KR102644443B1 - 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모 - Google Patents

순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모 Download PDF

Info

Publication number
KR102644443B1
KR102644443B1 KR1020230093815A KR20230093815A KR102644443B1 KR 102644443 B1 KR102644443 B1 KR 102644443B1 KR 1020230093815 A KR1020230093815 A KR 1020230093815A KR 20230093815 A KR20230093815 A KR 20230093815A KR 102644443 B1 KR102644443 B1 KR 102644443B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
yeast
fermentation
strain
korean wheat
culture
Prior art date
Application number
KR1020230093815A
Other languages
English (en)
Inventor
심규광
강동오
Original Assignee
우석대학교 산학협력단
강동오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 우석대학교 산학협력단, 강동오 filed Critical 우석대학교 산학협력단
Priority to KR1020230093815A priority Critical patent/KR102644443B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102644443B1 publication Critical patent/KR102644443B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)

Abstract

본 발명은 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 국내산 호밀과 우리밀에서 유래하고 천연발효종의 배양과정에서 얻어진 균주로서, 분리 과정에서 증식력이 높은 큰 Colony에서 분리되고, Cellulose를 분해할 수 있고, 알콜발효력이 강력하며 우리밀가루 반죽의 부풀림 양호하여 발효 시간을 단축할 수 있는 신규 우량 효모 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 선발된 신규 효모 균주는 증식속도가 빠르며, 이취가 나지 않으며 강한 발효취를 보이는 균주로서 우리밀 발효과정에서 부풀림이 빠르게 진행되고, 액체 배양에서 소용량인 경우 진탕배양, 중용량인 경우 폭기 배양으로 증식하더라도 우리밀 반죽의 발효에 발효력이 우수한 상태를 보이므로 선발된 효모의 액체 배양기법으로 제조한 배양액은‘천연발효종’제조에 효모의 순도가 100%이므로 잡균의 유입이 전혀 없으므로 호기적인 배양과정에서 이취는 전혀 발생되지 않으며, 배양액의 관리 일 수가 줄어들고, 발효력이 강하여 우리밀의 발효 반죽 관리 일 수를 단축할 수 있다. 또한, 본 방법에 의하여 선발된 효모 균주는 기존 관행 방법에 비하여 발효력이 강력하여 우리밀 반죽과정에서 아주 빠른 시간에 발효반죽의 부풀리는 효과가 뚜렷하므로 제품생산 단계에서 별도의 상업용 건조 이스트(dry yeast)을 전혀 첨가하지 않고도 제빵의 제조가 가능할 정도의 잇점이 있다.

Description

순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모{Superior yeast well adapted to Korean wheat purely separated and identified}
본 발명은 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 국내산 호밀과 우리밀에서 유래하고 천연발효종의 배양과정에서 얻어진 균주로서, 분리 과정에서 증식력이 높은 큰 Colony에서 분리되고, Cellulose를 분해할 수 있고, 알콜발효력이 강력하며 우리밀가루 반죽의 부풀림 양호하여 발효 시간을 단축할 수 있는 신규 우량 효모 및 그의 용도에 관한 것이다.
우리밀(Korean wheat)에는 복합다당류, 단백질이 다량 함유되어 있고 식이섬유가 다량으로 함유하며, 비타민 B1이 많으며, 글루텐이 많아 가공에 용이한 장점이 있다. 우리밀의 소비촉진에 기여할 수 있는 제과.제빵을 위한 주재료로 사용하고여기에 사용하는 균주는 효모 및 유산균류 등을 사용하게 된다.
효모와 유산균류의 주요한 세포호흡 반응기작에서 탄수화물의 기본당류(포도당; C6H12O6)와 O2(산소)의 반응으로 CO2(이산화탄소) H2O(물), ATP(에너지)를 생성시키며, 효모에서 분비된 Zymase 효소에 의하여 알콜이 생성되고, 유산균에 의하여 젖산 등과 다양한 유기산이 생성되는데, 균주에 따라 생리활성이 달라 고유한 풍미를 내게 된다.
제빵의 핵심 원재료인 효모는 세계 몇몇 회사에서 독점적으로 공급하는 상업적인 건조효모와 생효모를 많이 사용하고 있다. 하지만 자체적으로 가업을 이어오는 전통기법의‘천연발효종’기법을 계승 발전시킬 필요가 있다.
Sourdough는 상업적인 효모로 부풀린 빵에서 느낄 수 없는 특유의 풍미를 낼 수 있다. Sourdough라는 명칭에서도 알 수 있듯이 이는 신맛이 나는 빵 반죽을 일컫는데, 일반적인 빵은 효모만이 반죽의 발효에 기여하는 반면에 sourdough 빵은 효모 이외에 lactic acid bacteria(유산균)도 발효에 기여하기 때문이다. 대체로 sourdough 빵의 발효에 이용되는 유산균은 대체로 Lactobacillus 속에 속한다.
상업용 효모를 이용하여 부풀리는 일반 빵의 경우 전체 빵 중량의 1% 내외의 효모를 첨가하는 것과 비교하였을 때 전통적인 sourdough 제조의 경우 빵 전체 중량의 25% 내외의 매우 많은 양의 스타터(starter)가 필요하다. Starter의 양 뿐만 아니라 제조에 걸리는 시간도 산업적인 적용에 어려움을 끼치는 요인 중 하나이다.
물과 밀가루 등의 원재료에서부터 Starter의 제조에 걸리는 시간은 일반적으로 3일 이상 소요되며, starter를 이용하여 sourdough를 만드는 단계에서도 하루 정도의 시간이 소요되므로 발효에서 완제품 생산까지 3시간 내외로 시간이 소요되는 일반 빵과 비교하였을 때 매우 오랜 시간이 걸리며, sourdough에 이용되는 전통적인 starter는 배양 온도, 습도 등의 영향을 받아 균일한 품질을 유지하기 쉽지 않다.
천연발효종(사워도우 스타터; sourdough starter)을 사워도우(sourdough)로의 발효는 밀가루, 물 및 호밀 가루를 섞어서 그 안에 내재된 미생물들을 활성화하여 사워도우 스타터(sourdough starter)를 만들고, 그 일부를 반죽에 사용하고 나머지는 다음 반죽 시 사용을 위해 보관해두는 과정을 반복하는 방법이다.
이러한 사워도우 스타터를 이용하여 반죽 및 빵을 만들면 스타터 원료에서 기인된 효모, 유산균, 세균, 곰팡이 등의 다양한 미생물이 혼재하므로 풍부한 향을 기대할 수도 있겠으나, 반대로 병원성 미생물이나 이취를 강하게 유발하는 균류에 의해 오염율의 비율이 높아지며, 이종의 미생물에 의하여 저해된 효모균의 농도가 낮을 경우 추가적인 발효 시간이 더 필요로 하거나, 부패취가 심할 경우도 있고, 균일성 및 재현성이 낮아지고, 안정된 제조과정를 유지하기 어렵고, 항상 일정한 품질의 빵을 만들 수 없을 뿐만 아니라 빵의 식미 저하에 영향을 미치게 되는 단점이 있다.
사워도우 스타터는 생균수의 증식과 대사활성에 밀접하게 관련되어 있어 계절에 따른 온습도의 영향, 사용하는 물의 온도, 스타터의 관리방법, 관리기간, 발효기간 등에 따라 좌우되기 때문에 스타터를 만들기 위한 배합이 동일하더라도 똑같은 스타터를 만들기에는 상당한 어려움이 따르게 마련이다. 따라서 균일한 제품을 생산하기 위하여‘천연발효종의 균일성을 확보하는 것이 중요한 상황이다.
대한민국 등록특허 제10-2077760호(2020년02월10일) 대한민국 등록특허 제10-1095805호(2011년12월12일) 대한민국 공개특허 제10-2002-0063163호(2002년08월01일) 대한민국 등록특허 제10-1753372호(2017년06월27일)
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 개선하여 짧은 시간 내에 발효를 완료하여 생산 유동성 확보하고, 순수 분리된 효모와 유산균을 첨가하여 균일한 품질의 완제품 생산 및 유지를 도모하고, 새로운 속성 sourdough 빵의 제조법을 확립하기 위하여 예의 연구한 결과, 후술하는 바와 같이 순수 분리된 효모가 잡균의 유입이 전혀 없고 호기적인 배양과정에서 이취가 전혀 발생되지 않으며, 배양액의 관리 일수가 줄어들고, 발효력이 강하여 우리밀의 발효 반죽 관리 일수를 단축할 수 있으며 발효력이 강력하여 우리밀 반죽과정에서 아주 빠른 시간에 발효반죽의 부풀리는 효과가 뚜렷하므로 제품생산 단계에서 별도의 상업용 건조 이스트(dry yeast)를 전혀 첨가하지 않고도 제빵의 제조가 가능함을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 잡균의 유입이 전혀 없고 호기적인 배양과정에서 이취가 전혀 발생되지 않으며, 배양액의 관리 일 수가 줄어들고, 발효력이 강하여 우리밀의 발효 반죽 관리 일 수를 단축할 수 있으며 발효력이 강력하여 우리밀 반죽과정에서 아주 빠른 시간에 발효반죽의 부풀리는 효과가 뚜렷하므로 제품생산 단계에서 별도의 상업용 건조 이스트(dry yeast)를 전혀 첨가하지 않고도 제빵의 제조가 가능할 신규 효모 및 그의 용도를 제공하는 데에 있다.
이러한 본 발명의 목적은 국내산 호밀과 우리밀에서 유래하고 천연발효종의 배양과정에서 얻어진 균주로서, 분리 과정에서 증식력이 높은 큰 Colony에서 분리되고, Cellulose를 분해할 수 있고, 알콜발효력이 강력하며 우리밀가루 반죽의 부풀림 양호하여 발효 시간을 단축할 수 있는 것을 특징으로 하는 신규 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y36, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y40 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y45 균주 및 그의 용도에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따라 선발된 신규 효모 균주는 증식속도가 빠르며, 이취가 나지 않으며 강한 발효취를 보이는 균주로서 우리밀 발효과정에서 부풀림이 빠르게 진행되고, 액체 배양에서 소용량인 경우 진탕배양, 중용량인 경우 폭기 배양으로 증식하더라도 우리밀 반죽의 발효에 발효력이 우수한 상태를 보이므로 선발된 효모의 액체 배양기법으로 제조한 배양액은‘천연발효종’제조에 효모의 순도가 100%이므로 잡균의 유입이 전혀 없으므로 호기적인 배양과정에서 이취는 전혀 발생되지 않으며, 배양액의 관리 일 수가 줄어들고, 발효력이 강하여 우리밀의 발효 반죽 관리 일 수를 단축할 수 있다. 또한, 본 방법에 의하여 선발된 효모 균주는 기존 관행 방법에 비하여 발효력이 강력하여 우리밀 반죽과정에서 아주 빠른 시간에 발효반죽의 부풀리는 효과가 뚜렷하므로 제품생산 단계에서 별도의 상업용 건조 이스트(dry yeast)을 전혀 첨가하지 않고도 제빵의 제조가 가능할 정도의 잇점이 있다.
