 진달래 발효 추출물의 제조

1-1. 진달래 초임계 추출물의 제조

초임계 유체 추출기술을 사용하여 진달래 추출물을 제조하였다. 진달래 건고물을 초임계 추출장치에서 70-90℃, 4,000-6,000 PSI 압력으로 주용매인 이산화탄소 100 부피부에 대해 2-20(v/v)% 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 알카리성 공용매 1-20 중량부를 혼합시켜 추출한 후, 크로마토그래피를 이용하여 분리, 여과, 정제하여 항균활성 분획을 선별분리하여 감압농축 후 최종 건분말을 얻었다. 이러한 건분말을 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 물, 알콜 등의 용매에 용해시킨 제품을 진달래 추출물을 수득하였다.

이와 같은 초임계 유체 추출기술의 적용으로, 진달래 추출물을 기존의 추출방법으로 이룩할 수 없었던 추출물의 생리활성과 물성을 획득할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 흡착, 분별추출, 여과 등의 방법으로 이룩할 수 없었던 생물전환 반응산물의 탈색과 탈취 효과를 획득함으로써 화장품 제조시 진달래 추출물의 색상이나 향취가 제품에 영향을 주지 않도록 하는 장점이 있다.

1-2. 진달래 발효 추출물의 제조

상기 실시예 1-1에서 수득한 진달래 추출물을 MRS 배지를 기반으로 한 배지에 첨가하여 pH 를 5.5 로 조정한 후 고압살균기로 100℃ 이상에서 10분간 살균하였다. 살균이 끝난 시료는 42℃로 냉각한 후 상기 1-1에서 제조한 효소 배양액을 2% 접종하고 37℃의 항온기에서 15시간 발효하였다. 유산균 혼합 균주로는 Lactobacillus plantarum ATCC 10241 및 Lactococcus garvieae ATCC 11454 의 혼합 균주 (제조예 1), Lactobacillus plantarum ATCC 10241 및 Lactococcus garvieae LMG 8162 의 혼합 균주 (제조예 2), Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 및 Lactococcus garvieae ATCC 11454의 혼합 균주 (제조예 3), Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 및 Lactococcus garvieae LMG 8162의 혼합 균주 (제조예 4), Lactococcus garvieae ATCC 11454 및 Pediococcus pentosaceus ATCC 33316의 혼합 균주 (제조예 5)를 각각 사용하였다. Lactococcus garvieae LMG 8162는 Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM)에서 분양받아 사용하였고, 나머지는 모두 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받아 사용하였다.

발효기에 상기 배양 배지와 동일한 방법으로 본 배양 배지 35kg 을 준비하고 상기 전 배양액 3.5kg 을 접종한 후 30~37℃ 에서 12~20시간 배양하여 본 배양액을 제조하였다. 본 배양이 완료된 후 발효기의 온도를 약 70℃ 이상 승온시키고 30분간 유지하여 균을 실활시켰다. 이후 발효기의 온도를 약 50℃까지 냉각시키고, 배양액을 원심분리시켜 균체와 배양 여과액으로 분리시켰다. 분리된 배양 여과액에 배양 여과액 전체 부피의 약 1.0~2.0%에 해당하는 활성탄을 넣고 약 3시간 동안 탈색 및 탈취시키고, 이를 필터 프레스 여과기 (Filter press, 규조토+여과포로 구성됨; 필터 프레스 온도는 약 55~60℃, 필터 프레스 압력은 압력은 약 1~2기압, 여과포의 기공 크기는 약 5㎛, 규조토 사용량은 처리할 여과액 총 부피의 약 5%임)에 통과시켜 활성탄 및 불순물을 제거하고 정제된 배양 여과액을 수득하였다. 정제된 배양 여과액을 농축시켜 고형분 농도가 약 20 브릭스 (Brix)인 농축 배양 여과액 약 3.5㎏을 수득하였다. 농축 배양 여과액을 트랩온도 약 -80℃ 이하에서 약 40시간 이상 동결건조시켜 진달래 발효 추출물의 건조 분말을 수득하였다.

실시예 2. 진달래 발효 추출물의 효능 평가

2-1. 항균력 시험( Agar Serial Dilution Method )

그람양성균 (Bacillus subtilis ATCC 21770, Staphylococcus aureus ATCC 29213), 그람음성균 (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853), 효모 (Candida albicans ATCC 32354) 및 진균 (Aspergillus fumigatus ATCC 90906) 에 대한 진달래 발효 추출물의 항균력을 시험하였다.

항균력을 측정하기 위해 고체배양 희석법(Agar Serial Dilution Method)를 이용하였다. 다시 말하면 한천 평판 위에 다수의 균주를 도말할 수 있는 방법으로 항균제 용액을 2배 희석계열로 만들어 페트리 디쉬에 넣고 배지를 적당량 넣은 뒤 시험균을 접종하는 것이다.

