CN110438060A - 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备、富集方法 - Google Patents

一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备、富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌种在活化培养基上进行划线培养得到活化的菌种；再将活化的菌种菌落溶解到无菌去离子水中，制成菌悬液，随后加入到产孢培养基中进行芽孢的摇床培养，得到嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢。本发明通过操作简便的液体培养方法，快速获得高浓度的芽孢，通过对现有芽孢杆菌芽孢制备工艺的改进，使得芽孢制备仅需两种培养基即可，操作步骤简单，重复性好；培养时间得到进一步的缩短，耗时仅需28‑44h；芽孢产量达到了1×109cfu/ml，芽孢最高转化率大于99％；其操作简便、缩短了发酵时间、降低了生产成本、提高了使用效果，具有很强的实用性和广泛的适用性。

Description

一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备、富集方法
技术领域
本发明涉及一种芽孢的制备、富集方法，具体涉及一种一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备、富集方法，属于微生物芽孢发酵技术领域。
背景技术
芽孢又称内生孢子，是细菌休眠体。被誉为整个生物界中抗逆性最强的生命体，在抗热，抗化学药物和抗辐射等方面，十分突出。常见的产芽孢细菌主要为芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、芽孢乳酸菌属等。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等。例如，肉毒梭菌的芽胞在沸水中要经过5至9.5h才被杀死；巨大芽胞杆菌的抗辐射能力比E.coli细胞要强36倍。据文献记载，有的芽胞可以休眠数百至数千年，最极端的例子是在美国的一块有2500万~4000万年历史的琥珀，至今从其中蜜蜂肠道内还可以分离到有生命的芽胞。是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。在消毒学研究领域要使用微生物指标来评价各种理化因子对致病微生物杀灭效果 ，嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢(G.Stearothermophilus)就是其中重要指标菌，用来评价各种与热力有关的消毒灭菌设备的效果。
嗜热脂肪地芽孢杆菌为需氧或者兼性厌氧菌，为革兰氏阳性菌，最佳生长温度为55-60℃，最高生长温度为65-75℃，属于嗜热菌。嗜热脂肪地芽孢杆菌所产芽孢无致病性、无热原、无毒。该芽孢对一定灭菌因子有确定的抵抗力，因此可作为指示微生物被用来监测灭菌效果，包括压力蒸汽灭菌、过氧化氢(H2O2)低温等离子体灭菌、低温蒸汽甲醛灭菌等灭菌方式。作为灭菌生物指示菌，按照GB18281.3-2015，染菌载体和生物指示物的总活菌数应不少于1.0×105。
现有技术中，已经可以实现对嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢进行小剂量的制备，但在大规模量产时，却存在许多技术障碍，主要存在芽孢形成率不高、生产成本过高等问题，同时耗时长，工艺繁琐。CN 106434520A提供了一种芽孢杆菌芽孢的制备方法，但是工艺较为繁琐，且耗时较长（60-72h）。CN 105368746B提供了一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，然而整个制备周期耗时长达72小时，并且操作流程同样较为复杂。本发明通过改进培养基的配方以及培养的工艺，可有效地提高芽孢的生成率，得到大批量的芽孢。而且培养基的原料价格低廉，工艺流程相对简单，生产周期大大缩短，整个培养工艺一批次耗时大约40h，本发明提供了一种可以使芽孢的生产工业化发酵的路线，芽孢的转化率高，可一次获得菌浓度超过1× 109cfu/ml的芽孢。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种发酵时间短，可快速获得高浓度嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备、富集方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，制备方法包括以下步骤：
S1、菌种活化：将嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌种在活化培养基上进行划线培养得到活化的菌种；
S2、芽孢制备：将活化的菌种菌落溶解到无菌去离子水中，制成菌悬液，随后加入到产孢培养基中进行芽孢的摇床培养，得到嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢。
上述活化培养基，包括以下重量百分比的组成：大豆蛋白胨0.5％，胰蛋白酶胨1.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，蒸馏水补足至100％。
进一步的，上述活化培养基的pH为7.3± 0.2，且在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温，待用。
上述产孢培养基，包括以下重量百分比的组成：蛋白胨0.5％（蛋白栋为广谱蛋白提取物），氯化钠0.25％，牛肉浸出粉0.15％，氯化钙0.0025-0.005％，氯化锰0.0025-0.005％，磷酸氢二钾0.0025%，酵母粉0.5%，蒸馏水补足至100％。
进一步的，上述产孢培养基的pH为6.6-7.4，且在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温，待用。
上述无菌去离子水的灭菌方式为121℃下灭菌20-30min。
上述步骤S1中划线培养的倒置培养温度为55-65℃，培养时间为12-24h。
上述步骤S2中芽孢的培养温度为55-65℃，培养时间为16-20h；摇床培养转速为150-180rpm/min。
上述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，富集方法包括以下步骤：
A1、离心包含芽孢的产孢培养基，弃去上清液，继续加入无菌去离子水震荡均匀后离心，
A2、重复上述步骤A1若干次至上清液澄清；
A3、添加一定量的去离子水重悬移置冻存管中低温存储。
上述步骤A1中离心转速为7500-8500rpm/min，离心温度4-6˚C，离心时间10-18min；步骤A2中的重复为3-5次，步骤A3中的去离子水为2-6ml，存储温度为0-4˚C。