도 1은 본 발명의 관행적인 방법과 개선 방법에 대하여 비교한 대표 공정도이다.
도 2는 기존의‘천연발효종’으로 우리밀의 4회차 발효진행된 반죽의 사진이다.
도 3은 '천연발효종’을 제조하기 위한 호밀과 우리밀 분말의 사진이다.
도 4는 희석평판기법(Esculine 함유배지, YA배지)에 의하여 기존방법의‘천연발효종’으로부터 나타난 희석평판(105~14) 실험구에서의 생균수의 빈도 및 β-Glucosidase(효소) 역가를 확인한 사진이다.
도 5는 희석평판방법으로 나타난 독립 Colony를 1차로 이식한 상태의 분리 균이며 사용된 배지(Esculine 함유배지, YA배지)에서 유래한 상태의 독립균에 대하여 카제인 함유된 평판에서의 증식 및 효소분해력을 확인한 사진이다.
도 6은 도 5에서 얻어진 독립 Colony의 대표적인 정상균인 No. Y45 분리균과 오염균이 극심한 경우의 반죽에서의 표면 상태의 사진이다.
도 7은 도 5 등에서 얻어진 독립 Colony를 시험관 사면배지에 계대 배양한 사진이다.
도 8은‘천연발효종’의 우리밀 4회차 계대배양된 발효반죽에서 분리된 것으로 YA평판배지(101~12) 실험구에서의 나타난 생균수의 빈도를 보이는 사진이다.
도 9는 Esculine 함유배지에서 YA평판배지 대비 생균 수는 적지만 오염균의 Colony 크기가 정상발효균(예; 정상발효균으로 Yeast 추정의 Colony)보다도 상대적으로 큰 균환 상태의 사진이다.
도 10은 우리밀 4회 계대로부터 순수분리(108 실험구)에 의하여 독립 Colony 중에서 나타난 Small size Colony와 Big size Colony(도 10의 화살표)의 비율을 보여주는 사진이다.
도 11은 대조균주 및 분리한 균주의 시험관에서 YA배지(액체배지에서는 Agar 제외)를 이용한 액체 배양에서 증식상태의 혼탁도를 확인한 사진이며, 일부 선발된 균주에서 배양 후의 정치상태에서 효모균체의 침전상태의 사진이다.
도 12는 배양된 균을 슬라이드 글라스에 도말하여 Giemsa’stain 한 후와 각 균주의 희석평판(104)에 의한 생균수의 확인된 사진이다.
도 13은 도 12에서 배양된 균의 광학현미경을 통하여 저배율에서의 균 형태를 확인한 사진과 선발균주의 배양상태 사진이다.,
도 14는 순수분리과정에서 추가로 선발한 균주의 희석평판(107~12)에 의한 균체 확인의 사진이다.
도 15는 배양에 따른 부풀림 상태를 나타내는 그라프도이다.
도 16은 대조구와 No. Y04, Y33, Y35, Y40, Y45 균주의 삼각 액체배양 상태의 사례를 확인한 사진과 정치할 경우의 효모 형태 균주의 침전 상태의 사진이다.
도 17은 검경에 의하면 효모균류는 세균류보다 상대적으로 입자가 크므로 Mass Cylinder에 분주된 효모 배양액의 정치에 따른 침전 검토를 위한 사진이다.
도 18은 희석 평판에 의한 생균수 평가를 나타내는 사진이다.
도 19는 기존방법에 의하여 얻어진 반죽과 본연구의 순수분리로 얻어진 No. Y45 균주의 시험관액에서의 농도 차이 및 수 일 동안 정치시킨 후의 희석된 페이스트의 변색 유발 사진이다.
도 20은 부풀림 비교 시험 결과를 나타내는 사진이다.
도 21은 기존 방법에 의한‘천연발효종’유래와 순수분리에 의하여 선발된 No. Y45 균주와 우리밀을 이용하여 발효 시작과 발효 2회차 부풀림 상태 비교한 사진이다.
도 22는 우리밀 투입 3회차 단계에서, 기존 보관(Y2-7)와 신규 순수분리에 의하여 선발된 No. Y04, No. Y33 균주에 대하여 발효 시작과 발효 진행 140분 후의 부풀림 상태 비교한 사진이다.
도 23은 Y33의 희석 배수(107~8)균주에 혼입된 오염원의 증식속도 차이 비교 사진이다.
도 24는 발효에 따른 부풀림 진행 사진이다.
도 25는 반죽의 광학현미경 사진이다.
도 26은 발효 반죽의 망상 구조를 나타내는 사진이다.
도 27은 신규 순수분리에 의하여 선발된 No. Y40 균주유래에 의한 제빵굽기 결과 사진이다.
도 28은 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주의 동정 결과의 NJ tree 계통도 분석의 실험진행 및 결과를 나타내는 도면이다.
도 29는 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주 No. Y36의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 30은 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주 No. Y40의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 31은 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주 No. Y45의 염기서열을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 일면에 있어서, 국내산 호밀과 우리밀에서 유래하고 천연발효종의 배양과정에서 얻어진 균주로서, 분리 과정에서 증식력이 높은 큰 Colony에서 분리되고, Cellulose를 분해할 수 있고, 알콜발효력이 강력하며 우리밀가루 반죽의 부풀림 양호하여 발효 시간을 단축할 수 있는 것을 특징으로 하는 신규 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y36, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y40 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y45 균주 및 그의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모의 전체적인 구성에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
효모 균주는 비교적 증식속도가 빠른 특성이 있고, 여타의 다른 이종의 미생물이 혼재해 있어도 함께 공존하면서 비교적 잘 증식하는 경향이 있다. 이러한 이유로 공존하게 된 미생물은 초기에는 상대적으로 수가 적어 세력이 약하지만 효모류보다 증식속도가 빠른 미생물이 계대를 진행하게 되면 점점 더 빠르게 증식하게 되어 상대적으로 세력의 비율이 증가하게 될 때에 이취가 심하게 되는 특성을 가지고 있다.
제과, 제빵 과정의 밀가루 반죽 진행에서의 이취가 나면 심하면 반죽을 폐기해야 하며, 좀 약하게 혼재되어 있으면 부풀림이 약하게 되고, 액상화가 빠르게 진행되기도 하며, 제품 가치를 떨어뜨리는 주요한 원인이 된다.
기존의 방법에서 연속적으로 계대할 경우 효모균주 이외의 혼입된 이종의 박테리아(Bacillus spp. 추정)의 증식 속도가 더 빨라 몇 번 더 계대과정을 진행하면, 이취가 강해지고, 발효력이 약화하는 문제가 있었다. 이러한 단점을 극복하고자 본 발명을 수행하게 되었다.
국산의 호밀에서 유래되어, 이후의 계대과정에 우리밀에 활력이 강하게 나타난 효모에서 Esculine 양성반응, 단백질 분해능이 약한 균주의 특성을 갖는 효모이면서, 풍미가 양호하며, 발효력(부풀림)이 강한 독립된 Colony를 수차례 반복에 의하여 선발하였다. 대조군으로는 분양받은 균주 또는 이전에 동정된 효모와 상호 비교 검토하였다.
최종 선발된 3개의 독립 Colony 유래의 균주는 KCTC에 의뢰하여 균주를 동정의뢰 하였고, 동정을 위하여 Yeast 균주는 LSU rRNA gene sequencing 유전자 염기서열(길이 1200bp 이상)에 대한 계통도 분석(Phylogenetic tree analysis)에 의하여 Saccharomyces cerevisiae 로 동정되었다.
이들 의뢰 균주(Y36, Y40, Y45)를 각각 Saccharomyces cerevisiae GDO Y36, Saccharomyces cerevisiae GDO Y40, Saccharomyces cerevisiae GDO Y45로 명명하였으며, 이중 Saccharomyces cerevisiae GDO Y45 균주는 KCTC에 균주기탁하여 수탁번호 KCTC 15481BP를 부여 받았다.
한편, 본 연구의 궁극적인 목적은 효모 균주의 안정적인 배양을 통하여 대량으로 ‘천연발효종’을 액상으로 배양하기 위하여 순수한 상태로 분리하였으며, 기존의 방법을 개선하여 ‘천연발효종’과 같은 효과를 갖는 액체 배양 조건을 등의 조합을 완성하여 후속으로 대용량 배양 관련한 연구를 진행하고 있다.
사워도우(sourdough)를 이용한 발효법은 밀가루, 물 및 호밀가루를 섞어서 그 안에 내재된 미생물들을 활성화시켜 사워도우 스타터(sourdough starter)를 만들고, 그 일부를 반죽에 사용하고 나머지는 다음 반죽 사용을 위해 보관해두는 과정을 반복하여 계속하는 방법이다. 이러한 사워도우 스타터를 이용하여 반죽 및 빵을 만들 경우 스타터의 원료인 호밀, 우리밀 및 진행작업 과정에서 기인된 효모, 세균, 곰팡이 등의 다양한 미생물이 혼재하므로 풍부한 향을 기대할 수 있으나, 병원성 미생물이나 잡균에 의해 오염될 수 있게 된다.
발효에 관여하는 미생물의 농도가 낮을 경우 추가적인 발효시간이 필요하며 균일성 및 재현성이 낮기 때문에 동일하고 안정된 상태를 유지하기 어려워 항상 일정한 품질의 빵을 만들 수 없을 뿐만 아니라 빵의 식미 저하에 영향을 미치게 되는 단점이 있다. 특히 여름철에 오염빈도가 높이 대량으로 수행하기 어려운 문제가 있어 제조과정에서 균일성을 유지하기 어려운 점이 있어서 품질관리가 용이하지 않은 문제점이 더욱 크다.
본 연구를 통해 우리(통)호밀로부터 분리한 토종 효모(Saccharomyces cerevisiae), GDO Y35, 36, 40, 45 등의 균주는 맛과 풍미, 노화 지연 등 품질향상 효과가 높아 우수한 제빵용 효모로 사용될 수 있다.
그 중, GDO Y45 균주는 기본적으로 통호밀과 우리밀에 잘 적응된 상태에서 순수분리에 의하여 선발된 균주이므로 투입성분 중 탄수화물 및 질소원 등의 별도의 영양원 없이 오로지 우리밀, 탈지 대두박, 천연 소금 만을 넣어 배양할 수 있다. 액체 배양에서 소용량인 경우 진탕배양, 중용량(9L)인 경우 폭기 배양으로 증식하더라도 우리밀 반죽의 발효에 발효력이 우수한 상태를 보이는 균주이다.
