KR100888918B1

KR100888918B1 - 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법 및이를 이용한 발효식초의 제조방법

Info

Publication number: KR100888918B1
Application number: KR1020070063639A
Authority: KR
Inventors: 김성호; 권승혁; 김덕진; 김인호; 이진만; 박현진; 한태원; 김동명
Original assignee: 김성호; 권승혁
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2009-03-16
Also published as: KR20080114264A

Abstract

본 발명은 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법 및 이를 이용한 발효식초의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 딸기(생딸기 및 냉동된 딸기)에 함유되어 항산화 기능 등을 수행하는 물질인 폴리페놀 물질이 다량 함유되도록 하는 농축하는 농축액 제조방법과 이러한 농축액을 이용하여 2단계 발효법에 의해 최적발효조건으로 유리형의 폴리페놀이 강화된 딸기 발효식초 제조방법에 관한 것이다.

즉, 딸기(생딸기 및 냉동된 딸기)를 해동 후 마쇄, 착즙하는 단계와; 상기 착즙된 딸기에 알파아밀라아제(α-amylase)를 첨가하여 60~80℃에서 20~40분간 가열하는 단계와; 상기 가열된 딸기를 40~60℃로 냉각한 뒤 펙티나아제(pectinase)를 첨가하여 10~30분간 1차 효소 처리하는 단계와; 30~50℃에서 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)를 첨가하여 30~50분간 2차 효소 처리하는 단계; 를 거친 다음 이를 여과한 후 30~50브릭스도(°brix)로 농축하여 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법과,

본 발명에 의해 제조된 농축액을 12~18 브릭스도(°brix)로 조정하고 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyce cerevisiae)종을 3~8중량%를 접종하여 20~30℃, 발효시간 2~4일간 발효시키는 단계와; 상기의 알코올 발효물을 여과 하여 통상의 식초산 발효균 아세토박터 아세티(Acetobater aceti)로 식초산을 발효시키는 단계;를 거쳐 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 발효식초 제조방법을 특징으로 한다.

딸기, 폴리페놀물질, 농축, 발효식초

Description

딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법 및 이를 이용한 발효식초의 제조방법 {Producing method of concentrates for yield up polyphenol content of Fragaric ananassa Duch and method of vinegar using it}

딸기(Fragaric ananassa Duch.)는 쌍떡잎식물 이판화군 장미목 장미과의 여러해살이풀로 딸기가 재배된 것은 17세기로 알려져 있다. 딸기는 비타민 C의 함량이 풍부하며, 신맛과 단맛이 잘 조화되어 있으며, 독특한 향기를 갖는 과채류로서 오랜 전부터 봄철에 애용되어 왔다. 딸기는 국내에서 대부분 식용으로 이용되고 있으며, 일부 잼. 젤리, 아이스크림, 냉동딸기, 딸기주 등의 원료로 이용되고 있다.

딸기는 그 종류에 따라 성분 함량이 다르나 일반적으로 유기산이 많아서 신맛이 많고 당분이 많으며, 비타민C와 쿼세틴(quercetin), 카페익산(caffeic acid), 페룰릭산(ferulic acid) 등의 폴리페놀물질과 플라보놀(flavonol)류 등의 다양한 항산화 물질이 함유되어 있다.

일반적으로 폴리페놀류는 산화를 방지하는 작용, 즉 항산화 기능을 갖고 있다. 최근 폴리페놀류가 주목받고 있는 이유는 이 기능이 생체 내에서도 항산화제로 작용함으로써 건강유지와 질병예방 등에 기여할 것으로 기대되기 때문이다. 또한, 폴리페놀류는 콜레스테롤이 소화관으로 흡수되는 것을 막아주기 때문에 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮게 해주는 작용도 한다.

녹차에 들어 있는 카테킨류(catechins), 커피에 포함되어 있는 클로로겐산(chlorogenic acid), 딸기나 가지, 포도, 검은콩, 팥 따위 붉은 색이나 자색의 안토시아닌계 색소 등은 모두 폴리페놀화합물이다. 이밖에도 폴리페놀화합물은 야채나 과일, 카카오, 적포도주 등 여러 종류의 천연물에 포함되어 있다.

폴리페놀 물질은 벤젠고리(C₆H₆)의 수소 중 하나가 수산기(OH)로 치환된 물질을 페놀이라고 하는데, 수산기를 2개 이상 갖고 있는 물질을 폴리페놀, 즉 '다가(多價)페놀'이라고 총칭한다. 이와 같은 구조를 갖는 화합물은 자연계에 주로 존재한다.

이들은 농산물이나 식물계에 널리 분포되어 있는 2차대사산물의 하나로서 크게 플라보노이드(flavonoid)류와 비플라보노이드(nonflavonoid)성의 두가지 그룹으로 분류된다. 어글리콘(aglycon)과 당 결합형으로 존재하는 플라보놀(flavonol)류, 미리세틴(myricetin), 쿼세틴(quercetin), 캠페롤(kaempferol) 및 이소람네틴(isorhamnetin); 플라반올(flavan)-3-ols, (+)-카테킨(catethin)과 (-)에피카테친(epicatechin), 안토시아닌(anocyanin)은 전자인 플라보놀(flavonol)에 속하고 갈릭산(gallic acid), 하이드로시시나메이트(hydroxycinnamate);파라-쿠마릭산(p-coumaric acid), 카펙익산(caffeic acid) 및 카프타릭산(caftaric acid); 스티벤(stiben), 트랜스-레스베라트롤(tans-resveratrol), 시스-트랜스레스베라트롤(cis-resveratrol) 및 트랜스-레스베라트롤-O-베타 글루코사이드(trans-resveratrol-O-β-glucoside) 등은 후자인 비플라보노이드(nonflavonoid)류에 속한다(Burns et al., J agric. Foos Chem. 48(2), 220-230(2000)). 이들은 광범위한 스펙트럼의 시험관내 시험에서의(in-vitro)의 제약활성으로 인체에 대한 잠재적 유용효과가 널리 인정되고 있다(Hertog et al., The Lancet, 342, 1007-1011(1993), Decker E. A. Nutr. Rev., 55, 396-407(1997)).

일반적으로 천연물 유래의 페놀화합물류와 이들의 산화물은 천연물을 이용한 식품이나 음료 등의 색이나 맛 등에 기여하는 구성성분으로 최근에는 항산화, 항돌연변이, 항암 및 항고혈압 효과 등의 각종 생리활성이 밝혀지고 있다.(Cliffe et al., J Agric. Food Chem., 42(8), 1824-1828,(1994), Cook and Samman, Nutr. Biochem., 7, 66-76(1996), Bocco et al., J. Agric Food Chem., 46(6), 2123-2129(1998))

이와 같은 페놀성 물질은 구조적으로 다양하고 그에 따라 이화학적 성질 및 생리적 기능성이 다른데 특히 배당체나 결합형으로 존재하여 농산물의 원료 그대로 또는 기존의 단순 가공만으로는 체내 흡수성의 문제가 있어 고도의 기능성을 얻기가 어렵다. 또한 농산물 원료나 과실 등으로부터 페놀화합물을 분리 정제하여 상품화할 경우 공정이 복잡하고 대량생산이 어려워 산업경제성 측면에서 부적합한 것으로 알려져 있다.(Huang et al., J. Agric. Food Chem., 34(1), 48-51(1986)). 결합형 페놀류의 유리 페놀류로의 전환은 효소작용 또는 세포조직의 붕괴로서 이루어진다,

또 이러한 페놀화합물의 유리는 기존 농산물이나 식물류가 갖는 이미, 이취를 제거하여 품질을 향상시킬 수 있다.

