BR112015022769B1 - Extração de nitrogênio de materiais orgânicos por amonificação com populações bacterianas mistas - Google Patents

Abstract

extração de nitrogênio de materiais orgânicos por amonificação com populações bacterianas mistas. a invenção proporciona um processo para produzir amoníaco ou amônia a partir de um material orgânico por fermentação de um meio compreendendo o material orgânico na presença de uma população bacteriana mista capaz de amonificação, em que a fermentação é conduzida em condições, e durante um período de tempo suficiente, para produzir um produto de fermentação compreendendo amoníaco ou amônia. o material orgânico inclui compostos azotados adequados para conversão em amoníaco ou amônia.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente descrição refere-se, de um modo geral, a um processo novo para produzir amoníaco e/ou amônia a partir de matérias-primas orgânicas através de um processo de fermentação ou cultura microbiana que emprega uma população mista de micróbios.

[002] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O amoníaco (NH3) é um dos compostos químicos mais produzidos a nível mundial. A produção global atingiu 131 milhões de toneladas em 2010 (US Geological Survey 2012). A maioria do amoníaco produzida é utilizada em fertilizantes químicos para fornecer o nitrogênio necessário ao crescimento das culturas. O amoníaco tem também sido utilizado para produzir plásticos, fibras sintéticas e resinas, explosivos e inúmeros outros compostos químicos.

[004] O ciclo do nitrogênio é um processo que converte o nitrogênio nas suas diferentes formas químicas. A mineralização do nitrogênio em macromoléculas orgânicas, ou seja, a conversão de nitrogênio orgânico em amônia ou amoníaco, é denominada amonificação. A libertação de nitrogênio orgânico como amoníaco é uma parte do ciclo do nitrogênio e é realizada por bactérias amonificantes.

[005] A amonificação pode ser utilizada para libertar nitrogênio de resíduos de materiais orgânicos. Por exemplo, o pedido de patente dos EUA n.° 13/722 228, aqui incorporado integralmente por referência, descreve um método de amonificação. No método do pedido ‘228, material orgânico presente em um meio é posto em contato com uma enzima hidrolítica para se obter um meio constituído por material orgânico hidrolisado ou parcialmente hidrolisado, adequado para fermentação ou cultura microbiana. A fermentação é conduzida na presença de pelo menos um microrganismo capaz de amonificação. O microrganismo pode pertencer, por exemplo, ao gênero Aeromonas, Citrobacter, Clostridium e Entrococcus. O método proporciona taxas de produção de amônia de até cerca de 800 mg/l.

[006] A publicação do pedido de patente dos EUA n.° US20110126455 descreve um método para produzir um inóculo que pode ser utilizado no processo de mineralização para a produção hidropónica. O inóculo formado no processo é capaz de produzir concentrações do íon nitrato de até 400 mg/l, e o tempo necessário para completar o processo de mineralização é tipicamente de 4 a 8 dias.

[007] Continua, assim, a necessidade de longa data de outros métodos económicos para produzir amoníaco a partir de material orgânico, tal como, por exemplo, de resíduos de material orgânico.

[008] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Consequentemente, é proporcionado um processo para produzir amoníaco ou amônia a partir de um material orgânico, que inclui o processo o passo de:

[010] fermentar, em condições aeróbicas ou anaeróbicas, um meio aquoso contendo material orgânico na presença de uma população bacteriana mista capaz de amonificação, em que a fermentação ocorre em condições e por um período de tempo suficiente para produzir um produto de fermentação que compreende amoníaco ou amônia;

[011] em que o material orgânico inclui compostos azotados adequados para conversão em amoníaco ou amônia. Preferencialmente, os compostos azotados são aminas ou proteínas.

[012] Em certas formas de realização da invenção, o processo é realizado a uma temperatura entre 30 e 60 graus Celsius. Mais preferencialmente, o processo é realizado a uma temperatura entre 40 e 55 graus Celsius, ou entre 40 e 50 graus Celsius.

[013] Em certas formas de realização da invenção, o processo é realizado a um pH que varia desde cerca de 5 até cerca de 11. Mais preferencialmente, o processo é realizado a um pH que varia desde cerca de 6 até cerca de 9.

[014] Em certas formas de realização da invenção, o processo de fermentação pode ser realizado em condições aeróbicas ou anaeróbicas, em uma câmara ou frasco de reação adequado, durante um período de tempo e em um intervalo de temperatura eficazes para uma redução eficiente do material orgânico.

[015] Preferencialmente, o processo é realizado com uma população bacteriana mista que inclui uma população bacteriana mista substancialmente semelhante a uma população bacteriana mista selecionada do grupo constituído por H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 e FI1. A população bacteriana mista substancialmente semelhante possui preferencialmente um coeficiente de correlação de 0,80, mais preferencialmente um coeficiente de correlação de 0,90, e ainda mais preferencialmente um coeficiente de correlação de 0,95 em relação a uma população bacteriana mista selecionada do grupo constituído por H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 e FI1.

[016] Em certas formas de realização, a população bacteriana mista é substancialmente semelhante à população bacteriana mista de S1 (N° de Acesso CBS 136063). A população bacteriana mista substancialmente semelhante a S1 possui preferencialmente um coeficiente de correlação de 0,80, mais preferencialmente um coeficiente de correlação de 0,90, e ainda mais preferencialmente um coeficiente de correlação de 0,95 em relação à população bacteriana mista de S1.

[017] Em formas de realização alternativas, pelo menos metade das células na população bacteriana mista consiste em Sporanaerobacter acetigenes e/ou Clostridium spp.

[018] Em outra forma de realização, a população bacteriana mista inclui 5095% de Sporanaerobacter acetigenes e 3-35% de Clostridium spp. A quantidade cumulativa de Sporanaerobacter acetigenes e/ou Clostridium spp é de 70% ou superior. Preferencialmente, a população bacteriana mista inclui desde 50-90% de Sporanaerobacter acetigenes e 5-15% de Clostridium spp.

[019] Em outra forma de realização, a quantidade cumulativa de Sporanaerobacter acetigenes e/ou de Clostridium spp é de 85% ou superior. Em uma outra forma de realização, a população bacteriana mista compreende pelo menos 90% de bactérias da ordem Clostridiales.

[020] Preferencialmente, o processo inventivo inclui ainda a recuperação de amoníaco ou amônia, quer mecanicamente ou por precipitação, do produto de fermentação. O amoníaco ou amônia é opcionalmente recuperado através dos seguintes passos:

[021] separar os produtos de fermentação sólidos e líquidos;

[022] recolher o produto de fermentação líquido composto por amoníaco ou amônia-água, ou recolher uma mistura de gás libertada durante o processo de fermentação ou durante o passo de separação (a); e

[023] (c) recuperar o amoníaco ou amônia.

[024] No processo de acordo com a invenção, o material orgânico é preferencialmente um ou mais dos seguintes: farinha de carne e ossos (MBM), farinhas animais, subprodutos animais, resíduos de matadouros, soro de leite, resíduos urbanos, correntes residuais das indústrias alimentar e de fermentação, e suas combinações. As correntes residuais da indústria alimentar são, por exemplo, subprodutos animais, farinhas animais e resíduos alimentares.

[025] Ainda em outra forma de realização, a invenção inclui uma população bacteriana mista substancialmente semelhante a uma população bacteriana mista selecionada do grupo constituído por H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 e FI1. Preferencialmente, a população bacteriana mista é substancialmente semelhante à população bacteriana mista de S1.

[026] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[027] A FIG. 1 ilustra a determinação do intervalo de temperatura ótimo para a amonificação do nitrogênio proteico de farinha de carne e ossos (“MBM”) pelas populações bacterianas mistas A1, C1, H1, P1 e S1 no Exemplo 1. Os resultados são apresentados como percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco, ou seja, a eficiência de amonificação após 7 dias de incubação a várias temperaturas. As barras de erro indicam o desvio padrão entre duas réplicas biológicas. O intervalo de temperatura ótimo para a amonificação por A1, C1, H1 e P1 é 37-55 °C, e para S1 é 37-60 °C. “RT” indica temperatura ambiente.

[028] A FIG. 2 ilustra a determinação do intervalo de pH ótimo para a amonificação de nitrogênio proteico de MBM pelas populações bacterianas mistas A1, C1, H1, P1, e S1 do Exemplo 1. Os resultados são apresentados em percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco, ou seja, a eficiência de amonificação após 7 dias de incubação a 50 °C. As barras de erro indicam o desvio padrão entre duas réplicas biológicas. O intervalo de pH ótimo para a amonificação por A1, C1, H1, P1, e S1 é de 6 a 9. “N” indica o nitrogênio nos compostos a ser convertido em NH3.