순수분리하는 과정에서는 YA 배지를 이용하는 등의 불가피한 경우가 있었지만 동정 이후의 대용량의 액체배양기법을 완성하는 과정에서는 이와 같은 가공된 재료를 사용하지 않고 배양할 수 있는 방법으로 진행되었다. 이러한 방법으로 투입재료의 비용도 저렴하면서도 단순한 배지 조합이며 생균수는 많으면서도, 비교적 오랜시간 폭기 배양을 유지하더라도 영양원의 고갈문제가 없도록 하고자 한다.
발효력이 우수한 선발균주를 이용하게 되면, 순수하고 우량한 효모균주에 의한 밀도를 높일 수 있고, 이취가 나지 않으면서도 알콜취가 강렬하고, 반죽의 부풀림을 빠르게 진행시키는 특성이 확연하며, 실험 재현과정에서 왕성한 발효력을 억제시켜도 될 정도이다.
빵의 제조에 있어서 제품의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소의 하나인 효모에 대한 연구개발은 아직 제조기술의 단순 개선 단계에 머물러 있어 대부분이 세계의 특정 지역 및 몇몇 기업에서 독점적으로 공급하는 상업용 효모(yeast)를 사용하고 있는 실정이나 본 기법으로 국내 뿐 만 아니라 해외로 제과, 제빵용 효모 균종을 수출할 수 있는 계기가 될 것이다.
본 발명의 완성을 위하여 증식속도가 빠르며, 이취를 유발하는 오염균을 제거하고 강력한 발효취를 보이는 균주를 선발하여 동정하였다. 본 발명으로 선발된 균주는 우리밀 발효과정에서 부풀림이 빠르게 진행되는 특징이 있다.
본 발명은 ‘천연효모종’의 개념에서 벗어나지 않기 위하여 액체 배양원에 당류(예; 포도당, 설탕 등)를 제외하여 저렴한 우리밀과 탈지 대두박, 천연 소금만을 이용하여 호기적인 방법으로 증식한 효모를 액상으로 사용하는 기법을 적용하며, 우리밀 반죽과정에서 최종적인 목적은 대용량의 효모 균주 배양방법에서 호기적인 액체 배양기법으로 제조하여 사용하는 것이다.
본 발명에서 ①우리밀을 이용하여 빵류를 제조함에 있어 우리밀에 적합한 효모균의 순수분리, ②순수분리된 효모균 중에서 발효 목적에 적합한 효모를 분리하는 재료(예; 통호밀)로부터 시작하여 순차적으로 우리밀을 이용하여 발효반죽에 이용하고자 한다.
호밀(곡우)의 외피에는 많은 Cellulose 성분 등을 함유하고 있어 이러한 성분을 잘 분해하는 특성을 갖는 효모류가 잘 적응하고 있어 통곡류{우리밀의 통밀가루(whole wheat flour) 통밀가루(whole wheat)}의 Cellulose와 전분을 잘 분해할 수 있다.
비교적 짧은 배양 기간으로도 통상의 밀가루 반죽과정에서 유효한 특성을 갖는 효모 수가 많으면 발효 시간이 단축되는 등의 유익한 점이 있게 된다. 한편, 천연발효종의 관점과 제조 비용 절감과 편리성을 고려하여, 지속적인 계대배양에서 경시적으로 미생물의 균총에서 이종의 오염균에 의하여 발효종을 버리고 새로이 준비해야하는 낭비를 제거할 수 있으며, 재현성이 유지되도록하여 제품의 균일성 확보를 하고자 한다.
한편, 선행특허(등록특허 10-2077760)의 연구하여 분리되었고, KCCM 기탁된 Weissella cibaria KW1 균주(KCCM 12223P)를 본 연구에 의하여 분리된 효모와 함께 활용할 수 있다.
본 발명은 상기 균주는 본 발명자가 통호밀로부터 유래되고 연속하여 우리밀에 4~5회차 계대하면서 증량하는 단계에서 균을 분리하였다. 통호밀 유래 및 연이은 우리밀의 발효반죽과정에 희석평판기법에 의하여 독립되어 나타난 Colony 중에서 Colony가 큰 것 중심으로 선발하였고, 이어서 Esculine 함유배지에서 Black 착색이 빠르고 강하게 나타나는 Colony를 선발하였고, 카제인 함유 YA 배지에서 투명환을 보이지 않는 Protease 음성반응을 나타낸 것을 목표하에 선발하였다.
③선발된 효모균주에 대하여 동정을 실시하여 네이밍(Naming; 속명 종명)을 진행하고, KCTC에 기탁하여 균주의 보관 및 유전자 변이 방지 등의 안정성을 확보하고자 하였다.
본 발명은, 추가의 일면에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y45를 함유하는 것을 특징으로 하는 제과 또는 제빵용 반죽(Sourdough)을 제공하고 있으며, 본 선발의 효모균 이외의 유산균은 선행특허(등록특허 10-2077760)의 Weissella cibaria KW1 균주(KCCM 12223P)를 혼합배양 또는 별도의 배양과정에 의하여 우리밀 반죽에 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
순수 분리된 효모와 유산균을 첨가하여 발효 빵인 sourdough 빵의 독특한 풍미와 특성을 유지하면서도 24시간 정도의 짧은 시간 내에 발효가 가능하고 균일한 품질의 제품생산이 가능한 속성 sourdough 빵의 제조와 이를 이용한 샌드위치를 제조할 수 있다.
액체 배양기법에서는 Yeast보다도 증식속도가 빠른 Bacillus spp. 가 상대적으로 우점하는 문제가 있을 경우가 있어 단일의 순수분리된 Yeast의 품종의 확보가 필요하게 된다. 이러한 목적을 위하여 우리 호밀에서 유래되는 균주를 분리하고자 시도되었고, 통호밀가루와 우리밀가루에 적합한 Yeast를 선발하게 되었다.
효모 균주를 분리하기 위하여 첫번째 통호밀가루를 사용하였으며, 이후 계대배양 진행에서는 상기의 첫 번째 통호밀가루의 용량보다 약 2배량씩 증량하게 되며, 우리밀가루의 계대 증량 횟수는 4~5회차 진행하며, 연속하여 4~5일간 배양기 온도 30℃에서 진행하며,‘천연발효종’제조 진행하는 용기의 상부는 랩핑하여 수분증발을 방지하고, 외부의 미생물 유입 등의 간섭을 차단하였다.
통상 기존의 방법에 의하여 4~5일째 계대와 증량을 진행한‘천연발효종’의 1/2량은 제품제조에 사용하고, 나머지 1/2량 정도는 다시‘천연발효종’을 증량하였다.
상기 균주는 순수분리기법에 의하여 독립되어 나타난 Colony 중에서 Colony가 큰 것 중심으로 선발하였고, 이어서 Esculine 양성반응, 카제인 함유 YA 배지에서 투명환을 보이지 않는 Protease 음성반응을 나타낸 것을 분리하였다.
본 발명에서 사용되는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 기존방법에 비하여 잡균의 오염율을 확연하게 줄일 수 있어 이취를 거의 느끼지 못하고, 부풀림 등의 발효력이 월등하게 빠르며, 제조공정의 시간을 예측할 수 있으며, 빵의 풍미를 증진하므로‘천연발효종’의 특성을 유지하면서도 호기적인 액체 배양기법을 이용할 수 있는 잇점이 있다.
제빵의 균일성 유지와 안정적인 발효 진행을 위해서는 발효종균인 효모가 제빵환경에서 잘 적응할 수 있도록 종균의 개량이 요구되고 있으며, 품질향상 및 더 많은 시장개척을 위하여 제빵의 풍미 및 기능적 특성을 증가시키기 위해서도 종균 개량연구가 필요한 실정이다.
천연발효 빵 및 식품 제조에 있어 여러가지 방법들이 고안되었으며 대표적으로 샤워종 및 액종 시스템이 대표적이다. 본 발명에서는 샤워종(Sour dough) 시스템보다는 액종(Liquid-starter) 시스템을 선택하였다.
추후의 연구개발에서는 본 문건 이전에 순수분리된 유산균으로 선행특허(등록특허 10-2077760)의 Weissella cibaria KW1 균주(KCCM 12223P)를 혼합배양 또는 별도의 배양과정에 의하여 활용할 경우, 2종 이상의 균종에 의한 풍미가 가미될 것으로 판단되고 있어 액체종균제조기법(Liquid-starter)이 유용할 것으로 판단하였다. 따라서 우리밀 발효(반죽)에 본 연구에 의하여 동정된 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y45 균주와 Weissella cibaria KW1 균주(KCCM 12223P)를 단독 또는 혼합 액체 배양하여 우리밀 발효 반죽에 사용할 수 있다.
우리밀을 이용한 제과.제빵에서 통호밀과 우리밀을 사용하기 위하여 외국산의 밀가루보다도 더 많은 Cellulose 성분도 분해가 잘 이루어져야 한다. 이러한 효모를 얻기 위하여 순수분리과정의 희석과정에서 독립 Colony 형태에서 분리하였고작은 Colony보다는 큰 Colony 중심으로 선발하였다. β-Glucosidase 활성에 양성반응을 하는 Esculine 함유 YA 평판 배지에서 변색이 잘되는 균주를 선발하였고, 단백질 분해효소 반응이 없거나 거의 나타나지 않는 균주를 선발하였다.
YA배지의 조성으로는 물 1L 기준으로 Yeast ext 20g, Peptone 15g, Dextrose 2g, NaCl 3g, KH2PO4 2g, (액체 배지인 경우 Agar 15g 미첨가)를 사용하였다
이러한 과정에 의하여 반복되는 과정에서 얻어진 몇몇 Yeast 형태를 광학 현미경을 통하여 형태를 확인하였으며, 이 중에서 Big size Colony를 형성한 균주 중 심으로 선발하였으며 우리밀 반죽발효과정에서 발효력이 양호한 것 중에서 부풀림이 빠른 Yeast 균주 중에서 Saccharomyces cerevisiae No. Y36, Y40, Y45 를 선발하였다.
도 1은 본 발명의 관행적인 방법과 개선 방법에 대하여 비교한 대표 공정도이다.
관행적인 방법으로는 매번 통호밀 가루에서 유래된 효모균주 및 유산균류의 증식과정에서 소량으로 제조할 수 밖에 없었던 이유로는 위 유익한 균주 이외의 오염균주가 유입되어 효모 및 유산균보다 더 빠르게 증식하는 균의 유입이 있고, 이러한 균류는 단백질원도 잘 분해하는 특성이 있어 이취를 유발하는 원인이 된다.
