CN104974969A - 一种降解pfoa菌株yab-1及其应用 - Google Patents

一种降解pfoa菌株yab-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用，该PFOA降解菌为类黄色假单胞菌（Pseudomonas parafulva），保藏编号：CCTCC NO：M2015280，保藏日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。利用菌株YAB-1降解含PFOA物料的方法为：先将YAB-1单菌落接种至LB培养基12-18小时，然后将这个培养基制成一定OD600的菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。本发明提供了一种降解PFOA菌株YAB-1及其利用这种菌株处理含PFOA物料的方法。该菌株降解PFOA能力强，处理含PFOA物料的方法简单、有效，能显著降低物料中PFOA的浓度。

Description

一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用
技术领域
本发明属于生物及环境保护技术领域，具体指一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用YAB-1降解PFOA的方法。
背景技术
全氟辛酸类化合物（Perfluorinated octylic acid compounds）指 C7F15COOH 及其衍生物。其中全氟辛酸（Perfluorooctanoic Acid，简称 PFOA）别称十五氟辛酸，分子式为C8HF15O2，分子量为414.07 g/mol，密度为1.8 g/cm3，水中溶解度为3.4 g/L；溶于极性有机溶剂。
PFOA 是人工合成的表面活性剂，由于F具有最大的电负性，使得 C—F 的键能较大，为 460 kJ/mol，是自然界中键能最大的共价键之一，因而具有很高的化学、生物和热稳定性。但PFOA由于其独特的疏水疏油性质，被广泛用于纺织、造纸、食品包装、地毯、皮革和灭火泡沫等制造工业产品和日用消费品。
很多研究表明，因为PFOA的稳定性，使其在环境中很难自然的降解，因此在全球各个水域、各区域的动物和人体内都检测到了PFOA的存在。由于PFOA具有持久性、生物累积性、致癌、致畸、致突变性及内分泌干扰等特性，对生态环境和人类健康构成重大危害。2009年《斯德哥尔摩公约》将PFOA列为新型持久性环境污染物。
目前，国内外降解PFOA的方法主要包括化学降解法、物理降解法和生物降解法。化学降解PFOA的方法包括紫外光化学降解法、水热电化学氧化法等，但是这些方法成本非常高并且效率低；物理降解PFOA的方法主要是光降解法和超声波降解法，虽然价格没有化学降解法那么昂贵，但降解效果不明显，且容易产生二次污染物。
微生物降解氟类有机化合物已经有氟代苯、氟苯胺、多氟双酚、氟代调聚醇和氟代调聚磺酸盐等报道，这些研究结果表明，自然界中一些微生物存在脱氟酶，能对碳氟键发生攻击。但目前从自然界中分离筛选到的一些降解PFOA菌株，其降解能力都非常弱、且菌种资源也非常稀缺，难以能满足环境污染治理的需求。
因此，加大对PFOA 类持久性有机污染物的降解研究，筛选高效的PFOA降解菌株，为后续的降解机理研究和菌株改良提供优良的种质资源，无论是对于生物技术本身，还是环境保护都具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服现有技术的不足，提供一种高效降解PFOA的菌株及其降解PFOA的方法。
本发明人于2013年4月18日在武汉氟化工厂采集长期受PFOA污染的土壤样品。从该样品中分离得到一种降解PFOA菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）, 该PFOA降解菌为类黄色假单胞菌（Pseudomonas parafulva），保藏编号：CCTCC NO：M2015280，保藏日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学。
所述菌株YAB-1的筛选和分离步骤包括：
1、取样：样品取自于长期受氟化物污染的土壤，在低温下带回实验室保存待用。
2、驯化：采用梯度压力法驯化样品。按10%的接种量接种样品至含PFOA浓度为50 mg/L的驯化培养基中培养2周，随后每2周将PFOA浓度提高50 mg/L继续培养，直至PFOA浓度达到500 mg/L时，驯化结束，整个驯化共为期10周。
3、分离纯化：在无菌条件下，移取1 mL驯化液做梯度稀释，将不同稀释倍数的菌液涂布于无机盐离子培养基平板上，30 ℃培养，挑取生长状态良好的单菌落划线分离，获得1株以PFOA为惟一碳源生长的纯菌株。
驯化培养基配置：1000 mL蒸馏水中加入：NH4NO3 5 g，NaCl 2 g，KH2PO4 1 g，K2HPO4 1 g ，MgSO4  7H2O 0.5 g ，CaCl22H2O 0.05 g ，酵母膏 1 g和不同质量的PFOA，调pH至7.0，121℃灭菌30 min。
分离纯化培养基配置：1000 mL蒸馏水中加入：NH4NO3 5 g，NaCl 2 g，KH2PO4 1 g，K2HPO4 1 g ，MgSO4  7H2O 0.5 g ，CaCl22H2O 0.05 g，PFOA 500 mg，琼脂18 g，调pH到7.0，121 ℃灭菌30 min。
本发明的另一个目的是提供一种利用菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）降解含PFOA物料的方法，该方法包括如下步骤：
先将YAB-1单菌落接种至LB培养基12-18小时，然后将这个培养基制成一定OD600的菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的降解PFOA菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）及其利用这种菌株处理含PFOA物料的方法。该菌株降解PFOA能力强，是一种能够以PFOA为惟一碳源生长的菌株，当环境条件为：温度30℃、pH=7、接种量2%、PFOA初始浓度500 mg/L时，接种菌株YAB-1至无机盐离子培养基中振荡培养，经GC-MS测定，PFOA的降解率达32.4%。利用菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）处理含PFOA物料的方法简单、有效，能显著降低物料中PFOA的浓度。
具体实施方式
现结合具体实施例对降解PFOA菌株YAB-1及其应用进一步具体说明。