일반세균의 경우 전배양에는 뮐러힌턴육즙(Muller Hinton broth, Difco)를 사용하고 평판제조용 배지에는 뮐러힌턴한천을 사용하였다. 보통 한천을 1.5%정도 잘 넣고 끊인 후 멸균하고 50℃로 식힌 후 사용하였다. 뮐러힌턴육즙에 균을 접종(2 X 10⁶CFU/ml)하여 37℃에서 16-24시간 전 배양하였다. 진균배양에는 사보라우드 덱스트로즈육즙(Sabouraud dextrose broth)을 사용하였고 배지에 균을 접종하여 22℃ 배양기에서 5-7일간 배양하여 사용하였다.

한편 멸균된 페트리접시에 2배수로 0.8mg/ml~6μg/ml 농도의 진달래 발효 추출물 항균제 용액 (5% DMSO;Dimethylsulfoxide 생리식염수용액) 2ml씩을 넣고 대조군은 멸균증류수 2ml을 넣고 비교군으로 아모클라(Amocla:Amoxicillic염,건일제약)를 2ml 넣었다. 각 페트리 접시에 멸균 후 50℃로 식은 뮐러힌턴한천융해 배지를 18ml씩 넣고 페트리접시의 밑바닥을 회전시켜 잘 섞었다. 이후 전배양시킨 균을 백금이를 사용하여 5mm정도 도말하였다. 세균은 37℃에서 16-24시간 배양하고 진균 및 효모는 22 배양기에서 5-7일간 배양한 후 각 구획안에 집락형성여부를 관찰하여 성장이 인정되지 않는 평판의 최소 항균제농도를 최소저해농도(MIC,Minimum inhibitory concentration)로 하였다. 1차 MIC가 정해지면 각 농도단계를 좁혀 2차 MIC를 구하였다.

		최소저해농도 (MIC, %)
그람양성균	Bacillus subtilis ATCC 21770 Staphylococcus aureus ATCC 29213	0.156 0.313
그람음성균	Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853	0.156 0.313
효모	Candida albicans ATCC 32354	0.078
진균	Aspergillus fumigatus ATCC 90906	0.078

2-2. 항산화 활성 평가 ( DPPH assay )

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼은 oxygen free radical은 아니지만 수용액 뿐만 아니라 EtOH 등의 유기용매에서도 매우 안정하고 517nm에서 특징적인 광흡수를 나타내므로 측정하기 편리하며, 이 라디칼 소거작용은 지질과산화 억제활성 또는 항산화활성과 상관관계를 보이는 경우가 많으므로 항산화 활성물질의 검색에 널리 이용되고 있다. 따라서, 상기 실시예 1에서 제조한 진달래 발효 추출물의 항산화 활성 안정성을 측정하기 위하여 DPPH assay를 실시하였다.

96 well plate에 각 농도별 시료와 EtOH 에 녹인 100uM DPPH를 가한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, microplate reader를 이용하여 반응액의 흡광도를 515nm에서 측정하였고 시료 대신 용매를 가한 대조군에 대한 시료의 흡광도 감소정도를 측정하여 항산화활성을 산출하였다. 또한 항산화 효과의 비교를 위하여, 기존의 BHA (Butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene), 녹차 폴리페놀을 각각 비교 실험군으로 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 진달래 발효 추출물이 기존의 BHT, BHA, 녹차 폴리페놀보다 항산화력이 우수한 것으로 확인되었다.

2-3. 세포사멸 억제 효능 평가 ( BAEC cell assay test)

진달래 발효 추출물이 세포사멸을 저해하는 능력을 측정하기 위하여 BAEC cell assay test를 수행하였다. 혈관내피세포 (BAEC cell)에 산화제 4-HNE를 처리하면 세포질에 에이팝토시스로 인한 세포사멸 흔적을 보이는데, 이러한 에이팝토시스 유도 세포에 진달래 발효 추출물을 처리하여 세포주에 대한 노화 억제 활성을 살펴보았다.

그 결과, 진달래 발효 추출물을 처리한 경우에는 산화제 무처리군의 경우와 같이 세포질이 녹색으로 관찰되었는데, 이는 진달래 발효 추출물이 사멸 세포를 다시 활성화시킴으로서 세포기능을 회복시키는 활성을 가진다는 것을 보여주는 결과로 노화억제활성을 보여주는 것이다. 따라서, 진달래 발효 추출물은 산화제에 의한 세포사멸을 저해하는 능력이 우수한 것으로 판단되어 항노화제로서의 개발 가능성이 확인되었다.