이와같은 이취의 유발은 오염균이 증식속도가 빨라 상대적으로 효모의 증식을 억제하게 되어 제과, 제빵에서의 부풀림이 좋지 않을 뿐 만 아니라, 제품의 유효기간이 짧아지게 되는 원인이 되며 많은 단점이 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 순수분리에 의한 발효(Yeast)균주를 분리하였으며, 분리된 균주는 발효력이 강력하므로 지금보다 균주의 증식기법을 개선하여 대량생산할 수 있는 기법을 정립하고자 한다.
본 발명에서 제시된 효모선발과정에서의 특이점이 주요한 내용이며 부수적으로 후차적인 공정 개선하는 것으로 호기적인 폭기 배양에 의한 중용량(실시예: 9L)를 제시하고 있으나, 이 용량에 한정하는 것은 아니다.
이러한 기법을 완성하기 위하여 효모액체 종균을 사용하기 전에 오염여부를 확인할 수 있는 오염검사방법론에 대한 연구(Journal of Mushroom Science and Production, Vol. 10, No 1, p44-48 March 2012, 팽나무버섯 액체 종균의 접종 전 오염 검사, 심규광 등 4인)의 학술문건이 공개되어 있어 오염에 의한 문제는 없다.
천연발효종을 고수하는 이유 중이 하나는 국내산 호밀과 우리밀의 재배과정에서 파종을 가을철에 실시하여 봄에 수확하는 품종이기 때문에 생육하는 과정에서 무농약으로 생산되는 점이 가장 큰 이유가 되며, 무농약재배로 생산된 곡물에는 유용한 미생물이 많이 존재하기 때문이다.
(실시예)
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 더욱 용이하게 설명할 목적으로 제시된 것으로서, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
실시예 1: 천연발효종의 제조
도 1에 나타낸 방법에 의해 다음과 같이 관행적인‘천연발효종’을 제조하였다. 통호밀가루 50g량에 증류수(DW) 72g을 추가하여 30℃, 하룻밤 지난 후 우리밀가루 100g 및 증류수(DW) 70g을 추가하여 30℃, 하룻밤 지난 후 우리밀가루 270g 및 증류수(DW) 170g을 추가하여 30℃, 하룻밤 지난 후 우리밀가루 600g 및 증류수(DW) 330g을 추가하여 30℃, 하룻밤 지난 후 우리 밀가루 1100g 및 증류수(DW) 610g을 추가하여 30℃, 하룻밤 지난 후 아래 흰 용기의 우리밀 발효반죽인‘천연효모종’을 얻었다. 도 2는 기존의‘천연발효종’으로 우리밀의 4회차 발효진행된 반죽의 사진이다.
이후 실험분석 및 자료생성을 위하여 일부를 멸균된 삼각 프라스크에 분획하여 4℃에 냉장저장하여 실험에 사용하였다.‘천연발효종’은 50% 이내를 사용하여 제과, 제빵을 위한 새로운 우리밀가루 반죽에 활용하고, 나머지 50% 정도는 다시‘천연발효종’증량에 사용하기 위하여 발효시켜 사용하거나 냉장 저장하였다가 제품생산에 사용하였다.
도 3은 '천연발효종’을 제조하기 위한 호밀과 우리밀 분말의 사진이다.
밀은 밀속 식물의 낟알을 일컫는 말로 약 22개의 품종이 전 세계적으로 재배되고 있다.
호밀은 곡우라고도 칭하고 국산 품종이며, 우리밀의 품종은‘고소밀’이다. 국내 밀 시장에서 수입밀은 국내산 밀의 가격이 수입산 밀(1kg이 329원)보다 3배(국산은 925원) 가까이 비싸기 때문이다.
우리밀은 병충해 없이 잘 자라고 바람에 쓰러지지 않을 뿐 아니라 글루텐이 적어서 소화도 잘된다. 2017년 기준으로 국내 밀 자급율은 1% 정도였고, 국가 정책에 의하여 우리밀의 생산량은 2019년 기준 1만 5000t에서 꾸준히 증가하여 지난해 기준 3만 7000t 수준이다. 국내 밀 시장은 수입밀이 99% 독점하는 구조이며, 수입밀은 연간 420만t(식용 200만t, 사료용 220만t)이 국내로 들어온다.
국내산 밀가루 단백질 함량은 올그루 11.05%, 고분 11.66%, 탑동 13.07%, 금강 13.68%, 은파 13.70% 및 그루 13.75%이며, 회분 함량은 0.34~0.45% 범위에 있다.
국산 밀은 추파 동계작물이기 때문에 낮은 온도와 낮은 습도의 영향으로 병충해에 무관하므로 농약 살포없이 진행되고 있으나 수입밀은 춘파 밀로 농약살포가 많다는 것이며, 수입밀은 긴 물류기간 동안에 쥐나 병충해 및 부패 방지를 위하여 방부재 등을 사용하는 문제가 있다.
도 4는 희석평판기법(Esculine 함유배지, YA배지)에 의하여 기존방법의‘천연발효종’으로부터 나타난 희석평판(105~14) 실험구에서의 생균수의 빈도 및 β-Glucosidase(효소) 역가를 확인한 사진이다.
대부분의 경우 호밀유래의 우리밀 4회차에서 수득된 Yeast는 β-Glucosidase(효소) 역가가 높이 호밀의 껍질 부위에서 잘 적응할 수 있었던 균주로 판단된다.
본 문건에서 특별한 언급이 없는 한 효모의 배양온도는 30~32℃, 삼각 프라스크의 액배양에서 120rpm, Petri Dish는 직경 90mm, 사용된 배지는 YA배지, 평판에서의 생균수는 CFU/0.2ml 기준으로 표시하였다.
실시예 2: 독립 콜로니의 분리
도 5는 희석평판방법으로 나타난 독립 Colony를 1차로 이식한 상태의 분리 균이며 사용된 배지(Esculine 함유배지, YA배지)에서 유래한 상태의 독립균에 대하여 카제인 함유된 평판에서의 증식 및 효소분해력을 확인한 사진이다.
‘천연효모종’에서 분리된 효모와 이취를 유발할 것으로 추정되는 오염균의 증식 상태를 비교해 보면, 대부분의 효모균주가 우점하게 되는 상황이지만 처음 출발되는 생균수는 월등하게 적지만 증식속도가 아주 빠른 세균(Bacillus spp. 형태 확인)임을 확인하였으며, 이러한 오염균은 카제인이 함유된 평판배지에서 투명환을 보이는 것으로 보아 단빅질원을 분해하는 강력한 효소를 분비하는 세균임을 알 수 있다. 단백질을 분해하는 효소의 역가가 강할수록 악취는 많이 발생하게 되기 때문에 제과, 제빵을 위한 발효종으로 활용할 수 없게 되는 원인이 된다
도 6은 도 5에서 얻어진 독립 Colony의 대표적인 정상균인 No. Y45 분리균과 오염균이 극심한 경우의 반죽에서의 표면 상태의 사진이다.
도 5에서 오염균 3개(No.25, No.26, No.27)는 카제인을 함유한 평판배지에서 투명환을 보임으로써 단백질(원)을 분해할 수 있는 균주로 사료되며, 계대를 계속해서 진행할 경우에 색이 진하게 변색이 되며, 이취가 강하게 발생되는 것을 확인하였다. 따라서,‘천연발효종’에 함유된 이취는 이와 같은 혼입된 세균의 증식과 단백질을 분해하는 특성을 갖기 때문임을 알 수 있었다. 한편, Y45 효모 균주을 배양할 경우 이취가 느껴지지 않았으며, 효모의 단독 배양한 발효액을 사용하였고 현미경 검경에서 오염균을 찾을 수 없었으며, 배양과정이나 발효과정에서 강한 알콜취가 발생되었으며, 제빵 명인은‘향긋한 풍미’라고 표현하는 향취를 갖고 있다
도 7은 도 5 등에서 얻어진 독립 Colony를 시험관 사면배지에 계대 배양한 사진이다.
Esculine 시약에 대하여 검은색으로 변하는 양성반응, 카제인 함유 평판배지에서는 투명환을 보이지 않는 Protease 음성반응을 보이면서도 독립된 Colony가 상대적으로 큰 군락을 형성하는 것을 중심으로 선발한 효모형태의 균주와 오염을 유발하는 균주를 몇 개(3개) 선발하였다. 오염균주는 상대적으로 효모추정균의 Colony 보다는 훨씬 큰 반점을 보이는 균주로 Colony의 크기로 보더라도 증식속도가 효모추정보다도 월등하게 빠른 세균성(광학현미경 검경 결과 Bacillus spp.Type) 균주이다.
도 8은‘천연발효종’의 우리밀 4회차 계대배양된 발효반죽에서 분리된 것으로 YA평판배지(101~12) 실험구에서의 나타난 생균수의 빈도를 보이는 사진이다.
‘천연발효종’유래의 우리밀 반죽에서 1g을 취하여 멸균수에 희석하였으며, 희석액 중의 각각으로 부터 0.2g(ml)를 취하여 YA평판배지에 부착하여 나타낸 것으로 1012 에서도 효모형태의 Colony가 나타나고 있는 것으로 보아 기존의 방법에 의하여서도 많은 수의 효모균주가 증식하고 있다. 한편 희석하는 과정에서도 일부 실험구에서 오염을 유발하는 오염균(Bacillus spp. 추정) 균주가 혼재되어 있음을 확인하였다.
도 9는 Esculine 함유배지에서 YA평판배지 대비 생균 수는 적지만 오염균의 Colony 크기가 정상발효균(예; 정상발효균으로 Yeast 추정의 Colony)보다도 상대적으로 큰 균환 상태의 사진이다.
Esculine 함유 배지에서 검정색으로 나타내는 Colony 는 β-Glucosidase 효소를 분비하는 것을 의미한다. 이러한 효모는 통호밀의 겉 껍질에 다량으로 함유하고 있는 Cellulose를 분해할 수 있는 효소를 분비하는 균주임을 입증할 근거가 될 수 있어, 본 연구에서 통호밀 유래의 순수분리하여 선발된 효모는 알코올 생성력도 강하며, Cellulose도 잘 분해할 수 있는 균주로 평가할 수 있다
도 10은 우리밀 4회 계대로부터 순수분리(108 실험구)에 의하여 독립 Colony 중에서 나타난 Small size Colony와 Big size Colony(도 10의 화살표)의 비율을 보여주는 사진이다.