[029] As FIGS. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G e 3H ilustram a eficiência de amonificação de diferentes materiais orgânicos pelas populações bacterianas mistas H1, C1, P1, S1, e A1 do Exemplo 2. As barras de erro indicam o desvio padrão entre duas réplicas biológicas, com três repetições para cada. Os materiais orgânicos são, respetivamente, FIG. 3A: Subproduto de peixe, FIG. 3B: Subproduto de frangos, FIG. 3C: Subproduto de bovino/porcino, FIG. 3D: Máscara de bioetanol, FIG. 3E: Farinha de carne e ossos 1, FIG. 3F: Farinha de carne e ossos 2, FIG. 3G: Farinha de peixe, FIG. 3H: Farinha de penas. Os resultados são apresentados como a percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco, ou seja, a eficiência de amonificação após incubação a 50 °C durante vários períodos de tempo. A população S1 salienta-se por amonificar eficazmente os materiais representados nas FIGs. 3D e 3G, enquanto H1 amonifica rapidamente os materiais representados nas FIGs. 3C, 3D e 3E. Em resumo, todas as cinco populações aumentam a eficiência de amonificação em comparação com os controlos não inoculados. Este efeito é especialmente evidente nos materiais representados pelas FIGs. 3C, 3D, 3E, e 3F. “d” indica o número de dias.

[030] A FIG. 4 ilustra a amonificação de meio de subprodutos de peixe e meio de subprodutos de galinhas em um biorreator a +50 °C, sem um inóculo bacteriano e utilizando a população bacteriana P1 do Exemplo 4. As barras de erro representam os desvios padrão de três medições de amoníaco repetidas.

[031] A FIG. 5 ilustra a determinação do intervalo de temperatura para induzir populações mistas a partir de farinha de carne e ossos não estéril (“MBM”) de dois fabricantes diferentes (MBM1 e MBM2) no Exemplo 5. Os resultados são apresentados como a percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco, ou seja, a eficiência de amonificação após 7 dias de incubação a várias temperaturas. As barras de erro indicam o desvio padrão entre duas réplicas biológicas, exceto MBM1 a 45 °C e 55 °C com 4 e 7 réplicas, respetivamente. As populações de MBM2 são induzidas eficientemente entre a temperatura ambiente (RT) e 70 °C, enquanto a temperatura ótima da MBM1 para a conversão eficiente de nitrogênio é de 50 °C. “RT” indica temperatura ambiente.

[032] A FIG. 6 ilustra um exemplo de um processo de amonificação de subprodutos de matadouros na secção Discussão apresentada adiante.

[033] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[034] É apresentado um método para extração de nitrogênio a partir de materiais orgânicos, através de amonificação por populações bacterianas mistas. Um material orgânico pode ser qualquer material orgânico rico em proteínas, por exemplo, de origem animal ou vegetal. Com vista a um entendimento mais claro da invenção, são definidos os termos a seguir. Os termos listados adiante, salvo indicação em contrário, serão utilizados como indicado e pretende-se que deste modo sejam definidos. Definições de outros termos podem ocorrer durante a descrição. Pretende-se que todos os termos no singular também abranjam o plural, bem como as formas ativa e do pretérito de um termo, salvo indicação em contrário.

[035] O termo "compostos azotados" refere-se a compostos de nitrogênio adequados para a conversão em amoníaco ou amônia através do processo da invenção, tal como, por exemplo, nitrogênio orgânico, incluindo aminas, proteínas e afins. Exemplos de material orgânico incluem material contendo amina, por exemplo, material proteico, tal como farinha de carne e ossos (MBM), subproduto de matadouro, soro de leite, resíduos urbanos, farinha de peixe, correntes residuais da indústria alimentar, por exemplo, subprodutos animais e vegetais incluindo, mas não lhes estando limitados, a farinha de carne e ossos, peixe e penas, assim como resíduos industriais de beterraba, legumes, fruta e açúcar. O termo “MBM”, ou “farinha de carne e ossos”, é aqui utilizado como definido pelo Regulamento (UE) n.° 142/2011 da Comissão, ou seja, “farinha de carne e ossos significa proteína animal derivada do processamento de materiais de Categoria 1 ou Categoria 2 de acordo com um dos métodos de processamento descritos no Capítulo III do Anexo IV”.

[036] O termo ”farinha de origem animal” como aqui utilizado é uma farinha produzida a partir de materiais animais (tais como resíduos de matadouros). Nos Exemplos apresentados adiante, ”farinha animal” é um material do tipo pó. Um processo de fabricação da farinha é utilizar o resíduo do matadouro e extrair a humidade (ou seja, secá-lo), e a seguir moer os sólidos secos.

[037] Os ”materiais de origem vegetal” são definidos a seguir. ”Máscara de bioetanol” (St1 Oy, Finlândia) refere-se a resíduos de fermentação com origem na produção de bioetanol. ”Briquete de cevada” (Senson Oy, Finlândia) é um subproduto da produção de mosto, e ”Máscara de cevada” (Senson Oy, Finlândia) é um subproduto da produção de enzima de cevada. ”Briquete de trigo” (CropEnergies AG, Alemanha) e ”Pasta de colza” (Mildola Oy, Finlândia) são materiais produzidos para alimentar animais.

[038] O termo “ração animal” como aqui utilizado descreve comida preparada para alimentar animais.

[039] Os termos "fermentar" ou "fermentação" referem-se a um processo em que moléculas orgânicas servem tanto de dadores como aceitadores de eletrons. Difere da respiração no fato de os eletrons derivados das moléculas de nutrientes serem doados ao oxigênio (respiração aeróbica) ou a outras moléculas/iões inorgânicos, tais como nitrato, sulfato, dióxido de carbono ou íon férrico (respiração anaeróbica). Na fermentação, as moléculas de nutrientes são reduzidas em moléculas orgânicas pequenas, tais como ácidos gordos voláteis e álcoois. Além disso, o termo fermentação é utilizado para descrever o crescimento microbiano em um meio de crescimento em um recipiente fechado, ou seja, em um biorreator ou fermentador.

[040] O termo “amoníaco” refere-se ao composto NH3 encontrado na forma gasosa ou dissolvido em uma forma não ionizada em um meio como, por exemplo, um meio aquoso. O termo “amônia” refere-se ao íon NH4+, que é a forma iónica de NH3 encontrada, por exemplo, em solução aquosa. Em solução aquosa, o amônia e o amoníaco estabelecem um equilíbrio dependente da temperatura e do pH, por exemplo, quanto mais elevada for a temperatura e o pH, maior será a proporção na forma de amoníaco. Por esta razão, a referência a “amoníaco” feita aqui em relação ao processo inventivo e/ou aos microrganismos de amonificação e seus produtos deve ser entendida como incluindo a referência às formas NH3 e NH4+ deste composto, salvo indicação em contrário. Por exemplo, a discussão relativa aos microrganismos de amonificação como “produtores de amoníaco” ou “produtores de amônia” é entendida como incluindo a produção de NH3 e/ou NH4+ de acordo com o equilíbrio NH3/NH4+ encontrado no específico meio.

[041] O termo amonificação refere-se à mineralização de nitrogênio em macromoléculas orgânicas, ou seja, a conversão de nitrogênio orgânico em amônia ou amoníaco. É realizada por bactéricas amonificantes e consiste na hidrólise enzimática de proteínas em aminoácidos, e na libertação de nitrogênio como amônia/amoníaco através de reações de desaminação e eliminação. As cadeias estruturais de carbono dos aminoácidos são fermentadas em ácidos orgânicos, havendo libertação simultânea de dióxido de carbono e hidrogênio.

[042] O termo "forma unificada" como aqui utilizado em relação à recuperação de amônia e amoníaco dos produtos da fermentação ou cultura refere-se à conversão de iões amônia em outra forma química, tal como amoníaco não iónico (NH3) e/ou qualquer outro composto contendo nitrogênio conhecido na arte, por exemplo, um composto formado pela reação de amoníaco com ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ou ácido fosfórico, ou qualquer outro composto, respetivamente.

[043] As populações bacterianas mistas amonificantes incluem as populações H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 e FI1 e variações destas, e adiante serão descritas em pormenor.

[044] A análise da comunidade bacteriana das populações mistas H1, C1, P1, S1, e A1 foi realizada no DNA obtido por extração com fenol-clorofórmio- álcool isoamílico a partir de culturas de bactérias nas quais as células tinham sido rompidas por impactos com esferas. As populações tinham sido cultivadas durante quatro dias a 37°C, 50°C ou 55°C em meio MBM estéril (180 g de farinha de carne e ossos (MBM) por litro de água) ou em materiais de origem animal. O ensaio do gene 16S bacteriano por pirossequenciação do amplicão FLX codificado com tag (bTEFAP) e as análises de dados da diversidade bacteriana foram realizados pelo Research and Testing Lab (Lubbock, Texas, EUA) como descrito por Dowd et al. 2008a e Wolcott et al. 2009. Os iniciadores 28F ‘GAGTTTGATCNTGGCTCAG’ (SEQ ID NO: 1) e 519R ‘GTNTTACNGCGGCKGCTG’ (SEQ ID NO: 2) foram utilizados para a amplificação das regiões variáveis V1-3 de 16S (em que “N” é A, T/U, G ou C) e em que K é T/U ou G).

[045] A análise da diversidade bacteriana revelou a presença de bactérias pertencentes a 35 gêneros diferentes (Tabela 1). Do total de 53 resultados, 33 foram identificados ao nível da espécie e 20 ao nível do gênero. A TABELA 2 apresenta o gênero e a espécie bacteriana predominantes para cada população. Bactérias pertencentes a 6-8 gêneros formam a maioria de todas as populações. Clostridium spp. e Sporanaerobacter acetigenes são predominantes em todas as populações. Em S1 cultivado a 55°C, Caloramator spp. é tão comum como Clostridium spp.

