KR101773599B1 - 신규한 사카로미세스 세레비시아 s6-1 및 그 용도 - Google Patents

신규한 사카로미세스 세레비시아 s6-1 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 균주인 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명에서 연안 해역 해수로부터 분리한 신균주 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 내알콜성(alcohol tolerance), 내염성(salt tolerance) 및 내냉동성 특성을 나타내어 발효주를 포함한 다양한 발효식품 및 냉동 빵 반죽을 포함한 빵 반죽에 발효 효모로써 활용될 수 있다.

Description

신규한 사카로미세스 세레비시아 S6-1 및 그 용도{Novel Saccharomyces cerevisiae S6-1 and uses thereof}
본 발명은 신규한 균주인 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 해수로부터 분리한 신균주 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 및 이의 내알콜성(alcohol tolerance), 내염성(salt tolerance) 및 내냉동성을 이용하여 제조된 발효식품 및 빵 반죽에 관한 것이다.
효모는 3대 미생물 중의 하나로 기원전 수천 년경부터 이미 술이나 빵의 발효에 이용되어 온 것으로 알려져 있다. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 자낭균류에 속하는 대표적인 효모로 빵효모(baker’s yeast)나 맥주효모(brewery yeast)를 비롯하여 양조에 사용하는 효모는 대부분 이 종의 근연이라 할 수 있다. 이 효모는 당으로부터 알코올과 탄산가스를 생성시키는 것뿐만 아니라 깊은 풍미를 나게 하는 중요한 역할을 하며 균주에 따라 생리활성이 다르기 때문에 균주마다 서로 다른 고유한 풍미를 낸다.
발효 균주에 의한 고유의 풍미가 가장 대표적으로 발현되는 것은 술과 빵이다. 발효주의 발효능과 발효에 따른 향미성분은 품질에 영향을 주는 요소로서 발효 효모에 의해서 대부분 결정된다. 우리나라는 삼한시대 이래 지역 고유의 술들을 빚기 시작하였으며, 그 지역 자연환경에 따라 양조용수 및 원료곡물의 차이 및 서로 다른 자연환경으로부터 수득된 효모의 차이로 지역 고유 특성을 지닌 술이 현재까지 전해 내려오고 있으며, 일본과 서양에서도 각 지역의 토종 효모에 의해 서로 다른 맛과 풍미를 지닌 그 지역을 대표하는 향토 술이 있다. 요즘 국내에서 대량으로 생산되는 발효주는 대부분 외국의 상업효모에 의존하고 있어 맛과 풍미에 있어 다양성이 부족하고 수입에 따른 경제적인 부담이 있다.
최근 제빵 기술에는 갓 구운 빵의 제공, 제빵공정의 효율화 등의 장점이 있는 냉동반죽의 비중이 높아지고 있다. 냉동반죽은 효모, 소맥분, 식염, 유지, 물 등의 빵의 원료들을 혼합해 성형한 후 -20 ℃ 전후에서 동결 보관되다가 필요에 따라 해동하여 최종발효를 행하고 소성한다. 반죽을 장기간 냉동 보관하는 경우 효모가 상해를 입어 해동해도 발효가 이루어지지 않아 빵을 제조할 수 없게 된다. 따라서 냉동 내성이 있는 효모를 사용하고 통상의 빵에 비하여 효모 첨가량을 2 내지 3배 정도로 늘리는 방법을 일반적으로 사용하고 있지만 이 경우 효모 증량에 의해 빵의 풍미가 좋지 않은 단점이 있다.
최근 우리나라에서는 생활수준 향상에 따라 소비자의 기호가 다양해지면서 보다 맛있는 빵을 먹고 싶다든지, 보다 향미가 좋은 술을 마시고 싶다는 등 소비자의 취향이 다변화되고 있을 뿐만 아니라 웰빙에 대한 관심이 높아지면서 각종 발효식품에 대한 관심도 증가하고 있다.
이와 같은 요망에 부응하기 위해서 새로운 효모의 개발에는 크게 2가지 방법이 있고, 그 중 하나는 유전자 공학적인 방법에 의한 새로운 균주의 개발이고, 다른 하나는 자연계로부터 새로운 효모를 분리하는 방법이 있다. 전자의 경우에는 이미 알려져 있는 효모를 이용하는 방법이지만, 후자의 경우에는 야생효모이기 때문에 우리가 예측할 수 없는 우수한 능력을 갖추고 있는 효모가 존재 할 수 있고 실제로 주류를 포함한 식품에 많이 이용되고 있다. 주류에 대한 일예로 한국등록특허 제1,284,263호는 키위 껍질에서 분리된 사카로미세스 세레비시아의 신균주를 이용해 포도주를 제조하는 방법에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1,199,544호, 제1,199,545호, 및 제1,166,489호는 전통누룩에서 분리된 사카로미세스 세레비시아의 신균주를 이용한 발효주에 대해 개시하고 있다. 또한 제빵용 효모에 대한 일예로 한국등록특허 제1,074,340호는 유기농 거봉에서 분리하고 유기농 거봉 함유 배지에서 배양한 사카로미세스 세레비시아의 신균주를 이용한 빵 반죽 및 빵의 제조방법에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1,410,244호는 유기농 귤에서 분리된 사카로미세스 세레비시아의 신균주를 함유하거나 신균주 및 신균주를 파쇄하여 얻은 세포벽 분획물을 함유하는 제빵용 반죽에 대해 개시하고 있다.
