CN107922916B - 由传统酱曲分离的新型菌株、利用该菌株的豆曲制作方法及由该制作方法制作的豆曲 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及作为由传统酱曲分离的菌株的解淀粉芽孢杆菌CJ14‑6菌株、利用该菌属的豆曲制作方法以及由该制作方法制作的豆曲，所述豆曲制作方法包括通过将大豆浸渍或通过对大豆加水来进行蒸煮的蒸煮步骤；及在向所蒸煮的大豆接种解淀粉芽孢杆菌CJ14‑6菌株并进行发酵后进行干燥，以制作豆曲的制曲步骤。
Description
技术领域
本发明涉及作为由传统酱曲分离的具有优异的蛋白酶(protease)活性且具有抗肥胖活性的新的菌株的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ14-6菌株、利用该菌属的豆曲制作方法以及由该制作方法制作的豆曲。
背景技术
酱曲是用作作为韩国传统的豆发酵食品的酱油、辣椒酱和大酱等的原料的发酵食品。以大豆为主要原料制作的酱曲是用于制作传统酱类，即酱油、辣椒酱和大酱等的重要起始物(starter)。
酱曲根据其制作方法分为传统酱曲、改良式酱曲和工业用曲子(koji)。传统酱曲是在仅利用大豆成型后，用稻草包裹并发酵一定时间而成的；改良式酱曲是在蒸煮的大豆中预先添加曲霉属(Aspergillus sp.)菌株以发酵而成的；工业上生产的曲子是用小麦米或小麦粉用曲霉属的黄曲菌发酵而成的。
辣椒酱根据制作方法大致分为传统式(老式)辣椒酱和工厂式(改良式)辣椒酱。传统式辣椒酱是在将辣椒酱用酱曲(以一定比例混合大豆和谷物而制作)、大米等淀粉质原料、麦芽、食盐和辣椒面混合后，经发酵熟成而制作的。工厂式辣椒酱是熟成式、糖化式辣椒酱，其使用通过纯培养米曲霉(Aspergillus oryzae)而得的曲子而不是辣椒酱用酱曲。在曲子制作中，蛋白质原料使用大豆，淀粉质原料使用米或小麦粉。
随着女性走进社会的比重增加，购买工厂制作的辣椒酱的家庭也随之增加，因此工厂式辣椒酱的生产量表现出持续增加的趋势，辣椒酱的出口量也在呈现出持续增加的势头。
作为上述传统的工厂式辣椒酱的批量生产方法，韩国授权专利第10-0668056号公开了一种向大豆颗粒接种预培养的微生物并进行发酵而制备的大豆酱曲及其制作方法。更具体地，上述现有技术中公开了豆曲的制作方法以及由该方法制作的豆曲，该方法包括在将大豆蒸煮后进行干燥的蒸煮步骤及向上述大豆接种由传统酱曲分离培养的微生物后发酵一定时间段的制曲步骤。
但是即使采用上述传统方法，仍需要开发用于工厂式辣椒酱的批量生产的豆曲。
[现有技术文献]
专利文献1：KR10-0668056 B1(公告日2007年01月11日)
发明内容
技术问题
因此，本发明的发明人为了工厂式辣椒酱的大量生产而进行研究，以从传统酱类筛选出蛋白酶活性优异的菌株，从而筛选出了解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CJ14-6菌株，并确认到利用该菌株能够制作适合工厂式辣椒酱的大量生产的豆曲，由此完成了本发明。
本发明的目的在于，提供一种作为由传统酱曲分离的菌株的解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株。
另外，本发明的另一目的在于，提供一种利用所述菌株的豆曲的制作方法。
此外，本发明的又一目的在于，提供一种通过上述制作方法制作的豆曲。
技术方案
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供由传统酱曲中分离的具有优异的蛋白酶(protease)活性且具有抗肥胖活性的菌株解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株。
本发明还提供一种豆曲制作方法，包括：通过将大豆浸渍或通过对大豆加水而进行蒸煮的蒸煮步骤；及向所蒸煮的大豆接种解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株并进行发酵的制曲步骤。
本发明还提供由上述豆曲的制作方法制作的豆曲。
发明效果
本发明由传统酱曲中分离并筛选作为蛋白酶(protease)活性优异的新型菌株的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ14-6，并将此用于豆曲的制作，从而具有能够批量生产工厂式辣椒酱的效果。
附图说明
图1是实验例1中，利用苯胺蓝(aniline blue)染色液染色的对照组脂肪细胞的照片。
图2是实验例2中，利用苯胺蓝(aniline blue)染色液染色的实施例2组的脂肪细胞的照片。
具体实施方式
下面通过实施例详细说明本发明。
作为本发明第一方面，本发明提供作为由传统酱曲分离的具有优异的蛋白酶(protease)活性的菌株的解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株。
