CN112358987A - 植物乳杆菌菌株ldvs005及其应用 - Google Patents

植物乳杆菌菌株ldvs005及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株LDVS005及其应用，本发明的LDVS005菌株从南宁市场的酸豇豆中分离而得，该菌株具有较高的产GABA(γ‑氨基丁酸)能力和抑菌能力，且在传代20代后仍能保持较高的产GABA(γ‑氨基丁酸)能力和抑菌能力，是一株稳定遗传的植物乳杆菌，具有高产GABA功能和高抑菌效果，能用于加工保健食品；将本申请的菌株制备成冻干菌粉后，经过保护剂的保护作用，其菌粉的活力能达到95％以上，且产GABA的产量得到提升。

Description

植物乳杆菌菌株LDVS005及其应用
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株LDVS005及其应用。
【背景技术】
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，属于革兰氏阳性菌株，是一类具有弯杆状、圆端短杆状和链状等形态的菌体，且不产芽孢的兼性乳酸菌，其以果糖、葡萄糖、乳糖和木糖等作为原料进行代谢生长而产酸，是发酵产品生产中不可缺少的菌种之一，常见用于等豇豆、白菜、洋葱等泡菜生产。
植物乳杆菌目前常用于食品发酵，是一种常用的益生菌，现有技术中有报道：乳酸菌中有不少菌株可以通过代谢产生GABA(γ-氨基丁酸)，GABA是一种以自由态广泛存在于原核生物和真核生物的非蛋白质氨基酸,是哺乳动物体内一种重要的抑制性神经递质,具有很重要的生理功能；因此，有必要针对乳酸菌的产GABA功能进行定向选育，筛选出具有高产GABA的乳酸菌应用于食品中，例如加工酸奶、饮料等饮品，能有效提高食品的保健性能，提高菌株的附加性能，同时，为了方便储存、运输，还应该对上述菌株的冻干粉保护剂进行改进，提高菌株的活力。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种能高产GABA的乳酸菌的菌株，同时还通过改良冻干工艺达到提高菌株冻干粉活性的目的。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005，其保藏编号为CGMCCNO： 20027。
进一步的，所述菌株从酸豇豆中分离而得。
本发明还包括包含所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005的冻干粉。
进一步的，所述冻干粉中的保护剂成分包括：35-37g/100mL的脱脂乳、12-15g/100mL的蔗糖、2-7g/100mL的谷氨酸钠和12-15g/100mL的乳糖。
本发明还包括一种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005和/或所述冻干粉在提高γ-氨基丁酸产量上的应用。
本发明还包括一种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005和/或所述冻干粉在提高对大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌抑菌能力上的应用。
本发明还包括所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005和/或所述冻干粉在食品加工上的应用。
本发明还包括一种制备所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005冻干粉的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，将植物乳杆菌接种到MRS培养基扩大培养；
(2)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后、离心、去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液；
(3)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(4)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度20-30Pa条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右，即得。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明的LDVS005菌株从南宁市场的酸豇豆中分离而得，该菌株具有较高的产GABA(γ-氨基丁酸)能力和抑菌能力，且在传代20代后仍能保持较高的产GABA(γ-氨基丁酸)能力和抑菌能力，其中，GABA的产量最高可达3.88g/L：是一株稳定遗传的植物乳杆菌，具有高产GABA功能和高抑菌效果，能用于加工保健食品；将本申请的菌株制备成冻干菌粉后，经过保护剂：35-37g/100mL的脱脂乳、12-15g/100mL的蔗糖、2-7g/100mL的谷氨酸钠、12-15g/100mL的乳糖的保护作用，其菌粉的活力能达到95％以上，且产GABA的产量得到提升，为：4.25g/L，这可能是由于保护剂的某些成分有促进GABA转化的效果，或者是添加了谷氨酸钠之后，会增加原料来源，从而促进GABA的产量增加。
【附图说明】
图1为本申请的LDVS005菌株平皿生长情况图；
图2为本申请实施例的LDVS005菌株在显微镜下的镜检图；
图3为实施例2植物乳杆菌菌株生长曲线图；
图4为实施例2植物乳杆菌pH值变化曲线图；
