CN117100770A - 一种适用于水产动物的免疫增强剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于水产动物的免疫增强剂及其应用，所述免疫增强剂的活性成分为贝莱斯芽孢杆菌BSG‑2和/或其发酵产物，且其保藏编号为CCTCC NO：M 20222096；该菌株分离自健康的加州鲈肠道，不仅具有良好的抗逆性，还具有优良的益生性；将其用于水产养殖中，可有效改善机体的营养利用，并为机体在细菌性以及病毒性病原感染时提供免疫保护，降低感染死亡率，在鱼类养殖业中具有良好的应用前景。

Description

一种适用于水产动物的免疫增强剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物免疫技术领域，具体涉及一种适用于水产动物的免疫增强剂，该免疫增强剂的活性成分为贝莱斯芽孢杆菌BSG-2和/或其发酵产物，该免疫增强剂可以有效促进鱼类生长，提高抗病力且对水产动物损伤可能性更小。

背景技术

鱼类等水产品是提供蛋白质的重要来源之一，然而由于水产养殖过程中不断追求集约化、高密度养殖以及药物的频繁使用等原因，导致水产养殖过程中病害种类和程度越来越严重，严重制约了水产养殖业健康可持续发展。与此同时，水产养殖过程中普遍存在饵料率不足，由此所造成的饵料浪费导致了环境污染以及养殖成本升高，这极大的降低了养殖户的热情。因此，如何提高机体的营养利用以及安全有效的预防和控制疾病的发生是目前发展水产养殖业亟需解决的难题。

益生菌是当下普遍使用的饲料添加剂之一，可通过产生消化酶从而有助于机体的营养吸收，另外也可应用于发酵工艺使得原料中大分子蛋白变为容易被吸收的小分子营养物质。不足的是，鉴于鱼源益生菌的匮乏，企业在添加益生菌来改善鱼类饲料发酵工艺时，多数都是照搬畜禽的模式，采用来源于畜禽的工程菌；由于这些工程菌不能很好适应和定植于水产动物消化道内，常常效果不佳。对于外源性益生菌参与调节其他鱼类物种的研究已早有报道，然而，其中所涉及到的一些潜在问题如非同源物种来源的益生菌存在于机体的“不适”特征却未得到评估，例如，非同源物种来源的益生菌在机体的定殖能力如何，益生菌本身存在的毒力基因是否会对不同物种的鱼体造成安全性威胁。

另有研究表明，益生菌调控机体营养利用的同时，也参与机体的黏膜免疫应答，进而提高机体的免疫力和抗病力。然而，益生菌种类广泛，且益生能力存在差异。目前，芽孢杆菌属作为广泛使用的益生菌种类，因其抗逆性强，作用效果明显从而被广泛的应用在水产养殖业中。因此，寻求性能优良的鱼源益生性芽孢杆菌对提高鱼类机体的营养利用以及安全有效控制鱼类疾病迫在眉睫，这对鱼类养殖业的生产利用具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂，该微生物不但能提高鱼类机体的营养利用，还能用于鱼类常见危害性细菌病原和病毒性病原感染类疾病的防治，以促进水产养殖业的良性发展。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明第一方面提供了一种适用于水产动物的免疫增强剂，其活性成分为贝莱斯芽孢杆菌BSG-2和/或其发酵产物；对该菌株进行全基因组测序，明确其为贝莱斯芽孢杆菌，其拉丁文学名为Bacillus velezensis BSG-2，且该菌株已于2022年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20222096，保藏地址为中国武汉·武汉大学。

该菌株分离自加州鲈(学名大口黑鲈，Micropterus salmoides)肠道，来源于同源物种的共生芽孢杆菌可大大降低物种之间的排斥性，对同源物种的损伤更低，且有利于其在肠道的定植，故该菌株适用于水产动物，尤其是加州鲈。

在上述免疫增强剂中，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2可以为冻干菌粉或菌体悬液等形式，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的发酵产物可以是贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的发酵液、发酵液提取物或发酵提取物的冻干粉等形式。