베티-디-글루코시다아제(β-D-glucosidase)는 페놀 배당체를 유리 페놀산으로 가수분해하여 식품 및 음료산업에서의 적용가능성을 갖게 하는데 이 효소는 탄수화물의 잔기를 함유한 배당체뿐만 아니라 알릴, 알킬-베타-글루코사이드(allyl, alkyl-β-glucoside)에서 글루코사이드 결합의 가수분해도 촉매 하는 것으로 알려져 있다(Woodward, Enzyme Microb. Technol. 4, 73-79(1982).

한편 식초는 술과 함께 인류의 식생활사에서 가장 오랜 역사를 갖는 발효식품 중 하나로써 동맥경화, 고혈압 등의 성인병 예방효과, 콜레스테롤 저하효과, 체지방 감소, 피로회복에 효과적이다.

옛 부터 우리 민족은 다양한 종류의 식초를 가정에서 직접 제조하여 조미료로 이용하여 왔고 뿐만 아니라 최근에는 건강식품으로 인식되어져 희석하여 직접 음용하거나 식초케이크, 식초칵테일, 초란, 초콩, 바몬트 음료 등의 형태로 다양하게 이용되고 있다. 또한 우리의 식생활과 밀접한 관계를 갖고 오랜 옛날부터 이용되어 온 양조식초는 합성식초와는 달리 초산균의 초산발효에 의하여 생성되는 초산을 주성분으로 하여 소량의 유기산류, 유리당류, 유리아미노산류 및 에스테르류 등을 함유하여 특유한 방향과 맛을 가지는 발효식품이다.

이러한 발효식초는 이용 가능한 원료의 다양화와 더불어 품질이 우수하고 안정성이 확보된 고급의 발효식초에 대한 소비자의 관심이 크게 높아지고 있어 새로운 과일이나 야채 등을 이용하여 독특한 풍미를 가진 발효식초를 개발하고자 하는 시도가 활발히 행하여지고 있다.

따라서 본 발명에서는 저장성이 불량한 딸기의 효율적 이용과 딸기 내 생리활성물질의 활용성을 높일 수 있도록 유리형의 폴리페놀 물질이 다량 함유된 농축액과 이러한 농축액을 이용하여 유리형의 폴리페놀이 강화된 딸기 발효식초를 개발하는데 있다.

본 발명은 딸기 농축액을 제조하는데 있어서, 딸기를 마쇄, 착즙한 다음 알파아밀라아제(α-amylase)와 펙티나아제(pectinase)와 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)를 이용하여 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액을 제공함에 있다.

또한, 본 발명에 의해 제조된 딸기 농축액을 이용하여 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyce cerevisiae)종을 접종하여 발효시키고 통상의 식초산 발효균 아세토박터 아세티(Acetobater aceti)로 식초산 발효를 유도하여 폴리페놀 함량이 강화된 딸기발효식초의 제조방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 딸기(생딸기 및 냉동된 딸기)를 해동후 마쇄, 착즙하는 단계와; 상기 착즙된 딸기에 알파아밀라아제(α-amylase)를 첨가하여 60~80℃에서 20~40분간 가열하는 단계와; 상기 가열된 딸기를 40~60℃로 냉각한 뒤 펙티나아제(pectinase)를 첨가하여 10~30분간 1차 효소처리하는 단계와; 30~50℃에서 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)를 첨가하여 30~50분간 2차 효소 처리하는 단계;를 거친다음 이를 여과한 후 30~50 브릭스도(°brix)로 농축하여 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액을 제조함을 특징으로 한다.

그리고, 상기 딸기 전체중량을 기준으로 하여 알파아밀라아제(α-amylase) 는 0.8~1.2중량%를 첨가하고, 펙티나아제(pectinase)는 0.4~0.6중량%를 첨가하고, 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)는 0.04~0.06중량%를 첨가하여 농축액을 제조하게 된다.

또, 상기에서 제조된 농축액을 12~18 브릭스도(°brix)로 조정하고 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyce cerevisiae)종을 3~8중량%를 접종하여 20~30℃, 발효시간 2~4일간 발효시키는 단계와; 상기의 알코올 발효물을 여과 하여 통상의 식초산 발효균 아세토박터 아세티(Acetobater aceti)로 식초산을 발효시키는 단계;를 거쳐 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 발효식초를 제조함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 딸기 품종별 총페놀함량 및 유리형 페놀 화합물의 분석

본 발명에 사용한 딸기 원료는 국내에서 생산되는 딸기 5종(표1)의 품종을 사용하였다.

딸기 종류에 따른 총 페놀화합물 및 유리형 페놀화합물의 함량을 조사하기 위하여 딸기(2006년 4월산)를 구입하여 실험에 사용하였다.

총 페놀성 화합물의 함량은 폴린-데니스(Folin-Denis)법에 따라 비색 정량하였다. 즉, 딸기원료를 파쇄, 여과 및 원심분리하여 얻은 액 100㎕를 미리 10배 희석한 폴린-씨오칼티우(Folin-Ciocalteu)시액 0.75ml와 헌합하고 실온에서 5분간 방치하였다 여기에 Na₂CO₃(60g/L) 0.75ml를 가하고 실온에서 60분간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 검액 대신 증류수를 넣어 동일하게 처리한다. 이때 표준물질로는 카테친(cathethin)을 5～50 ㎍/ml의 농도로 조제하여 검량곡선을 작성하고 시료의 흡광도 값에 해당하는 표준물질의 농도 값으로 환산하였다.

또 유리형의 페놀성 화합물은 마이라드와 버셋(Maillard 및 Berset)등의 방법으로 추출하였다. 즉, 딸기 원료를 파쇄하여 그 파쇄액 5g을 50ml의 메탄올(methanol)로 30분간 2회 환류 추출하고 이를 여지(No. 1)으로 여과하였다. 이 여과액을 석유에테르(petroleum ether)로 3회 세척하고 40℃에서 진공 건조한 후 디메칠포름알데히드(dimethylformaldehyde) 4ml에 용해하고 0.45㎛ 여과지로 여과하여 유리 페놀성 화합물의 측정시료로 하였다. 이 유리 페놀성 화합물을 폴린-데니스(Folin-Denis)법에 따라 비색 정량하여 시료의 흡광도 값에 해당하는 표준물질 카테킨(cathethin)의 농도 값으로 환산하였다.

딸기 품종별 총 페놀화합물 및 유리형 페놀화합물의 함량분석의 결과는 표 1과 같다.

(표 1) 딸기 품종별 총 페놀 화합물 및 유리 페놀성 화합물의 함량분석
(생체중량)

딸기 품 종 명	당도(°brix)	총페놀 화합물 함량(mg%)	유리페놀 화합물 함량(mg%)
육보	11.2±0.2	131.5±5.6	2.5
장희	12.8±0.3	145.8±8.1	3.1
금향	12.1±0.4	122.8±5.5	2.1
설향	10.8±0.1	120.8±5.8	2.2
매향	11.6±0.3	127.6±6.8	2.3

모든 품종의 총페놀화합물 함량이 120 ~ 145mg%의 함유량을 보였고 그중 가장 함량이 높은 품종은 장희종으로서 145.8±8.1mg%가 함유되어 있는 것으로 나타났다. 또한 유리 페놀 화합물의 함량도 비슷한 경향을 보여 장희 품종이 3.1mg%로 가장 높은 함량을 보였다. 대개 과채류는 품종간, 재배조건, 재배지역의 기후조건, 수확시기 및 열매의 과숙의 정도에 따라 페놀화합물의 함량의 변화는 있을 것으로 사료된다. 따라서 본 발명에 사용한 딸기의 품종은 장희종으로 결정하고 유리형 페놀화합물의 함량이 증대되는 효소 처리조건을 조사하였다.

실시예 2 : 알파아밀라아제(α-amylase)농도에 따른 유리 페놀화합물의 함량 변화

딸기(생딸기 및 냉동딸기) 파쇄액에 알파아밀라아제(α-amylase, Sigma Co. A7595)를 각각 0.25 ~ 1.25 중량%로 첨가하여 70℃, 30분간 가열처리하여 유리페놀화합물의 함량 변화를 측정한 결과는 표2와 같다.