대부분의 선행특허는 상설한 선행특허들과 마찬가지로 식품 적용에 있어 한 가지의 활용성을 갖는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 신균주에 대해 개시하고 있다. 토종 신균주로서 여러 가지 특성을 나타내어 보다 다양한 식품에 동시에 활용이 가능한 균주에 대해 구체적으로 개시한 사례는 드물다. 즉, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 신균주로서 고알코올 발효능을 나타내면서 알코올 내성, 염분 내성 및 냉동 내성을 동시에 나타내어 발효주 및 제빵 등 두 가지 이상의 활용성이 있는 야생효모에 대해 구체적으로 개시한 사례는 많지 않다.
따라서 세계 몇몇 회사들이 독점적으로 공급하고 있는 상업효모 의존하지 않고 보다 다변화된 소비자의 기호를 충족시킬 수 있으면서 하나의 효모로 다양한 식품에 적용할 수 있어 경제성이 뛰어난 토종효모 개발이 요구되어진다.
한국등록특허 제1,284,263호 한국등록특허 제1,199,544호 한국등록특허 제1,199,545호 한국등록특허 제1,166,489호 한국등록특허 제1,074,340호
본 발명의 목적은 알코올 발효능력 우수하고, 고내알코올성으로 고알코올 함량에서도 발효가 가능하며, 염분 내성 및 냉동 내성이 있어 발효주뿐만 아니라 다양한 식품에 활용될 수 있는 신규한 발효용 효모 균주를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 연안해역의 해수로부터 분리 동정한 신균주 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 및 이의 고내알코올성, 염분 내성 및 냉동 내성을 이용하여 제조된 발효식품 및 빵 반죽을 제공한다.
본 발명의 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 균주는 자연계에서 분리된 새로운 효모 균주로 알코올 발효능력 우수하고, 고내알코올성으로 고알코올 함량에서도 발효가 가능하며, 염분 내성 및 냉동 내성이 있어 발효주를 포함한 다양한 발효식품 및 빵 반죽에 활용할 수 있다.
도 1은 S6-1 균주성장에 대한 배양액 초기 pH 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 S6-1 균주성장에 대한 배양액 초기 알코올(에탄올) 농도의 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 S6-1 균주성장에 대한 온도의 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 S6-1 균주성장에 대한 배양액 초기 NaCl 농도의 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 18S rRNA를 비교하여 S6-1 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 6도 고구마 품종(호박고구마 및 밤고구마)에 따른 1차 담금 및 2차 담금에 대한 S6-1 및 Y89-5-3 균주 각각의 발효경과 경향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 S6-1 및 라빠리장(La Parisienne) 균주를 각각 이용하여 30 ℃에서 2시간 동안 발효시킨 제빵용 생지를 촬영한 사진이다.
도 8은 S6-1 및 라빠리장(La Parisienne) 균주를 각각 이용하여 30 ℃에서 2시간 동안 발효시킨 제빵용 생지를 -20 ℃에서 7일 동안 냉동 보관한 후 30 ℃에서 2시간 동안 발효시켜 촬영한 사진이다.
도 9는 S6-1 균주를 이용한 식초 제조방법을 도시한 것이다.
본 발명은 해수로부터 분리한 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 내알코올성(alcohol tolerance), 내염성(salt tolerance) 또는 내냉동성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 10% 알코올 농도 미만에서 내알콜성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 10% NaCl 농도 미만에서 내염성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 45 ℃ 미만에서 -30 ℃ 온도까지 생육이 가능해 내냉동성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 20 내지 45 ℃ 미만에서 배양될 수 있다.
상기 균주의 생육 온도 범위는 30 ℃, 37 ℃, 40 ℃, 45 ℃에서 각각 균성장에 대한 온도의 영향 실험결과 30 ℃와 37 ℃는 성장저해를 받지 않았으나, 40 ℃에서는 65%의 성장저해를 보였고, 45 ℃에서는 전혀 성장하지 못하는 것으로 나타난 점과 균주를 이용한 제빵용 생지 발효실험에서 -20 ℃에 보관 후 다시 4 ℃ 또는 30 ℃에서 발효시켰을 때 발효능을 나타낸 것을 근거로 하였다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 5.0 내지 2.0 미만의 pH에서 배양될 수 있다. 상기 균주의 배양 적합 pH 범위는 pH 4.6, 4.0, 3.2, 2.0에서 각각 균성장에 대한 pH의 영향 실험결과 상기 pH 범위에서 생장이 가능하였고, pH 2.0에서는 증식이 일어나지 않았다 것을 근거로 하였다.