进一步地，在上述免疫增强剂中，还可以包括不影响贝莱斯芽孢杆菌或其发酵产物活性的载体、保护剂、助剂等物质。

本发明第二方面提供了该免疫增强剂作为饲料添加剂在制备鱼类饲料中的应用。

采用该免疫增强剂制备鱼类饲料时，可以参考以下方法：将贝莱斯芽孢杆菌BSG-2接种至液体培养基培养，离心弃去上清，PBS洗涤后重悬菌体沉淀，将所得菌体悬液喷涂于饲料中，即可进行投喂。

微生物类材料作为饲料添加剂时，需克服胃肠道以及饲料加工高温处理的考验，而长时间定植于机体且有益于机体健康又是评估益生菌发挥作用的前提，因此，益生菌需要具有良好的抗逆性，才能够在一定程度上保证其作为添加剂能有效到达肠道并在其中定植。本发明对贝莱斯芽孢杆菌BSG-2进行了体外的耐酸、耐高温等抗逆性实验，结果表明BSG-2具有良好的抵御不良环境能力，暗示其可有效到达肠道进行定植。

另外，本发明通过对贝莱斯芽孢杆菌BSG-2产酶能力的分析，发现贝莱斯芽孢杆菌BSG-2相对于其他芽孢杆菌，具有稳定的产消化酶能力，故当其成功定植于肠道后，有促进机体营养利用的潜力，且活体回归实验表明，投喂该菌株能显著降低饵料系数，并显著提高增重率和特定生长率。

本发明第三方面提供了该免疫增强剂在制备水产养殖中预防或/和治疗细菌性疾病和/或病毒性疾病的药物中的应用。

体外抑菌和抗病毒实验以及贝莱斯芽孢杆菌投喂和病原体感染实验表明，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2能够为机体在细菌和病毒感染下提供免疫保护，降低病原感染死亡率，可见该菌株在体内和体外环境下均可用于防治细菌和病毒感染类疾病。

在上述应用中，所述细菌性疾病的致病原包括但不限于嗜水气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌和迟钝爱德华氏菌等。体外实验证明，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2在体外环境中对嗜水气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌和迟钝爱德华氏菌均具有良好的抑菌能力，对于加州鲈主要危害性细菌病原鰤鱼诺卡氏菌的体内感染模型，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2能显著降低死亡率，并显著减轻加州鲈的感染症状。

在上述应用中，所述病毒性疾病的致病原包括但不限于加州鲈蛙虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)。体外抗病毒实验表明，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2与病毒孵育后能够明显降低对细胞的入侵从而降低病毒在细胞中的载量。病毒感染活体实验表明，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2能够显著降低蛙虹彩病毒感染的致死率，并降低中度及重症患病鱼体的比例，同时显著降低了其在脾脏和肠道中的病毒载量。

本发明第四方面提供了免疫增强剂在提高加州鲈饲料利用率和/或促进鱼类生长和/或提高鱼类抗病力中的应用。通过加州鲈活体回归实验，发现贝莱斯芽孢杆菌BSG-2能够提高机体的营养利用，具体表现为提高饲料利用率、促进鱼类生长等，同时可提高加州鲈血清中先天性免疫酶的活性，并且能够在加州鲈感染细菌和病毒性疾病时为机体提供一定的免疫保护。

本发明涉及生物材料的保藏说明：

菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌BSG-2；

拉丁名：Bacillus velezensis BSG-2；

保藏机构：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO：M 20222096；

保藏日期：2022年12月29日；

保藏地址：湖北省武汉市武汉大学。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的微生物免疫增强剂具有良好的抵御不良环境的能力，故其作为添加剂能够有效到达肠道并在其中定植；

(2)本发明提供的微生物免疫增强剂为分离自加州鲈肠道的共生芽孢杆菌，对同源物种的不良损伤更低，且有利于其肠道定植；

(3)相对于其他同样从加州鲈肠道中获取的芽孢杆菌，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2体外检测具有良好的拮抗病原菌的能力以及产消化酶的能力，同时在细胞实验上有助于抵抗蛙虹彩病毒感染，活体实验表明BSG-2可以有效改善机体的营养利用，提高机体营养代谢，投喂后可提高加州鲈血清中先天性免疫酶的活性，为机体在细菌和病毒感染下提供免疫保护，降低病原感染死亡率。

