KR20170012693A - 국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에 균주 - Google Patents

국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주에 관한 것으로서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST는 우수한 내당성 및 알콜 발효능을 가진 균주로서, 디저트 와인 제조의 발효종균으로 유용하게 활용될 수 있다. 다른 균주에 비해 현저히 낮은 메탄올(methanol) 함량을 나타내어 디저트 와인 제조의 발효종균으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에 균주{Osmotolerant Saccharomyces cerevisiae strain isolated from Korean Grapes}
본 발명은 국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주(KCCM11720P)에 관한 것이다.
와인은 잘 익은 포도의 당분을 발효시켜 만든 알코올 음료로 영어로는 Wine(와인), 프랑스어로는 Vin(뱅), 이탈리아어로는 Vino(비노), 독일어로 Wein(바인)으로 불린다. 와인에는 카테킨, 폴리페놀, 레스베라트롤 등이 함유되어 있어 노화 방지 및 심장병, 뇌질환, 암 예방에 도움을 주는 것으로 알려져 있으며, 1991년 CBS의 인기프로그램인 ‘60 Minutes’에서 ‘French paradox’라는 주제로 방영되면서 더욱 큰 관심을 끌었다. 이 방송에서는 프랑스가 포화 지방의 섭취가 많으며, 흡연률, 고혈압 등의 발병률이 높음에도 불구하고 심장병에 의한 사망률이 두 세배 이상 낮음을 시사하여 미국 내 와인 판매량이 4배나 급격히 증가하는 결과를 낳기도 하였다.
한국와인소믈리에학회의 연구(국내 소비자가 선호하는 와인 특성, 한국와인소믈리에학회, 2005)에 따르면 국내 소비자들은 와인의 향이 풍부하며 단맛이 나는 레드 와인을 가장 선호하는 것으로 나타났으며, 이 같은 특성을 지닌 와인으로는 식사시 용도에 따라 디저트 와인으로 분류된다. 단맛이 강한 디저트 와인은 독일, 프랑스, 이탈리아, 캐나다, 오스트리아, 스페인 등 유럽 및 호주에서 주로 생산되며, 당농축 방법에 따라 겨울까지 수확을 늦춰 포도를 동결시켜 제조하는 아이스와인, 포도를 건조시키는 특정 미생물을 이용하여 제조하는 귀부와인, 포도를 수확하지 않고 과수에 열린 상태에서 건조시키거나 포도를 수확하여 자연건조시킨 늦수확와인과 건조포도와인, 그리고 와인 발효중 브랜디를 첨가하여 알콜 함량과 당도를 높게 한 포트와인 등으로 나뉜다. 디저트 와인은 당분이 농축되어 단맛이 강하고 누구든지 편하게 즐길 수 있다는 장점이 있지만 각각 동결 및 건조의 과정을 거치므로 수율이 일반 와인 대비 30% 이하에 불과하다는 단점도 있다.
국내의 디저트 와인은 경북의 영천과 청도, 경남 거창, 경기도 안산, 충북 영동 등지에서 생산되며, 대부분 포도를 착즙한 후 과즙을 동결건조로 고당화하여 만드는데 국내에서도 Campbell early 품종을 이용한 아이스와인 제조에 관한 연구나 Muscat Bailey A를 동결건조하여 제조한 아이스와인, 동결농축에 의한 아이스 사과주의 제조 등 다양한 연구가 이루어지고 있다. 하지만 디저트 와인 발효에 있어 국산 포도에 자생하고 있는 야생효모에 대한 연구는 미미한 실정이며, 국산 포도에서 유래한 내당성 효모에 대한 연구 또한 미미하다. 따라서 본 발명에서는 국산 포도에 자생하고 있는 야생효모 중에서 내당성 효모를 분리·동정하여 디저트 와인 제조의 발효종균으로 사용하고자 한다.
한국등록특허 제10-0208968호(1999.04.19)
본 발명의 목적은 국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내 포도에서 분리된 내당성 및 알콜 발효능이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균즈(KCCM11720P)를 제공한다.
본 발명은 국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주에 관한 것으로서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST는 우수한 내당성 및 알콜 발효능을 가진 균주로서, 디저트 와인 제조의 발효종균으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 Y-2 균주에서 분리된 ITS DNA 분석 결과이다.
도 2는 Y-2 균주 및 연관종 간에 나타나는 계통도이다.