본 발명은 또한 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)의 고내알콜성, 염분 내성 또는 냉동 내성을 이용하여 제조되는 발효식품에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 발효식품은 발효주, 빵, 해초 발효식품, 해산물 발효식품, 식초 및 유제품으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 발효식품은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)의 고알코올 발효능 및 고내알콜성을 이용하여 제조된 발효주, 특히 고구마 소주일 수 있고, 냉동 내성 및 염분 내성을 이용하여 제조된 빵 반죽 또는 냉동 반죽으로부터 만들어진 빵일 수 있으며, 염분 내성을 이용하여 제조된 해초 또는 해산물의 발효식품일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 발효주는 소주일 수 있고 보다 더 구체적으로 고구마 소주일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 발효주는 탁주일 수 있고 보다 구체적으로 막걸리일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 쌀 막걸리일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 식초는 사과식초 사과, 사과매실식초, 또는 사과매실허브식초일 수 있다. 구체적으로 사과식초는 사과를 착즙한 사과과즙이 20 내지 30 브릭스가 되게, 보다 구체적으로 25 브릭스가 되게 보당한 후 S6-1 균주 종균을 접종하여 23 내지 27 ℃, 보다 구체적으로 25 ℃에서 15 내지 25일간, 보다 구체적으로 20일간 배양하여 12 내지 17%, 보다 구체적으로 14 내지 15% 알코올 농도의 사과와인을 제조한 다음 여기에 물을 첨가해 알코올의 농도가 6.0 내지 7.5%, 보다 구체적으로 6.5 내지 7.0이 되게 희석한 다음 3 내지 7일, 보다 구체적으로 5일 동안 배양한 종초를 접종하여 50 내지 70일간, 보다 구체적으로 60일간 배양하여 제조될 수 있다. 또한 사과매실 식초는 상기 제조한 사과와인에 매실 및 설탕을 사과와인 : 매실 : 설탕을 1 : 0.1 내지 0.5 : 0.1 내지 1.5의 비율, 보다 구체적으로 사과와인 : 매실 : 설탕을 1 : 0.3 : 0.3의 비율로 혼합하여 80 내지 100일간 보다 구체적으로 90일간 추출하여 제조될 수 있다. 한편 사과매실허브 식초는 상설한 제조방법으로 제조한 사과매실식초에 로즈마리, 페퍼민트, 바질, 레몬그라스, 오레가노, 케모마일, 및 레몬밤으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생허브를 첨가하여 15 내지 45일 보다 구체적으로 30일간 추출하여 제조될 수 있다. 상기 생허브의 종류는 상설한 범주에 한정되는 것은 아니며 식초의 향과 기능성을 향상시키는 범위 내에서 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)의 고내알콜성, 염분 내성 또는 냉동 내성을 이용하여 발효식품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (a) 전분질 원료, 누룩 및 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 또는 이의 배양액에 물을 첨가하여 밑술을 제조하는 1차 담금단계 및 (b) 상기 (a)단계에서 수득한 밑술에 증자한 전분질 원료 및 물을 추가로 첨가하여 발효시키는 2차 담금단계를 포함하는 발효주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)에서 수득한 발효액을 여과한 다음 앙금을 분리하는 단계를 추가로 포함하거나 단계 (b)에서 수득한 발효액을 증류한 후 여과하여 앙금을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 발효주의 제조방법은 고구마 발효주의 제조방법일 수 있으며, 이 경우 상기 단계 (a)에서 전분질 원료는 곡류일 수 있고 보다 구체적으로 쌀일 수 있으며, 단계 (b)에서 증자한 전분질 원료는 고구마이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 발효주의 제조방법이 고구마 소주의 제조방법일 경우 단계 (a)에서 쌀국이 전분질 원료 및 누룩 대신 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 염분 내성 및 냉동 내성이 있는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)을 제빵용 효모로 이용하여 제조된 빵 반죽에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 빵 반죽은 냉동 반죽일 수 있다.
이하, 하기 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 이는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것이지, 본 발명의 권리범위를 이로 한정하려는 의도는 아니다.
[실시예]
1. 해양효모 분리
우리나라의 서해, 남해 동해의 전 연안 해역 50 곳으로부터 미생물의 번식이 왕성한 6월에서 8월에 걸쳐서 해수를 채취하였다. 채취한 해수는 0.45 ul의 막여과기(membrane filter)를 이용하여 여과한 다음, 막여과기를 1.5 ml의 동일해수로 세척하였다. 분리용 YPD 한천(agarose)배지 (2% 글루코스(glucose), 2% 펩톤(peptone), 1% 효모추출물(Yeast extract), 3% NaCl, 100 ng/ul 클로람페니콜(chroamphenicol), 2% 한천(agar))에 여과한 해수를 100 ul씩 도말한 후 가스팩혐기성 용기(Jar)에 넣고, 25 ℃에서 5 ~ 7일간 배양하였다. 효모와 유사한 집락을 채취하여 분리용 평판배지에 도말하고 25 ℃에서 배양하여 형성된 단일 집락을 확보하였다.
2. 소규모 발효 시험(Small scale fermentation test)
분리된 단일 집락을 분리용 YPD액체배지(2% 글루코스(glucose), 2% 펩톤(peptone), 1% 효모추출물(Yeast extract), pH 3.2, 5% 에탄올(ethanol) 5 ml에 2일간 정치배양한 다음 백국균으로 제조한 백국(Koji)분말 3 g에 물 3 ml를 넣고, 분리하여 정치배양한 균주 200 ul를 넣어 30 ℃에서 배양하였다. 매일 매일 증발된 CO2의 무게를 재서 발효능력을 측정하여, 총 276 집락에서 발효능력이 우수한 14 균주를 1차적으로 선별하였다.
