CN105002118A - 一种高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法及应用，属于微生物发酵技术领域。本发明所提供的方法是将植物乳杆菌(Lb.plantarum)ATCC14917经过活化以后，按照3％的接种量，在发酵体系中进行培养：培养基为MRS培养基，发酵初始pH4.0-6.8；L-谷氨酸钠浓度为0-1mol/L，磷酸吡哆醛的添加量为0-0.001mol/L，发酵温度为25-42℃，发酵时间为8-72h。本发明提供的方法具有培养时间短、接种量少、γ-氨基丁酸产量高的特点。本发明所提供的方法接种量只有3％，培养时间只需要36h，但是γ-氨基丁酸产量的产量可达360.67mM/L发酵液，是对照组的7.77倍。

Description

一种高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法及应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是广泛存在于真核生物和原核生物体内的一种非蛋白质氨基酸，首次发现十九于世纪晚期，并成功对其进行了人工合成。GABA除在脑和脊髓中发现外，在多种哺乳动物的近30种外周组织中均有所发现，但其浓度较低，仅为脑组织中的1％。GABA的化学分子式为C4H9NO2，分子量为103.12。GABA在常温下成白色片状或针状结晶状态，分解点为202℃，无旋光性，气味微臭，具有潮解性，极易溶于水，为溶于热乙醇，不溶于冷的乙醇、乙醚和苯酚。

目前，GABA主要是通过化学合成的方法来进行大量生产，这种生产方式对环境污染比较严重，并且耗能高，存在一定的安全风险。然而，利用生物技术来生产GABA则可以避免以上问题。但是，利用生物技术来生产GABA面临的首要问题是提供一种具有高产GABA能力的菌种。在现有技术中，虽然已有研究人员对高产GABA能力的菌种进行了筛选，但所得到的菌种的产量仍然偏低，例如，专利CN 04480187A筛选获得了一株乳酸菌，但是该菌株GABA在发酵液中的含量仅能达到5.025g/L。专利CN10325740A获得的乳杆菌虽然产量可以达到46.16g/L，但接种量比较高，发酵的时间也比较长。造成以上问题的原因，一方面是菌株自身代谢能力有限，另一方面也在于培养方法不够合理。

发明内容

为解决以上问题，提供能够高效的高产GABA的植物乳杆菌，本发明提供了一种产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法。该方法是将植物乳杆菌(Lb.plantarum)ATCC14917经过活化以后，按照3％的接种量，在如下的发酵体系中进行培养：

培养基为MRS培养基，发酵初始pH4.0-6.8；L-谷氨酸钠浓度为0-1mol/L，磷酸吡哆醛的添加量为0-0.001mol/L，发酵温度为25-42℃，发酵时间为8-72h。

所述培养方法的步骤如下：

1)活化植物乳杆菌ATCC1497，获得活化植物乳杆菌；

2)在MRS培养基中添加0-1mol/L的L-谷氨酸钠，0-0.001mol/L的磷酸吡哆醛，并将pH调 节至pH4.0-6.8，获得发酵培养基；

3)将步骤1)所得的活化植物乳杆菌按照3％的接种量，接种到步骤2)所得的发酵培养基中，在25-42℃的发酵温度下，发酵8-72h。

优选地，步骤1)所述活化，是将植物乳杆菌ATCC14917按照2％的接种量接种到5mL MRS液体培养基中，在30℃下静置培养12h，培养结束后再将菌种接种到MRS固体培养基中在30℃下静置培养36-48h后，挑取单菌落再置于5mL液体MRS培养基中在30℃下静置培养12h，最后在以2％的接种量接种在50mL的MRS培养基中，在30℃下静置培养12h。

