KR101774912B1

KR101774912B1 - 알코올 분해력이 높은 아로니아 유래 초산균 및 그 균주를 이용한 아로니아 식초 제조방법

Info

Publication number: KR101774912B1
Application number: KR1020150128858A
Authority: KR
Inventors: 엄현주; 노재관; 김이기; 정연정
Original assignee: 충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원)
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2017-09-19
Also published as: KR20170031399A

Abstract

본 발명은 알코올 분해력이 높은 아로니아 유래 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주(기탁번호 KACC92089P) 및 이를 이용하여 제조하는 아로니아 식초 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 아로니아 발효액 유래 초산균을 이용하여 아로니아 식초 제조 시, 빠른 알코올 분해력으로 높은 함량의 초산을 단시일 내에 수득할 수 있으며, 총 폴리페놀 및 안토시아닌 함량이 높은 식초를 제조할 수 있다.

Description

알코올 분해력이 높은 아로니아 유래 초산균 및 그 균주를 이용한 아로니아 식초 제조방법{Strain with high hydrolyzing activity of alcohol from Aronia melanocarpa and method for vinegar of Aronia melanocarpa using the same}

본 발명은 알코올 분해력이 높은 아로니아 유래 초산균과 이를 이용하여 제조하는 아로니아 식초 제조방법에 관한 것이다.

식초는 식품의 맛을 돋워주는 신미료로서, 발효과정에서 생성된 독특한 방향과 신맛을 가지는 대표적인 발효식품으로 전세계적으로 사용되고 있다. 수세기 동안 여러 가지 원료를 사용하여 많은 종류의 식초가 만들어져 왔고 새로운 과일이나 채소, 곡류를 이용하여 식초를 제조하는 연구가 이루어졌으며, 현재는 식초 발효액에 다양한 부재료를 첨가함으로서 식품의 기능성을 향상시키려는 연구가 진행되고 있다. 이렇듯 식초는 식품의 보존 효과뿐만 아니라 대표적인 알칼리성 식품으로 동맥경화 및 고혈압 등의 성인병 예방, 피로회복, 살균효과, 체지방 감소 등의 효과가 밝혀지면서 식품의 조미료뿐만 아니라 음료 용도로도 개발이 활발히 이루어지고 있다.

현재까지 알려진 식초 제조방법은 속성발효법과 정치배양법으로 구분된다. 오늘날, 대부분의 시판 식초는 속성발효법으로 단기간에 대량생산하거나, 소규모 정치배양법에 따른 병행복발효에 의해 알코올로부터 생산되며, 원료 사용량과 제조방법에 따라 품질에 차이가 있다. 전통방법인 정치배양법은 자연발효를 통해 원료의 특성이 많이 남아있어 영양성이 우수하지만, 장기간의 비위생적인 발효과정을 거침으로 이미·이취가 발행하고 생산 수율이 낮아 품질관리에 문제점이 생겨 고품질의 상품화 수요에 충족하지 못하는 단점이 있다.

한편, 아로니아(Aronia melanocarpa)는 블랙 초크베리(black chokeberry)라고도 알려져 있으며, 그 원산지는 북부 아메리카지만 현재 유럽에서도 인기를 끌고 있으며 국내에서도 관심이 높아지며 재배되고 있다. 색과 향이 좋아 잼, 와인, 주스, 차 등 다양한 식자재로서의 이용 가치가 높고, 아로니아에 포함되어있는 다량의 안토시아닌은 짙은 자줏빛을 띠며 항산화물질, 천연색소로의 사용 가능하고, 그밖에 페놀산류, 플라보노이드류와 같은 생리활성물질은 항산화 효과, 항염증 효과, 항당뇨 효과, 면역조절기능 등 다양한 기능을 가지는 것으로 알려져 있다. 아로니아는 많은 생리활성 물질을 함유하고 있으나 과실 특유의 신맛과 떫은맛 때문에 생과로 이용하기보다는 가공용으로 개발할 필요성이 대두되고 있다. 국내에서는 양갱, 식빵, 설기떡, 청포묵, 막거리 등에 첨가하여 품질특성을 분석한 연구가 진행된 바 있으나, 보다 다양한 가공품 및 발효식품에 관한 연구가 부족한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 다양한 과일을 이용한 식초 중 항산화활성이 우수한 아로니아를 이용 식초를 제조하였고, 아로니아의 특성상 잘 발효가 일어나지 않으므로 아로니아로부터 초산균을 직접 분리하여, 알코올을 단시간에 분해해 초산 등 유기산을 생성하는 식초 제조방법을 개발함으로서 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1406739호 한국공개특허 제10-2012-0102478호

본 발명의 목적은 아로니아 유래 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주(기탁번호 KACC92089P)를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주(기탁번호 KACC92089P)를 이용하여 제조하는 아로니아 식초 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기탁번호 KACC92089P로 기탁된 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주를 제공한다.

