CN118064309A - 一种高产γ-氨基丁酸的复合发酵菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产γ‑氨基丁酸的复合发酵菌剂及应用。所述复合发酵菌剂包含副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株；所述副干酪乳杆菌菌株保藏号为CGMCCNO.29138，保藏日期为2023年11月27日，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)保藏号为CGMCCNO.25011保藏日期为2022年06月06日。所述复合发酵菌剂应用于酿造固态发酵食醋和液态发酵食醋，发酵剂用量少、发酵效率快，最终所发酵的食醋产品中的γ‑氨基丁酸含量显著提高，营养价值更高，且产品的风味和口感也明显优于对照组，可满足消费者的养生和高品质需求，为食醋保健功效的开发提供了新的途径。

Description

一种高产γ-氨基丁酸的复合发酵菌剂及应用

技术领域

本发明属于微生物应用和食醋酿造领域，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸的复合发酵剂及其在食醋酿造中的应用。

背景技术

食醋是中国各大菜系中传统的调味品，在我国已有三千多年的历史。近年来，人们对于食醋保健功能的认识也越来越清晰。食醋除含有有机酸以外，还含有丰富的氨基酸、多肽、微量元素、川芎嗪、多酚、黄酮等有益成分，它们赋予了食醋降血压、降血脂、抗氧化、心血管保健等多种功效。国内多位学者对我国多种传统食醋的功能性成分进行了研究，但对食醋中γ-氨基丁酸的研究报道并不多。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的功能性氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，有降血压、促进脑机能、促进长期记忆、生长激素的分泌、抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能、促进肾机能改善和保护、抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能等保健功能。由于γ-氨基丁酸具有良好的生物学功能，成为近年来食品营养领域研究的热点。

目前研究发现，微生物能够利用体内的谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸或其盐脱羧转化成γ-氨基丁酸。常见能够产生γ-氨基丁酸的微生物有乳酸菌、酿酒酵母、大肠杆菌、红曲霉等，但各种菌株间的产量差异比较大，且在不额外添加前体L-谷氨酸或其盐时所产的γ-氨基丁酸产量普遍偏低，且很少应用于实际生产中。例如，陈春旭在《γ-氨基丁酸高含量谷物醋的研制及其抗氧化功能研究》中公开了在额外添加3％谷氨酸钠(w/w)时所发酵的谷物醋中γ-氨基丁酸含量为100mg/L。赵天行等在《一种棕色、富含γ-氨基丁酸蜜柑醋的制作及其品质分析》(中国酿造，2021，40(5)：205-209)中公开了一种以高产棕色素的葡糖杆菌发酵柑橘汁，所制得的蜜柑醋中γ-氨基丁酸含量最高为383.19mg/100mL。中国发明专利CN104789610A公开了一种乳酸菌在生产γ-氨基丁酸中的应用及制备γ-氨基丁酸的方法，其中所述的乳酸菌能够产生γ-氨基丁酸，在发酵培养基中不添加谷氨酸钠时的产量仅为0.05g/L。中国发明专利CN113367191B公开了一种副干酪乳杆菌在制备具有抗氧化功效的组合物中的应用，所制备的发酵乳液中γ-氨基丁酸含量也仅有14～21mg/kg。中国发明专利CN103013879B公开了一株具有高产γ-氨基丁酸能力的植物乳杆菌，其产γ-氨基丁酸的能力为138mg/L。中国发明专利CN115181708B公开了一种高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌在未添加谷氨酸钠和添加1％谷氨酸钠的MRS培养基中的γ-氨基丁酸含量分别为116.40和337.10mg/L，且利用该菌株在未添加谷氨酸钠的条件下所发酵的黄瓜中γ-氨基丁酸含量为377.64mg/L。

乳酸菌和芽孢杆菌是食醋发酵过程中的重要微生物，与食醋的风味和口感以及营养物质有关。目前的研究主要集中在单菌株产γ-氨基丁酸，且单菌株合成γ-氨基丁酸的能力较弱，同时多数需额外添加前体L-谷氨酸或其盐，有关食醋源高产γ-氨基丁酸的副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合发酵的研究未见报道。因此利用复合菌株提高食醋中的γ-氨基丁酸含量从而提升食醋保健品质具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用量少、发酵效率快、γ-氨基丁酸产量高、产品营养价值丰富、风味口感佳、品质稳定的复合发酵剂及其在食醋酿造中的应用。