3. 알코올 생성능력 시험
YPD/30% 글루코스(glucose) 배지(글루코스 30 g) 150 ml에 선별한 균주 배양액 200 ul (1.0 x 106 cells/ml)을 접종하여 30 ℃에서 배양하며 매일매일 증발된 CO2의 무게를 재서 발효능력을 측정하였다. CO2의 무게가 줄어들지 않을 때까지 지속적으로 배양하고, 발효가 정지하면 100 ml의 배양액을 시험증류하고, 비중계로 비중을 측정하여 알코올 농도를 구했다. 누룩으로부터 분리한 89Y-5-3 균주를 대조군으로 하여 상기와 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과, 상기 2. 소규모 발효 시험(Small scale fermentation test)으로 선별된 14 균주 중 알코올 생성능력이 10% 이상이 되는 균주를 2차로 선별하였다. 선별된 균주는 총 4균주로 삼척에서 1주(SC-2), 신안에서 3주(S5, S6-1, S7)가 선별되었다. 선별된 4 균주의 알코올 생성능력은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 S5가 12.5%, S6-1가 15.3%, S7이 12%, SC2는 11.5%의 알코올을 각각 생성하여 14.3%의 알코올을 생성한 대조군인 누룩으로부터 분리한 89Y-5-3균주보다도 S6-1균주는 1%나 높은 알코올을 생성하는 것으로 나타났다. 따라서 상기 선별된 4 균주로부터 S6-1 균주를 최종적으로 선발하였다.
Figure 112015037307044-pat00001
[실험예]
1. S6-1 균주의 생리적 특성 분석
1) 균성장에 대한 배양액의 초기 pH의 영향
균주를 YPD배지 5 ml에 접종하여 30 ℃에서 2일간 정치배양한 후 알칼리성 메틸렌블루(alkaline methylene blue)용액으로 염색해 생균수를 측정하여 1.0 x 106 cells/ml이 되게 균주를 조정하였다. pH 2.3, 3.2, 4.0, 4.6의 YPD/0.1M 구연산나트륨(sodium citrate)배지 8 ml에 조정한 균주 200 ul를 접종하여 30 ℃에서 배양하며 매 2시간 간격으로 20시간 동안 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 초기 pH가 4.0보나 낮아지면 증식이 느려지지만 시간이 경과하면 적응이 되어 증식이 회복되는 경향을 보였고, pH 2.0에서는 증식이 일어나지 않았다. 배양액의 초기 pH는 고구마 소주를 제조할 때 2차담금시의 술덧의 pH가 4.0 전후이기 때문에 S6-1균주는 고구마소주의 제조에 이용하는 데 적합할 것으로 사료된다.
2) 균성장에 대한 배양액의 초기 알코올 농도의 영향
균주를 YPD배지 5 ml에 접종하여 30 ℃에서 2일간 정치배양한 후 알칼리성 메틸렌블루(alkaline methylene blue)용액으로 염색해 생균수를 측정하여 1.0 x 106 cells/ml이 되게 균주를 조정하였다. YPD(pH 4.0)/에탄올(ethanol)배지(0%, 5%, 7%, 10%) 8 ml에 조정한 균주 200 ul를 접종하여 30 ℃에서 배양하며 매 2시간 간격으로 20시간 동안 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 증식속도는 알코올 농도에 의존하였고, 알코올 농도 5%에서는 8시간 후에 서서히 적응이 일어나 16시간부터는 증식이 회복되어 20시간이 경과하면 완전히 성장이 회복되는 것으로 나타났다. 알코올 농도 7%에서는 14시간까지는 확실하게 저해가 일어났지만 그 이후에는 서서히 증식이 회복되어지는 것으로 나타났다. 그러나 10%의 알코올 농도에서는 20시간이 경과할 때까지 증식이 일어나지 않았다. 따라서 고구마 소주의 2차 담금 술덧의 초기 알코올 농도는 약 4 ~ 6% 정도인 것으로 알려져 있기 때문에 S6-1균주는 고구마소주 제조용 효모로 적합할 것으로 사료된다.
3) 균성장에 대한 배양액의 초기 NaCl농도의 영향
균주를 YPD배지 5 ml에 접종하여 30 ℃에서 2일간 정치배양한 후 알칼리성 메틸렌블루(alkaline methylene blue)용액으로 염색해 생균수를 측정하여 1.0 x 106 cells/ml이 되게 균주를 조정하였다. YPD(pH 4.0)/NaCl배지(0%, 3%, 5%, 7%, 10%) 8 ml에 조정한 균주 200 ul를 접종하여 30 ℃에서 배양하며 매 2시간 간격으로 20시간 동안 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 증식속도는 NaCl 농도에 의존하였고, NaCl 농도가 3% 이상에서는 성장저해가 일어났으나, 7%까지는 시간이 경과함에 따라서 농도 의존적으로 성장이 회복되는 것으로 나타났다. 그러나 NaCl농도 10%에서는 거의 증식이 일어나지 않았다. 따라서 S6-1균주는 7% NaCl 농도까지는 내염성을 나타내고 있기 때문에 제빵용 효모 및 해조류를 이용한 발효식품제조용 효모로 적합할 것으로 사료된다.