优选地，步骤2)所述L-谷氨酸钠添加量为0.375-0.75mol/L；所述磷酸吡哆醛含量为0.0001-0.0007mol/L。

更优选地，步骤2)所述L-谷氨酸钠添加量为0.5mol/L；所述磷酸吡哆醛含量为0.0005mol/L。

优选地，步骤2)所述发酵初始pH5.0-6.0，发酵温度为35-40℃，发酵时间为24-48h。

更优选地，步骤2)所述发酵初始pH5.5，发酵温度37℃，发酵时间为36h。

优选地，所述MRS培养基，培养基体积为2L。

所述培养方法的具体步骤如下：

1)将植物乳杆菌ATCC14917按照2％的接种量接种到5mL MRS液体培养基中，在30℃下静置培养12h，培养结束后再将菌种接种到MRS固体培养基中在30℃下静置培养36-48h后，挑取单菌落再置于5mL液体MRS培养基中在30℃下静置培养12h，最后在以2％的接种量接种在50mL的MRS培养基中，在30℃下静置培养12h，培养结束后获得活化植物乳杆菌；

2)在MRS培养基中添加至终浓度为0.5mol/L的L-谷氨酸钠和0.0005mol/L的磷酸吡哆醛，并将pH调节至5.5，获得发酵培养基；

3)将步骤1)所得的活化植物乳杆菌按照3％的接种量将步骤1)所得的活化植物乳杆菌按照3％的接种量，在37℃下发酵36h。

所述任一培养方法用于生产γ-氨基丁酸。 

本发明获得的有益效果如下：

相对于现有技术，本发明提供的方法具有培养时间短、接种量少、γ-氨基丁酸产量高的特点。本发明所提供的方法接种量至有3％，培养时间只需要36h，但是γ-氨基丁酸产量的产量可达360.67mM/L发酵液，是对照组的7.77倍。

附图说明

图1为不同发酵初始pH值发酵后GABA含量。

图2为不同L-MSG添加量发酵后GABA含量。

图3为不同辅酶添加量发酵后GABA含量。

图4为不同发酵温度下GABA含量。

图5为不同钙离子添加量发酵后GABA含量。

图6为不同发酵时间对GABA含量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

本发明所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、仪器和方法，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

Lb.plantarum ATCC14917购自中国普通微生物保藏中心，保藏编号：CGMCC 1.2437。

MRS培养基的组成是：

K₂HPO₄·3H₂O(20g+50mL)、MgCl₂·6H₂O(5.0g+50mL)、ZnSO₄·7H₂O(2.5g+50mL)、CaCl₂(1.5g+50mL)、FeCl₂(0.5g+50mL)蒸馏水定容至1000mL，调pH至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存。

实施例1菌种的鉴定、保藏与活化

1.菌种的鉴定和保藏

为确定购买菌株的纯度及种属，将购买的冻干菌粉中加入适量液体MRS培养，均匀混合后，适当稀释的菌液涂布于固体MRS培养基上，30℃培养至有单菌落形成。随机挑取5个单菌落，分别接种于4mL液体MRS培养基中，30℃纯培养12h，至对数生长期，4℃保存备用。

将5个单菌落菌液进行革兰氏染色，1000倍放大，在显微镜下镜检。同时将纯培养菌液重新按照2％比例接种到对应的MRS培养基，恒温培养达到对数生长期，连续传代培养2次，将菌液与80％灭菌甘油以3:1的比例混合均匀，放于-20℃冻存过夜，然后置于-80℃冰箱冷冻保存。

2.菌株活化

1)从-80℃菌种库中取经过鉴定的冻存菌株，按2％接种到5ml新鲜MRS培养基中，30℃静置培养12h；

2)用接菌环蘸取培养菌液一环与MRS固体平板上进行三区，30℃静置培养36-48h后挑取 单菌落；

3)单菌落接种至5ml新鲜MRS培养基中，30℃静置培养12h；

4)菌液按2％接种到50ml新鲜MRS培养基中30℃静置扩大培养培养12h。

实施例2培养条件的优化

1.发酵初始pH的优化

具体操作如下：

1)配制pH值分别为4.0、4.2、4.5、5.0、5.8、6.0、6.8的MRS培养基，分装于200mL三角瓶中，高温高压灭菌，4℃备用。每个pH条件设置三个平行；

2)按照2.3.1中的方法将菌株进行活化后，按照3％接种至200mL含有100mM L-MSG和20μM的PLP，37℃静置厌氧发酵24h；

3)发酵液4℃，12000rpm离心10min，取上清，4℃备用，待高效液相色谱检测其中γ-氨基丁酸含量。

经测定结果如图1所示。从图1中可知，发酵初始pH值对菌株产GABA的量有明显的影响。随pH值逐渐升高，菌株合成GABA的量呈现先升高后下降的趋势，当pH值为5.8时，GABA的产量最高。 