具体地，本发明第一方面提供了一种复合发酵剂，所述复合发酵剂包含副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株；所述副干酪乳杆菌菌株和枯草芽孢杆菌菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述副干酪乳杆菌菌株保藏号为CGMCCNO.29138，保藏日期为2023年11月27日，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)保藏号为CGMCCNO.25011保藏日期为2022年06月06日。

在某些实施方式中，所述复合发酵菌剂包含5～20份副干酪乳杆菌、10～30份枯草芽孢杆菌。

在某些实施方式中，所述复合发酵菌剂中副干酪乳杆菌CGMCC NO.29138和枯草芽孢杆菌CGMCCNO.25011的活菌数均为1.0×10⁷～1.0×10¹¹CFU/g。

本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的复合发酵菌剂的制备方法，包括如下步骤：将副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌单独分别用MRS液体培养基、LB液体培养基进行三级扩培，培养结束后采用中空纤维膜浓缩发酵液，然后将无菌保护剂与浓缩后的发酵液均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用真空冷冻干燥制得菌剂；在无菌操作环境中，将菌剂按重量份包含5～20份副干酪乳杆菌、10～30份枯草芽孢杆菌混合，分装。

在某些实施方式中，所述无菌保护剂的制备方法为：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、乳糖3g、山梨醇2g、甘露醇2g、海藻糖3g、麦芽糊精2g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的复合发酵菌剂在食醋酿造中的应用。

在某些实施方式中，所述食醋选自香醋、陈醋、米醋和/或果醋。

在某些实施方式中，当制备香醋或陈醋时，分别接入醋醅重量0.1～1％(w/w)的上述复合发酵剂和1～10％(w/w)的种醅进行醋酸发酵；当制备米醋或苹果醋时，分别接入米酒或苹果酒重量0.1～1％(w/w)的上述复合发酵剂和1～10％(w/w)的醋酸菌进行醋酸发酵。

在某些实施方式中，所述复合发酵剂可以直投也可以活化后加入。

在某些实施方式中，所述所述活化方法为：1g复合发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min。

本发明相对于现有技术具有以下效果：

本发明从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到的副干酪乳杆菌CGMCCNO.29138和枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011，制得的复合发酵剂可应用于酿造固态发酵食醋和液态发酵食醋，发酵剂用量少、发酵效率快。在不添加外源谷氨酸钠的条件下可稳定显著提高食醋中的γ-氨基丁酸含量，提升丰富产品营养价值，改善产品风味和品质；该复合发酵剂应用在食醋酿造中具有高产γ-氨基丁酸的活性，含量可达975.76mg/100mL(不额外添加谷氨酸钠)；该复合发酵剂应用在食醋酿造中，使产品营养价值更高，产品的香味及滋味也明显优于对照组可满足消费者的养生和高品质需求。

附图说明

图1为本发明的副干酪乳杆菌的菌落形态。

图2为本发明的枯草芽孢杆菌的菌落形态。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

本发明实施例中MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6，115℃灭菌20min。用于乳酸菌培养。

MRS固体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，碳酸钙25.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6，115℃灭菌20min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。用于芽孢杆菌培养。

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠0.5g，琼脂20.0g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min。

醋醅模拟培养体系：取自镇江香醋醋酸发酵第0天的醋醅(麸皮、糠、酒醪混合物，未接菌种)。

实施例中各项指标检测方法如下：总酸、不挥发酸的含量参照《GB 18187-2000》方法进行测定，其中总酸以乙酸计，不挥发酸以乳酸计；还原糖的含量参照《GB 5009.7-2016》方法进行测定，还原糖以葡萄糖计；川芎嗪(四甲基吡嗪)的含量参照《GB/T 19777-2013》方法进行测定；有机酸、氨基酸(含γ-氨基丁酸)采用HPLC法进行测定。