附图说明

图1为实施例1中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的生理生化鉴定以及ANI分析结果，其中A为BSG-2的生理生化实验鉴定，B为芽孢杆菌基因组水平上的平均核苷酸序列(ANI)相似性分析。

图2为实施例2中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2与其他芽孢杆菌对嗜水气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌和迟钝爱德华氏菌的体外抑菌能力统计。

图3为实施例3中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2与其他分离获得的芽孢杆菌的抗逆性分析，其中A为不同芽孢杆菌在酸性环境PH＝2和4环境下的存活率，B为不同芽孢杆菌在高温100℃处理10min下的存活率。

图4为实施例4中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2与其他芽孢杆菌产淀粉酶(Amylase)、纤维素酶(Cellulase)、蛋白酶(Protease)和脂肪酶(lipase)能力的对比分析。

图5为实施例5中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的体外抗病毒能力分析，其中A为细胞图片(a,c对照组；b,d芽孢杆菌处理组)，B为细胞中LMBV的载量分析。

图6为实施例6中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂对加州鲈营养利用及鱼体先天性免疫酶活性的影响分析，其中A为正常组与贝莱斯芽孢杆菌投喂组28d和56d饵料系数分析，B为正常组与贝莱斯芽孢杆菌28d和56d投喂组增重率分析，C为正常组与贝莱斯芽孢杆菌投喂组28d和56d特定增长率分析，D为正常组与贝莱斯芽孢杆菌投喂组28d和56d血清中溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)以及碱性磷酸酶(ACP)的活性统计。

图7为实施例7中贝莱斯芽孢杆菌BSG-2在病原感染后对机体提供的免疫保护分析，其中A为正常组与贝莱斯芽孢杆菌投喂28d后LMBV注射感染后的死亡率统计，B为正常组和贝莱斯芽孢杆菌投喂组在LMBV感染7d后加州鲈症状表型，C为正常组和贝莱斯芽孢杆菌投喂组在LMBV感染后7d脾脏(spleen)和肠道(gut)中的病毒载量，D为投喂56d后正常组和贝莱斯芽孢杆菌投喂组在鰤鱼诺卡氏菌注射感染后的死亡率统计，E为投喂56d后正常组和贝莱斯芽孢杆菌投喂组在鰤鱼诺卡氏菌注射感染后10d的肝脏病理变化(箭头指向诺卡氏菌形成的结节)。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的分离及鉴定

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2分离自湖北省仙桃市一养殖场的加州鲈肠道样品(该养殖场未投喂过商品化的芽孢杆菌)。肠道样品处理方法为：去除肠道内容物，将肠道在PBS里漂洗干净，用1mL无菌PBS刮取肠壁微生物，进行80℃水浴加热10min，随后将热处理后的肠道微生物涂于BHI平板37℃培养24h，随机挑选不同形态的单菌落，连续挑选单菌落至培养基扩大培养后保藏菌种。

对最终分离得到菌株进行全基因组测序，并进行生理生化鉴定分析以及基因组水平ANI分析。分析结果图1所示，从结果可明确该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(图1中A，B)，将其命名为BSG-2，并保藏于中国典型培养物保藏中心。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的体外抑菌能力鉴定

本例对比了贝莱斯芽孢杆菌BSG-2与其他同样分离自加州鲈肠道的芽孢杆菌的体外抑菌能力，具体如下：

(1)其他芽孢杆菌的获取。

从湖北省和湖南省的5个市(区)采集了11个不同地点的养殖场加州鲈的肠道样品，肠道样品处理方法同实施例1。对分离的菌株进行16s测序，并统计不同地点采集芽孢杆菌数量，具体如表1所示：

表1其他芽孢杆菌的统计表

(2)体外抑菌实验。

以水产常见的致病菌，即嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌以及加州鲈的主要危害性细菌病原鰤鱼诺卡氏菌为代表性病原菌，并通过体外抑菌平板对比了该菌株与其他芽孢杆菌的体外抑菌能力。实验步骤具体为：

①将待测芽孢杆菌菌液接种于10mL液体营养培养基中，37℃环境下200rpm/min培养6h，将菌液浓度调整至1×10⁸cfu/mL。

②取500μL浓度约10⁸cfu/mL的病原菌菌液添加至加热融化的50mL固体BHI培养基中，混匀倒平板，待平板干燥后使用移液枪移取1μL芽孢杆菌的菌液(10⁸cfu/mL)接种于病原菌平板中，随后将其倒置于37℃培养箱培养，24h后统计菌落直径(d)与抑菌圈直径(D)，计算两者的比值(D/d)。