具体地，本发明由韩国传统酱曲中分离多种菌株，在活性培养基中经初级筛选得到蛋白酶活性优异的芽孢杆菌属(Bacillus spp.)菌株，其次，以大豆为原料进行固体培养后，经次级筛选得到蛋白质分解能力较强的菌株。通过16s rDNA碱基序列分析(16s rDNAsequencing)，对最终筛选的芽孢杆菌属菌株进行了鉴定。
分离的芽孢杆菌属菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(序列号1)。将蛋白酶活性优异的该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ14-6，在2015年7月1日将其保藏至韩国微生物保藏中心(保藏号KCCM11718P)。
作为本发明第二方面，本发明提供包括通过将大豆浸渍或通过对大豆加水来进行蒸煮的蒸煮步骤；及向所蒸煮的大豆接种解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株并进行发酵的制曲步骤的一种豆曲制作方法。
更具体地，本发明提供如下的豆曲制作方法，包括：对大豆进行筛选和洗涤，并将大豆浸渍或对大豆加水的步骤；将大豆蒸煮后冷却的步骤；培养解淀粉芽孢杆菌CJ14-6以制备培养液的步骤；及向所冷却的大豆接种上述解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株的培养液并进行发酵的制曲步骤。
在所述蒸煮步骤之前，该制作方法还包括：在10℃至50℃下，将筛选和洗涤的大豆浸渍1至15小时的步骤，且可以加入饱和蒸汽(1.0～2.0kgf/cm2)，以在100℃～150℃下蒸煮1至60分钟，但不限于此。所蒸煮的大豆可以冷却至30℃至50℃，优选冷却至30℃至35℃。
所述大豆可以用高压蒸汽灭菌器(Autoclave)在100℃至150℃下蒸煮5分钟至15分钟，优选可以在110℃蒸煮10分钟。
所述解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株可以使用被转换为孢子状态培养的培养液，而且以原料总重量为基准，可以向所蒸煮的大豆接种0.1至3.0重量％的该培养液。
培养所述菌株的培养基可以是酱油培养基。所述酱油培养基可以通过将选自韩式酱油、酿造酱油或混合酱油的酱油1～10％和选自葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、半乳糖(glactose)或麦芽糖(maltose)的糖源0.1～10％混合而制作。
作为本发明的另一方面，本发明将纯化分离而保管的解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株接种至酱油培养基(酿造酱油+葡萄糖)，在30至42℃的温度范围培养20至42小时，直到生成孢子，从而制备解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株培养液。
接种解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株并进行混合后，在30℃至45℃，优选在34℃至44℃发酵1至3日而制备豆曲。
进一步地，在所述制曲步骤之后还可以进行干燥步骤。
作为本发明的第三方面，本发明还提供通过所述豆曲的制作方法来制作的豆曲。
通过本发明的制作方法来制作的豆曲可以用于工厂式辣椒酱的批量生产。
下面通过实施例进一步详细说明本发明的内容。但是，这些实施例仅用于例示本发明内容，本发明的保护范围不应被解释为由这些实施例限定。
[实施例]
实施例1：由传统酱曲分离并鉴定菌株
(1)菌株的分离和鉴定
本发明中作为起始物质使用的菌株是从京畿道、江原道、忠清北道、全罗南道的传统食品制作企业中收购的传统酱曲中分离、筛选。
将传统酱曲用灭菌水稀释之后，涂覆至寒天培养基(Nutrient agar(营养琼脂)，Difco公司)上，在37℃培养，并从传统酱曲中选择作为优势种栖息的5种细菌来进行纯化分离并鉴定。将分离的菌株分别命名为CJ3-27、CJ4-4、CJ5-10、CJ14-6和CJ16-57。
在营养培养基(Nutrient Broth(营养肉汤)，Difco公司)中，在37℃下以200rpm振荡培养上述分离的菌株24小时后，比较了蛋白酶的效价。鉴定结果和蛋白酶的效价结果在下表1中示出。
[表1]
源自传统酱曲的菌株的鉴定结果
(2)初级筛选
在上述经分离、鉴定的菌株中，初步选定除了显示最低蛋白酶效价的CJ5-10之外的CJ3-27、CJ4-4、CJ14-6、和CJ16-57。
(3)次级筛选
利用上述经初级筛选的菌株4种来制作豆曲，测定各自的蛋白酶效价。将其结果示于下表2中，并将结果进行比较以进行优秀菌株的次级筛选。
为了制作豆曲，将1kg的大豆在纯水中浸渍12小时后，用高压蒸汽灭菌器(Autoclave)在110℃下蒸煮10分钟，并在蒸煮后冷却至35℃。向经冷却的蒸煮大豆中混合以原料总重量为基准2.0重量％的上述分离的菌株后，在37℃下分别培养3日，并利用它们分别制作了豆曲。
通过利用蒸馏水在30℃下对上述分别制作的豆曲进行1小时的萃取和过滤后将其用作粗酶液而实施蛋白酶效价测定。作为酶反应液，向粗酶液
