CN103361285A - 一种詹氏丙酸杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能产丙酸詹氏丙酸杆菌的筛选及其应用，属于生物工程技术领域。本发明公开了詹氏丙酸杆菌于2013年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013071。所述詹氏丙酸杆菌是从奶酪厂下水道的淤泥中筛选所得，应用所述詹氏丙酸杆菌发酵生产丙酸的产量可达22.06g/L,生产强度为0.152g L^-1h^-1。本实验结果在一定程度上为提高工业生产丙酸产量提供了帮助。

Description

一种詹氏丙酸杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种詹氏丙酸杆菌及其应用，特别是一种产丙酸的詹氏丙酸杆菌。 

背景技术

丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除莠剂合成、有机合成中间体等方面。2006年世界丙酸总生产能力在35万吨/年左右，2008年达到50万吨/年。美国是世界上最大的丙酸生产及消费国。目前我国丙酸实际年产量只有200吨左右，远远不能满足实际的市场需求，每年仍需大量进口来弥补国内的空缺。 

用于丙酸发酵的菌种主要是丙酸杆菌属(Propionibacteria)，该属有多个种和亚种，均为厌氧菌，丙酸杆菌是一类G⁺、不产芽孢、不运动、接触酶阳性的厌氧菌。菌落呈现白色、黄色或者褐红色。一般情况下，最适pH为6.5～7.5，最适生长的温度为28℃～37℃。 

丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法是以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸的方法，该方法是工业级规模上丙酸的主要生产方法。微生物发酵法是丙酸菌在常温、常压下利用一般营养源通过自身代谢产生丙酸。由于微生物发酵生产丙酸能降低对石油等不可再生能源的依赖性，减轻对环境造成的压力，因此，在当前全世界面临环境污染、能源短缺的严峻情况下，微生物发酵法生产丙酸为丙酸合成提供了新的思路，同时得到了越来越多研究者的关注。但是微生物法生产丙酸仍然存在成本高，丙酸产量低等缺点。因此，筛选丙酸的高产菌株是非常有必要的。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种丙酸高产菌株詹氏丙酸杆菌JN926（Propionibacterium jensenii JN926），能够高效的生产和积累丙酸。 

所述菌株于2013年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013071，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。 

所述詹氏丙酸杆菌的筛选方法为： 

其技术方案是：从奶酪厂下水道淤泥中筛选出厌氧菌，根据其能耐受丙酸的性能，通过在培养基中添加丙酸来富集产丙酸菌。其具体步骤依次是取样，添加丙酸液体富 集培养，初筛，复筛，最后得到1株在厌氧条件下，能够实现丙酸高产量生产的菌株。 

（1）菌株来源 

奶酪厂下水道淤泥 

（2）培养基 

富集培养基（g/L）：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄2.5；KH₂PO₄1.5；丙酸1.5。 

初筛培养基（g/L）：琼脂20；酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄2.5；KH₂PO₄1.5；丙酸2.5。 

复筛培养基（g/L）：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄2.5；KH₂PO₄1.5；丙酸5。 

种子培养基（g/L）：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄2.5；KH₂PO₄1.5。 

发酵培养基（g/L）：酵母粉10；蛋白胨5；K₂HPO₄2.5；KH₂PO₄1.5；甘油30；CoCl₂0.01。 

（3）富集培养的具体方法是将奶酪下水道淤泥稀释接种到富集培养基中，每隔一段时间转接一次。 

（4）初筛的具体方法是将富集好的菌液进行稀释，涂布初筛培养基，30℃厌氧培养4-5天。 

（5）复筛的具体方法是将初筛得到的菌株接入复筛培养基，30℃厌氧培养4-5天。选择菌浓最高的3-4株菌接入发酵培养基，30℃厌氧培养150小时，测定丙酸浓度。 

1.菌体干重的测定 

用722型可见光分光光度计，于600nm处比色测OD值。 

2.丙酸产量的测定 

用Agilent高效液相仪测定发酵上清液中丙酸浓度。 

3.詹氏丙酸杆菌的应用 

将培养好的种子按照10%接种量接入装有2L发酵培养基的3L发酵罐内，间歇通氮气以出去氧气，控制温度30℃，200转/分钟，用Ca(OH)₂溶液控制pH为7.0。 

具体实施方式

实施例1：产丙酸的詹氏丙酸杆菌筛选方法 

取采取的一定量的淤泥，放入装有100mL无菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中稀释不同浓度梯度，将不同浓度梯度稀释好的样品分别接入富集培养基中30℃静置厌氧培养4-5天，分别重新转接新鲜富集培养基30℃静置厌氧培养4-5天。 

将富集好的培养液进行梯度稀释，分别涂布初筛培养基30℃厌氧培养4-5天。将菌落分 别接入复筛培养基中，30℃静置厌氧培养4-5天。分别测定其菌体浓度，选择菌浓最高的3-4株菌接入发酵培养基，进行产量检测。本发明获得一株詹氏丙酸杆菌JN926（Propionibacterium jensenii JN926），其丙酸产量显著高于现有菌种，于2013年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013071。 

实施例2：詹氏丙酸杆菌的应用 

以1%接种量接种于种子培养基，待生长至对数生长期时，以10%接种量接入装有2L发酵培养基的3L发酵罐内，间歇通氮气以出去氧气，控制温度30℃，200转/分钟，用Ca(OH)₂溶液控制pH为7.0，厌氧培养145小时，取发酵液8000rpm，4℃离心2min。取上清液用3.68mmol/L硫酸定容至10mL。 

检测条件：Agilent高效液相仪，Agilent ZORBAX SB-Aq液相柱，柱温35℃，检测波长210nm，进样量10μL，流动相为19.7g磷酸氢二钠与10mL乙腈溶于1000mL超纯水并且用磷酸将pH调为2.0。 

经过高效液相色谱检测，得到一株能高产丙酸的菌株，其厌氧瓶发酵145h丙酸产量为20.96g/L。 

Claims (4)

1.一种詹氏丙酸杆菌JN926（Propionibacterium jensenii JN926），于2013年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2013071。

2.权利要求1所述的詹氏丙酸杆菌其特征在于具有高丙酸产量。

3.应用权利要求1所述詹氏丙酸杆菌发酵生产丙酸的方法，其特征在于将培养好的詹氏丙酸杆菌按照10%接种量接入装有2L发酵培养基的3L发酵罐内，间歇通氮气以出去氧气，控制温度30℃，200转/分钟，用Ca(OH)2溶液控制pH为7.0。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基发酵培养基组成为：酵母粉10；蛋白胨5；K2HPO42.5；KH2PO41.5；甘油30；CoCl₂0.01，溶解于100ml水中。