4) 균성장에 대한 온도의 영향
균주를 YPD배지 5 ml에 접종하여 30 ℃에서 2일간 정치배양한 후 알칼리성 메틸렌블루(alkaline methylene blue)용액으로 염색해 생균수를 측정하여 1.0 x 106 cells/ml이 되게 균주를 조정하였다. YPD(pH 4.0) 액체배지에 조정한 균주 200 ul를 접종하고 30 ℃, 37 ℃, 40 ℃, 45 ℃의 각각의 배양기에서 배양하며 매 2시간 간격으로 20시간 동안 660 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 30 ℃와 37 ℃는 성장저해를 받지 않았으나, 40 ℃에서는 65%의 성장저해를 보였고, 45 ℃에서는 전혀 성장하지 못하는 것으로 나타났다.
5) 기질 자화성 시험(assimilation test)
탄소원에 대한 자화성을 알아보기 위하여 균주를 최소배지에서 배양하여 API 20C AUX V4.0 키트(kit)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 S6-1 균주는 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 알파메틸디글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), 말토오스(maltose), 사카로오스(saccharose), 트레할로오스(trehalose) 및 라피노오스(raffinose)의 탄소원에 대해서 자화성을 나타냈다.
Figure 112015037307044-pat00002
6) S6-1 균주의 동정
S6-1 균주의 18 rRNA 염기서열을 결정하여, 유전자 은행 데이터 상동성 검색(Gene Bank Data homology search) 결과 사카로미세스 세레비시아( Saccharomyces cereviziae) Z75578에 대하여 99%의 상동성을 나타냈다. 블라스트(BLAST) 검색결과로 얻어진 염기배열을 바탕으로 작성한 도 5에 나타낸 계통수에 의해서 S6-1 균주는 사카로미세스 (Saccharomyces)속에 속하는 계통군에 포함되며 사카로미세스 세레비시아(S. cereviziae) Z75578과 동일한 계통가지를 형성하고 있고 부트스트랩(bootstrap)값은 52%로 나타났다.
2. S6-1 균주를 이용한 고구마소주제조 시험
1) 밑술(Seed mash) 시험
백국 240 g에 물 240 ml을 첨가하고 균주 전배양액 1 ml를 접종하여 30 ℃에서 배양한다. 매일매일 증발된 CO2의 무게를 재서 발효능력을 측정한다. 배양 3일, 4일, 6일 째에 배양액을 거즈로 여과하고, 알칼리성 메틸렌블루(alkaline methylene blue)용액으로 염색하여 생균수와 사균수를 측정한다. 배양 3일, 4일, 6일째에 거즈로 여과한 배양액을 시험 증류하여 알코올 농도를 측정하였다. 누룩으로 분리한 Y89-5-3주를 대조군으로 사용하여 동일한 방법으로 시험하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 누룩으로 분리한 Y89-5-3주는 담금 후 3일에 생균수가 85.2%에서 6일에는 38%로 급격하게 떨어졌지만, S6-1주는 3일째에 95.2%에서 6일째에도 88%의 생존율을 나타냈고, 알코올 생성량도 Y89-5-3주가 15.2%였지만 S6-1주는 17.6%의 높은 알코올 생성능을 보였다. 따라서 S6-1주는 알코올 내성이 강한 것으로 나타났고 고구마소주의 2차 담금을 위한 주모로 적합할 것으로 사료된다.
Figure 112015037307044-pat00003
2) 술덧의 제조 및 분석
효모의 전배양은 YPD(효모추출물(yeast extract) 1%, 폴리펩텐(polypeptone) 2% 및 글루코스(glucose 2%) 액체배지 5 ml에 사면배지로부터 효모를 백금이로 식균하여 30 ℃에서 48시간 정치배양하였다. 고구마 소주의 1차 담금은 2 L용 유리병에 전배양액 2 ml, 쌀국 240 g 및 물 240 ml를 첨가하여 30 ℃에서 5일간 배양하였다. 1차 담금 시료에 1시간 동안 증자하여 분쇄한 고구마 1 kg과 물 560 ml를 넣어 2차 발효하였다. 고구마는 호박고구마와 밤고구마 각각에 대하여 시행하였다. 발효온도는 항온배양기에서 30 ℃로 일정하게 유지하고, 발효경과는 발생하는 탄산가스 중량을 술덧의 감소중량으로부터 산출하는 것으로 구했다. 누룩으로 분리한 Y89-5-3주를 대조군으로 사용하여 동일한 방법으로 분석하여 결과를 산출하였다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 1차 담금의 발효경과에서 2차 담금의 발효경과의 경향이 S6-1주나 Y89-5-3주 모두 고구마의 종류에 따라 비슷한 양상을 나타내는 것을 알 수 있었다. 그러나 S6-1주가 호박고구마나 밤고구마 모두의 경우에서 2차 담금의 발효상승이 Y89-5-3보다 약간 빠르게 진행되는 것으로 나타났다. 따라서 S6-1주의 경우에는 2차 담금이 Y89-5-3주의 경우 보다 안정적으로 진행될 수 있을 것으로 사료된다.