添加作为基质的2％的乳酪蛋白(Milk casein)
Mcllivine缓冲液(pH 6.0)
并在38℃下使其反应1小时。此后，加入0.4M TCA(三氯乙酸)溶液
以终止反应并进行过滤后，加入0.4M的Na2CO3 
和苯酚试剂
并充分混合，然后在38℃下显色30分钟，利用分光光度计在660nm测定吸光度。此时，至于酶活性，将1分钟内生成1μg的酪氨酸的酶的量定义为一个单位，利用酪氨酸为标准物质制作了校准曲线(calibration curve)。
[表2]
使用经初级筛选的菌株的豆曲的蛋白酶效价比较
| 经初级筛选的菌株 | 蛋白酶效价(U/g) |
| CJ3-27 | 258 |
| CJ4-4 | 118 |
| CJ14-6 | 225 |
| CJ16-57 | 155 |
从上述表2的结果，选定了蛋白酶效价优异的CJ3-27和CJ14-6菌株。
(4)三级筛选-体外(In vitro)3T3-L1抗肥胖活性
甲.细胞株
从韩国细胞株银行(KCLB)领取小鼠胚胎成纤维细胞系(Mouse embry onicfibroblast cell line)3T3-L1细胞并用作脂肪分化细胞。
乙.细胞培养
使用含有10％BCS(小牛血清)以及1％青霉素-链霉素(Penicillin-streptomycin)的DMEM培养基(杜氏改良Eagle培养基)来培养3T3-L1细胞。细胞增殖到培养皿的70％程度时，在1000rpm下离心分离5分钟后回收，并以1:5比例传代培养而使用。
丙.MTT assay
以细胞内的线粒体脱氢酶(mitochondria dehydrogenase)与MTT反应而形成蓝色的MTT甲臢晶体(MTT formazan crystal)为基本原理，按照Carmichael等的方法进行细胞增殖实验(MTT assay)。以1.5×104/ml浓度向48孔分别分株500μl的3T3-L1细胞后，在37℃、5％CO2的培养箱中培养24小时，以使细胞附着在板底。次日，向各个孔注入试料以使最终浓度为1000、250、0μg/ml。培养24小时后，向包含试料的培养基中分别加入被调整为5mg/ml的溴化噻唑蓝四氮唑溶液(Thiazolyl Blue Tetrazolium bromide solution)50μl，在37℃、5％CO2的培养箱中培养4小时。反应结束后，去除包含MTT试剂的培养基，添加300μl的二甲亚砜(DMSO，Dimethyl sulfoxide)以溶解MTT甲臢晶体(MTT-formazan crystal)，并在诱导显色5分钟后，利用ELISA酶标仪(microplate reader)在540nm下测定吸光度。
丁.3T3-L1cell的分化诱导
为了诱导细胞分化，以2.5×104/ml浓度将细胞接种至6孔板，用含有10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)的DMEM，在37℃、5％CO2的培养箱中培养4天，直至达到post-confluence(汇合后期)状态。抗肥胖实验中使用的代表性的阳性对照组使用了通过抑制全脂肪细胞的分化、促进脂肪分解、诱导成熟脂肪细胞的细胞自杀而具有脂肪形成抑制效果的白藜芦醇(resveratol)。达到Post-confluent状态，则在Day 0使用作为分化诱导培养基的含有10％FBS、1％青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)、5μg/ml胰岛素、1μM DMS(dexamethasone(地塞米松))、0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤))的培养基处理72小时，在Day 3和5使用仅含有10％FBS、1％青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)以及10μg/ml INS(胰岛素)的DMEM分化进行培养基进行处理。同时每当交换培养基时所有试料被处理成其最终浓度为10、50、0μg/ml，阳性对照组被处理成其浓度为20μg/ml。
戊.油红O(Oil Red O)染色和数值化
为了确认培养中的3T3-L1cell的分化程度，在分化最后一天第7天，使用染色脂肪滴的油红O试剂，改变Rene等和Kasturi等的方法以进行染色。
经分化的细胞通过在各个孔中注入多聚甲醛(para-formaldehyde(在PBS(磷酸盐缓冲液)中))，在常温下反应1小时以上并进行固定。去除固定液后，使用0.5％油红O染色(Oil Red O staining)对细胞进行染色1小时，并为了去除剩余染色而在流水中洗涤2次，直到板上无残留染色试剂，而染色的脂肪滴用异丙醇溶解，在510nm下测定吸光度。
比较了已确认具有较高的蛋白酶活性的2种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CJ3-27、CJ14-6的脂肪细胞分化抑制能力，以测定体外抗肥胖活性。