(표 2) 알파아밀라아제 농도별 딸기의 유리 페놀 화합물의 함량분석
(생체중량)

알파아밀라아제 농도(용량%)	유리 페놀 화합물 함량(mg%)
0	3.1
0.25	3.3
0.5	3.5
0.75	3.6
1.0	4.4
1.25	4.5

펙티나아제(pectinase)는 딸기 전체중량을 기준으로 0.4~0.6중량% 첨가하되 상기에 비해 첨가량이 적으면 유리 페놀 화합물 함량이 기대치에 못 미치고 첨가량이 과도하게 많은 경우에는 첨가량 대비 유리 페놀 화합물 함량의 증가가 미미하여 수율이 떨어지는 문제점이 있다.

가장 바람직하기로는 표 3과 같이 펙티나아제의 농도별 유리 페놀화합물의 함량에서 알파아밀라아제만 처리한 딸기의 4.4mg%에서 농도가 증가 할수록 총 페놀화합물의 함량 변화가 증가하였다. 농도가 0.5용량%까지 급격한 증가치를 보여 6.7mg%이었으나 펙티나아제 농도증가에 비례한 것 보다 유리폴리페놀 함량의 큰 변화가 없는 것으로 나타나 그 이후의 효소농도에서는 큰 함량 변화가 없었다. 따라서 0.5용량%로 처리하는 것이 가장 최적 농도에 해당되며, 이후의 시험은 0.5 용량%를 처리하여 이후 조건을 조사하였다.

알파아밀라아제(α-amylase)는 딸기 전체중량을 기준으로 0.8~1.2중량%를 첨 가하되 상기에비해 첨가량이 적으면 유리 페놀 화합물 함량이 기대치에 못 미치고 첨가량이 과도하게 많은 경우에는 첨가량 대비 유리 페놀 화합물 함량의 증가가 미미하여 수율이 떨어지는 문제점이 있다.

가장바람직하기로는 상기 표2와 같이 알파아밀라아제의 농도별 유리 페놀화합물의 함량에서 초기 알파아밀라아제 무처리 딸기에서 3.1mg%에서 농도가 0.75용량%까지는 큰 변화가 없었으나 1.0mg%에서 급격히 증가하여 4.2mg%였고 1.25용량% 농도에서는 4.5mg%로서 알파아밀라아제의 농도증가에 비례한 것 보다 유리폴리페놀 함량의 큰 변화가 없는 것으로 나타나 1.0용량%로 처리하는 것이 가장 최적의 농도에 해당된다. 따라서 이후 실험은 1.0용량%로 처리하여 이후 조건을 조사하였다.

실시예 3 : 펙티나아제 ( pectinase ) 농도에 따른 유리 페놀화합물의 함량 변화

70℃에서 1.0용량%의 알파아밀라아제를 처리한 딸기즙액의 온도를 50℃로 냉각하여 펙티나아제(pectinase, Sigma Co. 17389)를 농도별로 첨가하여 20분간 효소 처리하여 유리 페놀화합물의 함량을 측정한 결과는 표 3과 같다.

(표 3) 펙티나아제 농도별 딸기의 유리 페놀 화합물의 함량분석
(생체중량)

펙티나아제 농도(용량%)	유리 페놀 화합물 함량(mg%)
0	4.4
0.1	4.8
0.25	5.6
0.5	6.7
0.75	6.9
1.0	7.0

실시예 4 : 베타글루코시다아제(β- glucosidase1 )농도에 따른 유리 페놀화합물의 함량 변화

알파아밀라아제와 펙티나아제를 처리한 딸기즙액의 온도를 40℃로 냉각하여 베타글루코시다아제(β-glucosidase, Sigma Co. G4511)를 농도별로 첨가하여 40분간 효소 처리하여 유리 페놀화합물의 함량을 측정한 결과는 표 4와 같다.

(표 4) 베타글루코시다아제 농도별 딸기의 유리 페놀 화합물의 함량분석
(생체중량)

베타글루코시다아제 농도(용량%)	유리 페놀 화합물 함량(mg%)
0	6.7
0.01	7.1
0.025	7.6
0.05	8.2
0.075	8.2
0.1	8.3

베타 글루코시다아제(β-glucosidase)는 딸기 전체중량을 기준으로 0.04~0.06중량%를 첨가하되 상기에 비해 첨가량이 적으면 유리 페놀 화합물 함량이 기대치에 못 미치고 첨가량이 과도하게 많은 경우에는 첨가량 대비 유리 페놀 화합물 함량의 증가가 미미하여 수율이 떨어지는 문제점이 있다.

가장 바람직 하기로는 표 4와 같이 베타글루코시다아제의 농도별 유리 페놀화합물의 함량에서 알파아밀라아제와 펙티나아제만 처리한 딸기는 6.7mg%이었으나 베타글루코시다아제의 처리 농도가 증가 할수록 유리 페놀화합물의 함량 변화가 증가하였다. 농도가 0.05용량%까지 급격한 증가치를 보여 8.2mg%이었으나 그 이후의 효소농도에서는 큰 함량 변화가 없었다. 따라서 베타글루코시다아제를 0.05용량%로 처리하는 것이 가장 적절한 농도에 해당된다.

실시예 5 : 딸기 원료 및 효소처리된 농축액의 유리형 페놀화합물의 구성성분 분석

딸기 및 효소 처리된 농축물의 유리형 폴리페놀 화합물을 구성성분은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였다. 효소 처리된 딸기 농축액은 딸기 원료의 초기 브릭스도(°brix)와 동일하게 12 브릭스도(°brix)로 조정하였고 두 시료는 0.45㎛ 시린저 필터로 여과하여 그 여액을 분석 시료로 사용하였다. 이때 고속액체크로마토그래피(HPLC)의 분석조건은 표 5와 같다.

(표 5) 폴리페놀 화합물 분석을 위한 액체 크로마토그래피의 분석조건

항목	기기조건
기기	씨마쯔 LC 10A
컬럼	씸메트리 C₁₈(4.6×150mm, 5㎛, Waters Co.)
용매	A : 2% 초산 80%, B : 메탄올 20%
흐름 속도	1.0㎖/min
컬럼온도	40℃
주입량	20uL
검출기	UV 254nm

상기의 조건에서 분석한 딸기 원료 및 효소처리 된 딸기 농축액의 폴리페놀 화합물의 구성화합물의 농도는 표(6)과 같다.

(표 6) 딸기 및 효소처리 농축액의 폴리페놀 화합물의 구성성분 및 함량분석

구성성분	폴리페놀 화합물 함량(mg%)
구성성분	원료 딸기	효소처리 농축액
바닐린(Vanillin)	0.56	1.52
쿠마린(Coumarin)	0.45	1.48
시나픽산(Sinapic acid)	0.1	1.34
벤조익산(Benzoic acid)	1.89	2.56
쿼세틴(Quercetin)	0.11	0.65
캠프페롤(Kaempferol)	0.01	0.62
기타	0.04	0.12
총함량	3.16	8.29

원료 딸기의 폴리 페놀성분의 함량에 비하여 효소 처리된 농축액의 폴리 페놀 함량은 대부분의 성분에서 상당량이 증가 하였다. 구성 성분중 바닐린은 약 2.7배, 쿠마린은 약 3.3배, 시나픽산은 약 13.4배, 쿼세틴은 약 5.9배, 켐프페롤은 약 62배, 기타성분은 약 3배, 총 함량에서 약 2.6배의 함량 증가가 있었다. 따라서 일련의 효소 처리에 의하여 폴리페놀 함량의 증가가 가능하리라 판단된다.

