KR102262644B1 - 피부 상재균총 조절효과를 갖는 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 마스크 시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

피부 상재균총 조절효과를 갖는 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 마스크 시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 피부 마이크로바이옴 조절효과를 갖는 유산균을 하이브리드 발효하는 단계를 포함하는, 피부 마이크로바이옴 조절효과를 갖는 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스의 제조방법과, 상기 방법에 의해 제조된 피부 마이크로바이옴 조절효과를 갖는 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물 및 이를 포함하는 마스크 시트에 관한 것이다. 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 제조방법을 이용하는 경우, 박테리얼 셀룰로오스 생산균 단독으로 배양하는 경우와 비교하여 박테리얼 셀룰로오스의 생산 수율이 높고 품질이 우수하다. 또한, 박테리얼 셀룰로오스에 포집된 유산균이 피부상재균총을 조절하는 효능이 있으므로 피부건강을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피부 상재균총 조절효과를 갖는 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 마스크 시트 및 이의 제조방법 {Hybrid bacterial cellulose mask sheet having skin microbiome control effect and method for preparing the same}
본 발명은 피부 상재균총 조절효과를 갖는 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 마스크 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
박테리얼 셀룰로오스는 (C6H10O5)n의 분자식으로 표현되는 유기화합물로서, 1886년 A.J. Brown에 의해 최초로 발견되었으며 Acetobacter, Sarcina ventriculi, Agrobacterium 속의 미생물의 발효에 의해 생산된다. 박테리얼 셀룰로오스는 식물의 셀룰로오스와 다르게 가지(branch)를 형성하지 않은 체인인 ß-1,4 glucan chain을 기본단위로 하는 중합체이다.
종래의 기술로는 박테리얼 셀룰로오스 시트의 생산 수율이 낮아 대량생산이 어려웠다. 따라서, 본 발명자들은 박테리얼 셀룰로오스를 고생산하는 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 (Komagataeibacter rhaeticus KOSS-15) 균주(기탁번호 KCCM12270P) (등록특허 10-1970439)를 발명하였으며, 단당류인 포도당과 이당류인 설탕(포도당+과당, glucose+fructose)을 복합탄소원으로 사용함으로써 배지 중의 포도당을 미생물 생육에 사용하고, 설탕으로부터 분해되는 포도당을 박테리얼 셀룰로오스 생산을 위한 기질 포도당으로 이용하는 방법으로 생산 수율을 개선하는 방법(등록특허 10-1970440)을 발명한 바 있다.
그러나 박테리얼 셀룰로오스를 고생산하는 균주의 사용 및 두 가지 당농도 비율의 최적화에도 불구하고 배양과정 중 박테리얼 셀룰로오스 생산 균주의 균 농도가 pH, 온도, 산소량, 포도당 농도 등의 변화에 따라 민감하게 상승 변화되면서, pH 상승, 이상 발효에 의한 온도상승, 용존산소량의 고갈, 생육 포도당의 고갈현상에 의하여 박테리얼 셀룰로오스의 생산을 위한 기질 포도당까지 전용하게 됨으로 시트의 두께등이 불균일한 불완전 시트(imperfect bacterial cellulose sheet)가 생산되는 문제점이 여전히 존재하고 있다. 따라서, 생산 수율이 높으면서도 품질이 우수한 박테리얼 셀룰로오스 시트를 제조하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 건강한 사람의 피부 표면에는 피부상재균총인 피부 마이크로바이옴(skin microbiome)이 존재하며, 이들 피부상재균총이 균형을 이루는 것이 건강한 피부상태를 유지하는데 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 피부유익균으로는 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)가 알려져 있고, 피부 유해균으로는 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)가 알려져 있다. 최근 이러한 얼굴의 피부 마이크로바이옴 (facial skin microbiome)을 유지할 목적으로 유산균을 활용한 화장품 등이 출시되고 있으나, 대부분 국소크림 (topical cream) 또는 이를 희석한 유액의 형태로 제품이 출시되고 있다.
그러나 이러한 유액 형태의 제품으로는 개인위생상태와 피부재생주기(skin turnover)에 따라 그 목적하는 효과를 구현하기가 어렵다. 따라서 일반적인 화장품제형에 의한 피부 마이크로바이옴을 조절하는 것이 아닌 다른 유형의 제형적 검토가 요구되어 왔으며, 이 가운데 일정 시간 수분을 함유하고 피부적합성이 우수한 박테리얼 셀룰로오스 소재의 마스크 제형을 검토하게 되었다. 본 발명에서는 피부 마이크로바이옴 조절효과를 갖는 유산균을 대상으로 종래의 박테리얼 셀룰로오스 생산을 용이하게 하면서도 박테리얼 셀룰로오스 내에 포집되어 피부 마이크로바이옴 조절효과를 구현할 수 있는 새로운 형태의 마스크시트를 발명하였다.