상기 균주는 아로니아(Aronia melanocarpa) 또는 아로니아 발효액으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아로니아(Aronia melanocarpa)란, 블랙 초크베리(black chokeberry)라고도 명명되는 과일로 원산지는 북부 아메리카 지역이며, 국내에서도 재배되고 있다. 아로니아는 안토시아닌, 페놀산류, 플라보노이드류와 같은 생리활성물질을 다량 포함하고 있는 것으로 알려져 있다.

상기 균주는 알콜 분해능이 우수한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 아로니아에, 기탁번호 KACC92089P로 기탁된 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주를 접종하는 단계를 포함하는 아로니아 식초 제조방법을 제공한다.

상기 아로니아 식초 제조방법은

ⅰ) 기탁번호 KACC92089P로 기탁된 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주를 액체배지에 배양하여 배양액을 수득하는 단계;

ⅱ) 아로니아 착즙액에 주정을 아로니아 착즙액 전체 중량에 대하여 5~10 중량%로 첨가하는 단계;

ⅲ) 상기 단계 ⅰ)에서 수득한 배양액을 상기 단계 ⅱ)의 아로니아 착즙액에 아로니아 착즙액 전체 중량에 대하여 3~7 중량%로 접종하는 단계;

ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 접종한 아로니아 착즙액을 배양하는 단계;를 포함하는 제조방법일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 ⅳ)에서 상기 배양은 10 내지 12일 동안 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서, 본 발명에 따른 초산균을 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 총 산 함량은 6.19~7.34%로 대조군 균주(Acetobacter pasteurianus(KACC 13994))를 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 총 산 함량인 4.72%에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다(도 5). 또한, 본 발명에 따른 초산균을 첨가하여 제조한 아로니아 식초에서는 상당히 빠른 알코올 분해능을 나타내어 발효 12일째부터 잔존 알코올 함량이 0%였으나 대조군 균주를 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 잔존 알코올 함량은 1% 이상이었다(도 6).

본 발명의 일실시예에서 본 발명에 따른 초산균을 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 21일째 총 폴리페놀 함량은 243.33mg%로, 대조군 균주를 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 21일째 총 폴리페놀 함량인 112.70mg%에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다(표 4). 또한, 본 발명에 따른 초산균을 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 21일째 안토시아닌 함량은 95.60mg/L였으나, 대조군 균주를 첨가하여 제조한 아로니아 식초의 21일째 안토시아닌 함량인 59.12mg/L였다(표 5).

이와 같은 결과는 본 발명에 따른 초산균을 이용하여 아로니아 식초 제조 시 빠른 시간 내에 알코올을 소비하고 그 중 대부분을 초산으로 변환하는 고효율 초산 생성이 가능하므로, 발효기간을 단축하여 아로니아 식초를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 총 폴리페놀 및 안토시아닌 함량이 높은 식초를 제조할 수 있음을 시사한다.

본 발명에 따른 아로니아 유래 초산균을 이용하여 아로니아 식초 제조 시, 빠른 알코올 분해력으로 높은 함량의 초산을 단시일 내에 수득할 수 있으며, 총 폴리페놀 및 안토시아닌 함량이 높은 식초를 제조할 수 있다.