[046] Os coeficientes de correlação (TABELA 3) foram calculados a partir dos resultados apresentados na TABELA 1 utilizando a equação [1], na qual X e Y referem-se às duas matrizes, por exemplo H1 e C1, entre as quais a correlação é calculada, x e y são valores simples em uma matriz, e xey são as médias de todos os valores em uma matriz. Às espécies não presentes na população (células em branco na TABELA 1) foi atribuído o valor 0.

[047] O termo “substancialmente semelhante” em relação a uma população bacteriana como aqui descrita significa que a população bacteriana possui um coeficiente de correlação de pelo menos 0,8 quando comparado com uma ou mais das populações bacterianas definidas na TABELA 1. Preferencialmente, uma população bacteriana substancialmente semelhante possui um coeficiente de correlação de pelo menos 0,9, e mais preferencialmente, uma população bacteriana substancialmente semelhante possui um coeficiente de correlação de pelo menos 0,95 quando comparado com uma ou mais das populações bacterianas definidas na TABELA 1. Podem também ser utilizados outrosmétodos estatísticos para comparar populações.

[048] A TABELA 3 apresenta uma semelhança muito elevada entre todas as populações com a idade de 4 dias. A maioria das populações compreende apenas algumas espécies e gêneros, permanecendo muito semelhante em todas as condições testadas e superando as populações inatas presentes em materiais de origem animal. P1 é a oitava geração de uma população criada a partir de MBM não estéril, e demonstra que as principais características da população são retidas.

[049] As análises de diversidade bacteriana baseadas em métodos de sequenciação molecular são enviesadas devido, por exemplo, à especificidade e universalidade dos iniciadores (Dowd et al. 2008b). Por isso, o método descrito anteriormente deverá ser utilizado como método-padrão quando são feitas comparações com as populações mistas apresentadas adiante.

[050] TABELA 1. Resultados da análise de diversidade bacteriana: gêneros e espécies nas populações H1, C1, P1, S1, e A1. A população S1 foi também cultivada a 37°C (referida como S1-37), 50°C (referida como S1-50, uma réplica biológica de S1) e 55°C (referida como S1-55). S1 foi igualmente utilizada para inocular 20% (peso/volume) de subproduto de galinha (CBP), osso esmagado de porcino-bovino (CB), subproduto de peixe (MF), subproduto de porcino-bovino (PB) e penas de galinha (FE). Células de todas as culturas com a idade de quatro dias foram recolhidas para extração de DNA. Os resultados são expressos em percentagem da população total.

[051] TABELA 2. Gêneros e espécies de bactérias predominantes nas populações H1, C1, P1, S1 e A1. Os resultados são expressos em percentagem da população total.

[052] TABELA 3. Coeficientes de correlação entre diversidades bacterianas de populações mistas calculados a partir dos resultados apresentados na TABELA 1 utilizando a equação [1].

EXEMPLOS

[053] Os seguintes exemplos representam processos e compostos da presente invenção.

[054] Embora a presente invenção tenha sido descrita com a especificidade correspondente a certas formas de realização da presente invenção, os exemplos seguintes servem apenas para exemplificar e ilustrar a presente invenção e não pretendem limitar ou restringir o âmbito real da presente invenção.

EXEMPLO 1 CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA AMONIFICAÇÃO POR POPULAÇÕES MISTAS

[055] A fim de determinar o intervalo de temperatura ótimo para amonificação por populações mistas, cultivou-se A1, C1, H1, P1 e S1 em meio MBM estéril (180 g de farinha de carne e ossos (MBM) por litro de água) a 50 °C (graus Celsius) sem arejamento durante 3 dias. Estas culturas, que atingiram a fase estacionária de crescimento, foram utilizadas como inóculo a 5% (v/v) (volume por volume) em meio MBM, em um volume total de 60 ml (mililitros). As culturas inoculadas foram incubadas a várias temperaturas, sem arejamento, durante 7 dias.

[056] O crescimento das populações bacterianas mistas foi monitorizado medindo a produção de amônia das populações. Foi determinado repetidamente um nível máximo de amoníaco de cerca de 8 a 10 g/l para o crescimento das culturas nas condições descritas atrás. Por isso, quando a concentração de amoníaco atingiu este nível, isto foi interpretado como tendo sido atingido a transição para a fase estacionária de crescimento. A natureza diversa das populações restringiu a utilização dos métodos baseados na cultura em si para a contagem de células, e a opacidade do meio MBM impediu a utilização da medição da densidade ótica para estimar as densidades celulares. Em todos os exemplos que seguem, “inóculos de populações bacterianas mistas” refere-se a culturas bacterianas que alcançaram a fase estacionária do crescimento.

[057] O grau de amonificação foi determinado medindo a concentração de amoníaco em MBM inoculado, usando o teste Ammonium Test 1.10024.0001 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O resultado foi confirmado com o kit de análise de amoníaco Ammonia Assay Kit AA0100 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[058] O teor em nitrogênio de MBM foi determinado com o método de Kjeldahl por um laboratório de testes acreditado (Novalab Oy, Karkkila, Finlândia). Com base nele, foi calculado um nível máximo de amoníaco, ou seja, a concentração em que todo o nitrogênio proteico é convertido em amoníaco. Foi então calculada a percentagem de conversão do nitrogênio, ou seja, o grau de amonificação do nitrogênio proteico, com base na concentração de amoníaco nas amostras. Os resultados estão apresentados na FIG. 1.

[059] O intervalo de temperatura ótimo para a amonificação por A1, C1, H1 e P1 é 37-55°C, e por S1 é 37-60°C. Contudo, S1 foi mais tolerante à temperatura do que A1, C1, H1 e P1, pois reteve alguma da sua eficiência de amonificação mesmo à temperatura ambiente (RT, 23°C) e a 70°C.

[060] A fim de determinar o intervalo de pH ótimo para a amonificação por populações mistas, cultivou-se A1, C1, H1, P1, e S1 em meio MBM estéril (180 g de MBM por litro de água) a 50°C, sem arejamento, durante 3 d. Estas culturas foram utilizadas como inóculo a 5% (v/v), em meio MBM, em um volume total de 60 ml. O pH destas culturas foi então ajustado diariamente para valores entre pH 5 e 12. As culturas foram incubadas a 50°C, durante 7 d, sem arejamento. A percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco foi então determinada como atrás descrito. Os resultados estão apresentados na FIG. 2.

[061] O intervalo de pH ótimo para a amonificação por A1, C1, H1, P1, e S1 é de cerca de pH 6 até cerca de pH 9. C1, P1 e S1 apresentam todas uma diminuição na eficiência de amonificação a valores de pH abaixo e acima do pH ótimo de 6 a 9. Deve referir-se que a população H1 é, todavia, mais tolerante a um pH elevado do que as outras populações, apresentando alguma atividade a pH 11, enquanto a população A1 tolera um pH baixo, apresentando atividade a pH 5.

[062] Para determinar as condições de oxigênio ótimas para a amonificação por populações mistas, cultivou-se S1 em meio MBM estéril (180 g de MBM por litro de água) a 50°C, sem arejamento, durante 3 d. Estas culturas foram utilizadas como inóculo a 5% (v/v) em meio MBM, em um volume total de 60 ml. As culturas foram incubadas anaerobicamente (em um frasco anaeróbico com AnaeroGen, Oxoid), microaerobicamente (em frascos com tampa fechada), ou aerobicamente (em frascos Erlenmeyer com agitação a uma velocidade de 90 rpm) a +50°C durante 7 dias. Realizaram-se dois testes repetidos para cada condição. A produção de amônia pelas culturas foi medida após 3 e 7 dias de cultura, utilizando o kit para a determinação enzimática de amônia (Ammonium Assay Kit AA0100; Sigma-Aldrich), e a percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco foi então determinada como atrás descrito.

[063] A produção de amoníaco pela população S1 não era dependente do nível de oxigênio das culturas. Obtiveram-se rendimentos de amoníaco de 52,5 a 55,9% para todas as condições de oxigênio após 7 dias de cultura (TABELA 4). Em conclusão, a produção de amônia pela população S1 não era dependente do nível de oxigênio do meio.

[064] TABELA 4. Percentagens de nitrogênio convertido em amônia pela população S1 cultivada em diferentes condições de oxigênio. Os resultados representam as médias de testes de duas réplicas biológicas. São apresentados os desvios padrão de três medições repetidas das duas réplicas biológicas.

[065] Conclusões. Foi determinado o intervalo de operação para a amonificação de materiais proteicos com populações mistas de bactérias. Condições de temperatura de 30°C a 60°C, mais particularmente de 37 a 55°C, e de pH 5 a 11, mais particularmente de pH 6 a 9, foram as melhores para a amonificação bacteriana com as populações aqui descritas. A amonificação pode ser realizada em condições anaeróbicas, microaeróbicas, e aeróbicas utilizando as populações mistas.

EXEMPLO 2 AMONIFICAÇÃO AUMENTADA DE MATERIAIS ORGÂNICOS

[066] Foram utilizadas populações bacterianas mistas H1, C1, P1, S1, e A1 na amonificação de nitrogênio proteico com vários materiais orgânicos, ou seja materiais de origem animal e vegetal tal como definidos adiante.