대한민국 등록특허 제10-1970439호 대한민국 등록특허 제10-1970440호
본 발명자들은 생산수율이 높으면서도 품질이 우수한 박테리얼 셀룰로오스 시트의 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 박테리얼 셀룰로오스 생산 균주와 유산균을 하이브리드 발효(하이브리드 배양, 또는 공서배양)하는 경우 생산 수율과 품질이 우수한 박테리얼 셀룰로오스가 생산되고, 이들 박테리얼 셀룰로오스에 포함된 유산균이 피부상재균총의 균형을 조절하는 효과가 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균을 하이브리드 발효하는 단계를 포함하는, 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물을 포함하는 마스크 시트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균을 하이브리드 발효하는 단계를 포함하는, 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 "박테리얼 셀룰로오스(bacterial cellulose)"는 Acetobacter속, Rhizobium속, Agrobacterium속 등의 박테리아 종에 의해 생성되는 셀룰로오스로서 높은 기계적 강도와 극도로 미세하고 순수한 셀룰로오스로 구성된 3차원 망상구조를 가진다. 일반적인 식물섬유의 경우 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 등으로 이루어져 셀룰로오스만을 생산하려면 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하여야 하나, 박테리얼 셀룰로오스는 순수 셀룰로오스로만으로 이루어져 있다. 박테리얼 셀룰로오스가 이루는 망상구조의 피막은 랜덤으로 형성된 리본 모양의 피브릴화된 셀룰로오스이며, 그 너비는 100 nm 보다 작고 반지름이 2~4 nm인 무수히 많은 미세한 마이크로 피브릴로 이루어져 있고, 이 마이크로 피브릴은 1600 kg/m3의 밀도를 가진다. 또한, 높은 결정화도(84~89%)와 78 MPa인 고유의 성질을 가지기 때문에 일반적으로 보고된 Macro-scale의 천연 섬유보다 높거나 유리섬유의 탄성률(70 GPa)과 비슷한 성질을 보일뿐 아니라, 충분한 공극을 가지며, 생체적합성이 매우 우수한 특징을 보인다. 박테리얼 셀룰로오스는 생체적합성과 기계적 성질이 우수하고, 밀도가 낮아서 인공피부, 인공연골, 창상보호제, 인공혈관, 화상치료제 등에 의료용 소재로서 활용되고, 피부밀착력과 습윤성이 우수하여 미용재료로서 사용되기도 하며, 나타드코코(Nata de coco)와 같은 식용재료로서도 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 생산균은 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 (Komagataeibacter rhaeticus KOSS15) 균주(기탁번호 KCCM12270P)이다.
본 발명의 상기 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주는 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 균주라고도 표기될 수 있다. 상기 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주는 홍차버섯종균(kombucha) 유래이고, 상기 홍차버섯종균은 콤부차, 홍차버섯효모, 홍버섯, 장수버섯 등 여러 이름으로 불리며, 박테리아와 효모가 실 같은 균사를 모체로 공생하는 유기산생성균(유산균)의 일종으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 박테리얼 셀룰로오스 생산균과 하이브리드 발효 되는 유산균은 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 컬바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 플란타룸, 또는 이들의 조합이다. 상기 락토바실러스 람노서스는 보다 구체적으로 수탁번호 KCCM12452P의 락토바실러스 람노서스 SKB1253 균주이고, 상기 락토바실러스 플란타룸은 보다 구체적으로 수탁번호 KCCM12450P의 락토바실러스 플란타룸 SKB1234 균주이다.
본 발명의 박테리얼 셀룰로오스의 제조방법을 단계별로 설명한다.
(a) 먼저 박테리얼 셀룰로오스 생산균(초산균)과 유산균을 각각 배양하여 증균을 시킨다.
상기 박테리얼 셀룰로오스 생산균과 유산균은 상술한 바와 같다.
상기 증균 단계는 1계대, 2계대, 또는 3계대 이상 반복될 수 있고, 계대수가 거듭될수록 배양 배지를 대용량으로 교체한다. 예컨대 초기 배양 배지는 10L 이하의 용량의 배양 용기 및 배양 배지에서 배양한 후, 1계대에서 100L 이하, 2계대에서 1,000L 이하, 3계대에서는 10,000~30,000L 이하 규모의 배양 용기 및 배양 배지에서 증균을 시킬 수 있다.
(b) 다음으로 충분한 양의 박테리얼 셀룰로오스 생산균(초산균)과 유산균이 준비되면, 박테리얼 셀룰로오스 생산용 배양 배지에 각각을 접종하고 하이브리드 발효를 수행한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스를 시트(sheet) 형태로 제조하기 위해서는 트레이(tray) 상의 배양용기에서 박테리얼 셀룰로오스 생산균(초산균)과 유산균을 배양하여야 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 배양은 개방형 트레이 상(open system)에서 이루어진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양이 이루어지는 배양 배지의 초기 pH는 3.5~9이다. 본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이 배양 배지의 초기 pH는 박테리얼 셀룰로오스의 생산수율 및 품질에 영향을 미친다. 상기 배양 배지의 바람직한 초기 pH는 3.5~6이고, 보다 바람직한 초기 pH는 3.5~5, 또는 3.5~4이며, 가장 바람직한 초기 pH는 4이다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 배양이 이루어지는 배지의 최종 pH (배양 완료 후 배지의 pH)는 3~4.5이다. 상기 배양 배지의 보다 바람직한 최종 pH는 3~4이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양은 25~35℃의 온도 조건 하에서 이루어진다. 본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이 배양 온도에 따라 박테리얼 셀룰로오스의 생산 수율이 달라진다. 상기 배양의 바람직한 온도는 25~33℃, 25~30℃, 25℃, 28℃, 또는 30℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만 37℃에서 배양하는 경우에는 박테리얼 셀룰로오스의 생산 수율이 감소될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양이 이루어지는 배양 배지의 포도당 농도는 0.5~5 %(w/v)이다. 본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 배양 배지에 포함되는 포도당의 농도는 박테리얼 셀룰로오스의 생산 수율 및 시트의 품질에 영향을 미친다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 배양 배지에 포함되는 포도당의 농도는 바람직하게는 1~5%, 1.5~5%, 2~5%, 3~5%, 4~5%, 0.5~4%, 1~4%, 1.5~4%, 2~4%, 3~4%, 0.5~3%, 1~3%, 1.5~3%, 2~3%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%일 수 있고, 가장 바람직하게는 2%이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스의 생산을 위한 배양시간은 24시간 이상 이루어진다. 본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스는 배양시간에 비례하여 생산 수율이 증가하는 선형성(linearity)을 나타낸다. 또한, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스는 배양시간에 비례하여 하이브리드 발효한 유산균의 포집율도 증가한다. 상기 배양시간은 바람직하게는 24~120시간, 24~96시간, 24~72시간, 24~60시간, 24~48시간, 48~120시간, 48~96시간, 48~72시간, 48~60시간, 48시간, 60시간, 72시간 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(c) 다음으로, 박테리얼 셀룰로오스 생산균(초산균) 및 유산균의 하이브리드 발효에 의해 생산된 박테리얼 셀룰로오스를 세척 및 가압한다.