3) 술덧의 분석
발효 종료 후의 술덧의 알코올 농도는 술덧을 거즈로 여과하여 얻어진 여과액 200 ml을 이용하여 일본국세청소정분석법에 따라 수행하였다(국세청소정분석법주해, 1995).
술덧의 전당은 곱게 갈은 술덧 10 g을 200 ml용 삼각플라스크에 넣고, 증류수로 100 ml로 맞춘 후 25% HCl 10 ml을 넣어 잘 혼합하고 약 2.5시간 중탕으로 가열하였다. 가열 후 냉각하여 10% 수산화나트륨 용액으로 약산성 (pH 5~6)이 될 때까지 중화하여 증류수로 200 ml가 되도록 맞추고 No.2 여과지로 여과하여 얻어진 여과액의 환원당량을 일본국세청소정분석법에 따라 Somogyi-Nelson법으로 측정하여 구했다(Somogyi, 1952, Nelson, 1944).
환원당은 거즈로 여과한 술덧을 No.2 여과지로 여과하여 얻어진 여과액 10 ml을 이용하여 술덧의 환원당량을 구했다.
술덧의 산도는 거즈로 여과한 술덧을 No.2 여과지로 여과하여 얻어진 여과액 10 ml에 혼합지시약 2 ~ 3방울을 떨어뜨리고, 0.1 N NaOH 용액으로 진한 녹색이 맑은 스카이 블루가 될 때까지 적정하여 소요된 량에 0.1 N NaOH 용액의 역가(factor)를 곱해서 산도를 구했다.
술덧의 휘발산도는 시험 중류한 검체 50 ml을 200 ml 삼각플라스크에 넣고, 페놀프탈레인 지시약 4 ~ 5방울을 떨어뜨리고, 0.01 N NaOH용액으로 적정하여 담적색이 수 초간 나타날 때까지 적정하여 그 소요된 량에 0.01 N NaOH 용액의 역가(factor)와 0.2를 곱해서 휘발산도를 구했다.
그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 발효종료 후의 술덧의 조성에서 잔존 총 당량의 수치는 0.94% ~ 2.24% 정도였고, 환원당량은 0.31% ~ 0.4%를 나타냈다. 산도는 2.3 ~ 4.0 정도였고, 휘발산도는 0.6 ~ 1.1 정도로 비교적 낮았다. 이와 같이 발효후의 술덧 조성의 결과로 볼 때 4종류의 고구마 술덧은 잡균이 오염되지 않고 발효가 비교적 순조롭게 잘 이루어 졌음을 확인 할 수 있었다. 또한 발효 술덧의 알코올농도는 13 ~ 14%로 나타났다.
Figure 112015037307044-pat00004
4) 증류
2 L용 유리제품의 증류기에 술덧 1.5 kg을 넣고, 증기를 술덧에 직접 집어넣는 방법으로 증류한다. 증기가 들어가기 시작하여 약 40분간이 경과하면 알코올이 나오기 시작하고, 그 후 약 1.5시간 정도 후에 알코올 농도가 38%가 되면 증류를 종료한다.
5) 고구마 소주의 모노테르펜 알코올(Monoterpene alcohol, MTA)분석
고구마 소주의 원료인 고구마의 품종은 고구마 소주의 풍미에 가장 큰 영향을 미친다. Oota에 의하면 고구마 소주의 특징적인 향기는 리날룰(linalool), 알파테르피네올(α-Terpineol), 게라니올(Geraniol), 시트로넬롤(Citronellol), 네롤(Nerol)이라는 모노테르펜 알코올(Monoterpene alcohol)이 기여한다고 보고하고 있다(Oota, 1991). 따라서 본 연구에서 선택한 2종류의 고구마 품종으로 제조한 고구마 소주의 향기성분의 특성을 알아보기 위하여 발효가 끝나고 증류한 후 얻어진 원주를 5 ㎛의 여과기로 여과한 후 알코올 농도를 25%가 되게 증류수로 희석하여 고구마 소주 속의 향기성분의 농도를 GC/MS를 이용하여 측정하였다. 보다 구체적으로 고구마소주에 포함되어 있는 MTA의 분석은 Takamine 등이 기술한 방법에 따라 실행하였다(Tkamine et al., 2010). 시료 10 ml을 바이알(vial)에 넣고 폴리디메틸실록산 레진(Polydimethylsiloxane Resin)으로 코팅한 교반막대 (Twister GERSTEL（주))로 실온에서 1시간 교반(1,500 rpm)하였다. 교반막대를 꺼내어 증류수로 세척한 후에 여분의 물은 닦아냈다. 이 교반막대를 가열탈착장치(Thermo Desorption System, TDS)(GERSTEL TDS3; GERSTEL（주))에 설치하여 GC-MS로 분석하였다. GC-MS 분석조건은 표 5에 나타냈다. 성분의 동정은 Agilent ChemStation softwear와 NIST05a Mass Spectral Library 및 AromaOffice（Nishikawa계측（주))으로 산출한 보존지수(retention index (R.I))로부터 실행하였다. 정량에 사용한 이온은 시트로넬롤(citronellol), 네롤(nerol), 및 게라니올(geraniol)이 m/z=69, 리날룰(linalool)이 m/z=93, 알파테르피네올(α-terpineol)이 m/z=59를 이용하여 각각의 정량용 이온의 면적으로부터 절대검량선법을 이용하여 정량하였다. 한편, 표본물질은 분석하려는 시료와 같은 알코올 농도용액 및 완충액에 용해하여 검량선을 구하였다.