도 1은 아로니아 자연초산발효액으로부터 분리된 초산균 예상균주의 콜로니 및 이를 순수배양한 사진이다; (A) 초산균 예상균주의 콜로니 확인, (B) 단일 콜로니를 YGE 배지에서 순수배양.
도 2는 선발된 균주 8종을 아로니아 발효액에 접종한 후 발효시간에 따른 총 산 함량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 최종 선발된 초산균 AR9-1의 16S rRNA 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 최종 선발된 초산균 AR9-1에 대한 파이로제닉 트리이다.
도 5는 최종 선발된 초산균 AR9-1을 이용하여 제조한 아로니아 식초의 발효시간에 따른 총 산 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 최종 선발된 초산균 AR9-1을 이용하여 제조한 아로니아 식초의 발효시간에 따른 잔존 알코올 함량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 아로니아 자연초산발효액 제조

아로니아 식초용 초산균을 분리하기 위하여 아로니아 자연초산발효액을 제조하였다. 아로니아 착즙액을 50%로 희석하여 2L를 준비하고 당도가 15 브릭스(brix)가 되도록 설탕을 첨가하였다. 이후 효모(퍼미빈, Fermivin)(DSM Food Specialties, Seclin, France) 0.5g을 넣어 30℃에서 알코올 농도가 약 7%가 될 때까지 발효시키고, 항온수조(water bath)(KMC-1205SW1, Vision, Daejeon, Korea)에서 저온살균하였다. 살균된 발효액에 초산(acetic acid, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 1.5% 첨가하여 15~20℃의 공기가 잘 통하고 서늘한 곳에서 자연 초산발효를 유도하였다.

제조한 자연초산발효액으로부터 일주일 간격으로 시료를 채취하여 초산균의 분리를 위해 사용하였다.

< 실시예 2> 초산균의 분리 및 동정

<2-1> 초산균 예상균주 스크리닝

실시예 1에서 제조한 자연초산발효액 시료 내 초산균으로 예상되는 균주를 분리하기 위하여, 초산균 선택배지를 조성하고 초산균 예상균주를 스크리닝하였다.

구체적으로, 선택배지는 초산균 선택배지인 YCE 배지 및 YGE 배지의 2종류 배지를 사용하였으며, 121℃에서 15분간 오토클레이브(autoclave)한 후, 30℃에서 호기배양하였다. 각 배지의 조성은 하기 표 1과 같았다.

YCE 배지		YGE 배지
성분명	함량(중량%)	성분명	함량(중량%)
포도당	0.5	포도당	5
효모추출	1	효모추출	1
탄산칼슘	3	한천	2.5
한천	2.5	에탄올	3
에탄올	3
bromoceresol purple	0.03

시료 내 초산균 예상균주를 분리하기 위하여 십진희석법을 이용하였다. 실시예 1의 자연초산발효액 시료 1ml를 살린(Saline)으로 희석한 후, 9ml 살린(Saline)으로 10진 희석(10-7)까지 실시하였다. 그리고 표 1에 따른 YCE 배지에 100㎕씩 도말한 후, 30℃ 배양기에서 4일간 발효하였다. 이후 콜로니를 확인하고(도 1(A)) 단일 콜로니를 YGE 배지에서 순수배양하였다(도 1(B)).

<2-2> 초산균 분리 및 우수 초산균 선발

실시예 2-1에서 독립적으로 배양한 단일 콜로니 중 약 500개의 균주를 그람(Gram) 염색을 통해 그람음성균, 그람양성균으로 분리하였다. 초산균은 그람음성균이므로 그람양성균을 배제하고 초산균으로 예상되는 균주 약 200개의 균주를 1차 선발하였다.

1차 선발된 균주의 생육활성을 알아보기 위해 YGE 액체배지를 제조하여 OD값을 측정하였다. 위의 약 200개의 콜로니를 YGE 액체배지에 접종하여 48시간 동안 30℃ 배양기에서 진탕배양하고, OD값이 높은 균주를 선발하였다. 2회 반복실험을 통해 37개의 초산균 예상균주를 중간 선발하였다.

초산 예상균주를 최종 선발하기 위해 중간 선발된 37개의 초산균 예상균주를 주정을 5% 첨가한 아로니아 착즙액에 접종하여, pH 및 총 산(초산)값을 평가하였다(표 2). 표 2에서 1)은 광학현미경 1000x 배율로 관찰 시 미생물의 모양, 2)는 그람염색 시, 그람음성균임을 나타낸 것이다.