생산된 박테리얼 셀룰로오스 시트는 여분의 박테리얼 셀룰로오스 생산균(초산균)과 이물질 등을 제거하기 위하여 세척된다. 상기 세척 전후에는 NaOH 수용액(0.1%)에 침지시키는 공정이 추가될 수 있다. 상기 NaOH 수용액에 침지하는 공정은 시트의 강도를 강화시키는 효과가 있다.
세척된 박테리얼 셀룰로오스 시트는 두께를 균일하게 조절하고 시트 내에 포함된 수분을 제거하기 위하여 위하여 가압, 및/또는 멸균하는 공정을 거친다.
상기 세척, 가압(탈수), 및/또는 멸균 공정이 완료되면 박테리얼 셀룰로오스 시트가 완성된다.
(d) 마지막으로, 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트는 소정의 크기 및 모양으로 절단하는 추가 가공 공정에 의해 박테리얼 셀룰로오스 마스크 시트로 제조되거나, 분쇄공정에 의해 화장품의 원료물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물을 포함하는 마스크 시트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균의 하이브리드 발효에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 마스크 시트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균과의 하이브리드 발효에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스에는 유산균이 포집되어 있다. 또한, 상기 유산균이 포집된 박테리얼 셀룰로오스는 피부 유익균인 스테필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)의 생존율을 향상시키고, 피부 유해균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 증식을 억제시키는 효능이 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스에 포집된 유산균은 생균체 또는 사균체이다. 사균체의 경우라도 잔존하는 유산균의 세포질 성분에 의해 상술한 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물 및 이를 포함하는 마스크 시트는 피부미용 또는 화장용도로 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 피부 유익균인 스테필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)의 생존율을 향상시키고, 피부 유해균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 증식을 억제시키는 효능이 있으므로, 피부상재균총의 조절을 통해 피부 건강을 개선시키는 효능이 있다.
본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 상기 하이브리드 발효에 의해 제조된 마스크 시트는 박테리얼 셀룰로오스 생산균의 단독 발효에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 마스크 시트에 비하여, 시트의 두께, 함수율, 및 최대 하중이 증가된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 마스크 시트는 15시간 이상 정제수에 침지 후 두께 측정시 0.7~1.0 mm, 0.75~1.0 mm, 0.8~1.0 mm, 또는 0.85-1.0 mm이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 마스크 시트는 15시간 이상 정제수에 침지 후 식 3에 따른 함수율 계산시 110~160, 120~160, 130~160, 135~160, 140~160, 110~150, 120~150, 130~150, 135~150, 또는 140~150이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 마스크 시트는 15시간 이상 정제수에 침지 후 식 5에 따른 연신율 계산시, 16~30%, 18~30%, 19~30%, 20~30%, 22~30%, 16~28%, 18~28%, 19~28%, 20~28%, 22~28%, 16~26%, 18~26%, 19~26%, 20~26%, 또는 22~26%이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 두께, 함수율, 및 연신율의 측정의 조건은 본 발명의 마스크 시트 제조를 위해 30℃에서, 초기 포도당 농도 2%(w/v), 초기 pH 4.0의 조건으로 72시간 동안, K. rhaeticus 및 L. rhamnosus 를 하이브리드 발효시 배양하여 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트인 것을 전제로 한다.
본 발명의 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스가 화장료 조성물로 사용되는 경우, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다. 본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 충진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 이용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균을 하이브리드 발효하는 단계를 포함하는, 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 조성물 및 이를 포함하는 마스크 시트를 제공한다.
본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 제조방법을 이용하는 경우, 박테리얼 셀룰로오스 생산균 단독으로 배양하는 경우와 비교하여 박테리얼 셀룰로오스의 생산 수율이 높고 품질이 우수하다. 또한, 박테리얼 셀룰로오스에 포집된 유산균이 피부상재균총을 조절하는 효능이 있으므로 피부건강을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 하이브리드 발효온도에 따른 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트 생산량과 발효계에서의 pH 안정성을 나타낸 도이다.
도 2는 하이브리드 발효계의 초기 pH에 따른 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트 생산량과 발효계에서의 pH 안정성을 나타낸 도이다.
도 3은 하이브리드 발효계의 초기 포도당 농도에 따른 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트 생산량과 발효계에서의 pH 안정성을 나타낸 도이다.
도 4는 하이브리드 발효시 시간에 따른 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트 생산량의 선형성(linearity)을 나타낸 도이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트가 피부 유익균의 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트가 피부 유해균의 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7은 초산균 단독으로 생산한 박테리얼 셀룰로오스 시트를 대조군으로 하여 초산균 및 유산균의 하이브리드 발효로 제조된 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트와 비교한 결과를 나타낸 도이다(좌: 유산균, 중: 단독 발효 박테리얼 셀룰로오스, 우: 하이브리드 발효 박테리얼 셀룰로오스).
도 8은 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균의 하이브리드 발효를 이용한 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 제조공정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 박테리얼 셀룰로오스 생산균 단독으로 생산한 박테리얼 셀룰로오스(좌)와 본 발명의 박테리얼 셀룰로오스 생산균 및 유산균의 하이브리드 발효를 통해 생산한 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 외관을 나타낸 도이다.
도 10은 기존방법대로 박테리얼 셀룰로오스 생산균의 단독 배양에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트와, 본 발명의 하이브리드 발효에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트의 연신율을 비교하여 나타낸 도이다 .