图5为实施例5植物乳杆菌的抑菌效果图。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
本实施例为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005的筛选方法：
本实施例的菌株从酸豇豆中分离而得，酸豇豆取自广西南宁的市场，采用MRS培养基平板涂布法、斜面划线法分离而得，最终筛选出菌株LDVS012、LDVS007、LDVS008、LDVS005。经过测定申请人发现菌株LDVS005具有较高的产GABA(γ-氨基丁酸)的能力和抑菌能力。
本实施例的菌株用NCBIBlast程序将拼接后的序列文件与NCBI16S数据库中的数据进行比对，比对结果通过MEGA7.0构建系统发育树。其结果显示菌株LDVS005与植物乳杆菌的同源性分别为98.89％。经生理生化实验得出：菌株LDVS005的适合生长温度为27～30℃，经鉴定，菌株LDVS005属于乳酸菌属，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)种。所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：20027，保藏日期为2020年6月8日。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LDVS005菌株平皿生长的形态特征如图 1所示，在固体培养基上单个菌落为白色，圆形，表面光滑有水光，中间凸起呈半球状。镜检如图2所示，显微镜下观察发现菌株为杆状，杆状较长，对生或单个存在，首尾分裂生殖，不运动，无芽孢。
实施例2：
本实施例的菌株LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的生长、产酸能力鉴定：
在装有100mL液体MRS的三角瓶中，按2％(v/v)的接种量接入种子发酵液，于30℃条件下培养36h，分别于0、1、3、6、9、12、24、36h测定在波长600nm的OD值，绘制生长曲线；结果如图3所示：在0-3h时4株乳酸菌在生长阶段中处于迟缓期，3h之后开始进入对数生长期，12h之后开始进入稳定期。结果表明，12h前乳酸菌生长繁殖较旺盛，与图4乳酸菌pH值变化曲线的特征刚好吻合。在12h时LDVS012在600nm的吸光值要显著高于其他三株菌株(P<0.05)，LDVS005和LDVS007间无显著差异(P>0.05)，LDVS008显著低于其他三株菌株(P<0.05)。在24h、36h时，LDVS012和LDVS005在600nm的吸光值要显著高于其他两株(P<0.05)LDVS007和LDVS008之间无显著差异(P>0.05)，从4株高产酸菌株的生长曲线可以看出LDVS005和LDVS012较其他两株乳酸菌生长旺盛，在发酵后期具有显著优势，LDVS012生长能力最好。
将分离纯化的菌株接种到5mLMRS液体培养基中，30℃静置培养12h后，将种子发酵液按2％(v/v)的接种量接入在装有100mL液体MRS培养基，于30℃条件下培养发酵36h，分别测定在0、0.5、3、6、9、12、24、36h的pH值，结果如图4所示：在前12h内，乳酸菌生长繁殖较旺盛，产酸速度快，其中LDVS012在该阶段产酸能力优于LDVS005、LDVS007、 LDVS008。在12h后pH值下降缓慢，进入相对平稳阶段，4株乳酸菌在各时间点pH值无显著差异(P>0.05)，在36h时LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的MRS培养基 pH值分别为3.80、3.85、3.83、3.70，在后发酵阶段LDVS012和LDVS005要优于其他菌株。
同时，乳酸菌产酸使培养基形成透明圈，透明圈的大小反映了乳酸菌的产酸能力，透明圈和酸度结果参见表1：
表1不同乳酸菌产酸能力
菌株编号 溶钙圈直径/cm 酸度/％
LDVS005 1.33±0.072<sup>a</sup> 2.001±0.006<sup>a</sup>
LDVS007 1.24±0.042<sup>b</sup> 1.958±0.054<sup>b</sup>
LDVS008 1.23±0.038<sup>b</sup> 1.950±0.030<sup>b</sup>
LDVS012 1.34±0.076<sup>a</sup> 2.018±0.054<sup>a</sup>
从表1可知果表明LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的透明圈直径显著大于其他乳酸菌(P<0.05)，其中LDVS012透明圈直径最大(1.34±0.076cm)。与培养基酸度得到结果一致，其中LDVS005和LDVS012显著高于LDVS007和LDVS008菌株(P<0.05)。
实施例3：
菌株对亚硝酸盐降解能力的测试：
将乳酸菌接种液体MRS培养基中，于30℃条件下培养24h后,然后按2％(v/v)的添加量接入到5mL含100μg/mL的亚硝酸盐MRS培养液中，于30℃下恒温培养24h。采用亚硝酸盐试剂盒测定亚硝酸盐含量。
式中W0——亚硝酸盐初始含量
Wt——培养时间t时发酵液亚硝酸盐含量
将本申请筛选出来的4株菌株：LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012和市面上一款商业菌剂(购买自陕西赛恩生物科技有限公司)按照上述的试验方法，分别接入含有亚硝酸钠的MRS培养基中，在0、6、12、24h时测定亚硝酸钠的含量进行亚硝酸盐的降解能力对比；