시료	형태학적 관찰	O.D.	pH	총 산(%)
2	단간균¹ ⁾, Gram(-)²⁾	1.3959	3.7	1.176
4	단간균, Gram(-)	1.1246	3.94	0.7224
5	단간균, Gram(-)	1.1978	3.65	1.554
9	단간균, Gram(-)	1.3282	3.67	1.5672
12	단간균, Gram(-)	1.0724	3.62	1.794
13	단간균, Gram(-)	1.669	3.81	1.0944
18	단간균, Gram(-)	1.7926	4.00	0.6924
1-1	단간균, Gram(-)	1.0907	3.77	1.422
2-1	단간균, Gram(-)	0.9988	3.9	1.002
4-1	단간균, Gram(-)	1.0223	3.84	0.99
6-1	단간균, Gram(-)	1.0446	3.66	1.65
7-1	단간균, Gram(-)	1.4158	3.78	1.236
8-1	단간균, Gram(-)	1.0077	3.72	1.3164
9-1	단간균, Gram(-)	1.5988	3.8	1.314
10-1	단간균, Gram(-)	1.1056	3.94	0.9204
11-1	단간균, Gram(-)	1.0904	4.15	0.5124
12-1	단간균, Gram(-)	1.2301	4.11	0.612
15-1	단간균, Gram(-)	1.1665	3.98	0.7368
18-1	단간균, Gram(-)	1.1961	3.67	1.8744
19-1	단간균, Gram(-)	1.3665	3.99	0.72
20-1	단간균, Gram(-)	1.6825	3.95	0.9516
1-2	단간균, Gram(-)	1.2352	4.12	0.576
2-2	단간균, Gram(-)	1.1535	4.18	0.406
3-2	단간균, Gram(-)	0.9702	4.11	0.514
5-2	단간균, Gram(-)	0.9128	3.88	1.020
6-2	단간균, Gram(-)	1.3133	3.99	0.672
8-2	단간균, Gram(-)	1.2608	4.08	0.570
9-2	단간균, Gram(-)	1.4372	3.99	0.794
10-2	단간균, Gram(-)	1.246	4.21	0.408
11-2	단간균, Gram(-)	1.0159	3.91	0.930
12-2	단간균, Gram(-)	1.2085	3.99	0.809
13-2	단간균, Gram(-)	1.0204	3.93	0.828
14-2	단간균, Gram(-)	1.4791	3.94	0.870
15-2	단간균, Gram(-)	1.4284	3.92	0.913
17-2	단간균, Gram(-)	1.3852	4.06	0.653
19-2	단간균, Gram(-)	1.3973	4.07	0.588
20-2	단간균, Gram(-)	0.9203	4.16	0.432

이후 주정을 5% 첨가한 아로니아 착즙액에서의 pH 및 총 산값에 대한 반복실험을 통해 8개의 초산균을 선발하고 선발된 8개의 초산균을 아로니아 발효액에 접종하여 9일간 총 산의 변화를 측정하였으며, 그 결과에 따라, 4~6일 이후 총 산값이 감소한 5번 및 9번 균주와 계대배양 중 균주활성을 상실한 7-1, 12번 균주를 초산균 선발에서 배제하였다(도 2).

<2-3> 우수 초산균 최종 선발 및 분자생물학적 동정

실시예 2-2에서 최종적으로 선발된 초산균에 대하여 분자생물학적 동정을 수행하였다.

구체적으로, 균주 배양액으로부터 염색체(Chromosomal) DNA를 분리한 후, 세균의 유니버셜 프라이머[27F: 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'(서열번호 2; 정방향 프라이머)/ 1492R: 5'-GGT TAC CTT ACG ACT T-3'(서열번호 3; 역방향 프라이머)]를 이용하여 16S rRNA(서열번호 1, 도 3) 부위를 증폭하였으며, 염기서열 분석은 국내 생명공학회사(솔젠트(주))에 의뢰하여 수행하였다.

젠뱅크(GenBank) 염기서열 데이터베이스를 이용하여 16S rRNA 염기서열의 상동성(homology)을 분석한 결과, 최종 선발된 초산균은 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus)와 99% 상동성을 보였다. 최종 선발된 초산균에 대한 파이로제닉 트리를 도 4에 나타내었다.

< 실시예 3> 아로니아 식초 제조

실시예 2에서 최종 선발된 초산균 4종(AR6-1, AR8-1, AR9-1 및 AR18-1) 중 AR9-1를 실험군으로, 공시균주인 Acetobacter pasteurianus(KACC 13994)를 대조군으로 이용하여 아로니아 식초를 제조하였다.