2-4. 노화 단백질의 활성 억제 효능 평가

웨스턴 블라팅을 이용해 노화진행과 관련있는 bcl-2 단백질을 분석하였다. 세포주로는 보바인 펄모나리 아테리 엔도셀리알 세포주 (Bovine pulmonary artery endothelial cells, CPAE)를 사용하였는데, 4-하이드록시 2,3-노네날에 6시간 노출시킨 후 진달래 발효 추출물을 10uM로 처리하여 단백질을 세포로부터 모으고 이것을 웨스턴 블라팅 분석으로 확인하였다.

그 결과, 산화제인 4-HNE를 처리한 보바인 펄모나리 아테리 엔도셀리알 세포주에서는 노화와 관련된 P21, P53 단백질이 다량 발현되지만, 여기에 무처리 대조군에서는 P21, P53 단백질 발현이 억제되는 것으로 관찰되었으며, 이를 토대로 진달래 발효 추출물의 경우 항균활성 뿐만 아니라 노화억제활성도 가지는 것을 알 수 있었다.

제조예 1. 진달래 발효 추출물의 제형

1-1. 바이오리프팅 마스크

표 2의 (A)의 정제수를 90℃ 까지 가온한 다음 (A)의 나머지 원료를 차례대로 첨가하여 용해하였다. (B)를 제조탱크에서 혼합한 다음 완전히 용해시키고 (A)에 첨가 혼합하여 완전히 용해시켰다. (A) 및 (B) 혼합액을 40℃ 까지 냉각시킨 다음 (c)를 순서대로 첨가하여 30분 이상 Agi-Mixer로 혼합하여 시제품으로 사용하였다.

	품명	농도(%)
(A)	Aqua Multufruit BSC Purac PH90 Glycolic Acid L-Arginine Keltrol F	50 2 2 4.5 0.2 0.5
(B)	Propylene glycol Vitamin E acetate HCO-60 Herb Complex Lavender	5 0.2 0.5 0.1 0.1
(C)	SC glucan Magnolia ext. Chamomile ext. Green tea powder Lico-S Genistein SOM(0.3%) 진달래 발효 추출물 Aqua	1 0.1 0.1 0.001 0.05 1 2 to 100

1-2. 바이오리프팅 세럼

표 3의 (A)의 정제수를 70℃ 까지 가온한 다음 (A)의 나머지 원료를 차례대로 첨가하여 용해하였다. (B)를 제조탱크에서 혼합한 다음 완전히 용해시키고 (A)에 첨가 혼합하여 완전히 용해시켰다. (A) 및 (B) 혼합액을 40℃ 까지 냉각시킨 다음 (c)를 순서대로 첨가하여 30분 이상 Agi-Mixer로 혼합하여 시제품으로 사용하였다.

	품명	농도(%)
(A)	Aqua Multufruit BSC Purac PH90 Glycolic Acid L-Arginine Ultra Z 21 Cosmedia SP Glycerine	50 1 1 2 0.2 0.5 0.5 5
(B)	Propylene glycol Vitamin E acetate HCO-60 Green tea	5 0.2 0.5 0.1
(C)	SC glucan Magnolia ext. Chamomile ext. Green tea powder Lico-S Genistein SOM(0.3%) 진달래 발효 추출물 Aqua	1 0.1 0.1 0.001 0.05 1 2 to 100

Claims

진달래 발효 추출물을 포함하며,
그람양성균, 그람음성균, 효모 또는 진균에 대하여 항균 작용을 가지는 천연 방부제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 진달래 발효 추출물은 진달래의 초임계 추출물을 유산균으로 발효시켜 생성된 것인 천연 방부제 조성물.
제2항에 있어서, 상기 유산균은 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상인 것인 천연 방부제 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에로기노사 (Pseudomonas aeroginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스페르길루스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus)에 대하여 항균 작용을 가지는 천연 방부제 조성물.
제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 천연 방부제 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
삭제
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것인 화장료 조성물.
진달래를 초임계 추출하여 진달래 추출물을 제조하는 단계;
상기 진달래 추출물을 유산균 배양배지에 혼합하는 단계; 및
상기 유산균 배양배지에 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 그라미니스 (Lactobacillus graminis), 류코노스톡 시트레움 (Leuconostoc citreum), 바이셀라 헬레니카 (Weissella hellenica), 락토코커스 가르비에 (Lactococcus garvieae), 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis) 및 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유산균을 접종하고 발효시키는 단계를 포함하는,
제1항의 천연 방부제 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 유산균의 배양시의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃이고, 배양시간은 7시간 내지 40시간이며, 상기 유산균은 10¹⁰ 내지 10¹¹CFU/ml로 농축하여 사용하는 것인 제조방법.