Figure 112015037307044-pat00005
그 결과인 각각의 고구마소주 속에 포함되어 있는 향기성분의 농도를 하기 표 6에 나타내었다.
Figure 112015037307044-pat00006
6) 관능평가
원광대학교의 생명과학부 학생 20명을 패널로 선정하여 맛과 향의 나쁘면 1점 아주 좋으면 5점으로 평가하도록 하여 실시하여 S6-1주와 Y89-5-3주로 각각 제조한 밤고구마 소주와 호박고구마 소주의 맛과 향에 대한 기호도를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 고구마소주에 익숙하지 않은 우리나라 학생을 대상으로 하였기 때문에 그 편차가 컸지만, 대체적으로 고구마 품종과 효모의 종류에 크게 민감함은 나타나지 않는 것으로 나타났다. 호박이나 밤고구마 모두에서 S6-1주나 Y89-5-3주의 유의한 차이는 없는 것으로 나타났으며, 맛 면에서는 Y89-5-3 균주를 이용한 경우에 비하여 본 발명에 따른 S6-1 균주 적용 시 더 맛이 좋은 것으로 나타났다. 다만 GC-MS를 이용하여 추가적인 향미성분의 분석이 이루어져야 할 것이고, 최소 6개월 정도의 숙성기간을 거치고 관능평가를 하는 것이 필요할 것으로 보인다.
Figure 112015037307044-pat00007
3. S6-1 균주를 이용한 쌀 막걸리 실험
발효된 탁주의 알코올 농도를 분석하기 위하여 다음과 같이 주모제조, 1차 담금 및 2차 담금 과정을 통해 쌀 막걸리를 제조하였다.
① 주모제조
쌀 500 g을 씻어서 1시간 동안 물에 담가둔 후, 1시간 동안 물을 빼고, 1시간 동안 증자하여 고두밥을 만들고 개량누룩 200 g을 200 ml의 물에 녹여서 고두밥과 물 520 ml를 넣어 잘 섞어주었다. 이 때 잡균의 번식을 막기 위하여 70% 구연산 10 ml를 첨가하였다. 이 혼합액에 S6-1 효모배양액 5 ml을 넣어 잘 섞어주고 25 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 효모의 번식을 왕성하게하기 위하여 하루에 수차례씩 잘 저어주었다.
② 1차 담금
쌀 3.5 kg을 잘 씻어서 1시간 동안 물에 담가둔 후, 1시간 동안 물을 빼고, 1시간 동안 증자하여 고두밥을 만들어 식힌 후, 물 4.2 L와 함께 잘 섞어주고 주모를 섞어 25 ℃에서 3일 동안 배양하였다.
③ 2차 담금
쌀 5.5 kg을 잘 씻어서 1시간 동안 물에 담가둔 후, 1시간 동안 물을 빼고, 1시간 동안 증자하여 고두밥을 만들어 식힌 후, 물 7.2 L와 함께 잘 섞어 주고 1차 담금한 것을 섞어 25 ℃에서 7일 동안 배양하였다.
상기 제조한 쌀 막걸리의 알코올 농도를 측정한 결과, 18.5%로 고농도의 알코올 농도를 나타냈으며 이는 일반적으로 막걸리가 6 ~ 13%의 낮은 알코올 농도를 나타내는 것에 비해 매우 높은 것이므로 S6-1 균주를 이용하여 제조한 탁주는 고농도의 알코올 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.
4. S6-1 균주를 이용한 사과매실허브식초 제조실험
1) S6-1 균주를 이용한 사과매실허브식초 제조
사과를 세척하여 4조각으로 자르고, 사과 씨를 제거하고 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 착즙기를 이용하여 착즙하였다(회수율 : 65%, 사과 100 kg 에서 약 65 kg). 45 kg의 사과즙의 당도를 25 브릭스(Brix)까지 되게 설탕으로 보당한 다음 5일 동안 정치 배양하여 준비한 S6-1균주 종균 200 ml를 사과즙에 접종하였다. 25 ℃에서 20일간 배양하여 사과와인을 제조한(알코올농도 14~15%) 후 사과와인을 알코올 농도 6.5~7%가 되게 물로 희석하였다. 5일 동안 배양한 종초를 사과와인 45 L당 200 ml 접종하여 약 60일간 정치 배양하여 초산 농도 약 5.5~6%의 사과식초를 제조하였다. 추가로 사과와인 : 매실 : 설탕을 1 : 0.3 : 0.3의 비율로 넣어서 90일간 추출하여 기능성이 향상된 사과 매실식초를 제조하였다. 또한 사과매실식초에 허브의 향과 기능성을 추가하기 위하여 생허브(로즈마리, 페퍼민트, 바질, 레몬그라스, 오레가노, 케모마일, 레몬밤)를 재료의 특성에 맞춰 적당량 투입하여 약 30일간 추출하여 사과매실허브식초(산도 약 5.5%)를 제조하였다.