BSG-2与其他芽孢杆菌对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和鰤鱼诺卡氏菌的体外抑菌能力检测结果如图2所示，从图可知：不同芽孢杆菌对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和鰤鱼诺卡氏菌具有不同程度的抑菌能力，而菌株BSG-2对上述三种水产常见致病菌均具有优异的抑菌效果。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的抗逆性评估

鉴于微生物作为饲料添加剂，需克服胃肠道酸性环境以及饲料加工高温处理的考验，而长时间定植于机体且有益于机体健康是益生菌发挥作用的前提，因此对贝莱斯芽孢杆菌BSG-2进行酸性以及高温抗逆性的评估是必要的，本例具体过程如下：

(1)将菌种接种于100mL液体营养培养基中，37℃环境下200rpm/min培养96h，8000rpm/min离心5min，弃上清，PBS重悬菌体，溶菌酶200μg/mL处理10min，PBS洗三遍，将最后重悬的孢子浓度调整至1×10⁸cfu/mL后进行下一步实验。

(2)耐酸测试。模拟胃中的pH环境，设置PH＝2和4的不同pH处理组，使用PBS作为对照组，将孢子悬液分别在pH＝2和4以及PBS组中处理2h，随后对其梯度稀释涂平板，计算孢子的存活率。

(3)耐高温实验。将孢子悬液分别在100℃中处理10min，对照组不做高温处理，随后对其梯度稀释涂平板，统计数量计算孢子的存活率。

BSG-2与另外五株综合抑菌能力强的芽孢杆菌在PH＝2和4环境下的存活率结果见图3中A，从图可知：六株芽孢杆菌具有不同的耐低pH能力，而BSG-2对低pH具有很好的耐受性。

BSG-2与上述五铢芽孢杆菌在100℃处理下的存活率结果见图3中B，从图可知：六株芽孢杆菌具有不同的抵抗高温能力，而BSG-2对100℃的高温具有很好的耐受性。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的产酶能力分析

本例通过平板产酶实验检测了贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的产酶能力，具体过程如下：

(1)预先配制相应的蛋白平板，淀粉平板，纤维素平板和脂肪平板。

BHI培养基的配方：牛脑浸粉4.0g，牛心浸粉4.0g，蛋白胨5.0g，酪蛋白胨16.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.5g，琼脂13.5g溶于1L超纯水灭菌。

蛋白平板的配制：将脱脂牛奶溶于超纯水中配置2％的牛奶液体，同时配置2倍浓度的BHI固体培养基，自然pH值，混匀后倒平板。

脂肪平板的配制：采用三丁酸甘油酯琼脂培养基，其配方包括牛肉膏5g，琼脂粉15g，氯化钠5g，蛋白胨10g，三丁酸甘油酯20mL，蒸馏水1000mL。

淀粉平板的配制：淀粉浓度为0.3％，将称量好的淀粉加入BHI固体培养基后灭菌，倒平板，自然pH值。

纤维素平板：K₂HCO₃2.5g，Na₂HPO₄2.5g，羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨2g，酵母浸粉0.5g，琼脂15g，灭菌倒平板。

(2)测定。

取贝莱斯芽孢杆菌菌液和另外五株芽孢杆菌菌液分别接种于淀粉平板上，37℃培养24h，取适量碘液滴于平板上，菌落周围产生透明水解圈。

取贝莱斯芽孢杆菌菌液和另外五株芽孢杆菌菌液分别接种于纤维素平板上，37℃培养24h。用刚果红(1mg/mL)室温下染色1h，用1M的NaCl(58.4)脱色1h，之后用1M HCl使背景呈蓝色，可观察到明显的透明圈。

取贝莱斯芽孢杆菌菌液和另外五株芽孢杆菌菌液分别接种于蛋白平板和脂肪平板中，直接统计透明圈直径。

具体方法为待平板干燥后使用移液枪移取1μL芽孢杆菌的菌液(10⁸cfu/mL)接种酶平板中，随后将其倒置于37℃培养箱培养，24h后统计菌落直径(d)与透明圈直径(D)，计算两者的比值(D/d)，统计分析芽孢杆菌的产酶能力。