최종 선발된 초산균 AR9-1 및 공시균주(Acetobacter pasteurianus(KACC 13994))는 YGE 아가(agar)배지에 스트리킹하여 배양하였다. 30℃ 배양기에서의 이틀간 배양을 2회 반복하였다. 이후 배양된 균주를 YGE 액체배지에서 활성화한 뒤 균주를 포함하는 배양액의 OD값을 측정하고 동일한 OD값이 되도록 적절히 희석한 뒤, 주정을 7%가 되도록 첨가한 아로니아 착즙액에 5%가 되도록 희석한 배양액을 접종하였다. 아로니아 착즙액에 효모를 접종하여 발효주를 만든 뒤 초산발효를 일으켜야하나, 이러한 방법으로는 초산발효 시까지 시간이 많이 경과되어 아로니아의 항산화 활성이 감소되므로, 주정을 첨가하여 초산발효 시까지 소요되는 시간을 최소화하였다. 균주 접종 후, 30℃배양기에서 일정한 간격으로 시료를 채취하여 선발된 초산균의 초산 생성능 및 그를 이용한 식초의 품질특성을 조사하였다.

< 실험예 1> 아로니아 식초의 총 산 함량 분석

실시예 3의 아로니아 착즙액 발효 과정 중 생산된 총 산을 분석하기 위하여, 채취한 시료 30ml에 1% 페놀프탈레인 2~3방울을 첨가하고 0.1N 수산화나트륨으로 분홍색(pH 8.25~8.3)이 될 때까지 적정하였다. 적정에 소비된 수산화나트륨 소비량은 아세트산에 상당하는 유기산 계수를 이용하여 총 산 함량으로 환산하여 나타내었다.

그 결과, 도 5와 같이 대조군 균주를 첨가한 식초의 경우는 천천히 초산발효가 진행되어 발효 마지막 21일째에는 가장 낮은 4.72%의 총 산 함량을 나타내었다. 이에 비해 본 발명에 따른 AR9-1 균주는 발효 12일째 6.19%로 상당히 많은 양의 산을 생산하였다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 초산균을 이용하였을 때, 대조군보다 총 산 생성에 더욱 효과적인 것을 의미하며, 본 발명에 따라 아로니아 식초 제조 시 효율적인 발효가 가능함을 시사하였다.

< 실험예 2> 아로니아 식초의 잔존 알코올 함량 분석

실시예 3의 아로니아 착즙액 발효 과정 중 잔존하는 알코올의 함량을 국세청주류분석법의 증류법에 따라 분석하였다. 500 mL 플라스크에 여과한 아로니아 식초 시료 100 mL와 증류수 100 mL를 넣고 증류시켜 80 mL의 증류액을 얻었다. 그 뒤에 증류수를 가하여 최종 용량이 100 mL이 되도록 조절한 후 15℃가 되면 주정계를 넣어 알코올 함량을 정량하였다.

그 결과, 도 6과 같이 대조군 균주를 첨가한 식초의 경우는 발효 마지막까지 알코올을 다 소비하지 못해 1% 알코올이 잔존하였고, 본 발명에 따른 AR9-1 균주는 상당히 빠른 알코올 분해능을 나타내어, 12일째에 모든 알코올을 소비하는 것으로 나타났으며 알코올 분해능 및 초산 생성능이 모두 높았다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 AR9-1 균주를 이용하였을 때, 대조군보다 빠른 시간 내에 알코올을 소비하고 그 중 대부분을 초산으로 변환하는 고효율 초산 생성이 가능함을 의미하며, 본 발명에 따라 아로니아 식초 제조 시 발효기간을 단축하여 제조할 수 있음을 시사하였다.

< 실험예 3> 아로니아 식초의 색도 분석

실시예 3에서 제조한 아로니아 식초의 색도를 색도색차계(CM-3500d, Minolta, Japan)를 사용하여 분석하였다.

구체적으로, 아로니아 식초 시료 5 mL을 취하여 색도를 측정하였으며, 3회 측정값을 평균값으로 나타내어 L값(명도, lightness), a값(적색도, redness) 및 b값(황색도, yellowness)을 비교하였다. 표준백판의 값은 L=96.89, a=－0.07, b=－0.18이었다.