실시예 6 : 효소처리된 딸기 농축액을 이용한 식초산 발효용 알코올 발효균주 효모의 분리

효소처리 딸기 농축액을 이용하여 고부가가치 상품 중의 하나인 식초를 제조하기 위하여 1단계 알코올 발효에 필요한 효모 균주를 분리하여 선별하고자 하였다. 알코올 발효균주 분리하기 위해서 다음의 조성 (1% 효모엑스분말, 2% 펩톤, 2% 포도당, 2% 한천, pH 6.0)으로 제조된 고체평판배지에서 순수분리하여 알코올 발효능 및 이화학적 특성을 조사하였다.

분리된 알코올 발효 균주의 알코올 발효능을 알아보기 위하여 발효능 시험을 한 결과 표 7과 같은 결과를 나타내었다.

(표 7) 알코올 발효를 위한 분리 효모의 발효능 시험

분리균	알코올 농도(%)	산도(%)	당도(Brix)	내알코올성 (O.D)
S1	7.6	1.40	5.5	0.683
S2	7.8	1.44	5.0	0.705
S3	7.4	1.39	5.5	0.673
S4	8.0	1.38	5.0	0.697
S5	6.8	1.42	5.0	0.384

30℃에서 3일간 발효한 결과 5균주 모두에서 유사한 결과를 보여, 알코올 함량은 6.8~8.0, 산도는 1.38~1.44, 당도는 5.0~5.5 브릭스도(°birx)를 나타내었고, 식초를 생산하기 위한 충분한 알코올 발효가 일어남을 알 수 있었다. 이들 중 내알코올성과 산도 생성면에서 우수한 S2균주를 다른 효모균주와 알코올 발효력을 비교하였다.

실시예 7 : 다양한 알코올 발효균주의 알코올 생성의 변화

상기의 표 7에서 알코올 생성능과 내알코올성이 가장 우수한 분리한 알코올 발효 균주 S2와 경북과학대학의 바이오건강산업연구소에 보관 중인 알코올 발효 균주(Saccharomyces cerevisiae OMK, Saccharomyces cerevisiae RCY, Saccharomyces cerevisiae 11호) 와의 발효능 및 이화학적 특성을 비교 조사한 결과 도 1과 같은 결과를 나타내었다.

( 도 1) 균주에 따른 발효중의 알코올 함량 변화

알코올 발효능은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisia)RCY가 가장 높은 값을 나타내었으며, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisia)OMK가 가장 낮은 알코올 함량을 나타내었다. 분리한 균주 S2의 경우 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisia)RCY와 유사한 활성을 나타내어서 식초를 생산하기 위한 1차 알코올 발효에 충분한 알코올 발효를 유도하는 것으로 나타났다.

실시예 8 : 다양한 알코올 발효균주의 발효일수에 따른 산도의 변화

알코올 발효 균주의 발효일수에 따른 산도의 변화는 도 2와 같다.

(도 2) Fig. 2. 균주에 따른 발효중의 산도 변화

모든 균주에서 산도가 1% 이상의 값을 나타내었고, 딸기에서 분리한 균주의 경우 다른 균주에 비해 산도가 다소 낮게 나타났다. 딸기식초 제조를 위해 알코올 발효 균주를 선발한 결과 표 7에서와 같이 딸기에서 분리한 Saccharomyces cerevisiae S2 균주가 적합한 것으로 사료되어 딸기식초 제조를 위한 알코올 발효에는 딸기에서 분리한 Saccharomyces cerevisiae S2 균주를 이용하였다.

실시예 9 : 알코올 발효를 위한 S2균주의 배양조건의 검토

딸기에서 분리한 알코올 발효 효모 Saccharomyces cerevisiae S2의 배양온도에 대한 영향을 조사하기 위하여 포도당 농도를 15%로 조정한 YM배지(0.5% 효모엑스분말, 0.5% 펩톤, 0.3% 맥아엑스, 1% pH 6.0)에서 배양온도 20, 25, 30, 35 및 45℃로 달리하여 각각 3일씩 배양하여 알코올 수율을 측정한 결과는 표 8과 같다.

이때 알코올 수율은 다음의 식으로 구하였다.

삭제

(표 8) 딸기 알코올 발효효모 Saccharomyces cerevisiae S2의 알코올 발효에서 배양온도의 영향

온도(℃)	알코올 농도	알코올 수율(%)
15	-	-
20	5.0	65.36
25	7.0	91.50
30	7.6	99.34
35	7.0	91.50

그 결과 표 8에서와 같이 30℃에서 가장 높은 알코올 수율을 나타내었으며 35℃ 이상에서는 수율이 감소하는 경향이었다. 이상의 결과는 일반적인 효모의 최적 배양 온도와 유사한 경향이었다.

알코올 발효를 위한 Saccharomyces cerevisiae S2의 배양초기 pH의 영향을 조사하 기 위하여 상기의 포도당 농도를 15%로 조정한 YM배지의 초기 pH를 4~8까지 조절하여 30℃, 120rpm 속도로 배양하여 알코올 수율을 측정한 결과는 표 9와 같다.

(표 9) 딸기 알코올 발효효모 Saccharomyces cerevisiae S2의 알코올 발효에서 초기 pH의 영향

pH	알코올 농도	알코올 수율(%)
4.0	6.6	86.27
5.0	6.8	88.88
6.0	7.0	91.50
7.0	7.6	99.34
8.0	7.2	94.11

그 결과 pH 7.0에서 발효율이 가장 우수하였으며 낮은 pH에서도 수율이 높아 분리균 S2는비교적 내산성이 있는 것으로 나타났다.

Saccharomyces cerevisiae S2 배양시 진탕속도가 알코올 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 포도당 농도를 15%로 조정한 상기의 YM 배지를 pH 6.0으로 조절하여 30℃에서 진탕속도를 100, 120, 150 및 200rpm으로 3일간 배양하여 알코올 수율을 조사한 결과는 표 10과 같다. 가장 최적 속도는 120 및 150rpm에서 알코올 수율이 높았다.

(표 10) 딸기 알코올 발효효모 S2의 알코올 발효에서 진탕속도의 영향

진탕속도(rpm)	알코올 농도	알코올 수율(%)
100	7.0	91.50
120	7.8	101.96
150	7.6	99.34
200	6.6	86.27

분리된 알코올 발효균주의 온도, pH 및 진탕속도의 영향에 대하여 조사한 결과, 최적온도는 30℃, pH 7.0 및 진탕속도 120rpm에서 알코올 수율이 가장 높은 결과이었다. 따라서 이러한 조건에서 Saccharomyces cerevisiae S2의 알코올 발효중의 경시적 변화를 조사한 결과는 도 3과 같다.

(도 3) 딸기 알코올 발효효모 S2의 알코올 발효중의 경시적 변화

딸기 과즙에서 알코올 발효 균주를 5일간 배양하면서 경시적으로 알코올 수 율의 변화를 조사한 결과 도 3과 같다. 배양시간에 따라 알코올 수율이 증가하였으나 3일 배양으로 최대 알코올 수율에 도달한 후 그 이상의 배양시간에서는 일정한 값을 나타내었다. 따라서 본 본 실험의 조건에서 Saccharomyces cerevisiae S2를 사용하여 알코올 발효를 행할 경우 배양시간은 3일이 가장 적합할 것으로 생각된다.

실시예 10 : 알코올 발효조건 최적화를 위한 실험계획

본 실험에서는 발효특성의 모니터링과 발효조건의 최적화를 위하여 싸스프로그램(SAS program)의 반응표면분석법(repose surface methodology, RSM)을 이용하였고, 발효조건에 대한 실험계획은 중심합성계획을 실시하여 발효공정에서 중요한 독립변수(Xi)로서 발효온도, 초기당도 및 발효시간에 대한 실험범위를 설정하여 각각 5단계로 부호화하였으며, 표 11의 중심합성계획에 따라 16구간으로 설정하여 발효실험을 하였다.