BSG-2与和另外五株芽孢杆菌在消化酶鉴定平板检测结果见图4，从图可知：几株不同芽孢杆菌具有不同的产淀粉酶(amylase)、纤维素酶(cellulase)、蛋白酶(protease)和脂肪酶(lipase)能力，而BSG-2具有优异的产脂肪酶的能力。

实施例5贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的体外抗病毒能力鉴定

本实施例以蛙虹彩病毒为例，且采用了两种病毒接入方式，进行了菌株BSG-2的体外抗病毒实验，具体包括以下步骤：

(1)接单菌落至10mL液体营养培养基中，生长至10^⁸cfu/mL时收集菌液。在EPC细胞中开展体外的抗病毒实验，提前一天将细胞铺至24孔板，待其细胞铺满时进行下一步试验。

(2)第一种病毒接入方式，即共处理组(Co-treatment)。将菌液和蛙虹彩病毒液按1:1的比例混合后加入铺满的细胞培养板中，2h后移去病毒混合液，使用庆大霉素(1:1000稀释)处理30min，PBS洗3遍后接入正常的M199培养基28℃培养箱培养12h。

(3)第二种病毒接入方式，即预处理组(Pre-treatment)。将菌液和蛙虹彩病毒按1:1的比例混合后置于15mL离心管中28℃共孵育2h，孵育结束后使用0.22μm滤膜过滤，将过滤后的病毒液加入至铺满的细胞培养板中，2h后移去病毒液，PBS洗3遍后接入正常的M199培养基28℃培养箱培养12h。

(4)待上述培养结束后显微镜下观察细胞状态，并收集细胞提取细胞的DNA，特异性引物检测细胞中LMBV载量(探针引物见表2)。

表2蛙虹彩病毒特异性探针引物

检测结果见图5，表明：无论是在共处理组或预处理组，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的菌液与蛙虹彩病毒共孵育后，均能够明显的降低病毒对细胞引起的死亡损伤，减少病毒的入侵，从而降低病毒在细胞中的载量。

实施例6贝莱斯芽孢杆菌BSG-2回归活体投喂实例

本实施例将贝莱斯芽孢杆菌BSG-2伴饲投喂，以检测贝莱斯芽孢杆菌对加州鲈机体营养利用的影响，实验过程如下：

(1)将菌种接种于10mL液体营养培养基中，待其生长至10⁸cfu/mL时转接至500mL培养基中，37℃环境下200rpm/min培养96h，结束后检测孢子产生率，收集细菌悬液于8000rpm/min离心5min，弃上清，PBS洗三遍后重悬菌体，显微镜下计数统计菌体数量。

(2)将步骤(1)获得的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2菌液稀释喷涂于饲料中，确保最终浓度为10⁷cfu/g，对加州鲈进行投喂实验。投喂前对其称重，记录其初始投喂体重，投喂28d和56d后再次称量体重，分析其饵料系数，增重率以及特定生长率。

分析结果如图6所示，从结果可知：经过为期28d和56d的日粮饲养，与正常组(仅投喂基础饲料，其他操作同贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组一致)相比，28和56dBSG-2投喂组的饵料系数均明显降低，表现为28d正常组的饵料系数约为1.06，而BSG-2组的饵料系数为0.95，而在为期56d的饮食饲养，发现正常组的饵料系数约为1.14，而BSG-2组的饵料系数为1.07，即在不同的生长阶段，加州鲈饵料与体重之间的吸收转化效率不同；与此同时，与正常组相比，BSG-2投喂组的增重率和特定生长率均升高，并具有显著差异。以上结果表明，投喂此株贝莱斯芽孢杆菌BSG-2可以有效提高机体的营养利用继而促进加州鲈的生长。

与此同时，通过对血清中溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)以及碱性磷酸酶(ACP)等检测发现，与正常组相比，28d和56dBSG-2投喂组可提高血清中的先天性免疫酶LSZ和SOD的活性，而ACP酶的活性只在28d明显上升，56d无明显差异，表明此株贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂后可一定程度上促进机体的免疫反应。