芽孢的产生率可通过对嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢进行染色获得，芽孢呈绿色，没有形成芽孢的菌体呈现红色。
本发明中所采用的芽孢染色方法为：取菌体至玻片上，火焰上方滑动玻片加热数次将菌体水分蒸发干燥后固定在玻片上，滴加3-5滴5％孔雀绿染液于固定的菌体上，在火焰上加热5min，使染液冒蒸汽但不沸腾，弃染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色，干燥后用油镜观察。
本发明的有益之处在于：
本发明的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，通过操作简便的液体培养方法，快速获得高浓度的芽孢，其操作简便、缩短了发酵时间、降低了生产成本、提高了使用效果。
和现有技术相比，具有如下有益效果：
1、通过对现有芽孢杆菌芽孢制备工艺的改进，根据嗜热脂肪地芽孢杆菌的生长特点使得芽孢制备仅需两种培养基即可，操作步骤简单，重复性好；
2、培养时间得到进一步的缩短，耗时仅需28-44h；芽孢产量达到了1× 109cfu/ml，芽孢最高转化率大于99％。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其制备方法包括以下步骤：
S1、菌种活化：
将嗜热脂肪芽孢杆菌划线接种于平皿活化平培养基，在56℃恒温环境中培养18h后，获得活化的嗜热脂肪地芽孢杆菌营养菌体。
活化培养基由以下重量百分比的原料组成：大豆蛋白胨0.5％，胰蛋白酶胨1.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，蒸馏水补足至100％，调其pH为7.3± 0.2后在121℃下灭菌20min后冷却至室温待用。
S2、芽孢转化：
将活化的菌种菌落溶解到无菌去离子水中，制作成菌悬液，随后加入到产孢培养基中进行芽孢的摇床培养，摇床培养转速为160rpm/min，温度为56℃，时间为18h，得到嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢。
无菌去离子水灭菌方式为121℃下灭菌20min。
产孢培养基由以下重量百分比的原料组成：蛋白胨0.5％，氯化钠0.25％，牛肉浸出粉0.15％，氯化钙0.005％，氯化锰0.005％，磷酸氢二钾0.0025%，酵母粉0.5%，蒸馏水补足至100％；调其pH为6.8后在121℃下灭菌20min后冷却至室温待用。
S3、芽孢生成率统计：
取菌体至玻片上，火焰上方滑动玻片加热数次将菌体水分蒸发干燥后固定在玻片上，滴加3滴5％孔雀绿染液于固定的菌体上，在火焰上加热5min，使染液冒蒸汽但不沸腾，弃染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色，干燥后用油镜观察得芽孢形成率99.5%。
S4、芽孢收集：
将包含芽孢的产孢培养基进行离心，弃去上清，继续加入无菌去离子水震荡均匀后以8000rpm/min的转速离心，离心温度为4˚C，时间为15min；
弃去上清，重复加入无菌去离子水震荡离心水洗3次至上清液澄清，2ml去离子水重悬移置冻存管中低温4˚C存储。
无菌去离子水灭菌方式为121℃下灭菌20min。
对芽孢富集液进行计数，结果达到1× 109cfu/ml。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
S1、菌种活化：
将嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌种在活化培养基上进行划线培养得到活化的菌种；
S2、芽孢制备：
将活化的菌种菌落溶解到无菌去离子水中，制成菌悬液，随后加入到产孢培养基中进行芽孢的摇床培养，得到嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢。
2.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述活化培养基，包括以下重量百分比的组成：大豆蛋白胨0.5％，胰蛋白酶胨1.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，蒸馏水补足至100％。
3.根据权利要求2所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述活化培养基的pH为7.3± 0.2，且在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温，待用。
4.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述产孢培养基，包括以下重量百分比的组成：蛋白胨0.5％，氯化钠0.25％，牛肉浸出粉0.15％，氯化钙0.0025-0.005％，氯化锰0.0025-0.005％，磷酸氢二钾0.0025%，酵母粉0.5%，蒸馏水补足至100％。
5.根据权利要求4所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述产孢培养基的pH为6.6-7.4，且在121℃下灭菌20-30min后冷却至室温，待用。
6.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述步骤S1中划线培养的倒置培养温度为55-65℃，培养时间为12-24h。
7.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述无菌去离子水的灭菌方式为121℃下灭菌20-30min。
8.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述步骤S2中芽孢的培养温度为55-65℃，培养时间为16-20h；摇床培养转速为150-180rpm/min。
9.根据权利要求1-8任一所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，富集方法包括以下步骤：
A1、离心包含芽孢的产孢培养基，弃去上清液，继续加入无菌去离子水震荡均匀后离心，
A2、重复上述步骤A1若干次至上清液澄清；
A3、添加一定量的去离子水重悬移置冻存管中低温存储。
10.根据权利要求9所述的一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，其特征在于，所述步骤A1中离心转速为7500-8500rpm/min，离心温度4-6˚C，离心时间10-18min;步骤A2中的重复为3-5次，步骤A3中的去离子水为2-6ml，存储温度为0-4˚C。
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