또한 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Yn)로는 알코올 함량, 산도, 당도 등을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다. 또한 발효에 있어서 발효조건이 발효특성에 미치는 영향을 예측된 모델식을 바탕으로 메스메티카 프로그램(Mathematica program)을 이용하여 4차원 반응표면분석으로 해석하였다.

딸기의 고부가가치화를 위해 폴리페놀 화합물이 다량 함유된 딸기식초를 제조하고자 중심합성계획에 의한 16구간의 알코올 발효 조건에 따라 알코올 발효를 실시하였고, 이때 얻어진 여액의 화학적 품질변화를 살펴본 결과는 표 12와 같다. 알코올 함량의 경우 1.6～9.2의 값을 나타내었으며, 산도의 경우 0.42～1.24의 값을 나타내었다.

(표 12) 반응표면분석에 의한 중심합성계획하의 알코올 발효시 알코올 및 산도의 측정치

발효조건			알코올(%)	산도(%)
온도(℃)	초기농도 (˚Brix)	시간(day)	알코올(%)	산도(%)
30(1)^*	18(1)	4(1)	7.6	1.04
30(1)	18(1)	2(-1)	7.6	1.12
30(1)	12(-1)	4(1)	4.4	0.68
30(1)	12(-1)	2(-1)	4.4	0.72
20(-1)	18(1)	4(1)	8.6	1.10
20(-1)	18(1)	2(-1)	3.0	1.20
20(-1)	12(-1)	4(1)	5.0	0.70
20(-1)	12(-1)	2(-1)	2.0	0.82
25(0)	15(0)	3(0)	6.0	0.90
25(0)	15(0)	3(0)	6.2	0.88
35(2)	15(0)	3(0)	5.8	0.88
15(-2)	15(0)	3(0)	3.4	0.86
25(0)	21(2)	3(0)	9.2	1.24
25(0)	9(-2)	30)	2.4	0.42
25(0)	15(0)	5(2)	6.2	0.94
25(0)	15(0)	1(-2)	1.6	0.86

^*)중심합성계획법에 의한 실험계획의 부호화.

삭제

표 13에 나타난 다항식을 통해서 딸기과즙의 발효온도, 초기당도 및 발효시간에 따른 2차 다항식을 볼 수 있다.

(표 13) 반응표면분석(RSM) 프로그램에 의한 알코올 발효를 위한 다항 회귀식

반응값	다항 회귀식	R²	유의성
알코올 함량	Y_AC= - 29.825000 + 1.297500X₁+ 0.062500X₂ + 8.162500X₃- 0.015000X₁ ²+ 0.015000X₁X₂ - 0.008333X₂ ²- 0.215000X₁X₃+ 0.108333X₂X₃ - 0.550000X₃ ²	0.9814	0.0002
산도	Y_A= - 0.366250 + 0.002250X₁+ 0.122917X₂ - 0.076250X₃- 0.000200X₁ ²- 0.000167X₁X₂ - 0.001667X₂ ²+ 0.002500X₁X₃- 0.000833X₂X₃ + 0.002500X₃ ²	0.9519	0.0026

R²가 알코올 함량의 경우 0.9814, 산도의 경우 0.9519의 값을

나타내었으며, 1% 이내의 유의성이 나타났다. 효소 전처리된 딸기 농축액을 이용하여 발효온도, 초기당도 및 발효시간에 따른 알코올 함량 및 산도에 대한 능선분석을 통한 최적 조건의 수치를 구한 결과는 표 14와 같다.

(표 14) 능산분석(ridge analysis)에 의한 알코올 발효조건에서 예측되어지는 최적조건 수치

반응값	R²	Pro>F	X₁ ¹⁾	X₂ ²⁾	X₃ ³⁾	최대값	형태
알코올 함량	0.9814	0.0002	25.53	20.47	3.81	9.80	안장점
산도	0.9519	0.0026	23.64	20.87	2.70	1.25	안장점

¹⁾온도(℃), ²⁾초기농도(Brix), ³⁾발효시간(day)

알코올 함량이 가장 높게 나타나는 조건은 발효온도 25.53℃, 초기당도 20.47 브릭스도(°brix) 및 발효시간 3.81일일 때 가장 높은 9.80%를 나타내었으며, 산도가 가장 높게 나타난 조건은 발효온도가 23.64℃, 초기당도가 20.87일 때, 발효시간이 2.70일 때 가장 높은 1.25%를 나타내었다.

전처리된 딸기농축액을 발효온도, 초기당도 및 발효시간에 따른 알코올 함량 및 산도가 조건변수에 어떤 영향을 받는지에 대한 실험결과를 표 15에 나타내었다.

(표 15) 알코올 발효조건에 따른 알코올 함량 및 산도의 회귀모델에 대한 분산분석

발효조건 반응값	(F-값)F-Ratio
발효조건 반응값	온도(℃)	초기농도(°Brix)	시간(day)
알코올 함량	17.98^***	38.27^***	33.94^***
산도	0.22	29.32^***	0.16

^*10% 수준에서의 유의성; ^** 5%수준에서의 유의성; ^***1%수준에서의 유의성

알코올 함량의 경우 세 변수 모두에서 큰 영향을 받는 것으로 나타났으며, 산도의 경우는 초기당도에 가장 큰 영향을 받았으며, 발효온도와 발효시간에는 영향을 거의 받지 않는 것으로 나타났다

딸기과즙의 발효온도, 초기당도 및 발효시간에 따른 4차원 반응표면은 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있듯이 알코올 함량의 경우 발효온도가 증가할수록 초기당도가 높을수록 알코올 함량이 증가하는 값을 나타내고 있다.

알코올 발효조건을 설정하기 위해 발효온도, 초기당도 및 발효시간에 따른 화학적 품질 검사 결과 딸기로부터 분리한 균주를 이용하여 딸기과즙을 14 브릭스도(°brix)로 조정한 후 28℃에서 3일간 발효시킬 때 딸기식초 제조를 위한 충분한 알코올발효액을 얻을 수 있음이 확인되었다.

(도 4) 발효온도, 발효시간, 초기농도의 기능으로서 일정한 값(알코올 함량 3, 5, 7%)에서 알코올 함량에 대한 반응 표면 분석

실시예 11 : 식초산 발효균 분리

초산발효에 이용된 초산균은 각종 딸기 시료로 부터 분리된 초산생성균 중 산생성능이 가장 우수한 균주를 이용하였다. 즉, 각 딸기 시료를 30℃에서 24시간 동안 활성화 시킨 후, 생리식염수로 적절하게 희석하여 각각의 분리시료에서 0.2mL를 분리용 평판배지에 도말 접종하고, 30℃에서 2일 동안 배양하여 집락(colony) 주위에 투명환을 형성하는 균을 순수분리하였다. 고체배지에서 분리된 균을 다시 초산 생성균 액체배지에 접종하고 30℃에서 진탕배양한 후 초산 생성능이 우수한 균주를 최종적으로 선정하였다.

초산 생성력이 우수한 균주를 선정하기 위해 여러 곳에서 수집된 종초로부터 초산균 분리용 평판배지에서 집락(colony)의 주위에 투명환을 형성하는 12개의 초산균주를 순수 분리하였으며, 이들 균주를 3%의 알코올을 함유한 초산 생산균 분리용 액체배지에 각각 다시 접종하여 30℃에서 3일간 진탕배양한 후 초산 생성능을 비교한 결과는 표 16과 도5와 같다.