本发明的复合发酵剂不仅可应用于下述食醋的酿造，也适用于其它固态和液态发酵食醋的酿造。

实施例1副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

A.副干酪乳杆菌的分离与鉴定：

(1)菌株分离

称取镇江香醋醋醅样品15g，置于85mL已灭菌的MRS液体培养基，温度37℃、转速200r/min，振荡培养20min后，对样品进行10倍梯度稀释，选取稀释梯度为10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的稀释液，各梯度稀释液各吸取100μL涂布于含2.5％碳酸钙的MRS培养基平板，37℃倒置培养24-48h。

(2)菌株纯化与复筛

挑取MRS培养基平板长势良好、溶钙圈大的菌落，将单个菌落平板划线分离3次，取单菌落接种到复筛液体培养基中，培养72h后测定γ-氨基丁酸含量，选取产γ-氨基丁酸能力最强的菌株4℃冰箱保存以供使用。

(3)菌株分子鉴定

纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P₀-P₆扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16SrDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属。MRS培养基平板上筛得的菌株16S rDNA全长序列为1563bp，与其具有最高同源性的菌株为Lactobacillusparacasei，相似度为100.0％，16S rDNA序列见SEQ ID No：1，将该菌株命名为副干酪乳杆菌HSCY 2006。

SEQ ID NO:1副干酪乳杆菌的16S rDNA核苷酸序列

ACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGG

AACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAAC

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GTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCG

B.枯草芽孢杆菌的分离与鉴定：

(1)菌株分离

称取镇江香醋醋醅样品15g，置于85mL已灭菌的LB培养基中，温度30℃、转速200r/min，振荡培养20min后，90℃水浴加热10min，对样品进行10倍梯度稀释，选取稀释梯度为10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的稀释液，分别吸取100μL涂布LB固体培养基平板，40℃倒置培养48h。

(2)菌株纯化

挑取单个菌落革兰氏染色、镜检，对革兰氏阳性、杆状的细菌平板划线分离3次，取单菌落保存。

(3)菌株筛选

将纯化好的待测菌株用点接法接种到产蛋白酶筛选培养基，37℃培养24h后，选取菌落数30-300的平板，从中挑取生长良好、有明显透明圈的菌落，即产蛋白酶菌株。测量透明圈直径和菌落直径之比(H/d)，选择比值大于4.0的16株菌株，即具有较强产蛋白酶能力的菌株。再将初筛得到的16株菌株转接到产淀粉酶筛选培养基上，40℃培养36h后，在平板上滴加5mL碘液，均匀覆盖平板，按照前面方法选择透明圈最大的那株菌株，即可得到1株既高产蛋白酶又高产淀粉酶的菌株。其菌落形态为：呈白色或微黄色，表面粗糙，不透明，在液体培养基中生长时常形成皱壁。其菌落形态如图1所示。采用福林-酚比色法测定蛋白酶酶活发现，该菌株蛋白酶活性可达到952.87U/mL发酵液。同时作为对照，使用相同的方法检测公开号为CN113549575A的专利中枯草芽孢杆菌的蛋白酶活性，检测结果为202.3U/mL。采用3，5-二硝基水杨酸法(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)测定发现，该菌株淀粉酶活性可达到129.62U/mL发酵液。

(4)菌株鉴定

对纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P₀-P₆(中国硕士学位论文全文数据库，朱其瀚，“镇江香醋发酵过程中微生物分离及其产酸特性”，2008年)扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16S rDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16S rDNA全长序列为1425bp，与其具有最高同源性的菌株为Bacillus subtilis，相似度为100.0％，16S rDNA序列见SEQ ID NO：2。结合其特征，将本发明菌株命名为枯草芽孢杆菌HSCY 3011。

SEQ ID NO:2枯草芽孢杆菌的16S rDNA核苷酸序列

TACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT

GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTA

ATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT

TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACG

ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC

TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA

CGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG

TACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA

AGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGG

GTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGC

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AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC

CACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCT

AACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT

GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAC

CTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA

GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC

CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGA

CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGA

CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTA

AGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAA

GCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT

ACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTT

TTAGGAGCCAGCCGCCtGC.副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的保藏

上述副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别于2023年11月27日、2022年06月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏登记入册的编号分别为CGMCC NO.29138、CGMCC NO.25011，其分类命名分别为Lactobacillusparacasei、Bacillus subtilis。