도 3은 발효 균주를 달리하여 제조한 디저트 와인의 메탄올 함량을 나타낸다.
본 발명은 국내 포도에서 분리된 내당성 및 알콜 발효능이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주를 제공한다.
상세하게는, 상기 균주는 한국미생물보존센터에 KCCM11720P로 수탁된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 균주는 와인의 발효종균으로 사용될 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 와인은 디저트 와인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, '디저트 와인'은 독일, 프랑스, 이탈리아, 캐나다, 오스트리아, 스페인 등 유럽 및 호주에서 주로 생산되며, 당농축 방법에 따라 겨울까지 수확을 늦춰 포도를 동결시켜 제조하는 아이스와인, 포도를 건조시키는 특정 미생물을 이용하여 제조하는 귀부와인, 포도를 수확하지 않고 과수에 열린 상태에서 건조시키거나 포도를 수확하여 자연건조 시킨 늦수확와인과 건조포도와인, 그리고 와인 발효중 브랜디를 첨가하여 알콜 함량과 당도를 높게 한 포트와인 등으로 나뉜다. 디저트 와인은 당분이 농축되어 단맛이 강하고 누구든지 편하게 즐길 수 있다는 장점이 있지만 각각 동결 및 건조의 과정을 거치므로 수율이 일반 와인 대비 30% 이하에 불과하다는 단점이 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 내당성 효모의 분리, 내당성 및 당 분해능 탐색
경산, 영천, 영동에서 생산된 Muscat bailey A와 Campbell 포도를 착즙하여 30℃에서 발효하여 각 24, 48, 72시간째 채취한 시료를 spread plate법으로 YPD 배지에 도말, 35℃에서 48시간 배양 후 외적 특성에 근거하여 그 특성이 다른 효모(yeast)들을 분리하였다. 분리한 균주는 Einhorn tube에 40 % sucrose 용액을 fill-up 하고 포도 분리 효모(yeast) 15종을 접종하여 내당성과 당 분해능에 따라 최종 2종을 선정하여 실험에 사용하였다.
2. API kit
분리한 균주를 YPD broth 배지에 48시간 진탕배양(35℃, 150 rpm)하여 멸균 증류수에 현탁한 후 상기 현탁액을 API 20C AUX-kit (biomerieux, France)를 사용하여 1차 동정하였다.
3. Genomic DNA 추출
분리 균주의 genomic DNA 추출은 Harju의 방법(Harju S, Fedosyuk H, Peterson KR. Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab. BMC Biotechnol. 2004 Apr 21;4:8.; PMID: 15102338)을 응용하여 실시하였다. 24시간 YPD (1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % dextrose) broth에서 배양한 균주를 micro tube에 1.5 mL 씩 분주한 후 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상징액을 제거하고 Harju buffer(2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, pH 8.0 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 200 ㎕를 분주하였다. 세포 용해(cell lysis)를 위해 액체질소를 채운 bath와 95℃ water bath에 샘플(sample)이 든 micro tube를 각각 2분, 1분간 2회 반복하여 담그고, 30초 혼합한 후 200 ㎕ 클로로포름(chloroform)을 투입하고 다시 2분간 혼합하여 10000 rpm에서 3분간 원심분리(centrifuge)하였다. 상징액을 다른 tube에 옮긴 후 400 ㎕의 ice-cold 100% 에탄올(ethanol)을 투입하여 천천히 전도호화한 후 실온에서 5분간 배양하고 10000 rpm에서 5분간 원심분리(centrifuge)한 다음, 상징액을 제거한 후 0.5 ml 70% 에탄올(ethanol)을 투입하여 펠렛(pellet)을 세척하고 50 μ의 pH 8.0 TE buffer를 분주하여 실험에 사용하였다.
4. DNA 염기서열 결정 및 유연관계 분석
분리한 genomic DNA의 염기서열의 결정은 Solgent사(Daejeon, Korea)의 DNA sequencing service를 이용하여 분석하였으며, ITS1과 ITS4를 프라이머(primer)로 사용하였다. 염기서열 결과에 대한 상동성 검색은 NCBI(National center for Biotechnology Information)에서 BLAST를 이용하였으며, 계통학적 분석을 위한 multiple sequence alignment는 EMBL-EBI(European Molecular Biology Labaratory-European Bioinformatics Institute)에서 제공하는 ClustalX2를 이용하였다. 염기서열의 편집은 Bioedit ver 7.2.5를 사용하였고 neighbor-joining analysis에 의한 phylogenetic tree의 작성 및 분석에는 MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)6 프로그램을 이용하였다.