순수분리(108 실험구)에 나타난 Colony 환의 크기가 작은 것과 큰 것의 비율(Small size Colony 5~7 : Big size Colony 1)로 나타났다. 본 연구에서는 순수분리과정의 평판에 나타난 Colony를 [도 9]의 Esculine 함유평판배지에서 Black Colour를 진하게 형성하는 실험구와 카제인 함유배지에서의 투명환이 없거나 반응하지 않는 실험구를 중심으로 분리하였으며, Small size Colony는 분리만하였고, Big size Colony가 증식속도가 빠른 것으로 판단하여 Big size Colony를 중심으로 선발하였다. Small size Colony(No. Y04)와 Big size Colony(No. Y33)의 발효력의 차이는 도 22에서와 같이 동일한 조건일 때에 Big size Colony(No. Y33)가 빠르게 부풀림이 일어났다. 이는 증식속도가 월등하게 빠른 이유는 당연히 증식속도가 빠른 쪽에서 수가 많아질 것이며, 이로 인한 효소 분비력도 상대적으로 왕성하고 분해기작이 빠르게 진행되기 때문이다
이러한 과정으로 선발된 효모균주는 이취가 거의 없는 풍미를 유지하였고, 우리밀 발효반죽에서 월등하게 빠른 부풀림을 하였다. 이와같이 기존의 혼재된 효모가 아닌 증식력이 강한 효모 유래의 것만으로 발효반죽을 진행하게 되면, 발효력(우리밀 반죽의 부풀림)이 왕성한 특징을 갖게 된다.
도 11은 대조균주 및 분리한 균주의 시험관에서 YA배지(액체배지에서는 Agar 제외)를 이용한 액체 배양에서 증식상태의 혼탁도를 확인한 사진이며, 일부 선발된 균주에서 배양 후의 정치상태에서 효모균체의 침전상태의 사진이다.
이러한 상태를 이용하여 농축된 효모를 얻을 필요가 있는 경우에 액체 배양기법을 통하여 증식된 효모균체를 쉽게 얻어낼 수 있게 된다. 농축된 균체를 얻기 위하여 통상의 원심분리를 행하지 않더라도 대부분의 효모를 침전시킬 수 있게 되므로 2~3일 동안 정치하여 상증액을 제외하여 하부의 침전한 농축 효모를 얻을 수 있게 된다.
도 12는 배양된 균을 슬라이드 글라스에 도말하여 Giemsa’stain 한 후와 각 균주의 희석평판(104)에 의한 생균수의 확인된 사진이다.
각각의 균주는 Big size Colony 유래이며, No.Y35, No.Y36, No.Y37, No.Y40, No.Y41, No.Y43, No.Y44, No.Y45 균주를 희석평판 후 104의 실험구에서 0.2g를 도포(평판 도말 효과)한 후 크린벤치의 깨끗한 공기 흐름 중에서 평판의 물기를 제거하고, 뚜껑을 덮어 테이핑하고 페트리 디쉬 평판을 뒤집은 상태로 32℃에서 2~5일 후의 콜로니 출현 빈도를 보일 때에 Countting 하여 CFU/0.2g 기준으로 표시하였다. 본 순수분리에 의하여 분리된 균주는 동일한 조건의 증식에서 거의 유사한 생균수를 보이고 있는 것으로 보아 동일한 특성을 갖는 종으로 추정되었으며, 도 27~30에서와 같이 3개 균주의 동정 결과도 동일하였다.
도 13은 도 12에서 배양된 균의 광학현미경을 통하여 저배율에서의 균 형태를 확인한 사진과 선발균주의 배양상태 사진이다.
선발된 균주는 액체 배양과 반죽 발효과정 중에 알콜취가 있어서 효모 균주로 추정하게 되었으며, 이들의 균주를 액체 배양하여 광학현미경에 의하여 확인한 결과 모두 전형적인 효모형태인 난형을 보였다.
이들 균주의 보관을 위하여 시험관 YA 사면배지에 계대하였고, 평판 배양에서는 YA배지를 약 25ml 정도 분주하여 평판을 제조한 후 스크레치 또는 도말하여 배양하게 되며, 액체배양을 위해서 YA배지를 이용하여 배양하거나, 별도로 제시된 배지를 이용하게 된다. 이후 본 발명의 목표인 대용량 배양을 진행하게 될 때에는 삼각액 150~350ml, 온도 28~33℃, 120~150rpm 진탕 배양을 약 1~3일 정도 배양하면서 대용량의 폭기조에 접종원으로 투입하여 배양하게 된다. 대용량의 개념은 무한한 용량이나 통상의 버섯재배과정의 액체종균 제조 과정에서 많이 사용하는 범위의 50~1200L(예;스텐레스 재질)의 배양용기를 의미한다. 이보다 작은 중용량으로는 5~20L의 용량을 사용하면 통상의 실험실적인 규모의 Autoclave(고압살균기)를 이용하게 된다. 호기적인 액체배양기법에서의 용기의 크기는 언급한 것으로 제한하는 것은 아니다.
도 14는 순수분리과정에서 추가로 선발한 균주의 희석평판(107~12)에 의한 균체 확인의 사진이다.
평판배양에서 나타난 것은 오로지 효모형태의 순수한 상태로 독립된 Colony 였음을 확인하였고, 이취를 유발하는 오염원은 전혀 나타나지 않았다. 본 건의 단독 효모균만을 언급하고 있지만 추후 제빵의 풍미와 깊은 맛 등을 위하여 협력업체의 선행 공동연구된 등록특허(10-2077760)의 Weissella cibaria KW1 균주(기탁번호; KCCM 12223P)를 함께 이용할 수 있다.
천연발효종’으로 제빵을 구현할 때에 통상의 경우 발효력이 약하여, 제품을 제조할 때에‘천연발효종’과 우리밀을 동량으로 혼합할 때에 상업용 0.1~0.3% Dry Yeast를 사용하는 것이 업계의 관행이라고 한다. 하지만 본 연구 결과의 검증된 사항으로는 우리밀 3차 등의 증량과정을 위하여 삼각 프라스크의 배양액으로 접종하고, 9L 용량을 호기적인 조건으로 공기를 주입하면서 배양된 효모배양액을 우리밀과 동일한 량으로 투입하여 진행하고, 이후의 단계로는 각각 우리밀과 효모배양액을 2배량씩 증량하였다. 이 때에 상업용 Dry Yeast를 전혀 첨가하지 않고도 본 선발, 분리된 효모는 우리밀 발효에서 부풀림 속도는 아주 빠르며, 우리밀 3회차 증량에서 주기적인 시간 간격(실시예: 4시간 주기, 자료 도 15))으로 반복하여 재현됨을 확인할 수 있을 정도로 발효력의 부풀림이 왕성하게 발현되었다.
실시예 3: 효모의 호기적 액체 배양
도 15는 배양에 따른 부풀림 상태를 나타내는 그라프도이다. 중용량의 효모의 호기적인 액체 배양으로 제조된 효모배양액을 투입하여 진행하였으며, 1회차 1일간, 우리밀 300g, 효모배양액 300g을 물대신 투입하였고, 2회차 1일간, 우리밀 600g, 효모배양액 600g, 3회차 1일간, 우리밀 1500g, 효모배양액 900g 등으로 실시되었으며, 투입된 시료의 Volume에 따라 용기 2개에 분할하여 발효 중의 부풀림 상태를 높이(cm)로 측정하여 요약한 그래프이다. 발효 1, 2일째에서는 부풀림이 완만하였으며, 3일째에서는 부풀림이 강하고 규칙적으로 발생되는 것이 확인되었다. 3일째에 2개로 나누어 동량으로 진행하였으며, 결과는 거의 동일한 수준으로 나타났으며, 시료의 기저 Volume 대비 2~2.5배 이상으로 부풀림이 되는 시간은 평균 3.4시간이면 충분하였다.
기존의‘천연발효종’제조에서 4~5회차(day) 진행한 후 본 발효를 진행하여 제품을 생산할 수 있는데 반하여 본 기법에 의한 우리밀 발효는 3회차(days)로도 다음단계의 발효를 진행하여 제품생산이 가능하게 되어 발효종관리의 편리성이 있게 된다. 이 실험(B우리밀 발효종)에 사용된 액체 배양액은 3일째부터 6일째까지 배양 중인 효모배양액을 사용하였다.
처음 시작한 A발효반죽(9L 배양중 2일째부터 효모액 투입) Volume에 대하여 2~2.5배 이상으로 부풀림되는 시간은 평균 3.4시간(반죽이 부풀었을 때에 용기가 적어서 부풀림상태를 휘저어놓은 상태)이면 충분하였으며, 이러한 이유로 배양이 완료되어 활력이 강할 때에 바로 사용하는 것이 권장되는 이유이며, 이처럼 균일성을 유지하기 위하여 적합한 것은 액체 배양기법을 활용할 수 있음이 입증되었다(자료 미표시).
B발효반죽(9L 배양 중 3일째부터 효모액 투입) Volume에 대하여 2~2.5배 이상으로 부풀림되는 시간은 평균 4시간(반죽량이 많아 2개로 동량 분할하여 진행하여 용기가 충분히 높은 상태)의 반복되는 재현성이 나타나는 것은 도 15와 같다. 도 15에서 보는 바와 같이 우리밀 1회차(우리밀 300g+Y9L-3th-300g)1일간 배양, 2회차(우리밀 600g+Y9L-4th-600g)1일간 배양 기간 동안에 부풀림은 약하였지만, 3회차(우리밀 1500g+Y9L-5th-900g)투입후 부터는 부풀림이 왕성하게 나타나며, 4시간 후 발효반죽을 휘저어 놓은 후 다시 4시간 간격으로 부풀림이 반복되는 상태를 확인하였다.
실시예 4: 대조구의 액체 배양
순수분리된 균주 외에 대조구로는 냉장보관 중인 Y2-7 효모, 신규 분리 균주는 No. Y04, Y33, Y35, Y40, Y45 균주를 이용하였다.
도 16은 대조구와 No. Y04, Y33, Y35, Y40, Y45 균주의 삼각 액체배양 상태의 사례를 확인한 사진과 정치할 경우의 효모 형태 균주의 침전 상태의 사진이다.
효모균주는 통상의 세균류에 비하면 대단히 큰 난형의 세포를 가지고 있어 제시된 침전균주의 흰앙금을 형성하며 침전되는 특징이 있다. 이러한 침전되는 특징을 확인하기 위하여 도 17과 같이 200ml 메스 실린더를 이용하여 Yeast의 침전속도를 검토하였다.
도 17은 검경에 의하면 효모균류는 세균류보다 상대적으로 입자가 크므로 Mass Cylinder에 분주된 효모 배양액의 정치에 따른 침전 검토를 위한 사진이다.