实施例2复合发酵菌剂的制备、活化

复合发酵菌剂制备方法为：将副干酪乳杆菌CGMCC NO.29138和枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011单独分别用MRS液体培养基、LB液体培养基进行三级扩培，培养结束后采用中空纤维膜浓缩发酵液至原发酵液体积的1/6，然后将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用真空冷冻干燥制得菌剂，菌剂的活菌数均为1.0×107～1.0×1011CFU/g。在无菌操作环境中，将菌剂按重量份包含5～20份副干酪乳杆菌CGMCCNO.29138、10～30份枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011混合，分装于真空包装袋中，即为复合发酵剂，阴凉干燥条件下贮存期为一年。其中，无菌保护剂的制备：上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、乳糖3g、山梨醇2g、甘露醇2g、海藻糖3g、麦芽糊精2g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。真空冷冻干燥工艺参数：冷阱温度为-40℃，板的温度为25℃，真空度初始为30Pa，终止为40Pa。

复合发酵菌剂活化方法为：1g复合发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min。

实施例3菌株在醋醅模拟体系中产γ-氨基丁酸含量的测定

添加副干酪乳杆菌和草芽孢杆菌的试验组：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅10kg置于20L塑料桶中，接种新鲜活化的副干酪乳杆菌CGMCC NO.29138菌液，接种量为醋醅重量的1％；再接种枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011菌液，接种量为醋醅重量的1％；最后按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组1：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅10kg置于20L塑料桶中，加醋醅重量2％的蒸馏水替代上述两种活化的菌液，按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组2：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅10kg置于20L塑料桶中，接种新鲜活化的副干酪乳杆菌CGMCC NO.29138菌液，接种量为醋醅重量的1％，加醋醅重量1％的蒸馏水替代枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011菌液，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组3：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅10kg置于20L塑料桶中，接种新鲜活化的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011菌液，接种量为醋醅重量的1％，加醋醅重量1％的蒸馏水替代副干酪乳杆菌CGMCC NO.29138菌液，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组4：

取发酵第0天的醋醅10kg置于20L塑料桶中，接种新鲜活化的副干酪乳杆菌CGMCCNO.29138菌液，接种量为醋醅重量的1％；再接种新鲜活化的购自CGMCC，菌株保藏编号为CGMCC 1.8715的枯草芽孢杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％；最后按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组5：

取发酵第0天的醋醅10kg置于20L塑料桶中，接种新鲜活化的购自CGMCC、菌株保藏编号为CGMCC 1.9089的副干酪乳杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％；再接种新鲜活化的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011菌液，接种量为醋醅重量的1％，最后按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组6：

取发酵第0天的醋醅10kg置于20L塑料桶中，接种新鲜活化的购自CGMCC、菌株保藏编号为CGMCC 1.9089的副干酪乳杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的购自CGMCC，菌株保藏编号为CGMCC 1.8715的枯草芽孢杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，最后按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

发酵结束时，采用HPLC对各组醋卤检测γ-氨基丁酸含量。发酵结束醋卤中γ-氨基丁酸的检测结果如表1所示。

表1发酵结束醋卤中的γ-氨基丁酸含量

联合使用本发明的两珠菌株的实验组发酵结束醋卤中γ-氨基丁酸含量明显高于对照组1-6中不添加或单独使用的本发明菌株或本发明菌株与市售菌株联合使用的γ-氨基丁酸含量。

实施例4复合发酵剂在镇江香醋酿造中的应用

1、酒精发酵

取6个500kg大缸，各取60kg优质糯米加水浸泡过夜。利用蒸汽将糯米蒸熟，以冷水淋饭至温度约40℃加入酒药0.4kg，拌匀后入缸搭窝成喇叭状。待窝中有一定的酒液出现时，每缸加入麦曲3.0kg，然后加水180kg，搅拌均匀。酒精发酵过程中，定期搅拌，温度控制在30℃左右，发酵7天结束。发酵结束后，将6个大缸中酒醪混合均匀，备用。