도 11은 기존방법대로 박테리얼 셀룰로오스 생산균의 단독 배양에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트와, 본 발명의 하이브리드 발효에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트를 배양일자 별로 시트의 두께 또는 밀도의 균일성을 비교하여 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
배양 방법
종래 기술의 초산균 박테리얼 셀룰로오스 시트제조법 ( 비교예 1)
박테리얼 셀룰로오스를 생합성하는 효소인 biocellulose synthase (BCS)의 양은 대수증식기(exponential phase)의 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 (Komagataeibacter rhaeticus KOSS-15)의 증식량으로 표현된다. 따라서 이후 실시예에서 공통적으로 사용된 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 (기탁번호 KCCM12270P)의 배양 과정은 전배양 단계와 본배양 단계의 2단계 배양으로 진행하였다. 전배양을 수행하기 위해 포도당 1%, 효모추출물 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.02%, 발효주정 2%를 포함하는 배양배지에 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 균주(기탁번호 KCCM12270P)를 1.0 x 108 CFU/ml로 접종하여 30℃에서 80~160 rpm으로 교반하며 48시간 진탕배양하였다. 본배양을 수행하기 위해 포도당 1%, 설탕 1%, 프롤린 0.1%, 황산마그네슘 0.02%, 초산나트륨 0.1%, 초산 0.2%를 포함하는 본배양배지에 상기 전배양 종료액을 본배양 부피대비 10%(v/v)를 접종하였고 80 rpm, 통기량 0.3 v/v/m 의 조건으로 48시간동안 교반 배양하였다. 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15의 본배양 종료액을 배양배지 대비 5-10% (v/v)가 되도록 배양배지에 각각 접종 및 혼합하여 트레이에 분주하고 0 rpm 및 0.3 vvm 조건에서 3일 동안 정치배양하여 박테리얼 셀룰로오스 시트 전환을 유도하였다. 배양이 끝난 후, NaOH 0.1%를 첨가하여 세척시킨 뒤 탈수하였다.
본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트제조법 ( 제조예 )
비교예 1에서 사용된 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 균주의 증식과 별개로, MRS 액상배지에 보관된 유산균 종균액을 10%(v/v) 되게 접종하고 37℃에서 24시간 동안 하룻밤(overnight) 정치배양하였다. 최종 균체수는 1.0x1010 CFU/ml 수준을 유지하였다.
코마가테이박터 래티커스 KOSS-15의 본배양 종료액과 상기 유산균 배양 종료액을 각각 배양배지 대비 5-10% (v/v) 및 0.5-2% (v/v)가 되도록 접종 및 혼합하여 트레이에 분주하고 0 rpm 및 0.3 vvm 조건에서 72시간 동안 정치배양하여 박테리얼 셀룰로오스 하이브리드 시트 전환(생산)을 유도하였다. 수득한 박테리얼 셀룰로오스 하이브리드 시트는 NaOH 0.1%를 첨가하여 세척시킨 뒤 탈수하고 이어서 121℃, 60분간, 1.2 MPa의 조건에서 가압멸균하여 최종 제조 준비하였다.
실시예 1: 하이브리드 발효 유산균 선별
호기성 균주(Aerobic bacteria)인 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 단독의 박테리얼 셀룰로오스 생산에는 일정량의 균수가 확보되어야 한다. 따라서 증식을 위한 폐쇄적 발효조환경(closed system)에서 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15를 증식시키고 박테리얼 셀룰로오스 생산을 위해 개방형 트레이 환경(open system)으로 전환시켜 균체반응(whole cell reaction)에 의한 박테리얼 셀룰로오스를 생산한다. 따라서 박테리얼 셀룰로오스를 생산하는 균체반응 단계에서는 개방형 트레이 환경 때문에 외부 낙하균 및 용존 산소 등의 변화로 인해 박테리얼 셀룰로오스 생산효소(bacterial cellulose synthase or biocellulose synthase, BCS)의 활성이 떨어져 제대로 된 완전시트(perfect sheet)를 생산하기 어렵다. 따라서 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15균주가 증식에 사용하는 5탄당 회로(pentose phosphate pathway, PPP)를 공유하는 헤테로 유형의 유산균을 적용하여 박테리얼 셀룰로오스를 생산하는 개방형 균체반응 단계에서 균체증식쪽으로 대사흐름이 진행되지 않게 제어하고, 혐기성 균주(anaerobic bacteria)인 유산균이 자체적으로 생산하는 젖산과 초산이 박테리얼 셀룰로오스 생산효소(biocellulose synthase, BCS)의 활성을 극대화시킬 수 있는 산성환경을 제공하여 BCS 효소의 셀룰로오스 생산반응을 도울 수 있는 하이브리드 공정설계가 가능한 유산균의 선별이 중요하다.
본 발명자들은 본 발명의 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15균주와 함께 하이브리드 발효를 시키기 위한 유산균을 선별하기 위하여, SK 바이오랜드의 자체 cell bank로부터 8종의 유산균을 분양 받았다. 각 유산균과 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15균주를 제조예의 방법으로 하이브리드 발효를 하여 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 생산을 진행하고 건조 중량을 측정함으로써 생산 수율을 비교하였다. 대조군으로는 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15균주를 단독으로 이용하여 생산한 박테리얼 셀룰로오스(비교예 1)를 사용하였으며, 이 중에서 가장 높은 수율의 유산균을 선발하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.
하이브리드 발효 유산균 선별
하이브리드 발효의 유산균종 Final pH 박테리얼 셀룰로오스시트의 건조중량(g/18.15x18.15 cm2)
K. rhaeticus KOSS-15+L. casei 3.90 0.26
K. rhaeticus KOSS-15+L. rhamnosus SKB1253 3.60 0.50
K. rhaeticus KOSS-15+L. curvatus 3.67 0.36
K. rhaeticus KOSS-15+L. plantarum SKB1234 3.80 0.48
K. rhaeticus KOSS-15+L. sakei 3.59 0.28
K. rhaeticus KOSS-15+L. acidophilus 3.42 0.24
K. rhaeticus KOSS-15+Bifidobacterium longum 3.59 0.21
K. rhaeticus KOSS-15+Enterococcus faecalis 3.59 0.25
K. rhaeticus KOSS-15 (비교예1) 3.61 0.20
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, K. rhaeticus KOSS-15+L. rhamnosus SKB1253 (수탁번호 KCCM12452P)의 조합과, K. rhaeticus KOSS-15+L. plantarum SKB1234 (수탁번호 KCCM12450P)의 조합으로 하이브리드 발효시, 박테리얼 셀룰로오스 생산량이 가장 우수하였다. 이들은 초산균 K. rhaeticus KOSS-15를 단독으로 사용하여 생산한 박테리얼 셀룰로오스와 비교하여 약 2.5배의 생산성 증가를 나타냈다. 이하의 실시예에서는 L. rhamnosus SKB1253를 하이브리드 발효 유산균으로 이용하여 조건실험을 진행하였다.