혹시 추후의 Dry Yeast를 제조한다든가 하는 방법론의 개발을 위하여 본 실험을 진행하였다. 통상 미생물은 입자가 작아서 원심분리를 해야하지만 효모의 경우 배양액의 상태에 따라 다르겠지만 짧게는 침전 1일째 및 침전 3일째 정도만 되어도 효모균주의 증식이나 역가에 큰 변화없이 원심분리를 하지 않고도 어느 정도(예: 80%>)의 생균을 확보할 수 있을 것으로 판단되었다. Yeast Cell이 크기 때문에 정치에 의하여 침전되는 속도를 평가하였다
이와 같은 것을 입증하기 위하여 희석평판에 의하여 생균수를 확인하였다. 도 18은 희석 평판에 의한 생균수 평가를 나타내는 사진이다. 표 1은 Y45 균주 배양에서 액체상태의 대량으로 제조한 후의 정치한 시간이 길어짐에 따른 균체 회수 가능성 평가를 위한 희석평판에 의한 생균수 평가 결과를 나타낸다.
102 103 104 105 106 107 108
① YA배지 삼각 Y45-액 배양 후 정치시 이러한 다량의 침전 Yeast 400 80 10 3 0 1 x
② YA배지 삼각 Y45- 진탕 직후(Yeast 균주의 지표점을 대조구(10E 7~13승 희석) 무한 무한 많음 많음 35 16 4
③ YA배지 삼각 Y45--1/10량 시험관진탕-1시간 후---정치1시간후에는 Yeasy 침전되지 않음 600 250 71 30 5 0 1
④ YA배지 삼각 Y45-1/10량 시험관 진탕 정치 후 24시간---멸균수10X 시험관에서 1일간 짐전시 현저한 침전확인 25 7 1 1 0 x x
⑤ : YA배지 ① 액 1ml 접종-진탕 1일후 New 삼각 진탕배양 후의 1시간 정치 한 후의 평가 무한 150 140 30 1 0 1
액체 배양액이나 우리밀 발효 중의 효모의 침전상태를 확인할 경우에는 침전속도가 상대적으로 느리나 이를 10배 희석하여 정치할 경우에 상당히 빠른 속도로 침전이 되는 것을 확인하였다.
상기 ④에서 20시간 정치하면 많은 효모균이 침전됨을 확인하였다. ④ YA배지 삼각 Y45-1/10량 시험관 진탕 정치 후 24시간---멸균수10X 시험관에서 1일간 짐전시 현저한 침전이 확인된다.
10 배희석구에서 생존수는 다음의 표 2에 나타내었다.
　 102 103 104 105 106 107 108
① 9L 폭기 종료 직후--0519평판진행: 멸균수로 10X희석한 상태의 실험관액 x x x x 15 4 1
② 9L 폭기- 4시간후-- 0519평판진행-Tube-1/10X :: 균수로 10X희석한 상태의 험관액에서 부터 희석평판 진행 x x x x x 0//2 0
③-1. 9L 폭기- 24시간후(0520- 18:20)-Tube-1/10X*?*1일 후 :: 멸균수로 10X 희석한 상태의 실험관액의 희석평판 진행 0 0 0 0 0 0 X
④ ③-2. 9L 폭기- 24시간 후(0520- 18:20)_Mass cylinder 200ml -1일후(콩가루, 우리밀 혼합배지의 혼탁한 상태의 것을 직접 희석평판)-혼탁한 메스실린터에서 직접분획시 상부에 부유하고 있는 효모균이 그대로 존재 함 무한 무한 500 200 50 20 5
③-1 9L 폭기- 24시간후(0520- 18:20)-Tube-1/10X-1일 후 :: 멸균수로 10X 희석한 상태의 실험관액의 희석평판 진행에서 모든 희석구에서 생균수 0으로 나타났다.
표 3에 Y45 균주의 9L 폭기 배양에서 액체상태의 대량으로 제조한 후의 정치한 시간이 길어짐에 따른 균체 회수 가능성 평가를 위한 희석평판에 의한 생균수 평가-B를 나타냈다.
　 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
③-1 멸균수 Tube 정치 3일째에서 희석평판-채취(상 3cm에서 침전상태 이격된 희석 액) 80 10 1 0 0 0 0 　 　
③-1 멸균수 Tube 1/10X 를 다시 흔든 직후의 희석평판 무한 무한 1000 300 46 7 0 0 0
④ ③-2 9L 폭기-Mass cylinder 200ml-정치 3일째의 희석평판- 채취(상 5cm 에서 희석액) 3 2 0 0 0 0 0 0 0
72시간 정치하면 대부분의 효모균이 침전되어 상증액에 없음을 확인하였다. 중간의 페트리 디쉬에서 정치 3일째에 삼각 Y45 삼각 배양보다도 많은 수의 Yeast가 확인됨에 따라 침전유도 진행 시간에 따른 사멸은 걱정할 필요가 없다. 예상한 바와 같이 시험관의 멸균수에서는 정치 1일째는 1/10량 정도가 부유상태로 남아 있다.
메스 실리더(200ml)의 혼탁한 부유물 상태의 현탁액 등에서는 정치 3일째에 대부분의 효모는 침전되는 것이 확인된다, 이때 배양시의 투입된 영양원은 우리밀 100g, 탈지대두갑 15g, 황설탕 100g, 천연소금 5g, 기타(소포제 2ml)를 이용하여 배양된 배양액으로 부유물질이 많은 상태의 호기적인 배양상태의 액을 멸균된 메스 실리더에 200ml씩 분주한 상태이다. 배지 : YA 배지 조제(500ml).
표 4는 효모의 침전 속도를 나타낸다.
　 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
③-1 멸균수 Tube 정치 3일째에서 희석평판-채취(상 3cm에서 침전상태 이격된 희석 액) 80 10 1 0 0 0 0 　 　
③-1 멸균수 Tube 1/10X 를 다시 흔든 직후의 희석평판 무한 무한 1000 300 46 7 0 0 0
④ ③-2 9L 폭기-Mass cylinder 200ml-정치 3일째의 희석평판- 채취(상 5cm 에서 희석액) 3 2 0 0 0 0 0 0 0
효모의 침전 속도 정치 3일째 침전 확인 결과 Tube 1/10X 희석된 투명한 멸균수 Tube & Mass cylinder 200ml-정치 3일째의 희석상태에서 3일째에 효모이 침전 확인된다.
위 결과를 응용할 경우 기존의 제품제조에서 반죽(1kg) 중량에 첨가하는 Dry Yeast 0.1~0.3%을 대체할 수 있는 가능성도 확인되었다.
실시예 5: No. Y45 균주의 변색 유무의 비교 시험
도 19는 기존방법에 의하여 얻어진 반죽과 본연구의 순수분리로 얻어진 No. Y45 균주의 시험관액에서의 농도 차이 및 수 일 동안 정치시킨 후의 희석된 페이스트의 변색 유발 사진이다.
기존의‘천연발효종’(A-페이스트 표식)에서는 시간이 지남에 따라 액의 변색으로 혼탁해지며 혼탁된 띠가 선명하게 보이는 것으로 보아 호밀과 우리밀에서‘천연발효종’제조과정에서 유입된 오염균의 원인으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 하지만 새로이 순수분리된 Y45 균주는 흰색의 맑은 색을 유지하는 것을 확인하였다.
실시예 6: 순수 분리 균주의 부풀림 비교 시험
우리밀의 발효에서 기존의 ‘천연발효종’ 유래(1-A와 1-A의 10배 희석 실험구)와 순수분리, 선발에 의한 1-Y45, 2-Y40 균주를 이용하였다. 1-45는 발효 1번째 진행에서 Y45 균주를 이용하였고, 2-40은 발효 2번째 진행을 의미한다. 도 20은 부풀림 비교 시험 결과를 나타내는 사진이다.
이 중에서 Y45 효모형 균주는 기존의‘천연발효종에 비하여 부풀림의 상태가 월등하게 빨랐으며, 발효 3시간 후에 첫 Volume의 2.5배로 부풀림이 진행되었다. 부풀린 반죽을 휘저어 가라앉힌 다음 다음날 확인시에도 역시 3시간째보다도 더 높은 부풀림 자국이 남아 있었다.
우리밀 투입하여 발효 시작과 발효 1회차 부풀림 상태 비교한 사진이다. 제품 제조시에 기존의‘천연발효종’과 함께 별도의 Dried Yeast(건조 효모)를 첨가하여 평균 24시간을 발효시켜 진행하는 것에 비교하면 신규의 효모형 균주로는 부풀림 현상이 3시간이면 달성된다.
도 21은 기존 방법에 의한‘천연발효종’유래와 순수분리에 의하여 선발된 No. Y45 균주와 우리밀을 이용하여 발효 시작과 발효 2회차 부풀림 상태 비교한 사진이다.
1-A는 1회차 우리밀 첨가와 30일간 저온보관된 분주된‘천연발효종’으로 진행된 것, 1-B는 1회차 우리밀 첨가한 것으로 1-A를 10배 희석한 것이며, 1-45는 분리균주 No. Y45균주이며 1회차의 우리밀 진행이며, 2-40은 2회차 우리밀 증량한 것이다. 2-40의 병은 부풀림이 약하였으며 후차적으로 확인시 이취가 심하였다. 이는 진행과정의 실수 유입된 오염원의 영향이며, 오염원과 경합하는 효모의 발효에 지장을 받았기 때문에 부풀림이 약하였던 것으로 사료되었다.
기존(1-B & 1-A)의‘천연발효종’을 사용하는 경우에 24시간이 지나도 부풀림이 약하였지만 본 발명의 균주인 1-45(Y45)는 3시간 후에 배양병의 노란 테이핑 부분까지 부풀어 올랐고, 이후 반죽을 휘저어 놓은 후 다시 발효 15시간 후에 상부에 결합해놓은 뒤집은 병의 화살표까지 부풀었다가 사그라진 흔적을 보였다.
도 22는 우리밀 투입 3회차 단계에서, 기존 보관(Y2-7)와 신규 순수분리에 의하여 선발된 No. Y04, No. Y33 균주에 대하여 발효 시작과 발효 진행 140분 후의 부풀림 상태 비교한 사진이다.
우리밀을 이용한 반죽으로, 발효 140min 후 자체 보관 중인 기존 효모로 동정된 균주인 Y2-7의 경우 부풀림이 1.2 Volume으로 미약하였으나, 순수분리 및 선발과정의 No. Y04와 No. Y33에서는 처음 부피의 2배 이상의 부풀림 Volume을 보였으며, No. Y33 선발구는 뚜껑을 밀고 올라올 정도로 강력한 발효과정에 의한 부풀림을 보였다. 3-Y04 균주는 분리과정에서 독립 Colony의 Small size Colony였고, 3-Y33 균주는 독립 Colony의 Big size Colony였다. 따라서 순수분리과정에서의 Big size Colony 형태가 발효진행에 더 유용한 균주임이 확인되었다.