本发明人于2013年4月18日采集武汉氟化工厂采集长期受PFOA污染的土壤样品，从该样品中分离得到一种降解PFOA菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）, 该PFOA降解菌为类黄色假单胞菌（Pseudomonas parafulva），保藏编号：CCTCC NO：M2015280，保藏日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学。
菌株YAB-1的筛选方法、步骤如下：
1、采集不同样地样品混匀，四分法取样，留10 g样品待用。
2、样品的驯化：取10 g样品，接入90 ml富集培养基，培养2周后，转入含PFOA浓度50 mg/L的无机盐培养基，逐渐提高PFOA浓度驯化培养，每个浓度梯度驯化2周，当PFOA浓度达到500 mg/L时继续培养2周，驯化结束。
3、菌株的分离纯化：取不同稀释倍数的驯化菌液涂布于分离培养基平板，选择生长状态良好，形态不同的菌落，采用反复平板划线分离，获得1株以PFOA为惟一碳源生长的纯菌株YAB-1。
4、菌株的鉴定：对菌株进行形态、生理生化鉴定和16S rDNA序列测定。
（1）、采用CTAB法提取细菌YAB-1总DNA。
（2）、PCR扩增：以菌株DNA为模板，利用通用引物(PA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和PB：5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行PCR扩增。
（3）、PCR 反应体系：DNA 模板2 μL，10 × PCR Reaction Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，引物各1 μL，Taq 酶0.25 μL，去离子水36.75 μL。
（4）、PCR 扩增程序：95 ℃ 预变性5 min， 95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
（5）、 数据处理：PCR 产物由宝生物工程有限公司进行测序，测序结果提交到GenBank，并进行BLAST 分析，利用Clustal X2 进行多序列比对，通过MEGA 4 软件采用neighbor-joining 方法构建系统发育树，对分离菌株进行分类。
5、环境条件对菌株的生长和降解PFOA的影响：采用“单因素实验法”分别考察PFOA初始浓度、接菌量、初始pH、温度对菌株YAB-1的生长和降解PFOA的影响。将处于对数生长期的菌株YAB-1（原菌悬液的吸光度OD600 为2.0）接种至含PFOA的培养基中，于160 r/min振荡培养，并做平行实验3 次，每隔12 h取样测定菌株YAB-1 的生长和降解曲线。
（1）、单因素设置如下：底物浓度为100、200、500、800和1000 mg/L；接菌量为0.5%、1%、2%、5%和10%；pH值为5、6、7、8和9；温度为20、25、30、35和40 ℃。
（2）、PFOA的测定方法：
a. 样品浓缩：发酵液经5000 r/min离心5 min后，取5 mL至干净离心管，加入甲基叔丁基醚1 mL超声萃取10 min，静止分层，收集有机相，样品重复萃取3次，合并上层有机相。
b. 样品衍生：加入1 mL BSTFA充分混匀后，密封，置于40 ℃水浴中衍生化反应1 h，用正己烷定容至10 mL。
c. 样品测定：选用内标法进行GC-MS（SIM）定量分析，根据浓度与峰面积比的标准曲线计算PFOA的浓度。
（3）、菌体浓度测定：菌体浓度采用比浊法测定。本实验的菌体细胞浓度以OD600来表示，即波长为600 nm时，紫外光透过所测菌液样品的光密度值。
6、结果：从长期受氟化物污染的环境样品中分离1株细菌，命名为YAB-1，经鉴定YAB-1为黄色假单胞菌 （Pseudomonas parafulva）。
分离菌株的同源性分析和分类结果 
Strains Most similar strain similarity Genus
YAB-1 Pseudomonas parafulva 99% Pseudomonas
先将YAB-1单菌落接种至LB培养基16小时，然后将这个培养基制成一定OD的菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料，能有效降低物料中PFOA的浓度。
PFOA初始浓度对菌株生长和PFOA降解的影响：当PFOA浓度小于500 mg/L时，同时期的菌液OD600值随底物浓度增大而增大。当PFOA高于500 mg/L时，菌液OD600值随着PFOA浓度增大而变小。当PFOA浓度为500 mg/L时，培养基中生物量最大，降解效果也最高，PFOA的最大降解率为32.4%。
接菌量对菌株生长和PFOA降解的影响：当接菌量为1%和2%时，菌株的生长符合典型的指数生长曲线模型，同时菌株的生物量和PFOA的降解能力随接菌量的增大而提高，但当接菌量大于2%时，菌株的生长受到明显抑制，因此菌株YAB-1降解PFOA的最适接种量为2%。
pH值对菌株生长和PFOA降解的影响：微生物都有最适宜生长和繁殖的pH值。随着pH的升高，菌株的生长和降解率先升高后降低，当培养基pH=7.0时，96 h时菌液OD600和降解率达到最高，分别为0.181和28.9%。菌株YAB-1有较宽的pH范围适应，最适pH值为7.0。
温度对菌株生长和PFOA降解的影响：在培养温度为2 0 ℃-40 ℃时，菌株YAB-1均能生长良好。当温度为20℃时，菌株YAB-1生物量和PFOA降解率显著低于30 ℃和40 ℃。30 ℃时菌株生长量和PFOA降解率均达到最高。培养温度为30 ℃是菌株生长和降解PFOA的最适温度。

Claims (2)

1.一种降解PFOA菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）,该PFOA降解菌为类黄色假单胞菌（Pseudomonas parafulva），保藏编号：CCTCC NO：M2015280，保藏日期：2015年5月7日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学。
2.一种利用菌株YAB-1（Pseudomonas parafulva YAB-1）降解含PFOA物料的方法，其特征在于：先将YAB-1单菌落接种至LB培养基12-18小时，然后将这个培养基制成一定OD600的菌悬液，最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。
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