(표 16) 각종 종초 및 과실원료에서 분리된 초산생성균의 초산생성능

분리초산균주	pH	산도(%)
A1	3.16	2.28
A2	3.32	2.58
A3	3.25	2.49
A4	3.37	2.10
A5	3.31	2.49
A6	3.53	0.42
A7	3.33	2.22
A8	3.35	2.22
A9	3.19	2.25
A10	3.16	2.55
A11	3.27	1.56
A12	3.32	2.67

(도5) 초산균 분리용 평판배지에서의 투명환(산 생성능)

12개 균주 중 A12균주가 2.67%로 초산 생성능이 가장 높은 균주로 나타났으며, 다음으로 A12, A10, A3 및 A5균주 등이 2.58%, 2.55%, 2.49%로 각각 나타났다. 따라서 다른 균주에 비하여 초산 생성능이 가장 우수한 A12균주 최종 선정하였다.

실시예 12 : 분리균주 A12의 초산 생성을 위한 배양조건의 검토

삼각플라스크에 초산 생산용 액체배지를 100mL를 넣고 분리균주 배양액을 접종한 후 진탕배양기에서 30℃, 120rpm으로 배양하였다.

증식온도의 영향

증식온도는 초산균주 A12의 증식 최적 온도를 조사하기 위하여 3% 에탄올과 식초 생산용 액체배지에 분리균주를 접종하여 5℃ 간격으로 20~40℃의 온도범위에 서 배양한 다음 초산 생산량을 조사하였다. 3% 알코올과 초산 생산용 액체배지에서 발효온도를 20, 25, 30, 35 및 40℃로 하여 진탕배양하여 공시균주의 초산 생산량을 살펴본 결과는 표 17과 같다.

발효온도 30℃에서 최대의 균증식을 보였으며, 초산생성량도 증식최적온도에서 가장 높게 나타났다. 또한 25℃보다 온도가 낮아지거나 30℃보다도 높아지면 증식이 낮아지는 경향을 보였으며, 초산 생성량도 감소하였다. 본 실험에서 분리한 공시균주의 생육적온은 30℃로 초산발효에 유용한 균주로 생각되었다.

(표 17) 분리 초산균 아세토박터(Acetobacter sp.) A12의 생육 및 초산생성에 미치는 발효온도의 영향

온도(℃)	pH	산도(%)	세포생육도 (OD. 660nm)
20	3.57	3.24	0.905
25	3.47	4.20	1.129
30	3.45	4.38	1.169
35	3.66	2.94	0.915
40	4.58	0.36	0.089

초기 알코올 농도의 영향

초기 알코올 첨가농도가 아세토박터(Acetobacter sp.) A12 균주를 이용한 초산발효에 미치는 영향을 검토하기 위하여 알코올 함량을 3, 5, 7, 9 및 11 부파%로 되게 각각 첨가한 초산 생산용 액체배지를 진탕배양하여 초산 생산량을 조사한 결과는 표 18과 같다.

아세토박터(Acetobacter sp.) A12는 에탄올이 7 부피% 첨가된 배지에서 산 생성이 가장 우수하여 배양 후 총산도가 4.86%로 가장 높게 나타났으며, 에탄올 농도가 7 부피%보다 낮아지거나 높아지면 초산 생산량이 감소하는 경향을 나타내었다. 본 연구의 결과 초산 발효를 위한 에탄올 농도는 7 부피%가 적합할 것이라 나타났다.

(표 18) 아세토박터(Acetobacter sp.) A12 생육 및 초산생성 미치는 초기 에탄올 농도의 영향

에탄올 농도(%)	pH	산도(%)	세포생육도 (OD. 660nm)
3	3.71	2.96	1.004
5	3.45	4.38	1.018
7	3.39	4.86	1.129
9	3.51	2.52	0.719
11	3.66	2.04	0.573

초산농도의 영향

초기산도가 배양에 미치는 영향을 보기 위하여 3% 알코올이 함유된 식초 생산용 액체배지의 초기산도를 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0%로 각각 조절하여 배양으로 하였으며, 초산 농도를 1.0~3.0%로 조정한 초산 생산용 액체배지에 아세토박터(Acetobacter sp.) A12을 접종하여 초산 생산량을 측정한 결과는 표 19와 같다.

초산이 1% 첨가된 배지에서 초산 생산량이 4.38%로 가장 높게 나타났다. 초산 생산량은 초산 처리 농도가 높아질수록 감소하는 경향을 보였다. 따라서 딸기식초 발효 시 초기산도는 1%로 조정하는 것이 적당한 것으로 판단되었다.

(표 19) 아세토박터(Acetobacter sp.) A12 생육 및 초산생성 미치는 초기 산도의 영향

초기산도(%)	pH	최종산도(%)	세포생육도 (OD. 660nm)
1.0	3.34	4.38	0.605
1.5	3.35	3.48	1.015
2.0	3.31	3.48	0.914
2.5	3.30	3.12	0.795
3.0	3.29	2.64	0.684

실시예 13 : 식초발효조건의 최적화를 위한 실험계획 및 딸기식초 제조

전처리 된 농축액을 이용한 딸기식초의 제조를 위한 발효조건은 알코올발효와 초산발효 2단계로 나누어 중심합성계획에 따라 실험을 실시하였으며, 반응표면분석법을 위해서 SAS(statistical analysis system) 프로그램을 이용하였다.

초산발효는 500mL 삼각플라스크에 각각 알코올 발효액 200mL와 초산균주 아세토박터(Acetobacter sp.) A12 를 접종하였다. 요인변수로 설정된 발효온도, 교반속도 및 발효시간을 각 5수준(-2,-1,0,1,2)으로 부호화하여 표 20과 같이 중심합성계획을 수립하고 16개의 설정된 조건으로 실험을 행하였다. 이때 초산발효조건과 관련된 반응변수로는 산도, 유리 페놀화합물 함량 등으로 설정하였다.

앞선 실시예 10의 알코올 발효 최적조건의 결과를 도태로 초기농도 14브릭스도(°birx), 발효온도 28℃, 발효시간을 3일의 조건에서 7%이상의 알코올 함량을 얻은 후 초산발효조건 실험에 이용하였다. 초산발효조건 설정을 위해 발효온도를 15, 20, 25, 30 및 35℃로 교반속도를 50, 100, 150, 200 및 250rpm으로 설정하고, 발효시간은 4, 5, 6, 7 및 8일로 설정하였다. 발효조건에 따른 산도 및 유리 페놀화합물 함량 측정 결과는 표 21에 나타내었고, 그 결과 산도는 2.2～4.38%의 값을 나타내었으며, 유리 페놀화합물 함량은 4.9~7.9mg%의 함량을 나타내었다.

(표 20) 중심합성계획법에 따른 초산발효조건의 설정치

발효조건	-2	-1	0	1	2
X₁ 온도(℃)	15	20	25	30	35
X₂ 진탕속도(rpm)	50	100	150	200	250
X₃ 시간(hr)	4	5	6	7	8

(표 21). 반응표면분석에 의한 중심합성계획하의 초산 발효시 산도 및 유리페놀화합물 함량의 측정치

발효조건			산도 (%)	유리페놀화합물 함량 (mg%)
온도(℃)	진탕속도 (rpm)	시간 (day)	산도 (%)	유리페놀화합물 함량 (mg%)
30(1)	200(1)	7(1)	4.14	7.6
30(1)	200(1)	5(-1)	3.48	5.6
30(1)	100(-1)	7(1)	4.26	7.4
30(1)	100(-1)	5(-1)	3.55	7.9
20(-1)	200(1)	7(1)	3.26	6.3
20(-1)	200(1)	5(-1)	3.04	5.4
20(-1)	100(-1)	7(1)	3.35	6.2
20(-1)	100(-1)	5(-1)	3.12	5.2
25(0)	150(0)	6(0)	3.66	6.5
25(0)	150(0)	6(0)	3.68	6.5
35(2)	150(0)	6(0)	3.08	5.9
15(-2)	150(0)	6(0)	2.22	5.2
25(0)	250(2)	6(0)	3.50	5.9
25(0)	50(-2)	60)	3.10	6.4
25(0)	150(0)	8(2)	4.38	7.0
25(0)	150(0)	4(-2)	3.42	4.9

이들 결과에 대한 반응표면 회귀식은 표 22와 같다.