实施例7贝莱斯芽孢杆菌BSG-2在病原体感染时的免疫保护作用

基于实施例6，在贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组和正常组投喂28和56d后分别进行蛙虹彩病毒病毒和鰤鱼诺卡氏菌感染，记录死亡率、病理症状，并检测组织载量。

其中，病毒感染的方法为：实验室预先富集的LMBV病毒，检测病毒的TCID₅₀为10^-6.4，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组和正常组分别注射100μL LMBV病毒悬液，各自的对照组分别注射等量的M199培养基。自注射后观察加州鲈的生理状态以及记录鱼的死亡率。

细菌感染的方法为：将鰤鱼诺卡氏菌的菌液浓度调整至10⁵cfu/mL，离心后弃上清，PBS重悬，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组和正常组分别注射100μL诺卡氏菌悬液，各自的对照组分别注射等量的PBS。

实验结果见图7，具体分析如下：

在构建的LMBV注射感染加州鲈模型下，相对于正常组(投喂基础饲料)，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组死亡率明显降低，即40％，而正常组为60％(图7A)。对病毒感染后7d的加州鲈进行症状上的观察发现，相比于正常组，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组的临床病毒感染症状更轻，与此同时，对感染组织脾脏以及肠道取样检测LMBV病毒载量发现肠道和脾脏组织中病毒载量明显降低。以上结果表明加州鲈投喂此株贝莱斯芽孢杆菌BSG-2对加州鲈抵抗病毒感染具有一定的保护作用。

在构建的诺卡氏菌感染模型中，与正常组(投喂基础饲料)相比，贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组在鰤鱼诺卡氏菌感染下死亡率明显降低，即正常组死亡率36％，而贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂组死亡率为64％(图7D)。鰤鱼诺卡式菌感染的主要靶器官是肝脏，因此对感染后的加州鲈的肝脏进行病理切片分析，结果表明正常组表现出了更多的鰤鱼诺卡式菌入侵，即在肝脏组织内部中形成了多处肉芽组织(红色箭头所示为病原菌入侵导致的肉芽增生)，芽孢杆菌BSG-2投喂组则表现出了较为轻微的细菌感染，且肉芽组织主要集中于肝脏组织表面(图7E)。以上结果表明，在诺卡氏菌感染中，本发明提供的加州鲈本身来源的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2投喂于加州鲈可以为加州鲈提供一定的免疫保护，从而抵抗细菌性病原的威胁。

综上所述，本发明实施例通过体外抑菌和抗病毒功能分析，加州鲈活体投喂实验以分析投喂贝莱斯芽孢杆菌BSG-2后对加州鲈的营养利用的情况，并进一步进行细菌与病毒的注射感染实验等，综合性评估了本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌的性能。试验结果表明，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2能够提高机体的营养利用，并同时在加州鲈感染细菌以及病毒性病原下产生免疫保护。与此同时，同源物种来源的益生性芽孢杆菌在参与调控机体营养免疫的同时，又避免了非同源之间安全性的问题，更有利于为机体提供免疫保护。故本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BSG-2在鱼类的养殖中有良好的应用前景。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种适用于水产动物的免疫增强剂，其特征在于，所述免疫增强剂的活性成分为贝莱斯芽孢杆菌BSG-2和/或其发酵产物，所述贝莱斯芽孢杆菌BSG-2的保藏编号为CCTCC NO：M 20222096。

2.权利要求1所述的免疫增强剂作为饲料添加剂在制备鱼类饲料中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鱼类饲料的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌BSG-2接种至液体培养基培养96h后，离心弃上清，PBS清洗，将所得菌体重悬后喷涂于饲料中。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述鱼类为加州鲈。

5.权利要求1所述的免疫增强剂在制备水产养殖中预防或/和治疗细菌性疾病和/或病毒性疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水产养殖中的鱼类为加州鲈。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细菌性疾病的病原菌包括嗜水气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌和迟钝爱德华氏菌。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒性疾病的致病原包括加州鲈蛙虹彩病毒。

9.权利要求1所述的免疫增强剂在提高鱼类饲料利用率和/或促进鱼类生长和/或提高鱼类抗病力中的应用。