[067] MBM de origem animal. Os MBMs (doravante designados como MBM1 e MBM2, respetivamente) foram produzidos a partir de subprodutos animais de acordo com os métodos descritos no Regulamento (UE) n.° 142/2011 da Comissão, e consistiam em material de categoria 3 (Regulamento (CE) n.° 1069/2009) de baixo risco de infeção. Em particular, o MBM1 foi obtido de Findest Protein Oy, Finlândia, e o MBM2 foi obtido de SARIA Bio-Industries AG & Co. KG, Alemanha. A farinha de penas foi obtida de Findest Protein Oy, Finlândia, e a farinha de peixe era um produto polaco obtido de Henry Teirs Ltd, Finlândia.

[068] Materiais frescos de origem animal. Foram utilizados subprodutos de matadouro frescos de frango e de origem bovina/porcina. O subproduto dos frangos consistia em intestinos, moelas, fígado, coração, cabeças, sangue, patas, ossos, vértebras cervicais, pele do pescoço e gordura das vísceras. O subproduto de bovino/porcino consistia em pele, músculo, cartilagem, osso cartilaginoso, intestino delgado, coração, pulmão, rim, fígado, e sebo de porco; e músculo, osso cartilaginoso, traqueia, pulmão, sebo, e tripas de bovino. O subproduto de peixe consistia em resíduos de peixe incluindo osso, músculo, pele e vísceras. As penas eram penas lavadas trituradas até um tamanho de partícula 2 cm. O sangue de bovino era sangue congelado de qualidade alimentar. Todos os materiais de peixe, aves, porcinos e bovinos eram de origem finlandesa.

[069] Materiais de origem vegetal. A máscara de bioetanol (St1 Oy, Finlândia) eram resíduos de fermentação com origem na produção de bioetanol, o briquete de cevada (Senson Oy, Finlândia) era um subproduto de produção de mosto, e a máscara de cevada (Senson Oy, Finlândia) era um subproduto da produção de enzima de cevada. O briquete de trigo (CropEnergies AG, Alemanha) e a pasta de colza (Mildola Oy, Finlândia) eram materiais de ração animal.

[070] Os materiais frescos de origem animal foram aplicados como homogenatos a 40% (peso/volume) e as farinhas de origem animal e os materiais de origem vegetal em uma concentração de 180 g por litro. Os homogenatos e as soluções foram preparados com água da torneira em um volume total de 60 ml. O pH dos homogenatos e das soluções foi ajustado com NaOH para pH 7 quando o pH inicial era inferior a 7. Adicionalmente, os materiais de origem vegetal, nomeadamente a Máscara de cevada, Pasta de colza, Briquete de trigo, e Briquete de cevada necessitaram de um ajuste de pH para 7 diariamente, após a inoculação, uma vez que o pH nestes materiais caía para um valor abaixo do intervalo ótimo para a amonificação por populações mistas. Nem a máscara de bioetanol, nem nenhum dos materiais de origem animal necessitaram de ajuste de pH após a inoculação.

[071] As populações bacterianas H1, C1, P1, S1, e A1 foram cultivadas em meio estéril (180 g de MBM por litro de água) a 50°C, sem arejamento, durante 3 d. Estas culturas foram utilizadas como inóculo a 5% (v/v) em homogenatos e soluções de materiais orgânicos. Os materiais inoculados e os controlos não inoculados foram incubados a 50°C sem arejamento.

[072] O grau de amonificação foi determinado medindo a concentração de amoníaco nos materiais orgânicos inoculados através do teste de amônia 1.10024.0001 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O resultado foi confirmado com o kit de ensaio de amoníaco AA0100 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[073] O teor em nitrogênio de MBM foi determinado com o método de Kjeldahl por um laboratório de testes acreditado (Novalab Oy, Karkkila, Finlândia). Com base nele, foi calculado um nível máximo de amoníaco, ou seja, a concentração em que todo o nitrogênio proteico é convertido em amoníaco para cada material orgânico. Foi então calculada a percentagem de conversão do nitrogênio, ou seja, o grau de amonificação do nitrogênio proteico, com base na concentração de amoníaco nas amostras. Os resultados estão apresentados na TABELA 5.

[074] Conclusões. Os resultados apresentam um aumento na amonificação pelas populações bacterianas mistas H1, C1, P1, S1, e A1 em comparação com os controlos não inoculados. As populações bacterianas endógenas são responsáveis por alguma parte da amonificação, particularmente em materiais frescos de origem animal, mas o processo é acelerado pelas populações mistas. Os materiais de origem vegetal apresentam muito pouca atividade de amonificação endógena nas condições utilizadas, e beneficiam significativamente da inoculação de populações.

[075] As populações H1 e S1 pareceram ser as populações mais eficientes na amonificação. A população S1 foi a melhor produtora de amônia em subprodutos de peixe, farinha de peixe, e MBM2. A população H1 foi a melhor produtora de amônia em subprodutos de porcino/bovino, MBM1, e máscara de bioetanol. As populações S1 e H1 nunca foram, em nenhum material, os produtores mais fracos de amônia

[076] As FIGs. 3A-3H ilustram a eficiência de amonificação de diferentes materiais orgânicos pelas populações mistas H1, C1, P1, S1, e A1. Os materiais orgânicos são: FIG. 3A: Subproduto de peixe, FIG. 3B: Subproduto de frango, FIG. 3C: Subproduto de bovino/porcino, FIG. 3D: Máscara de bioetanol, FIG. 3E: Farinha de carne e ossos 1, FIG. 3F: Farinha de carne e ossos 2, FIG. 3G: Farinha de peixe, FIG. 3H: Farinha de penas. Os resultados são apresentados como a percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco, ou seja, a eficiência de amonificação após incubação a 50°C, durante vários períodos de tempo. A população S1 salienta-se, pois amonificou eficientemente os materiais das FIGs. 3A, 3D e 3G, respetivamente, enquanto a H1 amonificou rapidamente os materiais das FIGs. 3A, 3C, 3D e 3E, respetivamente. No final, todas as cinco populações aumentaram a eficiência de amonificação em comparação com os controlos não inoculados. Este efeito é especialmente evidente nos materiais 3C, 3D, 3E, e 3F. As FIGS. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G e 3H apresentam os resultados para os materiais das FIGs. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G e 3H, respetivamente.

[077] TABELA 5. A eficiência da conversão do nitrogênio em amoníaco é apresentada como percentagem do máximo. A determinação foi realizada 24 horas após a inoculação para os subprodutos de peixe, frango, porcino/bovino e farinha de peixe, 48 horas após a inoculação para farinha de carne e ossos, e 168 horas (7 dias) após a inoculação para farinha de penas, penas trituradas, sangue e todos os materiais de origem vegetal. Os controlos dos materiais derivados de plantas não sofreram ajustes de pH. n.d. = não determinado.

EXEMPLO 3 AMONIFICAÇÃO DE MATERIAIS ORGÂNICOS MISTOS (EFEITO DO TEOR DOS CARBOIDRATOS NA AMONIFICAÇÃO)

[078] Açúcar. O efeito da adição de glicose ou amido na produção de amoníaco pela população S1 foi testado em um meio de subproduto de galinha a 40% (peso/volume). Adicionou-se glicose ou amido ao meio em concentrações de 1%, 5% e 10%. A população S1 (cultivada em 180 g/l de meio MBM) foi adicionada como inóculo a 5% (v/v) em 60 ml de meios diferentes, e as culturas foram incubadas a +50°C durante 2 dias. Foram realizados dois testes repetidos com cada um dos meios. A produção de amônia foi medida após 2 dias de cultivo utilizando o kit de determinação enzimática para o amoníaco (Ammonia Assay Kit AA0100; Sigma-Aldrich).

[079] Resultados. A produção de amoníaco pela população S1 foi afetada negativamente pela adição de açúcar ao meio (Tabela 6). Sem adição de carboidratos, o rendimento do amoníaco foi de 60% após 2 dias de cultivo. A adição de glicose ao meio reduziu os rendimentos de amoníaco para 34-48%. 1% de amido não reduziu os rendimentos de amoníaco, mas adições de 5% e de 10% de amido reduziram os rendimentos de amoníaco para 45% e 37%, respetivamente. Os rendimentos mais baixos de amoníaco estavam associados aos pH mais baixos do meio. Em conclusão, a produção de amônia pela população S1 é afetada negativamente pela adição de açúcar ao meio de crescimento.

[080] TABELA 6. Foi testado o efeito da adição de açúcar ou de amido na produção de amoníaco da população S1 em meio de subproduto de galinha a 40%. A produção de amônia foi determinada após 2 dias de cultivo a +50 °C. Os resultados são médias de testes com duas réplicas biológicas. São apresentados os desvios padrão de três medições repetidas para ambas as réplicas biológicas.