그 결과, 표 3과 같이 명도(L)의 경우는 실험군에서 발효 첫날보다 높은 명도값이 나타났으며, 발효 마지막날까지 증가한 명도값을 유지하였다. 적색도(a) 및 황색도(b)의 경우 역시 발효 첫날에 비해 발효 4일째 급격히 증가하는 것으로 나타나, 아로니아 식초의 색도는 발효과정을 거치면서 명도, 적색도 및 황색도가 증가하였다.

	시료	발효기간(일)
	시료	0	4	8	12	16	21
L	13994	1.84	9.17	7.05	7.74	6.68	6.07
	AR9-1	1.93	7.16	5.70	6.24	7.25	7.25
a	13994	1.40	22.62	18.58	16.21	16.561	18.56
	AR9-1	2.00	22.53	17.51	17.36	17.23	17.82
b	13994	-0.63	7.59	3.87	0.75	2.13	3.69
	AR9-1	-0.4	7.01	3.23	2.33	2.02	3.24

< 실험예 4> 아로니아 식초의 총 폴리페놀 분석

실시예 3에서 제조한 아로니아 식초의 총 폴리페놀 함량을 폴린-시오칼투 (Folin-Ciocalteu) 방법(Amerine MA et al. Methods for Analysis of Musts and Wine. pp.176-180. Wiley & Sons, New York(1980))으로 분석하였다.

구체적으로, 시료 0.1mL, 증류수 8.4mL, 2N 폴린-시오칼투 시약(Sigma-Aldrich, USA), 0.5mL, 20% Na₂CO₃ 1mL을 혼합하여 1시간 반응시킨 후 725nm에서 분광광도계를 통해 흡광도 값을 측정하였다. 페놀화합물 함량은 표준물질인 갈산(gallic acid)(Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 상기의 방법으로 작성한 표준곡선으로 양을 환산하였고, 추출물 중의 갈산 함량(gallic acid equivalent, GAE, dry basis)을 mg%로 나타내었다.

그 결과, 표 4와 같이 발효 21일째 대조군은 발효 첫날에 비해 절반 정도의 총 폴리페놀만이 잔존하였으나, AR9-1 균주에서는 발효 16일째부터 총 폴리페놀이 증가하다가 발효 마지막날인 21일째에는 가장 높은 함량을 나타냈다.

시료	발효시간(일)
시료	0	4	8	12	16	21
13994(mg%)	202.00	194.00	168.73	150.83	108.80	112.70
AR9-1(mg%)	216.26	192.30	157.20	135.96	167.00	243.33

< 실험예 5> 아로니아 식초의 총 안토시아닌 분석

실시예 3에서 제조한 아로니아 식초의 총 안토시아닌을 pH differential method(Lee et al. Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential method: Collaborative study. Journal of the AOAC International, 88, 1269-1278.(2005))를 이용하여 분석하였다.

구체적으로, 시료 0.1mL을 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 메탄올 5 mL과 혼합한 후 20분간 초음파 분해(sonication)하고 이를 총 3회 반복 실시하였다. 얻어진 상등액을 여과지(Advanced No.2, Toyo Roshi Kaisha, Japan)를 이용하여 여과한 추출액을 사용하였다. 추출액 0.5mL에 0.025M 염화칼륨 버퍼(potassium chloride buffer, pH 1.0) 4.5 mL와 0.4M 초산나트륨 버퍼(sodium acetate buffer, pH 4.5) 4.5 mL를 각각 첨가한 후 반응액을 520nm와 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 안토시아닌 함량은 하기 식을 통해 나타내었다.

총 안토시아닌 함량(시아니딘-3-글루코사이드 함량(cyanidin-3-glucoside ewuivalents), mg/L) = (A×MW×DF×1000)/(ε×1)

A(흡광도(Absorbance))=pH1.0-pH4.5

MW (시아니딘-3-글루코사이드 분자량(Molecular weight))=449.2 g/mol

DF(희석률(dilution factor)) = 시료의 희석 비율

1000 = g에서 mg으로의 단위 변환

ε(시아니딘-3-글루코사이드 분자 흡수율(absorptivity))=26,900 L×mol×cm

1 = cm에서의 경로 길이(pathlength)

그 결과, 표 5와 같이 실험군 및 대조군은 발효 첫날 325~336.17mg/L로 유사한 안토시아닌 함량을 보였으나 발효가 진행되면서 급격히 감소하였고, 특히 발효 21일째에 대조군은 발효 첫날에 비해 18%의 안토시아닌이 잔존하였다. 그러나, AR9-1 균주에서는 95.60mg/L로 발효 첫날에 비해 약 28%의 안토시아닌이 잔존하는 것을 확인하였다.