실시예 2: 하이브리드 발효온도의 박테리얼 셀룰로오스 생산량에 대한 영향
SK바이오랜드에서 종래 개발한 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15 균주의 적정 증식온도는 25~30℃이하의 낮은 온도이다. 반면, 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus)는 이보다 높은 30~37℃에서 생장하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 하이브리드 균체 발효단계에서는 박테리얼 셀룰로오스가 생산되는데 필요한 pH 범위(pH 3~4)를 유지하기 위하여 락토바실러스 람노서스가 생산하는 젖산과 초산을 이용하고자 하였다. 따라서 박테리얼 셀룰로오스 생산효소(BCS)의 반응온도범위를 기존의 코마가테이박터 래티커스 KOSS-15의 증식온도보다 높게 설정하는 경우의 박테리얼 셀룰로오스의 생산량을 확인하였다.
실시예 1에서 선별된 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus)를 하이브리드 유산균으로 사용하여 25℃, 28℃, 30℃, 33℃, 37℃의 조건에서 제조예의 방법으로 각각 하이브리드 발효를 시켰다. 각 결과를 비교예 1에서 생산된 박테리얼 셀룰로오스의 생산량과 비교하고 균체 효소의 안정적 온도 구간, 및 발효시 필요한 pH가 유지되는지 여부를 확인하였다. 결과는 표 2 및 도 1에 나타내었다.
하이브리드 발효온도의 영향
반응온도 Final pH 박테리얼 셀룰로오스시트의 건조중량(g/18.15x18.15 cm2)
25℃ 3.22 0.70
28℃ 3.24 0.73
30℃ 3.24 0.79
33℃ 3.25 0.72
37℃ 3.26 0.42
K. rhaeticus KOSS-15 (비교예1) 30℃ 7.41 0.32
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 25~33℃ 범위 내에서는 시트의 건조 중량이0.7~0.79 (g/18.15x18.15 cm2)으로 온도 안정성을 나타내었다. 그러나, 37℃에서는 박테리얼 셀룰로오스 양이 최고치 대비 46.8% 감소하였다. 일반적으로 초산균은 25~30℃에서 박테리얼 셀룰로오스를 최적화하여 생산을 하는 것으로 알려져 있으나, 락토바실러스 람노서스와 하이브리드 발효계로 박테리얼 셀룰로오스를 생산할 경우, 최대 33℃까지 발효온도를 높일 수 있음을 확인하였다. 이후 실시예에서는 온도조건은 30℃로 설정하여 조건실험을 진행하였다.
실시예 3: 하이브리드 발효 초기 pH의 BC 생산량, pH, 시트 품질에 대한 영향
코마가테이박터 래티커스 KOSS-15는 초산균으로서 자신의 증식과정에서 대사산물로 초산(acetic acid)을 생산한다. 따라서 균체 내 모든 효소들은 산성인 외부환경에 적응되어 있다. 그러나 박테리얼 셀룰로오스를 생산하는 개방계(open system)에서는 낙하균을 제어할 수 없기 때문에 이로 인한 pH 상승을 유발하게 되고 박테리얼 셀룰로오스를 생산하는 효소의 활성이 떨어져 두께와 품질이 일정하지 않은 불완전 시트(imperfect sheet)가 생산하게 되어 산업적 손실을 야기시킨다. 따라서 하이브리드 발효를 통해 낙하균 등의 환경노출에도 불구하고 pH 상승되지 않고 산성조건을 유지할 수 있다면 두께가 얇은 완전 시트(perfect sheet)를 생산할 수 있어 산업적 손실을 방지할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 이를 확인하기 위해 제조예와 같은 조건에서 반응배지의 초기 pH를 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 및 9.0으로 각각 조정하여 만든 후, 30℃에서 72시간 동안 각각 하이브리드 발효를 시켜 비교예 1과 생산량, 최종 pH 및 시트 완전성 여부를 비교하였다. 결과는 표 3 및 도 2에 나타내었다.
하이브리드 발효시 초기 pH의 영향
L. rhamnosus 하이브리드 발효적용
초기pH 최종 pH 박테리얼 셀룰로오스시트의 건조중량(g/18.15x18.15 cm2) 시트 완전성
3.0 3.13 0.05 불완전
4.0 3.23 0.80 완전
5.0 3.46 0.46 완전
6.0 3.52 0.42 완전
7.0 3.30 0.38 완전
8.0 3.26 0.35 완전
9.0 3.23 0.34 완전
비교예 1 7.41 0.32 불완전
표 3에 나타낸 바와 같이, K. rhaeticus KOSS-15+L. rhamnosus 를 하이브리드 발효시 박테리얼 셀룰로오스는 초기 pH가 3.0 이하에서는 시트가 불완전하게 형성되었으며, 초기 pH가 5.0 이상일 경우 시트는 완전하게 형성되나 초기 pH가 4.0인 조건과 비교하여 생산량이 40% 이상 감소하는 결과가 확인되었다. 따라서, 초기 pH 4.0에서 가장 높은 생산량이 확인되었고 완전 시트가 형성되었다. 이하의 실시예에서는 초기 pH를 4.0으로 이용하여 조건실험을 진행하였다
실시예 4: 하이브리드 발효 포도당 농도의 영향
초산균은 포도당과 설탕, 과당 등의 단당류와 이당류의 복합당을 사용하여 포도당의 박테리얼 셀룰로오스로의 전환에 따른 고갈을 이당류를 통해 추가 공급하는 방식을 사용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 방식은 72시간 발효시간 동안 개방형 발효계에서 낙하균이 혼입되면 이들이 포도당을 소비하는 등으로 인해 pH 상승을 초래해 생산성을 떨어뜨리고, 불완전시트를 형성하게 되는 원인을 유발하게 된다.