2、醋酸发酵

添加复合发酵剂组：

选取3个500kg大缸，加入酒醪200kg，麸皮70kg，大糠32kg，将所投原料充分拌匀后，接种复合发酵剂。称取酒醪重量0.2％的复合发酵剂活化(1g发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组7：

选取3个500kg大缸，加入酒醪200kg，麸皮70kg，大糠32kg，将所投原料充分拌匀后，分别接种自制副干酪乳杆菌菌剂和自制枯草芽孢杆菌菌剂(副干酪乳杆菌购自CGMCC、菌株保藏编号为CGMCC 1.9089；枯草芽孢杆菌购自CGMCC，菌株保藏编号为CGMCC 1.8715的枯草芽孢杆菌，菌剂的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹¹CFU/g菌剂)。分别称取酒醪重量0.2％的副干酪乳杆菌菌剂和自制枯草芽孢杆菌菌剂活化(1g菌剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

3、加盐封醅7天，然后加入7.0％炒米色进行淋醋。经煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。对照组7步骤与实施例3保持一致。

4、总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量检测

发酵结束时，取两组醋卤进行检测。总酸、不挥发酸的含量参照《GB 18187-2000》方法进行测定，总酸以乙酸计；还原糖的含量参照《GB 5009.7-2016》方法进行测定，还原糖以葡萄糖计；川芎嗪(四甲基吡嗪)的含量参照《GB/T19777-2013》方法进行测定。

表2发酵结束醋卤中总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量对比

与对照组7相比，使用本发明复合发酵剂的实施例3，发酵结束醋卤中总酸含量提高12.22％，不挥发酸含量提高43.32％，还原糖含量提高31.89％，川芎嗪含量提高262.40％。

5、有机酸含量检测

采用HPLC对发酵结束的醋卤中9种有机酸含量进行分析，结果如表3所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在添加复合发酵剂的实施例3中的含量分别为48.31mg/mL和15.79mg/mL，相比于对照组7分别提高了16.44％和60.14％。有机酸含量增加，使食醋入口更柔和，回味绵长。说明该发明所用的复合发酵剂可代谢产生较丰富的有机酸，一方面能缓冲乙酸带来的强烈刺激性酸味，另一方面可以与醇类物质酯化生成酯类物质，可丰富食醋的风味与口感，提高产品品质。

表3发酵结束醋卤中的有机酸含量

6、氨基酸(含γ-氨基丁酸)含量检测

采用HPLC对成品醋中18种氨基酸含量进行了分析，结果如下表4所示。发酵结束时，实施例3中组成蛋白质的氨基酸有17种，总含量为2376.82mg/100mL，相比对照组7的864.52mg/100mL提高了174.93％；所检测出的非蛋白质氨基酸γ-氨基丁酸含量高达975.76mg/100mL，远高于对照组7。说明该发明所用的复合发酵剂可产生丰富的氨基酸，尤其高产功能成分γ-氨基丁酸，从而提高产品的口感和营养价值。

表4成品醋中的氨基酸含量

7、成品醋感官指标分析

选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例3与对照组7的产品进行感官评价分析，结果见表5。通过喜好性综合打分评价，实施例3的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组7，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，显著改善了产品风味和口感，从而提高了产品感官品质。

表5成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香气(10分)	滋味(10分)
					实施例3	9.5	9.6	9.6	9.8
对照组7	8.4	7.5	8.3	7.6

实施例5复合发酵剂在山西老陈醋中的应用

1、酒精发酵

取6个500kg大缸，各取粉碎至四到六瓣的高粱100kg加水50kg润料15h。利用蒸汽将高粱蒸熟，加入200kg水搅拌后冷却至30℃，然后加入60kg大曲和0.1kg活性干酵母，搅拌均匀。酒精发酵过程中，定期搅拌，温度控制在30℃左右，发酵15天结束。

2、醋酸发酵

添加复合发酵剂组：

选取3个500kg大缸，加入酒醪180kg，麸皮82kg，大糠95kg，将所投原料充分拌匀后，接种复合发酵剂。称取醋醅重量0.3％的复合发酵剂活化(1g发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行翻醅操作至发酵结束。