실시예 7: Y33 균주의 오염원의 증식 속도 차이 비교 시험
도 23은 Y33의 희석 배수(107~8)균주에 혼입된 오염원의 증식속도 차이 비교 사진이다.
‘천연발효종’유래의 독립 Colony를 채취하여 왔지만 작업과정의 부주의 등에 의하여 오염된 상황이며, 효모 또는 기타(유산균류 등 추정)의 생균수는 200여개(좌) 80(우)여개 중 오염균류의 승식된 Colony의 크기를 나타내고 있다. 이와 같이 대다수의 효모 또는 유산균 추정의 Colony 수보다 오염유발균은 처음 시작에서는 적게 혼재하지만 동일한 시간에 증식하는 속도는 효모균(유산균)류에 비하여 월등하게 큰 Colony를 보이는데, 이처럼 큰 균총을 형성하는 오염균은 계대횟수를 지속할 수 없는 원인이며, 도 5에서와 같이 단백질을 분해하는 효소를 분비하고 있어, 계대횟수가 진행될수록 오염균의 증식수가 많아져 이들이 분비한 효소가 강하게 반응하므로 이취가 심하게 된다.
실시예 8: Y40 균주의 증식 시간에 따른 부풀림 비교 시험
신규 분리한 No. Y40균주를 호기적인 방법에 의하여 중용량(2nd 9L)으로 효모를 증식하였으며, 호기적인 배양 2일째부터 증량할 때마다 우리밀의 동일한 량으로 첨가하게 된다. Y40균주 배양액을 (거의) 동량의 우리밀을 1회차(우리밀 150+Yeast 배양액 166g)시작하고 회차별 증량과정은 이전 단계의 2배량이 되도록하였다. 진행되는 Volume량이 과도할 때는 일부만 취하는 과정으로 6회차{(5회 반죽 300g)+우리밀400g+Y(east 배양액 343g) 340g 혼합 직후(09:45~)} 진행할 때에 첨가한 실험구에서 5시간까지의 경시적인 부풀림 진행 사진을 도 24에 나타내었다. 도 24는 발효에 따른 부풀림 진행 사진이다.
단면적이 넓은 용기(18*27*h 12cm)를 이용하여, 신규분리한 균주 No. Y40균주로 계대를 진행하면서 부풀림 현상을 평가하였다. 우리밀 반죽의 계대 횟수 6회째로 증량하여 시간별 비교한 발효반죽 부풀림의 높이(h=Volume)이다.
발효 시작시 반죽의 높이 1.5cm, 2시간 후 4.0cm, 3시간 후 5.7cm, 4시간 후 7.2cm로 부풀어 오른 상태를 보이고 있어, 본 발명에 의하여 선발된 균주는 기존 방법에서 다양하게 혼재된 균총에 비하여 발효력은 월등하게 왕성한 상황이었다.
도 21, 도 22에서의 면적이 좁은 버섯배양병(850cc 규격)과 달리 면적이 넓은 용기를 이용하였을 때에도 우리밀 발효종의 6회차까지 진행할 때에 부풀림 시간은 4시간만에 발효에 의한 부풀림은 최고조에 도달하였고, 5시간 후에는 부풀림상태가 이미 사그러졌었다.
이는 발효과정(간략 호흡반응식: C6H12O6 + O2 -> CO2 + H2O + Energy )에 의하여 생성된 CO2(이산화탄소) 가스가 포화되어 Bubble이 터졌기 때문이다. 발효과정에서 반죽의 액상화가 되는 원인 또한 발효과정(호흡반응)에서 생성되는 물질인 H2O(물)가 있기 때문이다.
위 과정에서 9L 배양액과 우리밀 발효반죽의 1g을 취하여 희석평판 배양을 진행하였으며, 광학현미경으로 검경한 결과 효모형(난형) 균주로 확인되었다. 도 25는 반죽의 광학현미경 사진이다.
우리밀 6회째 발효 후 일부를 취하여 1일밤 냉장한 후의 반죽상태의 조직감을 확인한 바는 도 16에 나타낸 바와 같이 그물망상구조를 확인할 수 있었다. 도 26은 발효 반죽의 망상 구조를 나타내는 사진이다.
이와 같은 그물망상구조의 형성은 우리밀에 함유되어 있는 글루텐에 의한 것으로 이는 발효과정에서의 단백질을 분해하지 않을 때에 잘 형성될 수 있으며, 이러한 구조가 확인되면 제빵과정의 부풀림이 잘 형성되어 질감이 양호해진다. 이러한 그물망상구조가 되면 밥스푼으로 반죽을 휘저을 때에 힘이 들 정도이며 이는 반죽의 신축성 측면에서 아주 양호한 상태라 평가할 수 있다.
실시예 9: Y40 균주를 이용한 제빵 굽기
본 실험은 새로운 방법으로 액체 배양기법을 이용하고자 진행된 것이다. 이와 같은 액체 배양에 의한 효모종균을 우리밀에 적용하였을 때에도 발효력이 강한 것이 확인되었으며, 이러한 우리밀 반죽을 이용하여 제빵 굽기 과정을 진행하였을 때에 기존의 관행방법을 충분히 대체할 수 있는 결과를 얻었다.
도 27은 신규 순수분리에 의하여 선발된 No. Y40 균주유래에 의한 제빵굽기 결과 사진이다.
본 연구에서와 같이 특수목적형의 효모를 이용할 수 있도록 고안된 방법은 우리밀의 발효반죽과정에서 물대신 액체 배양기법으로 배양된 Yeast를 대체하여 후속의 대용량 배양기법의 적용 실험에 의해 확인될 수 있다.
실시예 10: 계통수 분석
신규 순수분리에 의하여 선발된 균주의 동정 결과의 NJ tree 계통도 분석을 수행하였다. 도 28은 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주의 동정 결과의 NJ tree 계통도 분석의 실험진행 및 결과를 나타내는 도면이다.
A. 실험균주 : 1. GDO Y36, 2. GDO Y40, 3. GDO Y45
B. 의뢰내용 : LSU rRNA gene sequencing
C. 방법 : LSU rRNA 유전자 분석에 의한 효모의 동정
Sequence를 ribosomal RNA의 이차 구조를 참고하여 alignment 한다.
표준균주의 DB에서 유사도(Similarity)가 높은 순위의 리스트를 얻는다.
계통도 분석을 실시한다 (Phylogenetic tree analysis).
D. 결과 : LSU rRNA 유전자 염기서열 (길이 1200 bp 이상), 선발하여 의뢰한 시료의 동정 결과 균주 No. Y36, Y40, Y45의 균주는 모두 Saccharomyces cerevisiae 로 판정되었다.
본 신규균주의 동정 및 계통도분석 관련은 KCTC에 의뢰하여 진행되었다.
도 29는 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주 No. Y36의 염기서열을 나타내는 도면이다. 균주 GDO Y36의 LSU rRNA 유전자 염기서열의 길이는 1261bp이었다.
도 30은 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주 No. Y40의 염기서열을 나타내는 도면이다. 균주 GDO Y40의 LSU rRNA 유전자 염기서열의 길이는 1269bp이었다.
도 31은 신규 순수분리에 의하여 선발된 균주 No. Y45의 염기서열을 나타내는 도면이다. 균주 GDO Y45의 LSU rRNA 유전자 염기서열의 길이는 1269bp이었다.
제과, 제빵에 적합한 강력한 발효력을 갖는 선발된 Yeast를 원균으로 이용하고, 액체 배양상태의 최적화에 필요한 다양한 조건을 해결하여‘천연발효종’제조공정의 표준화가 필요하다.
본 발명에서 적용된 방법에 의하여 제조하게 되면, 기존제조방법에 비하여 원하지 않는 이종의 오염균 유입을 차단하여 반죽의 발효진행에서 특유의 이취가 감소되어 빵의 풍미를 살리고 빵의 원재료의 맛과 향을 느낄 수 있으며, 기존의 방법에 비하여 우수한 발효력을 나타내고 부플림의 반복시간이 주기적으로 진행되어 제품화의 표준화에 적합한 잇점이 있다.
본 발명의 균주는 우리밀을 주재료 사용한 상태에서도 균 증식속도가 양호하였으며, 폭기배양을 유지하면서도 제과, 제빵에 사용하기 위하여 비교적 긴 배양 기간 동안 활력에 문제가 없을 것으로 판단하였다.