[表3]
经次级筛选的菌株的脂肪细胞分化抑制率
统计学鉴定：student-T test
*:P<0.05
如上述表3的结果所示，相比在脂肪细胞分化抑制率上并没有显著性差异的CJ3-27菌株培养液，CJ14-6菌株培养液的脂肪细胞分化抑制率显示出具有显著性意义的阻碍性。
实施例2：豆曲的制作
将作为在上述实施例1中最终筛选的新型菌株的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CJ14-6为种菌，按照上述实施例1-(1)种记载的豆曲制作方法制作了豆曲。
为了与以往利用米曲酶的豆曲比较，利用CHONGMU发酵市售的通常的米曲酶(Aspergillus oryzae)作为麴菌，按照上述实施例1-(1)记载的豆曲制作方法制作了豆曲。
(1)蛋白酶效价测定
测定上述各个豆曲的蛋白酶效价，并将其结果示于下表4。
[表4]
使用新型解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ14-6和通常的米曲酶的豆曲的发酵效价
| 菌株 | 蛋白酶效价(U/g) |
| 解淀粉芽孢杆菌CJ14-6 | 225 |
| 通常的米曲酶 | 102 |
从上述表4种可以知道，使用新型解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CJ14-6菌株的豆曲的蛋白酶效价相比使用米曲酶(Aspergillusoryzae)的豆曲提高120.6％，用于辣椒酱或大酱的制作时，促进蛋白质成分分解力而能够有助于提高味道品质。
实验例1：使用新菌株(CJ14-6)的豆曲的抗肥胖效果测定
为了验证新型解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ14-6豆曲(实施例4)的抗肥胖效果，进行了动物实验。实验中使用的动物为雄性白鼠(S.D.rat 5周龄)，是从DAMOOL科技(韩国)购买的，饲养室温度维持为18±2℃，以12小时周期(08:00～20:00)进行调节。
实验鼠以每组7只分为2组，对照组的白鼠用粉末饲料中添加了猪油(lard)20％，供给高脂肪饲料，在实施例2组的所述高脂肪饲料中供给使用本发明的新型菌株的豆曲粉末0.91％。它们的体重和脂肪组织重量示于表5和表6。
每一周测定体重和饲料摄取量，脂肪组织重量和脂质含量在实验终止前进行12小时绝食后测定。采集的血液在1900×G下离心分离20分钟后，分离血清，以用作血清中脂质含量样本。为了分析肝和脂肪组织的总脂质、中性脂肪和总胆固醇含量，向摘取的肝和脂肪组织中添加0.1g的氯仿-甲醇(chloroform-methanol)(2:1，v/v)，并在冷藏状态下放置3天后添加蒸馏水，在1150×G下离心分离20分钟后，测定作为脂质层的底层部的总脂质含量。将该总脂质稀释以用于总胆固醇和中性脂肪含量的分析。由此获得的血清和组织的脂质含量结果在表7、8、9、和10中示出。
为了测定脂肪组织的脂肪酸生物合成相关酶活性，添加了相当于脂肪组织重量3倍的0.1M磷酸钙缓冲液(potassium phosphate buffer)(pH 7.4，37℃)，以进行均质化，然后在3000rpm下离心分离15分钟，取上澄液再次以15000rpm离心分离30分钟后，收集上澄液以使用。由此获得的酶活性结果在表11和表12中示出。
为了测定脂肪细胞的大小，用Bouin固定液对摘取的脂肪组织进行固定，制作蜡块并制作切片后，使用苯胺蓝(aniline blue)染色液进行染色。之后通过电子显微镜拍摄脂肪细胞照片后，比较了处理组间的脂肪细胞。
[表5]
[表6]
[表7]
表8
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
| 处理组 | 对照组 | 实施例2组 |
| 脂肪细胞照片 | 参照图1 | 参照图2 |
| 脂肪细胞大小(μm<sup>2</sup>) | 21.41±2.45 | 18.18±1.11 |
[表14]
统计学鉴定：student-T test
*:P<0.05
**:P<0.01
***:P<0.001
如上述表5的结果所示，可以确认实施例2组的体重增加率为对照组的91.5％水平。此外，表6的结果显示，在肾周脂肪组织的重量上，其重量增加量为对照组的83.3％，同样呈现减少。
因此从上述实施例的结果可以知道使用新菌株(CJ14-6)豆曲具有体重减少效果。
[保藏号]
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏号：KCCM11718P
保藏日期：2015-07-01
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 由传统酱曲分离的新型菌株、利用该菌株的豆曲制作方法及由该制作方法制作的豆曲
<130> PP16-0112
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1418