对照组8：

选取3个500kg大缸，加入酒醪180kg，麸皮82kg，大糠95kg，将所投原料充分拌匀后，分别接种自制副干酪乳杆菌菌剂和自制枯草芽孢杆菌菌剂(副干酪乳杆菌购自CGMCC、菌株保藏编号为CGMCC 1.9089；枯草芽孢杆菌购自CGMCC，菌株保藏编号为CGMCC 1.8715的枯草芽孢杆菌，菌剂的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹¹CFU/g菌剂)。分别称取醋醅重量0.3％的副干酪乳杆菌菌剂和自制枯草芽孢杆菌菌剂活化(1g菌剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行发酵、熏醅、淋醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。对照组8步骤与实施例4保持一致。

3、总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量

表6发酵结束醋卤中总酸、不挥发酸、还原糖和川芎嗪含量对比

与对照组8相比，使用本发明复合发酵剂的实施例4，发酵结束醋卤中总酸含量提高13.49％，不挥发酸含量提高24.53％，还原糖含量提高30.36％，川芎嗪含量提高178.71％。

4、有机酸含量

采用HPLC对发酵结束的醋卤中9种有机酸含量进行分析，结果如表7所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例4中的含量分别为37.20mg/mL和11.72mg/mL，相比于对照组8分别提高了17.97％和51.46％。同样也说明该发明所用的复合发酵剂可代谢产生较丰富的有机酸，降低酿造食醋入口的刺激感。

表7发酵结束醋卤中的有机酸含量

5、氨基酸含量

采用HPLC方法对成品醋中18种氨基酸含量进行了分析，结果如下表8所示。发酵结束时，实施例4氨基酸的总含量为1725.43mg/100mL，相比对照组8的648.94mg/100mL提高了165.88％；所检测出的非蛋白质氨基酸γ-氨基丁酸含量为563.86mg/100mL，是对照组8含量的十倍以上。

表8成品醋中的氨基酸含量

6、成品醋感官指标分析

选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例4与对照组8的产品进行感官评价分析，结果见表9。通过喜好性综合打分评价，实施例4的产品在色泽、体态、香气和滋味方面的得分明显高于对照组8，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，显著提高了产品品质。

表9成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香气(10分)	滋味(10分)
					实施例4	9.3	8.9	9.7	9.6
对照组8	8.1	6.8	7.6	7.1

实施例6复合发酵剂在液态米醋酿造中的应用

1、酒精发酵

将糯米经粉碎机粉碎成细粉后，与水按照1：5(w/w)的比例加入糊化罐中。加入2万U/mL的高温α-淀粉酶，添加量为每吨糯米加入0.5L。利用螺旋式冷却器将醪液温度降至60℃后，转入糖化罐，加入10万U/g的糖化酶，添加量为每吨糯米加入50g，55℃保温40min。保温结束后，利用螺旋式冷却器将温度降至30℃后，转入酒精发酵罐。接种购自CICC、菌株保藏编号为CICC1001的酿酒酵母，接种量为5％(v/v)，控制温度为30℃，发酵至酒精度为9％vol。

2、醋酸发酵

添加复合发酵剂组：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为9％vol的米酒，称取米酒重量0.5％的复合发酵剂活化(1g发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，同时按照米酒重量5％的接种量接入购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20761的醋酸菌，温度为30℃，调整通气量为0.30vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

对照组9：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为9％vol的米酒，称取米酒重量0.5％的蒸馏水代替上述复合发酵剂，同时按照米酒重量5％的接种量接入购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20761的醋酸菌，温度为30℃，调整通气量为0.30vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

3、发酵结束的醋液采用0.01μm陶瓷膜过滤后，调配酸度，灌装即得成品。

4、理化指标检测

发酵结束后分别对酿造的米醋中总酸、还原糖、乳酸及γ-氨基丁酸含量进行检测，如表10所示。

表10米醋主要理化指标对比

5、成品醋感官指标分析

选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例5与对照组9的产品进行感官评价分析，结果见表11。通过喜好性综合打分评价，实施例5的产品在香气和滋味方面的得分明显高于对照组9，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，对米醋香气和滋味贡献明显，显著提升了产品品质。