이러한 방법에 의한 대량 생균의 생산으로 천연발효종의 균일성을 확보하여 다음 단계에서의 표준화를 이루는 데에 효과가 클 것으로 판단된다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명의 사상은 아래에 기재된 특허 청구 범위에 의해서만 파악되어야 하고, 이의 균등 또는 등가적 변형 모두는 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
본 발명은 우석대학교 LINC3.0사업단과 강동오케익 협약체계에 의하여 수행된 산학공동연구(민간과제 ; 2023-0105) ‘국산 우리밀에 잘 적응한 우량효모의 순수분리 및 동정’의 연구 결과로 이루어진 것이다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15481BP 20230626
<110> KDO CAKE CO., LTD. <120> Superior yeast well adapted to Korean wheat purely separated and identified <130> KDO <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1262 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 tttgaaatct ggtaccttcg gtgcccgagt tgtaatttgg agagggcaac tttggggccg 60 ttccttgtct atgttccttg gaacaggacg tcatagaggg tgagaatccc gtgtggcgag 120 gagtgcggtt ctttgtaaag tgccttcgaa gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa 180 gtgggtggta aattccatct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gaacaagtac 240 agtgatggaa agatgaaaag aactttgaaa agagagtgaa aaagtacgtg aaattgttga 300 aagggaaggg catttgatca gacatggtgt tttgtgccct ctgctccttg tgggtagggg 360 aatctcgcat ttcactgggc cagcatcagt tttggtggca ggataaatcc ataggaatgt 420 agcttgcctc ggtaagtatt atagcctgtg ggaatactgc cagctgggac tgaggactgc 480 gacgtaagtc aaggatgctg gcataatggt tatatgccgc ccgtcttgaa acacggacca 540 aggagtctaa cgtctatgcg agtgtttggg tgtaaaaccc atacgcgtaa tgaaagtgaa 600 cgtaggttgg ggcctcgcaa gaggtgcaca atcgaccgat cctgatgtct tcggatggat 660 ttgagtaaga gcatagctgt tgggacccga aagatggtga actatgcctg aatagggtga 720 agccagagga aactctggtg gaggctcgta gcggttctga cgtgcaaatc gatcgtcgaa 780 tttgggtata ggggcgaaag actaatcgaa ccatctagta gctggttcct gccgaagttt 840 ccctcaggat agcagaagct cgtatcagtt ttatgaggta aagcgaatga ttagaggttc 900 cggggtcgaa atgaccttga cctattctca aactttaaat atgtaagaag tccttgttac 960 ttaattgaac gtggacattt gaatgaagag cttttagtgg gccatttttg gtaagcagaa 1020 ctggcgatgc gggatgaacc gaacgtagag ttaaggtgcc ggaatacacg ctcatcagac 1080 accacaaaag gtgttagttc atctagacag ccggacggtg gccatggaag tcggaatccg 1140 ctaaggagtg tgtaacaact caccggccga atgaactagc cctgaaaatg gatggcgctc 1200 aagcgtgtta cctatactct accgtcaggg ttgatatgat gccctgacga gtaggcaggc 1260 gt 1262 <210> 2 <211> 1269 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 gctcaaattt gaaatctggt accttcggtg cccgagttgt aatttggaga gggcaacttt 60 ggggccgttc cttgtctatg ttccttggaa caggacgtca tagagggtga gaatcccgtg 120 tggcgaggag tgcggttctt tgtaaagtgc cttcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca 180 gctctaagtg ggtggtaaat tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa 240 caagtacagt gatggaaaga tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa 300 ttgttgaaag ggaagggcat ttgatcagac atggtgtttt gtgccctctg ctccttgtgg 360 gtaggggaat ctcgcatttc actgggccag catcagtttt ggtggcagga taaatccata 420 ggaatgtagc ttgcctcggt aagtattata gcctgtggga atactgccag ctgggactga 480 ggactgcgac gtaagtcaag gatgctggca taatggttat atgccgcccg tcttgaaaca 540 cggaccaagg agtctaacgt ctatgcgagt gtttgggtgt aaaacccata cgcgtaatga 600 aagtgaacgt aggttggggc ctcgcaagag gtgcacaatc gaccgatcct gatgtcttcg 660 gatggatttg agtaagagca tagctgttgg gacccgaaag atggtgaact atgcctgaat 720 agggtgaagc cagaggaaac tctggtggag gctcgtagcg gttctgacgt gcaaatcgat 780 cgtcgaattt gggtataggg gcgaaagact aatcgaacca tctagtagct ggttcctgcc 840 gaagtttccc tcaggatagc agaagctcgt atcagtttta tgaggtaaag cgaatgatta 900 gaggttccgg ggtcgaaatg accttgacct attctcaaac tttaaatatg taagaagtcc 960 ttgttactta attgaacgtg gacatttgaa tgaagagctt ttagtgggcc atttttggta 1020 agcagaactg gcgatgcggg atgaaccgaa cgtagagtta aggtgccgga atacacgctc 1080 atcagacacc acaaaaggtg ttagttcatc tagacagccg gacggtggcc atggaagtcg 1140 gaatccgcta aggagtgtgt aacaactcac cggccgaatg aactagccct gaaaatggat 1200 ggcgctcaag cgtgttacct atactctacc gtcagggttg atatgatgcc ctgacgagta 1260 ggcaggcgt 1269 <210> 3 <211> 1269 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 gctcaaattt gaaatctggt accttcggtg cccgagttgt aatttggaga gggcaacttt 60 ggggccgttc cttgtctatg ttccttggaa caggacgtca tagagggtga gaatcccgtg 120 tggcgaggag tgcggttctt tgtaaagtgc cttcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca 180 gctctaagtg ggtggtaaat tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa 240 caagtacagt gatggaaaga tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa 300 ttgttgaaag ggaagggcat ttgatcagac atggtgtttt gtgccctctg ctccttgtgg 360 gtaggggaat ctcgcatttc actgggccag catcagtttt ggtggcagga taaatccata 420 ggaatgtagc ttgcctcggt aagtattata gcctgtggga atactgccag ctgggactga 480 ggactgcgac gtaagtcaag gatgctggca taatggttat atgccgcccg tcttgaaaca 540 cggaccaagg agtctaacgt ctatgcgagt gtttgggtgt aaaacccata cgcgtaatga 600 aagtgaacgt aggttggggc ctcgcaagag gtgcacaatc gaccgatcct gatgtcttcg 660 gatggatttg agtaagagca tagctgttgg gacccgaaag atggtgaact atgcctgaat 720 agggtgaagc cagaggaaac tctggtggag gctcgtagcg gttctgacgt gcaaatcgat 780 cgtcgaattt gggtataggg gcgaaagact aatcgaacca tctagtagct ggttcctgcc 840 gaagtttccc tcaggatagc agaagctcgt atcagtttta tgaggtaaag cgaatgatta 900 gaggttccgg ggtcgaaatg accttgacct attctcaaac tttaaatatg taagaagtcc 960 ttgttactta attgaacgtg gacatttgaa tgaagagctt ttagtgggcc atttttggta 1020 agcagaactg gcgatgcggg atgaaccgaa cgtagagtta aggtgccgga atacacgctc 1080 atcagacacc acaaaaggtg ttagttcatc tagacagccg gacggtggcc atggaagtcg 1140 gaatccgcta aggagtgtgt aacaactcac cggccgaatg aactagccct gaaaatggat 1200 ggcgctcaag cgtgttacct atactctacc gtcagggttg atatgatgcc ctgacgagta 1260 ggcaggcgt 1269

Claims (4)

  1. 국내산 호밀과 우리밀에서 유래하고 천연발효종의 배양과정에서 얻어진 균주로서, 분리 과정에서 증식력이 높은 큰 Colony에서 분리되고, Cellulose를 분해할 수 있고, 알콜발효력이 강력하며 우리밀가루 반죽의 부풀림 양호하여 발효 시간을 단축할 수 있으며, KCTC15481BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 신규 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y45 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 LSU rRNA 유전자 서열이 서열목록의 서열 3의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 신규 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) GDO Y45 균주.
  3. 삭제
  4. 삭제
KR1020230093815A 2023-07-19 2023-07-19 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모 KR102644443B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020230093815A KR102644443B1 (ko) 2023-07-19 2023-07-19 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020230093815A KR102644443B1 (ko) 2023-07-19 2023-07-19 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102644443B1 true KR102644443B1 (ko) 2024-03-07

Family

ID=90271565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230093815A KR102644443B1 (ko) 2023-07-19 2023-07-19 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102644443B1 (ko)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020063163A (ko) 1999-09-22 2002-08-01 가네가후치 가가쿠 고교 가부시키가이샤 신규 빵 효모 및 그 효모를 함유하는 밀가루 반죽
WO2011025635A2 (en) * 2009-08-31 2011-03-03 Avon Products, Inc. Cosmetic uses of modified stressed yeast extracts and related compositions
KR101095805B1 (ko) 2009-08-19 2011-12-21 씨제이푸드빌 주식회사 천연 발효종의 제조방법 및 상기 천연 발효종을 이용한 제빵용 반죽의 제조방법
JP2014521357A (ja) * 2011-08-12 2014-08-28 プラトス ナームローズ フェノートサップ 新規なサワードウ組成物およびそれらの調製方法
KR101753372B1 (ko) 2016-08-12 2017-07-04 주식회사 창억 기능성 균주를 이용한 부피 및 풍미가 개선된 증편의 제조방법
KR102077760B1 (ko) 2018-02-13 2020-02-17 우석대학교 산학협력단 Weissella cibaria KW1를 포함하는 천연 발효종 및 천연 발효종의 제어 방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020063163A (ko) 1999-09-22 2002-08-01 가네가후치 가가쿠 고교 가부시키가이샤 신규 빵 효모 및 그 효모를 함유하는 밀가루 반죽
KR101095805B1 (ko) 2009-08-19 2011-12-21 씨제이푸드빌 주식회사 천연 발효종의 제조방법 및 상기 천연 발효종을 이용한 제빵용 반죽의 제조방법
WO2011025635A2 (en) * 2009-08-31 2011-03-03 Avon Products, Inc. Cosmetic uses of modified stressed yeast extracts and related compositions
JP2014521357A (ja) * 2011-08-12 2014-08-28 プラトス ナームローズ フェノートサップ 新規なサワードウ組成物およびそれらの調製方法
KR101753372B1 (ko) 2016-08-12 2017-07-04 주식회사 창억 기능성 균주를 이용한 부피 및 풍미가 개선된 증편의 제조방법
KR102077760B1 (ko) 2018-02-13 2020-02-17 우석대학교 산학협력단 Weissella cibaria KW1를 포함하는 천연 발효종 및 천연 발효종의 제어 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108118002B (zh) 一种分枝横梗霉及其应用
CN112940954A (zh) 一株高产酯异常威克汉姆酵母及其应用
KR101138684B1 (ko) 유용미생물 배양방법 및 이를 이용한 식품
KR20140043988A (ko) 제빵용 천연발효종의 제조방법
CN109971657B (zh) 一种高产糖化酶的米根霉及其应用
CN112322509B (zh) 耐低温、高产酒精的矮小假丝酵母菌、其组合物及应用
KR101774912B1 (ko) 알코올 분해력이 높은 아로니아 유래 초산균 및 그 균주를 이용한 아로니아 식초 제조방법
KR102644443B1 (ko) 순수분리 및 동정되고 국산 우리밀에 잘 적응한 신규 우량 효모
JPH03172171A (ja) 微生物の培養法
KR101242108B1 (ko) 제빵용 효모의 대량생산방법
CN116769611A (zh) 一种产糖化酶的曲霉属菌株、糟醅发酵方法及其应用
FI97068B (fi) Uusi leivinhiiva
CN114621880B (zh) 一株产酯的异常威克汉姆酵母及其在白酒大曲中的应用
JP2021078358A (ja) 酵母及びこれを用いた食品
Mounir et al. Optimization of biomass production of Acetobacter pasteurianus KU710511 as a potential starter for fruit vinegar production
CN113502233B (zh) 一株美极梅奇酵母及其在葡萄酒酿造中的应用
Kadhim et al. Morphological and phylogenetic identification of Pichia species associated with foods in Basrah, Iraq
JP7152921B2 (ja) 特定の地域の生育する椿由来の新規酵母
JP5478692B1 (ja) 新規発酵風味液及び該発酵風味液を含有する食品
KR102177262B1 (ko) 저온 내성을 갖는 카자흐스타니아 세르바찌 yog-07 균주 및 이의 용도
Novichenko et al. Study of antimicrobial activity and fermentability of the yeast Wickerhamomyces anomalus in wheat dough
Olowonibi Isolation and characterization of palm wine strains of
KR100208968B1 (ko) 고핵산 효모엑기스 제조에 이용되는 Saccharomyces cerevisiae NS 9 균주
CN116769619B (zh) 一株假丝酵母b2、辣椒制品和方法
Lasztity Micro-organisms important in food microbiology

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant