CN106834202B - 一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，其中，包括步骤：将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；然后在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。本发明使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌进行长期定向选育，获得抗鲎素耐受型菌株。鲎素长期持续诱导得到的菌株对鲎素产生了较强的耐受性。

Description

一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物类领域，尤其涉及一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法。

背景技术

鲎素是从鲎血细胞小颗粒分离提取的一种阳离子抗菌肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化等生物活性,是一种具有巨大潜在应用价值的抗菌肽。鲎素主要有从鲎血细胞分离纯化、化学合成及基因工程表达三种生产手段。由于鲎资源匮乏以及化学合成的高成本，前两种方法很难进行大规模生产，因此，基因工程表达生产鲎素是实现其产业化的必由之路。

国内外对鲎素基因工程表达的研究从上个世纪九十年代后期就开始了，但重组鲎素商品至今尚未问世。其中最主要的原因是各种表达宿主均不能克服鲎素I的抑杀及对鲎素I的降解作用，从而导致表达量达不到产业化的要求。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，旨在解决现有技术中表达宿主均不能克服鲎素I的抑杀及对鲎素I的降解作用的问题。

本发明的技术方案如下：

一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，包括步骤：

A、将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；

B、在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入步骤A得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；

C、然后在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入步骤B得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，步骤B中，在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的培养基。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，各鲎素浓度的培养基下划线培养的方法为：各鲎素浓度下反复培养20～40次。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，所述培养基为BLM培养基。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，培养的条件为：温度为37℃，200rpm的振荡培养箱中培养。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，还包括：对各阶段划线培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌进行形态观察及污染监控。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，将各阶段划线培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌接入含25％甘油的培养基中保存。

一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌，其中，引用如上任一所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法制备而成。

所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌，其中，所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌为耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。

有益效果：本发明使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌进行长期定向选育，获得抗鲎素耐受型菌株。鲎素长期持续诱导得到的菌株对鲎素产生了较强的耐受性。耐受菌株的超微形态结构发生一定的改变，同时细胞膜渗透性、膜表面电荷及耐药分子表达水平均朝着有利于耐受鲎素的方向变化。这些耐药表型的改变有助于耐受鲎素的枯草芽孢杆菌适应鲎素的长期胁迫。

附图说明

图1为本发明的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法较佳实施例的流程图。

图2为原始菌(WB800)的形态图。

图3为诱导菌(WB800-160)的形态图。

图4为原始菌(WB800)和诱导菌(WB800-160)的表面电荷差异示意图。

图5为原始菌(WB800)和诱导菌(WB800-160)的dlt基因表达情况示意图。

图6为原始菌(WB800)和诱导菌(WB800-160)的生长曲线示意图。

具体实施方式

本发明提供一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明菌株的分类名称为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为：GDMCC No.60095，保藏日期为：2016年10月19日，保藏地址为：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。

图1为本发明的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法较佳实施例的流程图，如图所示，其包括步骤：

S100、将枯草芽孢杆菌种于培养基中培养，得到枯草芽孢杆菌；

步骤S100具体为，挑选枯草芽孢杆菌种于BLM液体培养基中，37℃下，200rpm振荡培养中培养，直到枯草芽孢杆菌液OD600值达到约1.25。

S200、在新的培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度不同的培养基；先在鲎素浓度较低的培养基中接入步骤S100得到的枯草芽孢杆菌进行划线培养，得到耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌；

步骤S200具体为，本发明预先检测原始枯草芽孢杆菌在BLM液体培养基中的最小抑菌浓度(MIC)值，测得鲎素对原始枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为10μg/mL。本发明以MIC值的一半(即1/2MIC，5μg/mL)为起始诱导浓度。本发明从低浓度鲎素开始进行诱导，目的是使菌株能对鲎素进行逐步适应，以便获得更加稳定的诱导菌株。然后配制鲎素浓度不同的培养基，具体是在新的BLM培养基中加入鲎素，制成鲎素浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的培养基。接着，先在5μg/mL鲎素浓度的培养基中接入步骤S100得到的枯草芽孢杆菌进行培养，培养的条件为：温度为37℃，200rpm的振荡培养箱中培养。再通过划线培养的方法，得到纯的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。划线培养具体是，在5μg/mL鲎素浓度的培养基中反复培养20～40次(如25次)，即在5μg/mL鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌20～40次(如25次)，使耐受鲎素的枯草芽孢杆菌达到稳定耐受，且该耐受鲎素的枯草芽孢杆菌能够耐受5μg/mL鲎素。