表11成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香气(10分)	滋味(10分)
					实施例5	9.6	9.4	9.1	9.3
对照组9	8.9	8.3	7.3	6.7

实施例7复合发酵剂在苹果醋酿造中的应用

1、酒精发酵

将新鲜苹果汁调配至糖含量为16～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0后，接种购自CICC，菌株保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母，接种量为5％(v/v)，

28～30℃发酵至酒精度约为7％vol。

2、醋酸发酵

添加复合发酵剂组：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为7％vol的苹果酒，称取苹果酒重量0.8％的复合发酵剂直投式接种，同时按照米酒重量6％的接种量接入购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20001的醋酸菌，温度为30℃，调整通气量为0.30vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

对照组10：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为7％vol的苹果酒，接种自制副干酪乳杆菌菌剂和自制枯草芽孢杆菌菌剂(副干酪乳杆菌购自CGMCC、菌株保藏编号为CGMCC 1.9089；枯草芽孢杆菌购自CGMCC，菌株保藏编号为CGMCC 1.8715的枯草芽孢杆菌，菌剂的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹¹CFU/g菌剂)。分别称取苹果酒重量0.8％的副干酪乳杆菌菌剂和自制枯草芽孢杆菌菌剂直投式接种，同时按照苹果酒重量6％的接种量接入购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20001的醋酸菌，温度为30℃，调整通气量为0.4vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

3、发酵结束的醋液采用0.01μm陶瓷膜过滤后，调配酸度，灌装即得成品。

4、理化指标检测

发酵结束后分别对酿造的苹果醋中总酸、还原糖、乳酸及γ-氨基丁酸含量进行检测，如表12所示。

表12苹果醋主要理化指标对比

5、成品醋感官指标分析

选取30名富有经验的香醋感官评价人员，对实施例6与对照组10的产品进行感官评价分析，结果见表13。通过喜好性综合打分评价，实施例6的产品在香气和滋味方面的得分明显高于对照组10，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，对苹果醋香气和滋味贡献明显，显著提升了产品品质。

表13成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香气(10分)	滋味(10分)
					实施例6	9.3	8.9	9.6	9.8
对照组10	9.1	8.5	7.7	7.5

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种复合发酵剂，其特征在于，所述复合发酵剂包含副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株；所述副干酪乳杆菌菌株和枯草芽孢杆菌菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述副干酪乳杆菌菌株保藏号为CGMCCNO.29138，保藏日期为2023年11月27日，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)保藏号为CGMCCNO.25011保藏日期为2022年06月06日。

2.根据权利要求1所述的复合发酵菌剂，其特征在于，包含5～20份副干酪乳杆菌、10～30份枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合发酵菌剂中所述副干酪乳杆菌CGMCC NO.29138和枯草芽孢杆菌CGMCC NO.25011的活菌数均为1.0×10⁷～1.0×10¹¹CFU/g。

4.根据权利要求1-3任一项所述的复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌单独分别用MRS液体培养基、LB液体培养基进行三级扩培，培养结束后采用中空纤维膜浓缩发酵液，然后将无菌保护剂与浓缩后的发酵液均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用真空冷冻干燥制得菌剂；在无菌操作环境中，将菌剂按重量份包含5～20份副干酪乳杆菌、10～30份枯草芽孢杆菌混合，分装。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述无菌保护剂的制备方法为：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、乳糖3g、山梨醇2g、甘露醇2g、海藻糖3g、麦芽糊精2g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合。

6.根据权利要求1-3任一项所述的复合发酵菌剂在食醋酿造中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食醋选自香醋、陈醋、米醋和/或果醋。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，当制备香醋或陈醋时，分别接入醋醅重量0.1～1％(w/w)的上述复合发酵剂和1～10％(w/w)的种醅进行醋酸发酵；当制备米醋或苹果醋时，分别接入米酒或苹果酒重量0.1～1％(w/w)的上述复合发酵剂和1～10％(w/w)的醋酸菌进行醋酸发酵。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述复合发酵剂可以直投也可以活化后加入。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述所述活化方法为：1g复合发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min。