따라서, AR9-1 초산균을 첨가하여 아로니아 식초를 제조하였을 때 알코올을 빨리 분해하여 총 산 함량을 신속하게 높이면서 총 폴리페놀 및 안토시아닌 함량은 많이 잔존하는 식초를 제조할 수 있음을 확인하였다.

시료	발효시간(일)
시료	0	4	8	12	16	21
13994(mg/L)	325	266.45	232.30	100.00	81.71	59.12
AR9-1(mg/L)	336.17	245.11	194.92	123.6942	111.45	95.60

실험예에 따라 AR9-1 초산균은 빠른 시간 내에 알코올을 소비하고 그 중 대부분을 초산으로 변환하는 고효율 초산 생성이 가능하므로 발효기간을 단축하여 아로니아 식초를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 총 폴리페놀 및 안토시아닌 함량이 높은 식초를 제조할 수 있음을 확인하였으므로, 이를 국립농업과학원에 기탁하였으며 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) Aro-9(기탁번호 KACC92089P)로 명명하였다.

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC92089P

수탁일자 : 20150812

<110> Chungcheongbuk-do Agricultural Research Service <120> Strain with high hydrolyzing activity of alcohol and method for vinegar using the same <130> P15G10D1118 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1293 <212> DNA <213> Acetobacter pasteurianus <400> 1 gtggcggacg ggtgagtaac gcgtaggtat ctatccatgg gtgggggata acactgggaa 60 actggtgcta ataccgcatg acacctgagg gtcaaaggcg caagtcgcct gtggaggagc 120 ctgcgtttga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgatgat caatagctgg 180 tttgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 240 gcagtgggga atattggaca atgggggcaa ccctgatcca gcaatgccgc gtgtgtgaag 300 aaggtcttcg gattgtaaag cactttcgac ggggacgatg atgacggtac ccgtagaaga 360 agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgctcgg 420 aatgactggg cgtaaagggc gtgtaggcgg tttgtacagt cagatgtgaa atccccgggc 480 ttaacctggg agctgcattt gatacgtgca gactagagtg tgagagaggg ttgtggaatt 540 cccagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt gggaagaaca ccggtggcga aggcggcaac 600 ctggctcatt actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 660 ggtagtccac gctgtaaacg atgtgtgcta gatgttgggt gacttagtca ttcagtgtcg 720 cagttaacgc gttaagcaca ccgcctgggg agtacggccg caaggttgaa actcaaagga 780 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgcagaa 840 ccttaccagg gcttgaatgt agaggctgca agcagagatg tttgtttccc gcaagggacc 900 tctaacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 960 cgcaacgagc gcaaccccta tctttagttg ccatcaggtt gggctgggca ctctagagag 1020 actgccggtg acaagccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgt 1080 cctgggctac acacgtgcta caatggcggt gacagtggga agctaggtgg tgacaccatg 1140 ctgatctcta aaagccgtct cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaaggtg 1200 gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1260 accgcccgtc acaccatggg agttggtttg acc 1293 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer forward_27F <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer reverse_1492R <400> 3 ggttacctta cgactt 16

Claims

아로니아(Aronia melanocarpa) 또는 아로니아 발효액으로부터 분리된, 기탁번호 KACC92089P인 알콜 분해능을 갖는, 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus) 균주.
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아로니아에, 제1항의 균주를 접종하는 단계를 포함하는 아로니아 식초 제조방법.
제4항에 있어서,
ⅰ) 제1항의 균주를 액체배지에 배양하여 배양액을 수득하는 단계;
ⅱ) 아로니아 착즙액에 주정을 아로니아 착즙액 전체 중량에 대하여 5~10 중량%로 첨가하는 단계;
ⅲ) 상기 단계 ⅰ)에서 수득한 배양액을 상기 단계 ⅱ)의 아로니아 착즙액에 아로니아 착즙액 전체 중량에 대하여 3~7 중량%로 접종하는 단계;
ⅳ) 상기 단계 ⅲ)에서 접종한 아로니아 착즙액을 10 내지 12일 동안 배양하는 단계;를 포함하는 아로니아 식초 제조방법.
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