S300、再在下一个鲎素浓度较高的培养基中接入步骤S200得到的耐受较低浓度鲎素的枯草芽孢杆菌进行划线培养，依次类推，逐步提高鲎素浓度，培养出能够耐受较高浓度鲎素的枯草芽孢杆菌。

步骤S300具体为，按步骤S200中的方法进行10μg/mL鲎素的耐受诱导，同样反复培养20～40次(如25次)，即在10μg/mL鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌20～40次(如25次)，使耐受鲎素的枯草芽孢杆菌达到稳定耐受，且该耐受鲎素的枯草芽孢杆菌能够耐受10μg/mL鲎素。然后按照同样的方法，逐步提高鲎素浓度，依次在20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL……直到160μg/mL的鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌20～40次(如25次)，通过长期诱导后，获得可以耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。

本发明还包括：对各阶段的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌进行形态观察及污染监控，以免因污染而导致菌种不纯。本发明还将各阶段划线培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌接入含体积比25％甘油的培养基中保存。

本发明培养基不限于BLM培养基，也可以用MH肉汤进行替代。

本发明使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌进行长期定向选育，获得耐受鲎素的枯草芽孢杆菌。鲎素长期持续诱导得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌对鲎素产生了较强的耐受性，其中鲎素抑杀这种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)活性由10μg/mL升高到256μg/mL。耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的超微形态结构发生一定的改变，同时细胞膜渗透性、膜表面电荷及耐药分子表达水平均朝着有利于耐受鲎素的方向变化。这些耐药表型的改变有助于耐受鲎素的枯草芽孢杆菌适应鲎素的长期胁迫。

本发明的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌，其中，引用如上任一所述耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的制备方法制备而成。本发明通过鲎素长期胁迫培育耐受鲎素的枯草芽孢杆菌的方法，获得耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。

下面通过实施例对本发明进行详细说明。

实施例

(1)、检测WB800原始菌(即枯草芽孢杆菌)在BLM培养基中的MIC值，测得鲎素对WB800原始菌的最小抑菌浓度(MIC)为10μg/mL，如下表1所示。本实施例以MIC值的一半(即1/2MIC，5μg/mL)为起始诱导浓度。

(2)、首先，挑取枯草芽孢杆菌种于30mL BLM液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养箱中培养，直到枯草芽孢杆菌液OD600值达到1.25。然后，在新的5mL BLM培养基中加入鲎素，使其终浓度达到5μg/mL鲎素的培养基。然后，在该5μg/mL鲎素的培养基中接入50μL培养好的新鲜的枯草芽孢杆菌，在37℃，200rpm振荡培养箱中培养。最后，通过划线培养的方法，即在5μg/mL鲎素浓度下反复诱导25次，使菌株达到稳定耐受，得到纯的耐受5μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。

(3)、按(2)所述的方法进行10μg/mL鲎素的耐受诱导，同样反复诱导25次，使菌株达到稳定耐受，得到纯的耐受10μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌。

(4)、然后按照(2)和(3)所述，依次对20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL......直到160μg/mL的鲎素浓度下反复诱导耐受鲎素的枯草芽孢杆菌25次。通过长期诱导后，获得可以耐受160μg/mL鲎素的枯草芽孢杆菌(WB800-160菌株)。(5)、对上述各个阶段的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌进行形态观察及污染监控，并将各个阶段培养得到的耐受鲎素的枯草芽孢杆菌保存在含25％甘油的培养基中。

测试结果如下：本实施例使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌(WB800)进行长期定向选育，获得抗鲎素的耐受菌(WB800-160)。鲎素长期持续诱导得到的耐受菌WB800-160对鲎素产生了较强的耐受性，其中鲎素抑杀这两种诱导菌的最小抑菌浓度(MIC)活性由10μg/mL升高到256μg/mL，见下表1所示。原始菌(WB800)的形态图见图2所示，耐受菌(WB800-160)的形态图见图3所示，原始菌(WB800)和耐受菌(WB800-160)细胞膜流动性检测表见下表2所示，原始菌(WB800)和耐受菌(WB800-160)的表面电荷差异见图4所示，原始菌(WB800)和耐受菌(WB800-160)的耐药分子表达水平见图5所示，原始菌(WB800)和耐受菌(WB800-160)的生长曲线见图6所示。从表格和图可看出，耐受菌株的超微形态结构发生一定的改变，同时细胞膜流动性、表面电荷及耐药分子表达水平均朝着有利于耐受鲎素的方向变化，这些耐药表型的改变有助于耐受鲎素的枯草芽孢杆菌适应鲎素的长期胁迫。