结果如图5所示。结果表明在6h时，LDVS005、LDVS008、LDVS012降解亚硝酸盐的能力显著高于其他菌株(P<0.05)，其中LDVS012的亚硝酸盐降解率最高(16.2％)，降解能力LDVS012＞LDVS005＞LDVS007＞LDVS008＞商业菌剂。在12h时，LDVS005、 LDVS007、LDVS008、LDVS012降解亚硝酸盐的能力显著高于商业菌剂(P<0.05)，其中 LDVS012的亚硝酸盐降解率最高(86.6％)，降解能力LDVS012＞LDVS005＞LDVS007＞ LDVS008＞商业菌剂。在24h时LDVS005、LDVS012降解亚硝酸盐的能力显著高于其他菌株(P<0.05)，其中LDVS012的亚硝酸盐降解率最高(98.83％)，降解能力LDVS012＞LDVS005 ＞LDVS007＞LDVS008＞商业菌剂。
实施例4：
菌株的产GABA(γ-氨基丁酸)能力鉴定：
将上述菌株：LDVS005、LDVS007、LDVS008和LDVS012经过MRS培养基划线纯化培养，挑取纯化培养后的菌苔2环，接入100mL的MRS液体培养基中，活化培养24h，然后再将带有MRS培养基的活化菌液按照5％的接种量接入TYG液体培养基(培养基中含质量分数为1％的谷氨酸钠)，密封培养24h后检测GABA(γ-氨基丁酸)产量，产量如表2 所示：
表2乳酸菌的产GABA能力
菌株 LDVS005 LDVS007 LDVS008 LDVS012
GABA产量(g/kg) 3.88 1.56 —— 1.15
由表2可知，LDVS005的产GABA能力优于LDVS007和LDVS012；菌株LDVS008 不产GABA，说明菌株LDVS005相对于其他乳酸菌菌株有较高的产GABA能力。
实施例5：
菌株的抑菌能力检测：
乳酸菌种子液按2％(v/v)接种量接入MRS肉汤37℃恒温静置培养24h，利用改进牛津杯法比较乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力。水琼脂培养基作底层，待凝固后放上牛津杯，将大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)悬液加入到LB培养基，往牛津杯中加入0.2mL 乳酸菌发酵液，于30℃下恒温培养48h，培养观察抑菌圈。
乳酸菌产酸能够对有害菌起生长抑制作用，有对抗腐败细菌的广泛活性。此外在乳酸菌生长代谢过程产生的乳酸菌素细胞生长抑制剂也可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及酵母的生长。为了减少腐败微生物对腌制酸豇豆的影响，除了乳酸菌需要有快速生长能力之外，还需要能对其他菌种有一定抑制能力，能有效防止其他菌种在发酵过程产生有害代谢物。乳酸菌LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS12进行传代活化后，进行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌能力测定对比。
LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS12在培养基中的抑菌圈测定结果如图5所示，LDVS005和LDVS12抑制大肠杆菌能力显著高于其他菌株(P<0.05)，抑菌圈直径分别为20.19mm、19.75mm、18.86mm、18.81mm，因此抑制大肠杆菌能力结果为 LDVS005>LDVS12>LDVS007>LDVS008。LDVS005抑制金黄色葡萄球菌的能力显著高于其它三个菌株(P<0.05)，抑菌圈直径分别为17.08mm、16.66mm、16.43mm、16.08mm，因此抑金黄色葡萄球菌能力结果为LDVS005>LDVS12>LDVS007>LDVS008。
从上述结果表明，虽然抑菌效果差异不算很显著，但是菌株LDVS005与其它乳酸菌菌株相比仍保持了较高的抑菌能力。
实施例6：
菌株性能稳定性的检测：将菌株传代培养20代，按照实施例4和实施例5的试验方法测试其传代培养后的产GABA(γ-氨基丁酸)能力和对金黄色葡萄球菌的抑菌能力，结果如下：
表3乳酸菌传代20代后产GABA能力和抑菌能力
菌株 LDVS005 LDVS007 LDVS008 LDVS012
GABA产量(g/kg) 3.75 1.10 —— ——
抑菌圈(mm) 16.02 13.25 5.22 3.32
由表3可知，传代20代后菌株LDVS005的GABA产量和对金黄色葡萄球菌的抑菌能力与传代前相比相差不大，而其他菌株：LDVS007、LDVS008和LDVS12均有不同程度的下降，说明，菌株LDVS005的遗传性能相对稳定，即使经过多代繁殖仍不会影响其产GABA的能力和抑菌能力。
实施例7：
用菌株LDVS005来制备冻干粉；制备方法如下：
(1)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，按接种量2％(v/v)将植物乳杆菌接种到MRS培养基扩大培养，30℃条件下40r/min摇床培养24h。
(2)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后，在4℃条件下7500rpm离心10min，去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的冻干保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液。
(3)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(4)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度30Pa(本实施例仅公开一个试验条件，实际上在20-30Pa都能达到冷冻干燥的效果)条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右。
冻干保护剂经过申请人的正交优化选择后认为，对保护剂影响最大的几个成分为脱脂乳、蔗糖和谷氨酸钠对菌株LDVS005的存活率呈正相关，保护剂中各成分为：35-37g/100mL的脱脂乳、12-15g/100mL的蔗糖、2-7g/100mL的谷氨酸钠和12-15g/100mL的乳糖，经过正交实验后，选择部分有显著差异的配方进行实验，具体配方如表4所示：
表4冻干粉保护剂的选择配方
Figure RE-GDA0002820035590000081
根据表4冻干粉保护剂制备得到的冻干保护剂制备得到的冻干粉进行存活率测定、亚硝酸降解能力、耐盐能力测定，测定方法如下：
(1)存活率测定：在第24h，分别测定冻干前的植物乳杆菌活菌数和同样体积菌泥冻干后的活菌数。
冻干存活率/％＝(冻干后1mL菌泥活菌数)/(冻干前1mL菌泥活菌数)
(2)将冻干粉按照5％的接种量接种到MRS培养基中培养24h活化，然后再将活化菌液按照5％的接种量接种到TYG培养液(培养液中含有质量百分数为1％的谷氨酸钠)中30℃恒温摇床培养24h后用HPLC测定培养液中GABA含量，并计算GABA产量。
(3)将冻干粉按照5％的接种量接种到MRS培养基中培养24h活化，利用改进牛津杯法比较乳酸菌对大肠杆菌的抑菌能力。水琼脂培养基作底层，待凝固后放上牛津杯，将金黄色葡萄球菌悬液加入到LB培养基，往牛津杯中加入0.2mL乳酸菌发酵液，于30℃下恒温培养48h，培养观察抑菌圈。
测试得到的结果见表5：
表5不同冻干保护剂的菌株存活率、亚硝酸盐降解率和耐盐能力
组别 组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7
存活率(％) 95.36 96.31 98.21 65.36 74.25 81.26 79.48
GABA产量(g/kg) 4.25 4.65 4.99 2.65 3.45 3.84 3.64
抑菌圈(mm) 19.32 20.13 19.57 17.58 18.32 19.11 18.32
由表5可知，组1-组3的存活率、GABA产量明显高于组4-组7；说明冻干粉菌粉中，存活率会影响乳酸菌的GABA产量并呈正相关，而抑菌圈组1-3虽然比组4-7高，但是并未达到显著差异，说明对于LDVS005菌株而言，抑菌能力与菌株的存活率关系不大；然而组1-3的存活率明显高于组4-7甚至达到95％以上，说明对于LDVS005菌株而言；保护剂的成分选择脱脂乳35-37g/100mL、蔗糖12-15g/100mL、谷氨酸钠2-7g/100mL、乳糖3-6g/100mL能对菌株LDVS005起到为此菌株内细胞液平衡，起到良好的保护作用。
综上所述，使用本申请的植物乳杆菌LDVS005具有较高的产GABA能力，且相较于其他菌株有很好的抑制致病菌的能力，可用于加工保健食品，经过对保护剂的优化制备成冻干粉后仍能保持较高的活力，并且还具有较强的产GABA能力和抑菌能力，且在传代培养20代后，仍能保持上述活性，是一株稳定的优良产GABA乳酸菌菌株。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005，其保藏编号为CGMCCNO：20027。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005，其特征在于，所述菌株从酸豇豆中分离而得。
3.包含如权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005的冻干粉。
4.根据权利要求3所述的冻干粉，其特征在于，所述冻干粉中的保护剂成分包括：35-37g/100mL的脱脂乳、12-15g/100mL的蔗糖、2-7g/100mL的谷氨酸钠、12-15g/100mL的乳糖。
5.一种如权利要求1-2任意一项所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005和/或如权利要求3-4任意一项所述冻干粉在提高γ-氨基丁酸产量上的应用。
6.一种如权利要求1-2任意一项所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005和/或如权利要求3-4任意一项所述冻干粉在提高对大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌抑菌能力上的应用。
7.如权利要求1-2任意一项所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005和/或如权利要求3-4任意一项所述冻干粉在食品加工上的应用。
8.一种制备如权利要求3所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS005冻干粉的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，将植物乳杆菌接种到MRS培养基扩大培养；
(2)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后、离心、去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液；
(3)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(4)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度20-30Pa条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右，即得。
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