[081] Materiais orgânicos mistos. A população S1 foi utilizada para amonificar as misturas de materiais de origem vegetal e animal. Foram preparados meios de cultura com 5% em peso seco. Os meios continham os materiais a seguir, um material ou dois materiais de cada vez, em uma proporção de 50% + 50%: subprodutos de galinha picados (200 g/l isoladamente, 100 g/l em misturas de 50-50), subprodutos de peixe picado (200 g/l isoladamente, 100 g/l em misturas de 50-50), pó da alga Chlorella seco (50 g/l isoladamente, 25 g/l em misturas de 50-50), e briquete de cevada (50 g/l isoladamente, 25 g/l em misturas de 50-50). Os briquetes de cevada foram também misturados em outras proporções com subprodutos de galinha e de peixe, de modo que o teor em peso seco total do meio fosse sempre 5%. Os materiais continham nitrogênio como se segue: galinha 22,2 g/kg, peixe 30,4 g/kg, Chlorella 113,6 g/kg, e cevada 24,6 g/kg. Inoculou-se 7,5 ml da população S1 cultivada em meio MBM (180 g/l) em 150 ml de cada meio. Foram realizados dois testes repetidos para cada meio. As culturas foram incubadas a +50 °C e a produção de amônia das culturas foi determinada após 4 ou 7 dias de cultivo utilizando um kit enzimático quantitativo para a determinação de amoníaco (Ammonia Assay Kit AA0100; Sigma-Aldrich) em amostras biológicas de acordo com as instruções do fabricante.

[082] Resultados (I). Foi produzido amônia em todos os materiais testados e respetivas misturas. O nitrogênio foi convertido em amoníaco em níveis muito elevados (os rendimentos em amoníaco foram os mais elevados) nos meios que continham materiais animais, isto é frango e peixe (72-78%). Nos meios contendo materiais vegetais, isto é, Chlorella e cevada, os rendimentos foram mais baixos (Tabela 7). Quando todos os 4 materiais foram misturados em um meio nas proporções de 25% + 25% + 25% + 25%,o rendimento em amoníaco foi de 67,5 ± 6,7% em 4 dias.

[083] TABELA 7. A produção de amoníaco pela população S1 em meio contendo diferentes materiais e suas misturas em 4 dias. Os resultados são a média de testes de duas réplicas. São apresentados os desvios padrão de três medições repetidas das duas réplicas biológicas.

[084] Os rendimentos nos meios contendo cevada aumentaram com a adição de base aos meios durante a cultura. Quando o pH das culturas foi mantido a 7-8 pela adição de NaOH às culturas (no início e após 1, 4, 5, e 6 dias de cultura), observaram-se os seguintes rendimentos em amoníaco decorridos 4 dias de cultura: 54,5 ± 9,0% nos meios contendo galinha e cevada, 35,6 ± 4,4% nos meios contendo Chlorella e cevada, e 61,2 ± 7,1% em meio de cevada (após 7 dias de cultura). Em relação aos resultados do efeito negativo da adição de carboidratos na amonificação, o efeito acidificante da cevada pode ser consequência do seu teor mais elevado em carboidratos, em comparação com os materiais animais.

[085] Resultados (II). Os briquetes de cevada foram também misturados com subprodutos de galinha e com subprodutos de peixe em diferentes proporções para determinar se o efeito acidificante da cevada poderia ser evitado pela adição de materiais animais ao meio em quantidades suficientes. Estes testes foram realizados em volumes de 60 ml.

[086] A TABELA 8 mostra que em meios contendo subprodutos de galinha, a proporção máxima de cevada era de 30%, pois para valores mais altos o pH caía para menos de 5 e o rendimento máximo em amoníaco era de 21%. Em meios contendo subprodutos de peixe, os rendimentos em amoníaco diminuíram significativamente quando havia menos de 40% de peixe no meio, e o pH também diminuiu para menos de pH 5.

[087] TABELA 8. A produção de amoníaco pela população S1 em meios contendo diferentes materiais e suas misturas em 3 dias. Os resultados são as médias de testes com duas réplicas biológicas. São apresentados os desvios padrão de três medições repetidas das duas réplicas biológicas.

[088] Amonificação de resíduos alimentares com materiais animais. As misturas de resíduos de peixe moídos e resíduos alimentares moídos foram também amonificadas pela população S1. Os meios contendo 40 g de matéria- prima em um volume de 100 ml foram preparados a partir de resíduos de peixe com um teor em nitrogênio de 27,1 g/kg e de resíduos alimentares com um teor em nitrogênio de 10,1 g/kg. O resíduo alimentar continha materiais vegetais e animais. Os meios foram ajustados para pH 7, ou seja, neutro. A população S1 cultivada em meio MBM (180 g/l) foi adicionada como inóculo a 5% (v/v) a 60 ml de cada meio. As culturas foram incubadas a +50 °C e a produção de amônia pelas culturas foi determinada após 3 dias de cultura com um kit de determinação enzimática para o amoníaco (Ammonia Assay Kit AA0100; Sigma- Aldrich).

[089] Resultados. A população S1 converteu 55-72% do nitrogênio do meio em amônia nos meios contendo no mínimo 60% de resíduos de peixe e no máximo 40% de resíduos alimentares (Tabela 9). Para 50% ou menos de resíduos de peixe no meio, o pH das culturas caiu para pH 5 ou menos e o rendimento em amoníaco diminuiu para 8-16%. No Exemplo 3, foi também demonstrado que a adição de carboidratos ao meio provocou a acidificação do meio e teve um efeito negativo na amonificação. O teor elevado em carboidrato dos resíduos alimentares é provavelmente a razão para a acidificação observada dos respetivos meios quando a sua concentração no meio é demasiado elevada, isto é, superior a 40%.

[090] TABELA 9. A produção de amoníaco e o pH da população S1 cultivada em meios contendo diferentes proporções de resíduos de peixe e resíduos alimentares, em 3 dias. São apresentados os desvios padrão de três medições repetidas.

[091] Conclusões. As misturas dos vários materiais foram amonificadas pela população S1. De uma forma geral, os materiais de origem vegetal foram amonificados menos eficientemente do que os materiais de origem animal. Embora não se deseje estar limitado por qualquer hipótese ou teoria da invenção, é possível que esta observação seja explicada pela acidificação do meio durante a cultura. A acidificação do meio pode ser evitada pela adição de base à cultura. Além disso, quando os materiais de origem vegetal e animal estavam misturados em proporções corretas, a acidificação foi evitada e foram alcançados rendimentos mais elevados em amoníaco.

EXEMPLO 4 AMONIFICAÇÃO À ESCALA PILOTO

[092] A capacidade da população bacteriana S1 para amonificar materiais frescos de origem animal foi demonstrada à escala de 20-25 litros. Para estes processos de fermentação ou cultura, utilizaram-se recipientes de aço fechados, de 30 litros, equipados com um sistema de controlo de temperatura e um mecanismo de agitação. Os meios de crescimento eram suspensões a 20% preparadas a partir de subprodutos de frango ou subprodutos de peixe. Em alguns dos testes, adicionou-se à cultura 2,5% ou 5% (v/v) de inóculo de população S1 cultivada em 180 g/l de meio MBM. As culturas foram incubadas sob agitação moderada contínua, a +37°C ou a +50°C, durante 2-3 dias. A produção de amoníaco foi determinada diariamente utilizando o kit de determinação enzimática de amoníaco (Ammonia Assay Kit AA0100; Sigma- Aldrich).

[093] Resultados. Quando os subprodutos de galinha foram incubados a +50°C em um volume de 20 litros, a adição de inóculo de S1 a 5% à cultura demonstrou aumentar os rendimentos em amoníaco significativamente ( FIG. 4), de 5% até 72% em 40,5 horas. Com subprodutos de peixe, em volumes de 25 litros, a adição de inóculo de S1 a 2,5% aumentou os rendimentos de amoníaco de 71% para 91% em 39,5 horas, quando as culturas foram incubadas a +50°C.

[094] Para os processos de fermentação ou cultura de subproduto de peixe com a população S1, compararam-se as temperaturas de cultura de +37°C e +50°C. Após 24 horas de cultura, os rendimentos em amoníaco eram mais elevados, de 80 ± 6%, a +50°C, e mais baixos, de 58 ± 6%, a +37°C. Isto confirmou que +50°C é uma boa temperatura para a amonificação de materiais proteicos com a população bacteriana S1.

[095] Conclusões. Estes resultados, que foram alcançados à escala de 20 25 litros, confirmaram os resultados do Exemplo 2, em que foi demonstrado que a adição de uma população bacteriana aumentava os rendimentos em amoníaco em meios contendo materiais de origem animal.

EXEMPLO 5 INDUÇÃO DE POPULAÇÕES MISTAS A PARTIR DE FARINHA DE CARNE E OSSOS

[096] A população A1 foi criada como se segue: Aspergillus oryzae CECT 2095 foi cultivado em ágar com dextrose de batata (potato dextrose agar) (Meio ATCC 336, a receita é a seguinte: ferver 300 gramas de batatas cortada finamente em 500 ml de água até ficar muito bem cozida. Filtrar e adicionar água ao filtrado até 1000 ml. Adicionar 20 g de glicose e 15 g de ágar, e autoclavar a 121°C.), durante cerca de 7 dias. Verteu-se três mililitros de meio líquido de dextrose de batata (preparado como o ágar com dextrose de batata, mas sem adição de ágar) na cultura de ágar de A. oryzae, e a suspensão foi transferida para 100 ml de meio com dextrose de batata. A cultura foi incubada à temperatura ambiente sob agitação suave durante 3 dias. A seguir, preparou-se um meio MBM1 no estado sólido misturando 36 g de MBM1 não estéril com 50 ml de água da torneira. Inoculou-se 10 ml de cultura líquida de A. oryzae no meio no estado sólido, e a cultura foi incubada a +30°C durante 16 dias. Adicionou-se então água à cultura para se obter uma concentração de 180 g de MBM por litro de água. Esta cultura líquida foi incubada a +50°C durante 4 dias.