따라서 본 발명자들은 발효시간내에 포도당 기질을 단독으로 효소대비 기질양을 높게 유지시킬 때 박테리얼 셀룰로오스 생산량을 최대로 유지시킬 수 있는 기질양을 최적화하고자, 포도당의 농도를 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0으로 변화시키며 박테리얼 셀룰로오스 시트의 생산량, 품질, 및 발효계의 pH를 확인하였다. 결과는 표 4 및 도 3에 나타내었다.
하이브리드 발효 포도당 농도의 영향
포도당 농도
(%, w/v)		 발효계 최종 pH 박테리얼 셀룰로오스시트의 건조중량(g/18.15x18.15 cm2) 시트 완전성
0 8.26 0 불완전
0.5 4.43 0.26 완전
1.0 3.63 0.29 완전
1.5 3.31 0.58 완전
2.0 3.09 0.96 완전
3.0 3.13 0.95 완전
4.0 3.21 0.93 완전
5.0 3.24 0.85 완전
비교예1 7.41 0.32 불완전
표 4에 나타낸 바와 같이, K. rhaeticus KOSS-15+L. rhamnosus 를 하이브리드 발효시 박테리얼 셀룰로오스는 탄소원인 포도당이 존재하지 않을 경우 박테리얼 셀룰로오스를 생성하지 못하였으며, 포도당 농도가 증가할수록 박테리얼 셀룰로오스의 생성량은 증가하였다. 그 중에서도, 포도당 농도가 2~4% 일때 시트의 생산량이 가장 우수하였으며, 품질이 우수한 완전시트가 형성되었다. 또한, 포도당 농도가 2% 미만 혹은 5% 이상일 경우에는 오히려 생산량이 감소하는 결과값을 나타내었다. 따라서, 포도당의 농도를 2~4%로 조절하는 경우, 동일한 기질내의 하이브리드 효소반응을 최대화시켜 초산균과 유산균 모두 대사과정을 원활하게 이용하고 개방형 발효계에서 박테리얼 셀룰로오스를 최대로 생산할 수 있음을 확인하였다.
이하의 실시예에서는 초기 포도당 농도를 2%로 이용하여 조건실험을 진행하였다.
실시예 5: 하이브리드 발효시간에 따른 박테리얼 셀룰로오스 생산량의 선형성과 유산균세포 포집율
피부 마이크로바이옴에 효과가 있는 유산균에 따라, 효능에 필요한 양이 상이할 수 있을 것이다. 따라서 유산균과 효능의 종류에 따라 박테리얼 셀룰로오스 시트 내 유산균의 포집율을 다르게 할 수 있어야 하고, 발효시간에 따라 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 두께를 조절할 수 있어야 한다. 본 발명자들은 이 두 가지 산업적 난제를 해결하기 위해 실시예 1에서 선별된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 비교예 2에서 24시간, 48시간, 72시간동안 각각 하이브리드 발효를 시켜 비교예 1과 생산량을 비교하고 하이브리드 발효시 시간에 대한 생산량을 확인하였다. 또한, 유산균의 포집율은 하기 식에 따라 전체 균수에서 포집반응 후, 남은 균수를 빼어 백분율로 계산하였으며, 각각의 균수는 헤모사이토미터를 활용한 직접계수법을 사용하였다.
식 1
박테리얼 셀룰로오스의 유산균 포집율 (%) = (1-남은균수/전체균수)x100 (%)
결과는 표 5 및 도 4에 나타내었다.
하이브리드 발효시간에 따른 유산균세포 포집율
L. rhamnosus 하이브리드 발효적용
반응시간(h) 박테리얼 셀룰로오스시트의 건조중량
(g/18.15x18.15 cm2)		 포집율(%)
24h 0.34 20
48h 0.59 35
72h 1.03 62
부직포 - 15
상기 표 5 및 도 4에 나타낸 바와 같이, K. rhaeticus KOSS-15+L. rhamnosus 를 하이브리드 발효시 배양시간이 경과함에 따라 시트의 생산량은 증가하고 72시간 발효시 가장 높은 박테리얼 셀룰로오스 생산량을 보여, 발효 시간에 따른 선형성(linearity)이 있음을 확인하였다. 또한 유산균 포집율도 박테리얼 셀룰로오스 생산량이 증가됨에 따라 증가하는 경향성이 있음을 확인하였다. 이는 생성되는 박테리얼 셀룰로오스 양이 증가됨에 따라 더 많은 공극이 형성되고 형성된 공극 사이로 유산균세포가 포집되면서 유산균의 포집율이 증가된 것으로 생각된다.
실시예 6: 피부 마이크로바이옴 항상성 비교
본 발명의 유산균 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 피부 마이크로바이옴의 균형조절과 관련된 항상성(homeostasis) 유지 효과를 비교하기 위하여, 본 발명의 유산균 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트가 피부 유익균인 스테필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)와 피부 유해균인 스테필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 미치는 증식 영향성을 평가하였다.
구체적으로 먼저 trypticase soy broth (TSB)에 상기 피부 유익균과 피부 유해균을 포함하는 글리세롤 보관 용액을 각각 1% (v/v)씩 접종하여 37℃, 18~20시간 동안 진탕배양하고 배양종료액을 생리식염수로 희석해 O.D.600 ㎚ = 0.02~0.04로 맞추었다(약 1x107 CFU/ml). 본 발명의 유산균 하이브리드 시트를 생리식염수에 3% (w/v)의 농도로 첨가하였다. 상기 하이브리드 시트를 3% 첨가한 생리식염수 용액 9.9 ml에 상기 피부 유익균과 피부 유해균 배양 희석액을 100 ㎕씩 접종하고(최종균수 1x105 CFU/ml), 접종 후 0일차, 3일차, 6일차의 생균수를 10배수 다단계 희석하여 trypticase soy agar (TSA)에 1 ml씩 접종하고 플레이트 상에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각 세균별 생존율은 하기 식 2로 계산하였다. 대조군으로는 비교예 1의 초산균만을 사용하여 제조한 박테리얼 셀룰로오스 시트를 사용하였다.