2) 관능평가
원광대학교의 생명과학부 학생 20명을 패널로 선정하여 맛과 향의 나쁘면 1점 아주 좋으면 5점으로 평가하도록 하여 실시하여 상기에서 제조한 사과식초, 사과매실식초, 사과매실허브식초, 및 시판 중이 매실식초(C사: 100% 우리매실·사과로 만든 정통 매실식초)의 맛과 향에 대한 기호도를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 S6-1 균주를 이용하여 제조한 식초들(사과식초, 사과매실식초, 및 사과매실허브식초)은 향기 및 맛에서 모두 3.7 이상의 평가를 받아 3.4 미만의 평가를 받은 시판 중인 C사의 매실식초 보다 기호성이 뛰어난 것으로 확인되었다. 특히 S6-1 균주를 이용하여 제조한 사과매실식초 및 사과매실허브식초는 4 이상의 높은 평가를 받아 월등한 기호성을 갖는 것으로 확인되었다.
Figure 112015037307044-pat00008
5. S6-1 균주를 이용한 제빵용 생지의 발효시험
S6-1 균주가 제빵용 생지를 발효시키는 능력이 있는지를 알아보기 위해서 시중에서 빵효모로 사용되고 있는 라빠리장(La Parisienne)효모를 대조군으로 하여 생지발효시험을 실시하였다. 구체적으로 효모의 전배양은 YPD(효모추출물(yeast extract) 1%, 폴리펩톤(polypeptone) 2% 및 글루코스(glucose) 2%) 액체배지 5 ml에 사면배지로부터 효모를 백금이로 식균하여 30 ℃, 48시간 정치배양한 다음 YPD배지 500 ml에 전배양을 접종하여 5일간 30 ℃에서 정치배양하였다. 배양액을 1000 rpm에서 원심분리하여 균을 침전시켜 모으고, 증류수로 2회 세척한 후, 물기를 완전히 제거하여 제빵용 효모로 사용했다. 제빵용 강력분 100 g에 효모 2 g, NaCl 1.5 g, 글루코스(glucose) 5 g, 증류수 62 ml를 첨가하여 잘 반죽하여 시험용 생지를 만든다. 50 g 씩 나누어서 성형을 하고, 각각 4 ℃, 30 ℃에서 2시간동안 발효시키고, 내부에 생성된 CO2를 제거한 후, 재 성형하여 30 ℃에서 추가로 1시간 동안 발효시켰다.
냉동에 대한 내성을 측정하기 위하여 50 g 씩 나누어서 성형한 후, -20 ℃에서 1주일간 보관하고, 실온에서 녹인 뒤, 각각 4 ℃, 30 ℃에서 2시간동안 발효시키고, 내부에 생성된 CO2를 제거한 후, 재 성형하여 30 ℃에서 추가로 1시간 동안 발효시켰다. 4 ℃와 30 ℃에서 발효경과를 빵의 크기를 비교 분석하여 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 S6-1주도 30 ℃에서 라빠리장(La Parisienne)효모와 유사한 정도로 발효시키는 것을 알 수 있었다. 또한 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 S6-1주의 냉동내성을 알아보기 위하여 30 ℃에서 2시간동안 발효시킨 생지를 -20 ℃에서 7일간 보관한 후, 30 ℃에서 발효시킨 결과 라빠리장(La Parisienne)효모와 동일한 정도로 발효시키는 것을 확인할 수 있었다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93225P 20150414

Claims (14)

  1. 해수로부터 분리한 알코올 고생산능, 내알코올성(alcohol tolerance), 내염성(salt tolerance) 및 내냉동성을 가지는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 10% 알코올 농도 미만에서 내알코올성을 갖는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 10% NaCl 농도 미만에서 내염성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 -30 ℃ 온도까지 내냉동성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 20 내지 45 ℃ 미만에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)는 2.0 내지 5.0의 pH에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P).
  8. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)의 알코올 고생산능, 고내알콜성, 염분 내성 또는 냉동 내성을 이용하여 제조되는 발효식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 발효식품은 발효주, 빵, 해초 발효식품, 해산물 발효식품, 식초 및 유제품으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발효식품.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 발효주는 고구마소주인 것을 특징으로 하는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)을 이용하여 제조된 발효식품.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 발효주는 탁주인 것을 특징으로 하는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)을 이용하여 제조된 발효식품.
  12. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)의 알코올 고생산능, 고내알콜성, 염분 내성 또는 냉동 내성을 이용하여 발효식품을 제조하는 방법.
  13. (a) 전분질 원료, 누룩 및 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P) 또는 이의 배양액에 물을 첨가하여 밑술을 제조하는 1차 담금단계 및
    (b) 상기 (a)단계에서 수득한 밑술에 증자한 전분질 원료 및 물을 추가로 첨가하여 발효시키는 2차 담금단계를 포함하는 발효주의 제조방법.
  14. 염분 내성 및 냉동 내성이 있는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) S6-1 (KACC93225P)을 제빵용 효모로 이용하여 제조된 빵 반죽.
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