[097] A população C1 foi criada misturando MBM1 não estéril com água da torneira fria em uma proporção de 180 g de MBM por litro de água. O MBM foi cultivado sem arejamento, a 50°C, até a concentração de NH3 estar nivelada e a fase estacionária de crescimento ter sido alcançada como explicado no EXEMPLO 1.

[098] A população H1 foi criada misturando MBM1 não estéril com água da torneira a ferver, em uma proporção de 180 g de MBM por litro de água. A mistura foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente. O MBM foi cultivado sem arejamento a 50°C até a concentração de NH3 estar nivelada e a fase estacionária de crescimento ter sido alcançada como explicado no EXEMPLO 1.

[099] A população P1 foi criada misturando MBM1 não estéril com água da torneira fria em uma proporção de 45 g de MBM por litro de água. A mistura foi tamponada para pH 9 com MOPS 20 mM, e cultivada sem arejamento a 50 °C. A cultura que alcançara a fase estacionária de crescimento foi então utilizada para inocular meio MBM1 estéril, e foi cultivada sem arejamento a 50 °C até à fase estacionária. A inoculação e a cultura foram repetidas sete vezes. Por isso, P1 representa a 8â geração da população original de MBM1.

[100] A população S1 foi criada misturando MBM2 não estéril com água da torneira fria em uma proporção de 180 g MBM por litro de água. O MBM foi cultivado sem arejamento, a 50°C, até a concentração de NH3 ter nivelado e a fase estacionária de crescimento ter sido alcançada como explicado no EXEMPLO 1.

[101] Todas as populações foram mantidas por armazenamento da cultura líquida a +4°C. Esta cultura foi utilizada para inocular as culturas utilizadas nos EXEMPLOS de 1 a 6.

[102] Efeito da temperatura. Para determinar a temperatura ótima de enriquecimento de populações de bactérias amonificantes a partir de MBM não estéril, prepararam-se meios MBM não estéreis (180 g de MBM1 ou MBM2 por litro de água da torneira fria) tamponados a pH 7,5 - 8 com MOPS 20 mM. Os meios foram incubados a várias temperaturas entre a temperatura ambiente (RT) e 80°C, durante 7 dias, sem arejamento. As concentrações de NH3 foram determinadas como explicado no EXEMPLO 1. Os resultados estão apresentados na FIG. 5.

[103] Resultados. A temperatura ótima para induzir uma população a partir de MBM1 é de 50°C (FIG. 5.). A temperatura ligeiramente inferior de 45 °C parece ficar entre uma população mesofílica e termofílica como sugere o elevado desvio entre os resultados observado a esta temperatura. Em algumas das amostras das réplicas biológicas observou-se uma eficiência elevada de conversão de nitrogênio, enquanto outras apresentaram baixas recuperações. A população termofílica possui um ótimo distinto, pois a 55°C nem todas as amostras das réplicas biológicas a população é induzida. O MBM2 apresentou um potencial elevado de indução da população a uma vasta gama de temperaturas, RT-70°C. A população de MBM2 apresenta atividade de amonificação em um intervalo mais alargado de temperaturas do que a população de MBM1.

[104] Efeito do pH. Para determinar o pH ótimo de enriquecimento de populações de bactérias amonificantes a partir de MBM não estéril, foram preparados meios MBM não estéreis (180 g de MBM por litro de água) e o seu pH foi ajustado para diferentes níveis (pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12) ou foi deixado sem ajustar. Estes meios foram incubados a +50°C durante 7 dias, sem arejamento. Durante o cultivo, em um teste, os pH foram ajustados para o nível original aos dias 1, 2, 3, e 4. Em outro teste, o pH não foi ajustado durante a cultura. Foram testadas farinhas de carne e ossos (MBM1 e MBM2).de dois fabricantes diferentes

[105] Resultados. O intervalo de pH ótimo para o enriquecimento de populações amonificantes a partir de MBM1 foi de 7-9 quando o pH das culturas foi ajustado diariamente (TABELA 10). Quando o pH foi ajustado apenas no início da cultura, o intervalo de pH ótimo foi de 8-11. Com MBM2, o intervalo de pH ótimo foi de 6-9 quando o pH foi ajustado diariamente. Quando o pH foi ajustado apenas no início da experiência, os pH de 5 a 11 foram todos igualmente bons para o enriquecimento de bactérias amonificantes.

[106] TABELA 10. Efeito do pH da cultura no enriquecimento de populações de bactérias amonificantes a partir de MBM1 e MBM2 não estéreis. O pH da cultura foi ajustado ou no início do teste ou diariamente. São apresentados os desvios padrão de testes com duas réplicas biológicas e três medições repetidas para cada amostra.

[107] Conclusões. As populações mistas podem ser induzidas a partir defarinhas de carne e ossos de dois fabricantes diferentes. As populações sãoinduzidas a várias temperaturas, mas a temperatura ótima varia entre as MBMs.Se o pH for mantido abaixo de 6 ou acima de 9, a indução da população é inibidapara ambas as MBMs.

EXEMPLO 6 PRÉ-TRATAMENTO DE MATERIAIS DE ORIGEM VEGETAL PARA AMONIFICAÇÃO COM ASPERGILLUS ORYZAE

[108] A amonificação de materiais vegetais ricos em carboidratos por populações mistas de bactérias pode causar a acidificação da cultura como descrito nos Exemplos 2 e 3. Neste teste, os materiais vegetais foram pré- tratados com Aspergillus oryzae para diminuir o seu efeito de acidificação na amonificação.

[109] Pasta de colza, briquete de trigos, briquetes de cevada, puré de cevada, e resíduos alimentares (contendo principalmente materiais vegetais mas também alguma carne) foram primeiro hidrolisados com Aspergillus oryzae CECT 2095. Os meios contendo 36 g de pasta de colza ou briquetes de trigo e 90 ml de água da torneira foram preparados em frascos Erlenmeyer de 1 litro. Os meios contendo 18 g de briquetes de cevada e 45 ml de água da torneira, 18 g de puré de cevada e 20 ml de água da torneira, ou 32 g de resíduos alimentares e 43 ml de água da torneira foram preparados em frascos Erlenmeyer de 500 ml. Os meios de pasta de colza e briquetes de trigo foram autoclavados a +121°C para os esterilizar ou foram deixados não estéreis. Os meios de cevada e o meio com resíduos alimentares foram deixados não estéreis.

[110] A.oryzae CECT 2095 foi primeiro cultivado em uma placa com ágar de dextrose de batata (potato dextrose agar) (ferveu-se 300 g de batatas cortadas aos cubos em 500 ml de água até estarem muito bem cozidas, o líquido foi filtrado e adicionou-se água até 1000 ml; acrescentou-se 20 g de glicose e 15 g de ágar; o meio foi autoclavado a +121°C e vertido em placas de ágar), durante 3-7 dias à temperatura ambiente. A seguir, inoculou-se A. oryzae em meio líquido de dextrose de batata (preparado como o ágar de dextrose de batata, mas sem ágar) e cultivou-se à temperatura ambiente, sob agitação moderada, durante 3-5 dias. Inoculou-se 10 ml e 5 ml da cultura líquida nos meios em frascos Erlenmeyer de 1 litro e de 500 ml, respetivamente. As concentrações finais dos meios eram as seguintes: pasta de colza, briquetes de trigo, e briquetes de cevada: 360 g/l, puré de cevada: 720 g/l, resíduos alimentares: 400 g/l.

[111] Todas as culturas foram incubadas a +30°C durante 14 dias. A seguir, as culturas foram pesadas e foi adicionada água em uma quantidade igual à água evaporada das culturas durante a cultura. Os meios hidrolisados com A. oryzae foram amonificados utilizando uma população mista de bactérias de S1. Primeiro, adicionou-se água da torneira às culturas para obter meios com concentrações de 90 g de material vegetal por litro de água. Os meios com resíduos alimentares foram mantidos à concentração original de 40%. Foi adicionado um inóculo de S1 a 5% (v/v) a 40 ou 60 ml dos meios, as culturas foram incubadas a +50°C durante 7 dias, e a produção de amônia nas culturas foi determinada com um kit de determinação enzimática de amoníaco (Ammonia Assay Kit AA0100; Sigma-Aldrich).

[112] Como controlo, foram amonificados pasta de colza, briquetes de trigo, briquetes de cevada, puré de cevada, e resíduos alimentares com a população S1 sem qualquer pré-tratamento. Os meios contendo 180 g/l de briquetes de trigo, pasta de colza, briquetes de cevada, ou puré de cevada por litro de água e uma suspensão de 40% de resíduos alimentares foram preparados em água da torneira. Foi adicionado um inóculo da população S1 a 5% em 40 ou 60 ml do meio, e as culturas foram incubadas a +50°C durante 7 dias. O pH das culturas foi deixado não ajustado ou então foi ajustado diariamente (aos dias 0, 1, 2, 3, e 4) para um nível neutro, utilizando NaOH. A produção de amônia das culturas foi determinada com um kit de determinação enzimática paro amoníaco (Ammonia Assay Kit AA0100; Sigma-Aldrich).