2.底物L-谷氨酸钠添加量的优化

具体操作如下：

(1)按照实施例1中的方法将菌株进行活化后，按照3％接种至200mL MRS中，同时添加0mM、25mM、50Mm 75mM、100mM、125mM、150mM、200mM的L-MSG和20μM的PLP，37℃静置厌氧发酵24h；

(2)发酵液4℃，12000rpm离心10min，取上清，4℃备用，待高效液相色谱检测其中γ-氨基丁酸含量。

经测定结果如图2所示。从图2中可知，培养基中底物L-MSG的添加量能够显著影响菌株积累GABA的量。随底物添加量逐渐增加，发酵液中GABA的含量呈现先升高后下降的趋势，当培养基中底物为125mM时，GABA的积累量达到最大值

3.辅酶磷酸吡哆醛(PLP)添加量的优化 

具体操作如下：

(1)按照实施例1中的方法将菌株进行活化后，按照3％接种至200mL MRS中，同时添加0μM、10μM、20μM、60μM、100μM、140μM、200μM的PLP和100mM的L-MSG，37℃静置厌氧发酵24h；

(2)发酵液4℃，12000rpm离心10min，取上清，4℃备用，待高效液相色谱检测其中γ-氨基丁酸含量。

经测定结果如图3所示。从图3中可知，辅酶PLP对GABA的积累量有影响，但不如发酵初始pH值和底物浓度对其积累量的影响明显。随辅酶添加量逐渐增大，GABA积累量缓慢升高后又逐渐下降，最大积累量在辅酶浓度为100μM时达到。

4.发酵温度的优化

(1)按照实施例1中的方法将菌株进行活化后，按照3％接种至200mL MRS中，同时添加100mM的L-MSG和20μM的PLP，分别在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃静置厌氧发酵24h；

(2)发酵液4℃，12000rpm离心10min，取上清，4℃备用，待高效液相色谱检测其中γ-氨基丁酸含量。

经测定结果如图4所示。从图4中可知，不同发酵温度对菌株产GABA的量有明显影响。温度较低时，GABA的积累量较低，随着温度逐渐升高，GABA的产量也明显升高，当温度为37℃时，最高产量

5.钙离子添加量的优化

(1)按照实施例1中的方法将菌株进行活化后，按照3％接种至200mL MRS中，同时添加100mM的L-MSG和20μM的PLP。培养基中再分别添加0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM的氯化钙，37℃静置厌氧发酵24h；

(2)发酵液4℃，12000rpm离心10min，取上清，4℃备用，待高效液相色谱检测其中γ-氨基丁酸含量。

经测定结果如图5所示。从图5中可知，培养基中添加氯化钙会抑制菌株合成GABA，而且，随着添加量的增大，这种抑制作用逐渐增强。然而，钙离子对菌株积累γ-氨基丁酸的抑制作用不像发酵初始pH值和发酵温度对其影响的那么显著，由此推测，钙离子可能是对γ-氨基丁酸积累的一个非显著性因素。

6.正交实验优化 

基于上述实验，为确定影响菌株产γ-氨基丁酸的主次因素，并从其中筛选出最重要的因素，根据单因素优化的结果，进行五因素三水平的正交设计实验。设计方案见表1。

表1 正交设计因素及水平确定

根据表1设计的实验方案，以1L的发酵体积进行实验，并检测各发酵液中γ-氨基丁酸的含量，每个发酵条件进行三次平行试验，检测结果取平均值，见表2。

表2 不同发酵条件下发酵液中γ-氨基丁酸含量

对上述结果进行方差分析和极差分析后，最终结果表明，上述五个因素中对Lb.plantarum积累γ-氨基丁酸积累量的影响顺序为pH值＞温度＞底物＞辅酶＞钙离子。

实施例3发酵时间的确定

冻存菌株经MRS固体培养基平板三区划线得到单菌落，挑取单菌落至4mL MRS液体培养基30℃纯培养12h，连续扩大培养两代后得到的种子用于发酵。发酵培养基采用MRS培养基，发酵体系为2L，发酵初始pH值为5.5，发酵温度为37℃，发酵时间72h。诱导组中额外添加100mM L-MSG，对照组除不添加L-MSG外，其他发酵条件均同于诱导组。实验结果如图6所示。