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 1
agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac 60
gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg 120
ttgtttgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac 180
ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga 240
cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360
aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc 420
ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc 540
ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600
tgagtgcaga agaggagagt gggagtacca cgtgtagcgg tgacatgcgt agagatgtgg 660
aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgacagcg 720
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgataagt 780
gttagggggt ttccgccctt tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag 840
tacggtcgca agagtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900
gtggtttaat tagaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc 960
tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gagcatggtt gtcgtcagct 1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatt ttagttgcca 1080
gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gttacacacg tgttacaatg gacagaacaa 1200
agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttttcagt tcggatcgca 1260
gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1320
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtctctc cacgagagtt tgtaacaccc 1380
gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccga 1418
Claims (7)
1.一种由传统酱曲分离鉴定的具有优异的蛋白酶活性、具有抗肥胖活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CJ14-6菌株，其保藏号为KCCM11718P。
2.一种豆曲的制造方法，包括：通过将大豆浸渍或通过对大豆加水来进行蒸煮的蒸煮步骤；及向所蒸煮的大豆接种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株并进行发酵的制曲步骤。
3.根据权利要求2所述的豆曲的制作方法，其中，在所述蒸煮步骤之前，所述制作方法还包括：在10℃至50℃下，将经筛选和洗涤的大豆浸渍1至15小时，
所述蒸煮步骤包括：加入1.0kgf/cm2至2.0kgf/cm2的饱和蒸汽，以在100℃至150℃下蒸煮1分钟至60分钟，
在所述蒸煮步骤后，所述制作方法还包括：将所蒸煮的大豆冷却至30℃至50℃。
4.根据权利要求2所述的豆曲的制作方法，其中，在所述蒸煮步骤中，用高压蒸汽灭菌器(Autoclave)在100℃至150℃下蒸煮5分钟至15分钟。
5.根据权利要求2所述的豆曲的制作方法，其中，以原料总重量为基准，向所蒸煮的大豆接种0.1重量％至3.0重量％的所述解淀粉芽孢杆菌CJ14-6菌株。
6.一种豆曲，所述豆曲由权利要求2至5中任一项所述的方法制作。
7.一种豆曲，所述豆曲由权利要求2至5中任一项所述的方法制作，且具有抗肥胖活性。
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