5. 발효 균주를 달리한 디저트 와인 제조
포도는 경산에서 수확한 MBA를 시중에서 구입하여 사용하였으며, 제경하지 않은 채로 5~6알씩 소분하여 각 30 kg을 예비실험 결과에 따라 20℃에서 시작하여 최초 중량의 75%에 도달한 10일차에서 35℃로 변경한 후 최초 중량의 50%(최종 38 °Brix)가 될 때까지 공기순환식 건조를 실시하였다. 건조가 완료된 포도는 파쇄하여 Potassium metabisulfite(K2S2O5)를 100 ppm을 첨가하였으며, 12시간 동안 안정화 시간을 거친 뒤 균주를 접종하였다. 발효 균주는 상업용 효모인 EC-1118(Saccharomyces bayanus)과 Pasteur red(Saccharomyces cerevisiae), 예비실험에서 자체 분리한 B-2(Saccharomyces cerevisiae), Y-2(Saccharomyces cerevisiae) 효모를 YPD broth 배지에서 48시간 진탕배양하고 4000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상징액을 제거한 뒤 권장 수준인 5.0×106cells/mL을 접종하였다. EC-1118은 발효 온도 범위가 넓고 알코올 내성이 뛰어나며 발효 속도가 빨라 스위트 와인이나 발포성 와인에 사용되고 있으며, Pasteur red는 발효 속도가 빠르며 복합적인 향을 생성하는 것으로 알려져 레드와인 제조에 주로 사용되는 효모이다. 발효중 포도 must는 발효통 내부 온도가 23 ℃에서 25 ℃로 유지되도록 하였으며 발효를 촉진시키고 페놀성 화합물 추출을 용이하게 하기 위해 매일 2회씩 교반하여 주었다. 침용과정인 1차 발효는 7일간 진행하였으며 여과 후 2차 발효를 7일간 실시하였다. 건조 포도의 유용 성분 침출을 유도하기 위해 1차 발효는 14일간 실시하였으며, 여과 후 7일간 2차 발효를 실시한 후 lacking하여 30일 숙성하였다.
6. 가스크로마토그래피를 이용한 디저트 와인의 메탄올 함량 분석
시료의 메탄올 함량과 향기성분 분석은 가스크로마토그래피(gas chromatography; GC)를 이용하여 분석하였다. 시료를 증류한 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 분석하였으며, 각 샘플은 표준물질의 잔류시간(retention time)과 비교하여 R2=1으로 작성한 표준검량곡선에 대입하여 amount를 측정하였다. GC 조건은 표 1과 같다.
Instrument Condition
model Agilent Technologies 6890N, USA
Column Innowax Closed Linked(60mm×0.25mm×0.5μm)
Column temp Initial 40 ℃(2 min) - 10 ℃/min - Final 120 ℃(2 min)
Carrier gas He
Injection volume 1.0 μL
Detector Flame Ionization Detector(FID)
Injector temp 220 ℃
Detector temp 230 ℃
Split ratio 5:1
Flow rate 1.0 mL/min
7. 디저트 와인의 관능평가
대학생 20명으로 구성된 일반 관능요원을 선정하여 무작위로 제시된 시료를 색, 향, 맛, 종합적 기호도에 대한 7점 척도법으로 관능평가를 실시하였으며, 이때 관능평점은 1점(아주 나쁨)에서 7점(아주 좋음)으로 나타냈다.
< 실시예 1> 분리 균주의 내당성 및 알콜 발효능 확인
포도 분리 균주를 40% sucrose 용액에 접종하여 내당성과 알콜 발효능을 동시에 확인한 결과 c-5, b-1, b-2, g-2, g-3, y-1, y-2, y-3, gm-1 균주가 내당성을 지닌 것으로 확인되었으며, 특히 Y-2 균주가 발효중 가장 많은 당을 소모하여 빠른 발효속도를 나타냈다(표 2).
CO2 emission
(mL) 		0hr 24hr 48hr 72hr Soluble solid
( Brix °)
c-1 0 0 0 1 17.8
c-2 0 0 0 2.5 17.4
c-3 0 0 0 0 17.2
c-4 0 0 0 0 17.4
c-5 0 7.5 10 10 16.2
c-6 0 0 0 0 17.2
b-1 0 7.5 10 10 16.8
b-2 0 7 10 10 15.6
g-2 0 7 10 10 16.8
g-3 0 6 10 10 18
y-1 0 7 10 10 16.6
y-2 0 7.5 10 10 15.4
y-3 0 8 10 10 16.6
GM-1 0 6 10 10 16.2
GM-2 0 0.5 4.5 10 16.4
< 실시예 2> API 20C AUX kit 동정 결과
포도 분리 내당성 균주 중 발효능이 가장 뛰어난 Y-2 균주를 API 20C AUX Kit를 사용하여 동정한 결과 glu, gal, mdg, mal, sac, tre에 대한 분해능이 있는 것으로 나타났으며, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 99.0% 일치하는 것으로 나타났다(표 3).
Isolated yeast Identification result % ID T Index Conflicted biochemical characterization
Y-2 Saccharomyces cerevisiae 2 99.0 1.0
< 실시예 3> DNA 염기서열 결정과 상동성 및 유연관계
균의 동정을 위한 ITS 영역의 염기서열 결정 결과는 도 1과 같으며, 분리 균주 Y-2는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 100%의 상동성을 나타내었다. 분리 균주의 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 근연균과의 상관관계를 조사하여 작성한 계통도(phylogenetic tree)는 도 2와 같다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 와인 제조시 주 발효균으로 사용되며 다양한 종류의 균주가 상업성 효모로 사용되고 있다. 본 발명에서 분리한 내당성 균주 Y-2는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST로 명명하고, 한국미생물보존센터에 KCCM11720P로 수탁하였다.
< 실시예 4> 발효균주를 달리한 디저트 와인의 메탄올 함량
발효 균주를 달리하여 제조한 디저트 와인의 메탄올(methanol) 함량은 도 3에서 나타내었다. 메탄올(methanol)은 주로 펙틴의 분해로 생성되며 인체에 흡수되면 포름알데히드로 변하여 시신경에 피해를 주거나 심할 경우 생명에 지장을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 식품공전에서는 과실주의 메탄올(methanol) 함량은 1000 mg/L으로 규정하고 있다. 분리균주 Y-2로 발효한 디저트 와인의 메탄올(methanol) 함량이 다른 균주에 비해 현저히 낮은 메탄올(methanol) 함량을 나타내었다.
< 실시예 5> 발효균주를 달리한 디저트 와인의 관능평가 결과
대학생 일반 관능요원 20명을 대상으로 관능평가를 실시한 결과 색상은 B-2와 Y-2, 향은 EC-1118, 맛과 종합적 기호도는 Y-2가 가장 우수한 것으로 나타났다(표 4). 디저트 와인의 제조에 있어 색상과 맛, 종합적 기호도가 가장 우수한 Y-2 균주가 발효 종균으로 가장 적합할 것으로 사료된다.
EC-1118 1) Pasteur red B-2 Y-2
Color 4.40±0.552) ab3 ) 4.00±0.00a 4.60±0.89a 4.60±0.55a
Flavour 5.20±0.84b 3.60±0.548a 4.20±0.837ab 4.80±0.84b
Taste 5.20±0.84bc 4.20±0.84ab 3.60±0.89a 5.80±1.30c
Overall 5.00±0.71bc 4.20±0.45ab 3.60±0.89a 5.40±0.89c
1) EC-1118 : EC-1118로 발효시킨 와인, Pasteur red : Pasteur red로 발효시킨 와인, B-2 : B-2로 발효시킨 와인, Y-2 : Y-2로 발효시킨 와인.
2) 모든 수치는 평균±SD로 표시하였다.
3) 평균에 일렬로 표시된 다른 글자는 Duncan's multiple range test에 의해 α=0.005에서 유의적으로 차이가 있다는 것을 나타낸다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11720P 20150701

Claims (4)

  1. 국내 포도에서 분리된 내당성 및 알콜 발효능이 우수한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 KCCM11720P로 수탁된 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 와인의 발효종균으로 사용되는 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 와인은 디저트 와인인 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) MFST 균주.
KR1020150103780A 2015-07-22 2015-07-22 국내 포도에서 분리된 내당성이 우수한 사카로마이세스 세레비지에 균주 KR101743526B1 (ko)

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