식 2
생존률 (%) = (n일차 실험군 생균수)/(0일차 증류수 생균수) x 100
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 피부 유익균의 생존율이 대조군의 경우 급격히 감소하는 반면, 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스의 경우 피부 유익균의 생존률 감소 경향성이 더디게 나타나는 것을 확인하였다. 이는 박테리얼 셀룰로오스 부착에 따른 상대적인 통기성의 감소에 의한 영향으로 대조군의 경우 급격히 감소하나 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 경우 시트 내 포집된 유산균이 유익균의 생육에 도움을 주면서 상대적으로 유익균의 사멸속도를 더디게 한 것으로 생각된다.
또한, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 박테리얼 셀룰로오스에 의해 유해균의 생존율에 대한 실험결과 대조군의 경우 유해균의 증식에 아무런 영향을 주지 않아 시간이 경과됨에 따라 오히려 유해균이 증식하는 결과가 도출되었다. 반면, 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트를 사용한 경우 시트에 포집되어 있는 유산균세포 성분에 의해 유해균의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7. 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 전자현미경사진(FE-SEM) 비교
유산균 세포가 포함된 본 발명의 5세대 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 완성여부를 전자현미경(FE-SEM)사진을 통해 확인하였다. 도 7은 초산균 단독으로 생산한 박테리얼 셀룰로오스 시트를 대조군으로 하여 초산균 및 유산균의 하이브리드 발효에 의해 제조된 본 발명의 하이브리드 시트와 비교한 결과를 나타낸 도이다. 본 발명의 하이브리드 시트는 세탁 전에는 많은 균 및 이물질에 의해 유산균이 확인되지 않았지만, 세탁 후에는 유산균이 박테리얼 셀룰로오스 시트에 포집되어 있는 것이 확인되었다.
실시예 8: 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 대량생산
상기 실시예를 통해 완성된 본 발명의 5세대 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 생산 공정을 기반으로 1톤 단위 대량생산을 하였다. 공정도는 도 8에 나타내었다. 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트와 KOSS-15 균주 단독 배양으로 제조한 박테리얼 셀룰로오스 시트의 완전성을 육안으로 확인하였다(도 9).
도 9에 나타낸 바와 같이, KOSS-15 초산균 단독으로 생산한 박테리얼 셀룰로오스(좌)보다 본 발명의 하이브리드 시트(우)가 두께가 얇으면서도 균일한 완전시트가 되었으며 KOSS-15 균주 단독 배양으로 생산된 시트는 상대적으로 두께가 불균일하여 품질이 낮은 것을 확인하였다.
실시예 9: 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 물성 비교
상기 실시예를 통해 제조된 본 발명의 5세대 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트의 품질과 관련된 물성을 다음과 같은 실험을 통하여 확인하였다. 시험군은 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트를 사용하였고, 대조군으로는 유산균과 공서배양하지 않고 제조한 박테리얼 셀룰로오스 시트를 사용하였다.
9-1. 시트의 두께, 함수율 및 건조중량의 측정
본 발명자들은 시트의 두께, 함수율 및 건조중량을 측정하였다(Biotechnology Letters (2005) 27: 1435-1438 참조).
시트의 함수율(WHC, water holding capacity)은 하기 식 3에 따라 측정하였다.
식 3
WHC = (Wwet - Wdry) / Wdry
상기 함수율을 측정하기 전, 각 박테리얼 셀룰로오스 시트를 5000 mm2 (지름 약 79.8 mm)의 원형 시험편으로 제작한 후, 정제수에 15시간 이상 침지하였다. 상기 함수 시트의 무게(Wwet)는 상기 정제수에서 15시간 이상 침지한 시트를 꺼내어 반원으로 2회 또는 90˚로 4회 털어내어 잔여수분 제거한 후에 측정하였다. 상기 건조 시트의 무게(Wdry)는 85℃에서 하룻밤 동안 건조 또는 105℃에서 5시간 이상 건조한 후에 측정하였다.
시트의 건조중량 (미터평량)은 하기 식 4에 따라서, 상기 측정된 샘플의 무게(Wdry)를 동일한 면적값으로 환산하여 측정하였다.
식 4
미터평량(g/㎡)=건조셀룰로오스 무게(g/5000 ㎟) X 200
시트의 두께는 상기 각 시험편을 정제수에서 15시간 이상 침지한 후 마이크로미터기를 이용하여 각 시트의 두께를 측정하였다.
결과는 표 6에 나타내었다.
구분 두께(㎜) 젖은무게 (g) 건조중량(g/㎡) 함수율
기존방법 0.61±0.03 7.22±0.21 13.97±0.35 102.49±5.42
공서배양 0.86±0.03 9.56±0.14 13.56±0.31 140.16±2.40
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 박테리얼 셀룰로오스 시트는 기존방법으로 제조된 박테리얼 셀룰로오스 시트에 비하여 건조중량은 감소하였으나, 두께, 젖은무게 및 함수율의 면에서 크게 증가하였음을 확인하였다. 상기 셀룰로오스 중량대비 함수율의 증가, 젖은 무게 및 두께의 증가는 유산균과의 공서배양으로 인해 시트 내에 공극율이 증가했기 때문인 것으로 예상된다. 함수율의 증가는 화장유액이나 수분을 많이 흡수할 수 있음을 나타내고, 시트 내 공극이 많으면 시트가 부드럽고 푹신한 촉감을 줄 수 있다.
9-2. 시트의 최대하중 및 연신율의 측정
본 발명자들은 시트의 최대하중 및 연신율을 측정하였다.
먼저 시험편을 다음과 같이 제조하였다.
Figure 112020070642915-pat00001
폭(b): 15mm
두께(h): ≤ 1mm, 인장강도 테스트 전 마이크로미터를 이용하여 측정
게이지 길이(L0): 50.0 mm
전체길이: 90 mm로 제작
상기 규격에 따라서 마스크 시트 1개당 가로방향으로 절취한 시험편 2개와 세로방향으로 절취한 시험편 2개를 제조하였다.