[113] Resultados. Decorridos 14 dias do pré-tratamento com A. oryzae, o pH das culturas era de 7-9. Em todos os meios de origem vegetal não pré- tratados, o pH era acídico. O pré-tratamento de materiais de origem vegetal com A. oryzae aumentou os rendimentos de amoníaco 1,7-8 vezes quando comparado com os materiais de origem vegetal não pré-tratados (TABELA 11). Um aumento semelhante na produção de amônia foi obtido com um ajuste diário do pH da cultura com NaOH. Assim, o pré-tratamento de materiais vegetais com A. oryzae é um meio alternativo para superar o efeito acidificador de materiais vegetais ricos em carboidratos na amonificação. Os materiais vegetais podem ser esterilizados antes do pré-tratamento com A. Oryzae, ou então deixados não estéreis.

[114] TABELA 11. Produção de amônia pela população S1 em diferentes materiais de origem vegetal, com ou sem ajuste diário de pH (foram utilizados meios não estéreis), ou com 14 dias de pré-tratamento com A. oryzae (os meios eram não estéreis ou foram esterilizados antes da inoculação com A. oryzae). A produção de amônia é representada como a percentagem de N convertido em nitrogênio em 7 dias. Os resultados são médias de testes com duas réplicas biológicas e três medições repetidas para cada amostra. Na experiência com A. oryzae, foram realizadas duas réplicas biológicas de culturas de A. oryzae e duas réplicas biológicas de culturas de S1.

EXEMPLO 7 POPULAÇÕES INATAS E POPULAÇÕES DERIVADAS DE FARINHAS DE CARNE E OSSOS INOCULADAS, COMO COMUNIDADES AMONIFICANTES

[115] A análise da comunidade bacteriana de populações inatas de subproduto de frangos (CBP-M), subproduto de porcino/bovino (PB-M), penas de galinha (FE-M), subproduto de peixe (MF-M) e ossos de porcino/bovino esmagados (CB-M) foi realizada em DNA obtido por extração com fenol- clorofórmio-álcool isoamílico de culturas em que as células foram rompidas por impactos com esferas. As populações cultivadas foram criadas e recolhidas a partir de materiais incubados a 20% (peso/volume), a 50 °C, durante quatro dias (FE durante 8 dias). O ensaio do gene bacteriano 16S por pirossequenciação do amplicão FLX codificado com tag (bTEFAP) e a análise de dados da diversidade bacteriana foram realizados pelo Research and Testing Lab (Lubbock, Texas, EUA) como descrito por Dowd al. 2008a e Wolcott et al. 2009. Os iniciadores 28F ‘GAGTTTGATCNTGGCTCAG’ (SEQ ID NO: 1) e 519R ‘GTNTTACNGCGGCKGCTG’ (SEQ ID NO: 2) foram utilizados para a amplificação das regiões variáveis V1-3 de 16S.

[116] Resultados. A análise da diversidade bacteriana de comunidades inatas e inoculadas revelou a presença de bactérias pertencentes a 58 gêneros diferentes (TABELA 12). Do total de 115 resultados, 79 foram identificados ao nível da espécie e 36 ao nível do gênero. A TABELA 13 apresenta o gênero e a espécie bacteriana predominantes em cada população. A maioria das populações era formada por bactérias de 5 a 9 gêneros diferentes. Clostridium spp. e Sporanaerobacter acetigenes predominavam em populações derivadas dos materiais inoculados com S1 assim como em populações inatas de PB-M e MF-M. As outras três populações inatas apresentaram maior variedade: CBP-M consistia predominantemente em Enterococcus spp. e Pediococcus spp., a população FE-M em Petrobacter succinatimandens, Soehngenia saccharolytica, Tissierella sp., e Clostridium spp., e a população CB-M em Leptothrix sp. e Schlegelella spp.

[117] Os coeficientes de correlação (TABELA 14) foram calculados a partir dos dados apresentados na TABELA 12 utilizando a equação [1], em que X e Y se referem às duas matrizes, por exemplo CBP-M e CBP, entre as quais a correlação é calculada, x e y são valores simples na matriz, e xey são as médias de todos os valores em uma matriz. Às espécies não presentes na população (células em branco na TABELA 12) foi atribuído o valor 0.

[118] A TABELA 14 revela uma semelhança elevada entre as populações em todos os cinco materiais inoculados e as populações inatas PB-M e MF-M. As restantes populações inatas CBP-M, FE-M, e CB-M apresentam baixa semelhança entre si, bem como em relação a outras populações. Como referido atrás a respeito dos resultados da TABELA 3, S1 supera as populações inatas presentes em materiais de origem animal. Todavia, uma população semelhante a S1 pode surgir em materiais de origem animal (PB-M e MF-M) nas condições utilizadas. Isto é provável, uma vez que a farinha de carne e ossos, que é a fonte de S1 e de outras populações amonificantes eficazes A1, C1, H1, e P1 (ver EXEMPLO 5), é fabricada a partir de subprodutos de matadouro de várias espécies animais. Contudo, a comparação de populações inatas e inoculadas de CBP, FE, e CB mostra que a comunidade bacteriana pode evoluir para uma composição diferente em condições semelhantes. A TABELA 14 também indica o rendimento em amônia, ou seja, a percentagem de nitrogênio no material de origem animal convertido em amoníaco no momento da colheita da população para extração de DNA. Os rendimentos estão correlacionados com a semelhança entre a população inata e a população inoculada. São alcançados rendimentos de 40% ou mais apenas quando o coeficiente de correlação é superior a 0,9, e preferencialmente superior a 0,95.

[119] TABELA 12. Resultados da análise de diversidade bacteriana: gêneros e espécies nas populações inatas para os materiais de origem animal: subproduto de frangos (CBP-M), subproduto de porcino/bovino (PB-M), penas de galinha (FE-M), subproduto de peixe (MF-M) e osso esmagado de porcino/bovino (CB-M). A análise da diversidade foi também realizada nos mesmos materiais inoculados com 5% (volume/volume) de população S1 derivada de farinha de carne e ossos. Estes resultados são referidos como CBP, PB, FE, MF ou CB e são os mesmos apresentados na TABELA 1. Os resultados são expressos em percentagem da população total.

[120] TABELA 13. Gêneros e espécies bacterianas predominantes nas populações CBP-M, CBP, PB-M, PB, FE-M, FE, MF-M, MF, CB-M, e CB. Os resultados são expressos em percentagem da população total.

[121] TABELA 14. Coeficientes de correlação entre diversidades bacterianas de populações mistas calculados a partir dos dados apresentados na TABELA 12 utilizando a equação [1]. O rendimento (última linha) é a percentagem de nitrogênio no material de origem animal convertido em amoníaco no momento da colheita da população para extração de DNA.

EXEMPLO 8 EFICIÊNCIA DE AMONIFICAÇÃO POR POPULAÇÕES DERIVADAS DE SOLO E DE FARINHA DE CARNE E OSSOS

[122] Para comparar a composição da comunidade bacteriana e a capacidade de amonificação de populações derivadas de farinha de carne e ossos e outras fontes, cultivaram-se populações naturais de solos de floresta e do campo.

[123] As populações FO1 e FI1 foram criadas misturando solo de floresta (FO) ou do campo (FI) não estéril com água da torneira fria em uma proporção de 180 g de solo por litro de água. A mistura foi cultivada sem arejamento a 50°C. As populações FO2 e FI2 foram criadas misturando solo não estéril de floresta (FO) ou de campo (FI) com água da torneira a ferver em uma proporção de 180 g de solo por litro de água. A mistura foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente. Todas as misturas foram incubadas sem arejamento a 50°C. Após 7 dias de incubação, inoculou-se 5 ml de cada cultura em 100 ml de meio MBM1 estéril contendo 180 g de MBM1 por litro de água. As culturas foram incubadas a 50°C durante 7 dias.

[124] A análise da comunidade bacteriana das populações do solo foi realizada em DNA obtido por extração com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico de culturas nas quais as células tinham sido rompidas por impacto com esferas. O ensaio do gene 16S por pirossequenciação do amplicão FLX codificado com tag (bTEFAP) e a análise de dados da diversidade bacteriana foram realizados pelo Research and Testing Lab (Lubbock, Texas, EUA) como descrito por Dowd et al.2008a e Wolcott et al. 2009. Foram utilizados os iniciadores 28F‘GAGTTTGATCNTGGCTCAG’ (SEQ ID NO: 1) e 519R‘GTNTTACNGCGGCKGCTG’ (SEQ ID NO: 2) para a amplificação das regiões variáveis V1-3 de 16S.