산도 측정에 대한 발효액의 회귀식 R²는 0.9466이며, 1% 이내에서 유의수준이 인정되었다. 예측된 정상점은 안장점(saddle point)으로 능선분석을 실시하여 본 결과 최대값은 4.60%로 예측되었다. 이 예측값을 발효할 수 있는 조건은 발효온도 28.13℃, 진탕속도 151.26rpm 및 발효시간 7.89일로 나타났다(표 23).

발효조건별 산도 변화의 반응표면은 도 6과 같이 발효시간이 길어질수록 산도가 증가하는 것으로 나타났으며, 표 24에서도 알 수 있듯이 발효시간 및 발효온도에 큰 영향을 받는 것으로 나타났다.

유리 페놀성 화합물 함량에 대한 발효액의 회귀식(표 22)의 R²는 0.9867이고 1% 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 예측된 정상점은 최대점이고, 최대값은 7.9mg%로 예측되었고, 이때 발효조건은 발효온도 28.90℃, 진탕속도 101.38rpm 및 발효시간 7.56일이었다.(표 23).

표 24에서 보는 바와 같이 발효액의 유리 페놀성 화합물 함량은 발효시간, 발효온도, 진탕속도 순으로 영향을 받는 것으로 나타났으며, 그 차이가 크지는 않아 전체 반응변수에 골고루 영향을 받는 것으로 확인할 수 있었다.

(표 22) 반응표면분석 프로그램에 의한 초산발효를 위한 다항회귀식

반응값	다항회귀식	R²	유의성
Acidity	Y_A= - 0.971250 + 0.428250X₁+ 0.012800X₂ - 1.008750X₃- 0.0010200X₁ ²- 0.000010000X₁X₂ - 0.000037X₂ ²+ 0.023000X₁X₃- 0.000150X₂X₃ + 0.057500X₃ ²	0.9466	0.0035
Total phenolics content	Y_pH= - 79.821875 + 5.146125X₁+ 0.315755X₂ + 19.025625X₃- 0.094250X₁ ²- 0.006155X₁X₂ - 0.000363X₂ ²+ 0.157750X₁X₃- 0.012875X₂X₃ - 1.2697500X₃ ²	0.9867	0.0001

(표 23) 능산분석(ridge analysis)에 의한 초산 발효조건에서 예측되어지는 최적조건 수치

반응값	R²	Pro>F	X₁ ¹⁾	X₂ ²⁾	X₃ ³⁾	최대값	형태
산도	0.9466	0.0035	28.13	151.26	7.89	4.60	안장점
유리 페놀화합물 함량	0.9867	0.0001	28.90	101.38	7.56	7.9	최대

¹⁾온도 (℃), ²⁾ 진탕속도(rpm), ³⁾시간(day)

(표 24) 초산 발효조건에 따른 산도 및 유리페놀화합물의 회귀모델에 대한 분산분석

발효조건 반응값	F-Ratio
발효조건 반응값	온도(℃)	진탕속도(rpm)	시간(day)
산도	15.67^***	1.00	6.91^**
유리 페놀화합물 함량	30.93^***	9.24^***	80.96^***

효소 처리된 농축액을 이용한 딸기식초 제조를 위해서는 딸기에서 분리한 알코올발효 균주를 S2를 이용하여 딸기 농축액을 14 브릭스도(°birx)로 조정한 후 28℃에서 3일간 발효시켜 알코올 발효액을 얻은 후 딸기에서 분리한 아세토박터(Acetobacter sp.)A12를 이용하여 발효온도 28℃, 진탕속도 150rpm, 발효시간을 7.5일로 조정하면 산도 4% 이상의 식초 생산이 가능함이 확인되었다.(표 25, 도 6)

(표 25) 초산발효에서 최적 반응값의 겹침(superimposing)에 의한 예측된 최적발효조건

발효조건	예측된 최적범위
온도(℃)	28
진탕속도(rpm)	120
시간(day)	7.5

(도 6) 발효온도, 발효시간, 초기농도의 기능으로서 초산 함량의 일정한 값(산도 3.0, 3.5, 4.0%)에서 에 대한 반응 표면 분석

실시예 14 : 식초의 이화학적 특성 비교시험

효소 처리된 딸기 농축액은 14브릭스도(°brix)로 농도조정하고 딸기에는 당을 보당하여 14 브릭스도(°brix)로 조정후 위의 최적 조건으로 딸기식초를 제조한 제품들과 시중판매중인 사과식초의 이화학적 성분을 비교분석하였다.

유기산 분석

유기산 분석은 제조한 각 식초 원액을 적당히 희석하여 0.45㎛ 미세막 필터로 여과하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 이때 분석조건은 썬파이어(Sunfire) C18 컬럼과 0.01N 황산(H₂SO_4,pH 2.4)를 이동상으로(흐름속도 0.5mL/min)으로 자외선검출기(210nm)를 이용하였으며, 동일한 분석 조건으로 표준품의 검량곡선을 작성하여 유기산을 정량하였다.

당 분석

각 식초를 0.45㎛ 미세막 필터로 여과하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 이때 분석조건은 유트론(ULTRON) PS-80N컬럼과 증류수를 이동상(흐름속도 0.6ml/min)으로 굴절검출기(RI)를 이용하였으며, 동일한 분석 조건으로 표준품의 검량곡선을 작성하여 유리당을 정량하였다.

무기성분 분석

시료를 건식분해한 다음 일정량을 취하여 0.45㎛ 미세막 필터로 여과한 후 원자흡광광도계를 이용하여 목적하는 무기성분의 분석조건에 따라 검량선을 작성하고 이를 토대로 시험용액을 분석하였다.

아미노산 분석

식초의 아미노산 분석은 6N 염산을 식초시료 2ml에 가해 110℃에서 24시간 가수분해 하여 여과 후, 감압하여 농축건고 시킨 다음 구연산염 버퍼(sodium citrate buffer)(pH 2.2)에 용해하여 0.45㎛ 미세막 필터로 여과한 후 표 26과 같은 조건으로 분석하였다.

(표 26) 식초제품의 아미노산분석을 위한 분석조건

항목	조건
기기	S7130 아미노산분석기(amino acid analyzer) (Sykam Co., Germany)
컬럼	LCA K02/Na 양이온분리컬럼(Cation separation column)
버퍼용매	A : 0.12N 구연산염 버퍼(sodium citrate buffer) (pH 3.45) B : 0.20N 구연산염 버퍼(sodium citrate buffer) (pH 10.85)
버프용매의 흐름속도	0.45mL/min
닌하이드린 용액의 흐름속도	0.25mL/min
주입량	20uL

앞의 최적 발효조건에 한 2단계(알코올 및 초산) 발효에 의해 제조된 효소 처리된 딸기농축액 식초와, 효소처리되지 않은 일반적인 딸기식초 및 시판 유통되고 있는 사과주정식초의 품질을 비교 분석한 결과는 표 27~32와 같다.

브릭스도(°brix)당도는 일반적인 딸기식초가 7.0브릭스도(°brix)로 다른 제품에 비해 다소 높았으며, 사과식초는 6.6브릭스도(°brix), 효소 처리된 딸기농축액 식초는 6.0브릭스도(°brix)였다. 총산함량은 사과식초에서 6.3%로 비교적 높게 나타났으며 일반적인 딸기식초는 5.0%, 효소처리된 농축액 딸기는 4.5%의 함량 값을 나타내어 식초의 제품규격에 적합하였다(표 27).