측정장치는 그립 거리를 게이지 길이(L0) 50 mm에 맞게 조절하고, 테스트 조건을 입력(Separation rate 50mm/min, Preload 0.1N)하여 준비하였다.
상기에서 준비된 시험편은 양 끝에 여과지(HM No.20)를 덧대어 게이지 표시에 맞춰서 파지하였다. 여과지를 덧댄 이유는 마스크팩 시트만 파지할 경우 미끄러짐이 발생하였기 때문이며, 응력 발생시에는 측정장치의 그립 거리를 조절하여 해소하였다. 시험편의 명칭과 dimension을 입력하고 테스트를 진행하였다. 폭과 길이는 동일하게 하였으며, 파지 전 두께를 측정하여 입력하고, 방향성에 따른 시편별로 5개의 데이터가 얻어질 때까지 반복 테스트하였다. 이 때 그립에서 파단된 샘플 데이터는 폐기하였다 (ASTM D 882 - Standard Test Method for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting, KS K ISO 9073 텍스타일 - 부직포 시험방법 - 제3부: 인장 강도 및 신도 측정 참조)
시트의 연신율은 하기 식 5에 따라서 계산하였다.
식 5
연신율(%) = 파단 순간까지 늘어난 길이(L-L0) / 초기 게이지 길이(L0) X 100
결과는 표 7 및 도 10에 나타내었다.
구분 최대하중(N) 연신율 ( % )
기존방법 5.08±0.15 14.13±1.79
공서배양 11.00±1.58 22.06±2.49
상기 표 7 및 도 10(A: 기존방법, B: 공서배양)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 BC 시트의 경우 유산균의 공서 배양으로 인해 시트의 최대 하중 및 연신율이 동시에 크게 증가하였음을 알 수 있다. 이는 유산균의 존재로 인해 시트의 내부구조가 변하였기 때문인 것으로 생각되며, 셀룰로오스 간의 꼬임이 증가했을 것으로 예상된다. 연신율이 증가하면 시트의 촉감이 우수해지고, 시트의 강도가 늘어나 찢어지지 않고 사용할 수 있다. 또한, 시험편의 방향성에 따른 물성의 차이는 유의적이지 않았다.
9-3. 시트의 두께 또는 밀도의 균일성 비교
본 발명자들은 배양일수에 따른 시트의 두께 또는 밀도의 균일성을 비교하였다. 도 11의 A에 나타낸 바와 같이, 기존의 방법으로 BC 생산 미생물만을 배양하였을 때에는 1일차에 시트가 균일하게 제작되지 않아 시트의 색깔에 차이가 있는 것을 볼 수 있었다. 그러나, 도 11 B에 나타낸 바와 같이, BC 생산균과 유산균을 공서배양한 때에는 1일차부터 균일한 시트를 얻을 수 있음을 확인하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12270P 20180530 한국미생물보존센터(국외) KCCM12450P 20190305 한국미생물보존센터(국외) KCCM12452P 20190305

Claims (21)

  1. 박테리얼 셀룰로오스 생산균으로 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 (Komagataeibacter rhaeticus KOSS15) 균주(기탁번호 KCCM12270P);
    락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 유산균을 하이브리드 배양하는 단계; 및
    상기 배양에 의해 생산된 박테리얼 셀룰로오스를 세척 및 멸균하는 단계를 포함하는, 유산균을 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 시트의 제조방법에 있어서,
    상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 박테리얼 셀룰로오스 생산균의 단독 배양에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 박테리얼 셀룰로오스 시트에 비하여, 두께 균일성, 함수율, 연신율 및 최대 하중이 증가된 것인, 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 SKB1253 균주(Lactobacillus rhamnosus SKB1253, 수탁번호 KCCM12452P), 락토바실러스 플란타룸 SKB1234 균주(Lactobacillus plantarum SKB1234, 수탁번호 KCCM12450P), 또는 이들의 조합인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양은 개방형 트레이 상에서 이루어지는 것인, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 배양이 이루어지는 배지의 초기 pH는 3.5~9인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배양이 이루어지는 배지의 최종 pH는 3~4.5인, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 배양은 25~35℃의 온도 조건 하에서 이루어지는 것인, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 배양이 이루어지는 배지의 포도당 농도는 0.5~5 %(w/v)인, 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 배양은 24시간 이상 이루어지는 것인, 제조방법.
  12. 박테리얼 셀룰로오스 생산균으로 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 (Komagataeibacter rhaeticus KOSS15) 균주(기탁번호 KCCM12270P); 및
    락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 유산균의 하이브리드 배양에 의해 제조된 후 멸균한 박테리얼 셀룰로오스 시트를 포함하는, 유산균 하이브리드 마스크 시트에 있어서,
    상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 박테리얼 셀룰로오스 생산균의 단독 배양에 의해 제조된 박테리얼 셀룰로오스를 포함하는 마스크 시트에 비하여, 두께 균일성, 함수율, 연신율 및 최대 하중이 증가된 것인, 유산균 하이브리드 마스크 시트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 SKB1253 균주(Lactobacillus rhamnosus SKB1253, 수탁번호 KCCM12452P), 락토바실러스 플란타룸 SKB1234 균주(Lactobacillus plantarum SKB1234, 수탁번호 KCCM12450P), 또는 이들의 조합인, 유산균 하이브리드 마스크 시트.
  16. 제12항에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 피부상재균총의 조절 효능이 있는 것인, 유산균 하이브리드 마스크 시트.
  17. 제12항에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 피부 유익균인 스테필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)의 생존율 향상용인, 유산균 하이브리드 마스크 시트.
  18. 제12항에 있어서, 상기 박테리얼 셀룰로오스 시트는 피부 유해균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 증식 억제용인, 유산균 하이브리드 마스크 시트.
  19. 삭제
  20. 제12항, 및 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 유산균 하이브리드 마스크 시트를 포함하는, 피부미용 또는 화장용 마스크 팩.
  21. 제12항, 및 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 유산균 하이브리드 마스크 시트 및 화장유액을 포함하는, 피부미용 또는 화장용 마스크 팩.

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