从图6可以看出，发酵初始阶段，实验组和对照组发酵液中γ-氨基丁酸含量差异并不那么明显，8h时实验组是对照组的3.51倍，12h时为5.58倍；当发酵进程过半，这种产量上的差异逐渐明显，当36h时，二者的差异差异最为明显，实验组是对照组的7.77倍；随着发酵 继续进行，对照组发酵液中γ-氨基丁酸的含量缓慢增加，而实验组γ-氨基丁酸的产量有所降低，导致二者差异逐渐趋于平缓，到发酵结束时，实验组γ-氨基丁酸的含量仅为对照组的2.98倍。另外，结果还显示36h时，实验组发酵液中γ-氨基丁酸的产量是最高的。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高产γ-氨基丁酸植物乳杆菌的培养方法，其特征在于，是将植物乳杆菌(Lb.plantarum)ATCC14917经过活化以后，按照3％的接种量，在如下的发酵体系中进行培养：培养基为MRS培养基，发酵初始pH4.0-6.8；L-谷氨酸钠浓度为0-1mol/L，磷酸吡哆醛的添加量为0-0.001mol/L，发酵温度为25-42℃，发酵时间为8-72h。

2.权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤如下：

1)活化植物乳杆菌ATCC1497，获得活化植物乳杆菌；

2)在MRS培养基中添加0-1mol/L的L-谷氨酸钠，0-0.001mol/L的磷酸吡哆醛，并将pH调节至pH4.0-6.8，获得发酵培养基；

3)将步骤1)所得的活化植物乳杆菌按照3％的接种量，接种到步骤2)所得的发酵培养基中，在25-42℃的发酵温度下，发酵8-72h。

3.权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤1)所述活化，是将植物乳杆菌ATCC14917按照2％的接种量接种到5mL MRS液体培养基中，在30℃下静置培养12h，培养结束后再将菌种接种到MRS固体培养基中在30℃下静置培养36-48h后，挑取单菌落再置于5mL液体MRS培养基中在30℃下静置培养12h，最后在以2％的接种量接种在50mL的MRS培养基中，在30℃下静置培养12h。

4.权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤2)所述L-谷氨酸钠添加量为0.375-0.75mol/L；所述磷酸吡哆醛含量为0.0001-0.0007mol/L。

5.权利要求4所述培养方法，其特征在于，步骤2)所述L-谷氨酸钠添加量为0.5mol/L；所述磷酸吡哆醛含量为0.0005mol/L。

6.权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤2)所述发酵初始pH5.0-6.0，发酵温度为35-40℃，发酵时间为24-48h。

7.权利要求6所述培养方法，其特征在于，步骤2)所述发酵初始pH5.5，发酵温度37℃，发酵时间为36h。

8.权利要求2所述培养方法，其特征在于，所述MRS培养基，培养基体积为2L。

9.权利要求2所述培养方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将植物乳杆菌ATCC14917按照2％的接种量接种到5mL MRS液体培养基中，在30℃下静置培养12h，培养结束后再将菌种接种到MRS固体培养基中在30℃下静置培养36-48h后，挑取单菌落再置于5mL液体MRS培养基中在30℃下静置培养12h，最后在以2％的接种量接种在50mL的MRS培养基中，在30℃下静置培养12h，培养结束后获得活化植物乳杆菌；

2)在MRS培养基中添加至终浓度为0.5mol/L的L-谷氨酸钠和0.0005mol/L的磷酸吡哆醛，并将pH调节至5.5，获得发酵培养基；

3)将步骤1)所得的活化植物乳杆菌按照3％的接种量将步骤1)所得的活化植物乳杆菌按照3％的接种量，在37℃下发酵36h。

10.权利要求1-9所述任一培养方法，其特征在于，用于生产γ-氨基丁酸。