각 식초에 함유된 유기산 중 초산의 함량(표 28)은 3.2~4.8%로 주된 유기산 성분으로 나타났으며, 효소 처리된 딸기농축액 식초는 시중 유통되고 있는 사과식초에 비해 총산은 낮았으나 사과산, 구연산, 호박산의 함량은 높았으며, 특히 구연산의 함량은 15배 이상 높았다.

유리당의 함량은 서당(sucrose)이 가장 많이 잔류함을 볼 수 있었으며 시판되고 있는 사과식초에 비해 과당의 함량이 월등히 낮았다.

무기성분은 딸기식초 제품군이 시판 사과식초에 비해 월등히 높은 값을 나타내었다. 두가지 딸기식초에서는 칼륨이 다량으로 존재하였고, 그 다음으로 나트륨, 칼슘, 마그네슘의 함량이 높았다.

각 식초에서 총 아미노산 함량은 효소처리 딸기농축액 식초가 286.86mg%로 가장 높았고 본 발명에 따른 딸기식초는 243.43mg%였고 시판 사과식초 33.29mg%에 비해 7~8배 이상 높았으며, 딸기식초 제품들의 경우 글루탐산의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과로 2단계 발효로 생산한 딸기농축액 식초 제품의 품질이 시중 유통되고 있는 사과식초보다 우수함을 알 수 있었다.

효소처리 농축액으로 제조한 식초의 유리형 폴리페놀 함량은 4.67mg%이었으나 일반적인 딸기식초의 경우 0.73mg%, 시판용 사과식초는 0.195mg%로서 효소처리 농축액 식초가 많은 폴리페놀의 잔존이 다량 확인되었다.
(표 27) 식초제품의 이화학적 성분비교

		효소처리 딸기농축액 식초	일반적인 딸기식초	시판 사과식초
pH		3.65	3.43	2.74
산도(%)		4.5	5.0	6.3
브릭스도(°brix)		6.0	7.0	6.6
갈색도		1.854	1.707	0.057
탁도		0.095	0.089	0.003
훈트의(Hunter's) 색도	명도(L 값)	72.23	73.40	99.39
	적색도(a 값)	16.85	14.78	-0.68
	황색도(b 값)	78.32	75.40	3.55

(표 28) 식초제품의 유기산 성분의 함량

제품군	유기산함량(%)
제품군	L-사과산	젖산	초산	구연산	호박산	D-사과산	총 유기산
효소처리 딸기농축액 식초	0.33	0.16	3.45	0.9	0.07	0.37	5.28
일반적인 딸기식초	0.35	0.18	3.27	1.0	0.08	0.35	5.23
시중판매 사과식초	0.16	0.18	4.8	0.06	-	0.32	5.52

(표 29) 식초제품의 유리당 성분의 함량

제품군	유리당 함량(%)
제품군	포도당(Glucose)	과당(Fructose)	서당(Sucrose)	총 유리당함량
효소처리 딸기농축액 식초	1.89	0.15	2.01	4.05
일반적인 딸기식초	1.21	0.24	4.01	5.46
시중판매 사과식초	2.26	1.99	3.49	7.74

(표 30) 식초제품의 무기질성분의 함량

제품군	무기질 함량(mg%)
제품군	칼슘(Ca)	철(Fe)	칼륨(K)	마그네숨(Mg)	망간(Mn)	나트륨 (Na)	아연(Zn)	총함량
효소처리 딸기농축액 식초	15.6	0.84	158.3	21.2	0.55	38.7	0.25	235.44
일반적인 딸기식초	20.7	0.90	212.20	19.30	0.48	49.40	0.35	303.33
시중판매 사과식초	4.8	0.96	23.06	7.10	0.03	24.00	0.08	60.03

(표 31) 식초제품의 아미노산성분의 함량

	아미노산 함량(mg%)
	효소처리 딸기농축액 식초	일반적인 딸기식초	시중판매 사과식초
아스파틱산	25.31	16.77	18.21
세린	10.52	13.64	0.45
트레오닌	8.55	10.06	0.59
글루탐산	79.25	65.69	3.23
프로린	5.25	3.52	0.00
글리신	19.52	13.14	0.44
알라닌	56.11	40.21	1.20
시스틴	0.00	0.00	0.00
발린	11.21	9.87	0.39
메치오닌	0.89	0.69	0.00
이소루신	5.24	6.89	0.22
루신	8.54	9.51	0.27
티로신	0.00	0.00	0.00
페닐알라닌	3.21	4.77	0.00
히스티딘	36.17	21.17	0.89
라이신	12.57	15.51	0.29
알기닌	4.52	5.44	0.18
총아미노산 함량	286.86	236.88	26.36

(표 32) 식초제품의 폴리페놀 화합물의 함량분석

구성성분	폴리페놀 화합물 함량(mg%)
구성성분	효소처리 딸기농축액 식초	일반적인 딸기식초	시중판매 사과식초
바닐린(Vanillin)	0.71	0.34	0.09
쿠마린(Coumarin)	1.05	0.03	0.005
시나픽산(Sinapic acid)	0.56	0.02	0.01
벤조익산(Benzoic acid)	1.50	0.31	0.09
쿼세틴(Quercetin)	0.45	0.01	-
캠프페롤(Kaempferol)	0.28	0.008	-
기타	0.12	0.02	0.03
총함량	4.67	0.738	0.225

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이와 같은 본 발명은 알파아밀라아제, 펙티나아제, 베타글루코시다아제의 효소를 이용하여 유리 페놀화합물인 폴리페놀이 다수 함유된 딸기 농축액을 제조할 수 있게 되어 저장성이 불량한 딸기의 효율적 이용과 함께 딸기 내 생리활성물질의 활용성을 높일 수 있는 효과가 있다.

또한 상기의 조건으로 제조된 딸기 농축액을 이용하여 딸기에서 분리한 사카로마이세스 세레비지에 종이나 통상의 알코올 발효 효모를 접종하여 알코올 발효시키고 딸기에서 분리한 식초산균과 통상의 식초산 발효균 아세토박터 아세티로 식초산 발효를 유도하여 폴리페놀 함량이 강화된 딸기발효식초를 제공할 수 있는 효과가 있다.

Claims

딸기(생딸기 및 냉동된 딸기)를 해동후 마쇄, 착즙하는 단계와;

상기 착즙된 딸기에 알파아밀라아제(α-amylase)를 첨가하여 60~80℃에서 20~40분간 가열하는 단계와;

상기 가열된 딸기를 40~60℃로 냉각한 뒤 펙티나아제(pectinase)를 첨가하여 10~30분간 1차 효소처리하는 단계와;

30~50℃에서 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)를 첨가하여 30~50분간 2차 효소 처리하는 단계; 를 거친다음 이를 여과한 후 30~50 브릭스도(°brix)로 농축하여서 됨을 특징으로 하는 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법
제 1항에 있어서,

딸기 전체중량을 기준으로

상기 알파아밀라아제(α-amylase)는 0.8~1.2중량%를 첨가하여 농축하게 됨을 특징으로 하는 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법
제 1항에 있어서,

딸기 전체중량을 기준으로

상기 펙티나아제(pectinase)는 0.4~0.6중량%를 첨가하여 농축하게 됨을 특징으로 하는 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법
제 1항에 있어서,

딸기 전체중량을 기준으로

상기 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)는 0.04~0.06중량%를 첨가하여 농축하게 됨을 특징으로 하는 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 농축액 제조방법
상기 1항 내지 제 4항중에서 선택되는 어느 한 항의 농축액을 12~18°brix로 조정하고 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyce cerevisiae)종을 3~8중량%를 접종하여 20~30℃, 발효시간 2~4일간 발효시키는 단계와;

상기의 알코올 발효물을 여과 하여 통상의 식초산 발효균 아세토박터 아세티(Acetobater aceti)로 식초산을 발효시키는 단계;를 거쳐서 됨을 특징으로 하는 딸기의 폴리페놀물질 함량이 증대된 발효식초 제조방법