表1、原始菌(WB800)和耐受菌(WB800-160)MIC值的测定

菌株	MIC值(μg/mL)
		原始菌	10
耐受菌	256

表2、原始菌(WB800)和耐受菌(WB800-160)细胞膜流动性检测(T-test；*表示p<0.05)

	各向异性	荧光偏振度
			原始菌	0.124±0.013	0.150±0.006
耐受菌	0.164±0.012*	0.199±0.020*

本发明诱导得到的WB800-160菌株已于2016年10月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60095。

本发明诱导得到的WB800-160菌株经16S rDNA保守序列测定，基因序列如下：

(1)FD1的序列(总924bp)：

ATAcATGCaAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACATGCCTTCAACCGCGGCAGTACGGATCTGGTAAGCGTTGTCCCTAATTATTGGGCGTAACGGGTTCGCAGGCGATTTCTACAATTTTAGGTGCTTTCCCCCTGTTCTTTCTGATACTCAAATGGTAAACTTCGACACTTGCTGGTGGATACGGAATTTGAGAAGCTTGAAAGTTGAAGCCACGACTATATTCAGCTGACTCCTCCTCGATTACTTGCGACCCCTCTCAACAGGTACTATTTATGAAATATCTAAATAAATCTTAAAACTCTTAGTGAGACGGATCCTCACATCCTAAGCGTCTTTTTCCGAGATCTTGCAGCTTTTTCCTTCTCCCGAAGCCGGGACGAGGCTGGCGCGTTAGACCGTTGCTCTTCCCCAATATGCAAGGCCGCGTGCTCCAAGCGATGAGAAGCTTGCGAACACACAGTTCAACGTCTAGGTGACCATCTAA

(2)RP1的序列(总930bp)：

cCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCATTACGCCCAATAATTCCAGGACACACTTGCA

综上所述，本发明提供的一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌及其制备方法，本发明使用添加梯度浓度鲎素的培养基持续对枯草芽孢杆菌进行长期定向选育，获得抗鲎素耐受型菌株。鲎素长期持续诱导得到的菌株对鲎素产生了较强的耐受性，其中鲎素抑杀这两种诱导菌的最小抑菌浓度(MIC)活性由10μg/mL升高到256μg/mL。耐受菌株的超微形态结构发生一定的改变，同时细胞膜渗透性、膜表面电荷及耐药分子表达水平均朝着有利于耐受鲎素的方向变化。这些耐药表型的改变有助于耐受鲎素的枯草芽孢杆菌适应鲎素的长期胁迫。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

基因序列如下 ：

（1）FD1的序列（总924 bp）：

ATAcATGCaAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACATGCCTTCAACCGCGGCAGTACGGATCTGGTAAGCGTTGTCCCTAATTATTGGGCGTAACGGGTTCGCAGGCGATTTCTACAATTTTAGGTGCTTTCCCCCTGTTCTTTCTGATACTCAAATGGTAAACTTCGACACTTGCTGGTGGATACGGAATTTGAGAAGCTTGAAAGTTGAAGCCACGACTATATTCAGCTGACTCCTCCTCGATTACTTGCGACCCCTCTCAACAGGTACTATTTATGAAATATCTAAATAAATCTTAAAACTCTTAGTGAGACGGATCCTCACATCCTAAGCGTCTTTTTCCGAGATCTTGCAGCTTTTTCCTTCTCCCGAAGCCGGGACGAGGCTGGCGCGTTAGACCGTTGCTCTTCCCCAATATGCAAGGCCGCGTGCTCCAAGCGATGAGAAGCTTGCGAACACACAGTTCAACGTCTAGGTGACCATCTAA

（2）RP1的序列（总930 bp）：

cCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCATTACGCCCAATAATTCCAGGACACACTTGCA

Claims (1)

1.一种耐受鲎素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为：GDMCC No.60095，保藏地址为：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。

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