[125] Resultados. A análise da diversidade bacteriana das populações do solo e de MBM revelaram a presença de bactérias pertencentes a 45 gêneros diferentes (TABELA 15). Do total de 85 resultados, 66 foram identificados ao nível da espécie e 19 ao nível do gênero. A TABELA 16 apresenta os gêneros e as espécies bacterianas predominantes em cada população. A maioria das populações era formada por bactérias de 6 a 7 gêneros diferentes. Clostridium spp. e Sporanaerobacter acetigenes predominavam nas populações derivadas de MBM assim como de FO1 e FI1. As outras duas populações do solo apresentavam maior variedade: FO2 consistia predominantemente em Bacillus spp., Thermoanaerobacterium spp., e Clostridium spp., e FI2 em Clostridium spp., Tissierella sp., e Caloramator sp. Os coeficientes de correlação (TABELA 17) foram calculados a partir dos dados apresentados na TABELA 15 utilizando a equação [1], em que X e Y se referem às duas matrizes, por exemplo A1 e C1, entre as quais a correlação é calculada, x e y são valores simples na matriz, e xey são as médias de todos os valores em uma matriz. Às espécies não presentes na população (células em branco na TABELA 12) foi atribuído o valor 0.

[126] A TABELA 17 mostra uma semelhança elevada (coeficiente de correlação > 0,9) entre todas as cinco populações derivadas de MBM, assim como entre as populações do solo FO1 e FI1. Deste modo, populações semelhantes às populações derivadas de MBM podem ter origem no solo. Os coeficientes de correlação de FO2 e FI2 são inferiores a 0,2, indicando pouca semelhança. Como tal, a dissolução de solo em água a ferver é letal para as bactérias importantes para a amonificação. A TABELA 17 também indica o rendimento em amônia, ou seja, a percentagem de nitrogênio em MBM convertido em amoníaco no momento da colheita da população para extração de DNA. Os rendimentos apresentam uma boa correlação entre a população inata e a população inoculada. Rendimentos de 40% ou mais são alcançados apenas quando o coeficiente de correlação é superior a 0,9.

[127] TABELA 15. Resultados da análise da diversidade da comunidade bacteriana: gênero e espécies nas populações derivadas do solo e de farinha de carne e ossos A1, C1, H1, P1, e S1. Os resultados das populações derivadas da farinha de carne e ossos A1, C1, H1, P1, e S1 são os mesmos apresentados na TABELA 1. Os resultados são expressos em percentagem da população total.

[128] TABELA 17. Coeficientes de correlação entre diversidades bacterianas de populações mistas calculados a partir dos dados apresentados na TABELA 15 utilizando a equação [1]. O rendimento (última linha) é a percentagem de nitrogênio no material de origem animal convertido em amoníaco no momento da colheita da população para extração de DNA.

EXEMPLO 9 EFICIÊNCIA DE AMONIFICAÇÃO POR POPULAÇÕES DERIVADAS DO RÚMEN DE VACA E FARINHA DE CARNE E OSSOS

[129] Para comparar a capacidade de amonificação de populações derivadas de farinha de carne e ossos com outras fontes, foi estudada a população do rúmen bovino. A produção excessiva de amoníaco é uma deficiência nutricional importante em ruminantes. A generalidade da atividade de catálise de aminoácidos, e deste modo de produção de amoníaco do rúmen, foi atribuída a certos micróbios denominados bactérias híper-produtoras de amoníaco (HAB) (Russell et al. 1988; Chen e Russell 1989; Krause e Russell 1996, Eschenlauer et al. 2002). Deste modo, o rúmen pode ser uma fonte de bactérias que amonificam eficientemente.

[130] O enriquecimento de uma população amonificante foi testado por sucessivas rondas de cultura de bactérias do rúmen bovino em MBM1 estéril. O conteúdo do rúmen bovino foi obtido a partir de uma vaca fistulada, e filtrado para separar o líquido dos sólidos. O líquido foi adicionado a meio MBM1 estéril (180 g de farinha de carne e ossos por litro de água) como um inóculo a 25% (volume/volume), e cultivado sem arejamento a 37 °C. Cada ciclo de enriquecimento durou 7 dias para permitir que a reação de amonificação se realizada em toda a sua extensão.

[131] Resultados. O rendimento em amoníaco, ou seja, a percentagem de nitrogênio convertido em amoníaco, aumentou de 12,3% ± 6,6% para 24,7% ± 3,1% durante os três primeiros ciclos de enriquecimento, mas nos quatro ciclos seguintes permaneceu ao mesmo nível. Como se pode ver na FIG. 1 do EXEMPLO 1, as populações derivadas de MBM proporcionam maiores rendimentos em amoníaco, desde 37,9% ± 2,3% até 58,8% ± 13,9% a 37 °C. Deste modo, apesar do enriquecimento, a população do rúmen é menos eficiente na amonificação do que as populações derivadas de MBM.

[132] As populações enriquecidas do rúmen não foram sujeitas a análise de diversidade da comunidade. Fouts et al. (2012) referem no seu estudo de populações ruminantes com doze vacas, que 80% das bactérias identificadas ao nível da espécie pertenciam às ordens Clostridiales, Bacteroidales, Erysipelotrichales e TM7 não classificadas. Esta composição difere da composição das populações derivadas de MBM A1, C1, H1, P1, e S1 (TABELA 2), 94-98% das quais consistiam em bactérias pertencentes à ordem Clostridiales (gênero Caloramator, Clostridium, Sporanaerobacter, Garciella e Tissierella).

[133] DISCUSSÃO

[134] Com base nos testes, é evidente que a amonificação com populações mistas definidas resulta em rendimentos superiores aos obtidos com a técnica anterior. Utilizando as populações descritas atrás, foram conseguidas concentrações de amoníaco de até 12 g/L, dependendo do teor em proteína do material/meio de partida. Isto representa um aumento de 15-30 vezes nos rendimentos de amonificação em comparação com a técnica anterior. Tipicamente, verificou-se que 50-80% do nitrogênio total do meio foi convertido em amoníaco em 24-48 horas.

[135] Um exemplo de ambiente 100 de um processo de amonificação de subprodutos/resíduos de matadouro é apresentado na FIG. 6. O material orgânico (subprodutos) é armazenado em um recipiente 106. O resíduo no recipiente 106 é alimentado a um biorreator 104. É adicionada água ao biorreator 104 de uma fonte de água 102. Inóculo é adicionado ao biorreator 104 de uma fonte 116. O tipo de inóculo é selecionado de um grupo de H1, C1, P1, S1 e A1. Preferencialmente, o inóculo é de uma população mista de S1. O biorreator pode ter os meios de mistura/agitação 105 e meios de controlo de aquecimento/temperatura 110. De acordo com as formas de realização, o elemento de aquecimento 110 é utilizado para aquecer o conteúdo do biorreator 104 até cerca de 50 graus Celsius (40-55 graus Celsius para a população S1). Se necessário, o pH pode ser controlado por adição de base (tal como NaOH) ao biorreator 104 para manter os níveis de pH acima de 6. O tempo de fermentação é preferencialmente cerca de 16-48 horas.

[136] Durante o processo de fermentação com uma população bacteriana mista, o amônia/amoníaco é libertado para o líquido de fermentação. Amostras de líquido do biorreator 104 podem ser retiradas periodicamente para seguir a evolução do processo. Um parâmetro a seguir é a concentração de amoníaco/amônia no líquido. Por exemplo, em certas formas de realização da invenção, o processo de fermentação está completo ou suficientemente completo quando a alteração na concentração de amoníaco/amônia entre duas amostras consecutivas não revela um aumento significativo.

[137] Todo ou algum do líquido do biorreator 104 pode ser conduzindo à fase de dessorção 108, na qual o amônia/amoníaco é extraído do líquido na forma de amoníaco (NH3). O amoníaco pode ser armazenado em um recipiente 112 para utilização futura, tal como parte da produção de fertilizante. Alternativamente, algum ou todo o líquido pode ser transferido para o recipiente 113 e utilizado diretamente como fertilizante.

[138] Após remoção de todo ou algum do líquido, os sólidos e/ou líquidos podem ser recolhidos e armazenados em 114 para utilização futura. Algum do material em 114 pode ser também alimentado ao biorreator 104 e utilizado como inóculo no ciclo seguinte. Adicionalmente, alguns líquidos e/ou sólidos podem ser deixados no biorreator 104 para formar a base para o próximo ciclo.

[139] A amonificação de materiais de origem vegetal com um teor elevado em carboidratos pode ser inibida por acidificação do meio durante o processo de fermentação. A acidificação do meio pode ser evitada pela adição de base (tal como NaOH) à cultura. Além disso, se os materiais de origem vegetal e animal forem misturados em proporções moderadas, a acidificação poderá ser evitada e serão obtidos rendimentos em amoníaco superiores.

[140] A amonificação de diferentes materiais proteicos poderá ser otimizada pela seleção apropriada de uma população mista de bactérias. Como se pode ver na TABELA 3, a eficiência de amonificação de cada material depende da população de bactérias utilizada. Por exemplo, os subprodutos de porcino/bovino são amonificados mais eficientemente pela população H1, enquanto os subprodutos de peixe são amonificados mais eficientemente pela população S1. Em média, as populações H1 e S1 são as populações amonificantes mais eficientes com todos os materiais proteicos, e qualquer uma entre H1 e S1 poderá ser selecionada como a população utilizada na amonificação de qualquer material.

[141] S1 e outras populações derivadas de MBM são eficientes na amonificação de vários materiais de origem animal. Alguns destes materiais podem dar origem a populações inatas que amonificam eficientemente quando incubadas em condições semelhantes às utilizadas para produzir as populações derivadas de MBM. No entanto, nenhum dos materiais de origem animal possui uma população amonificante. O rúmen é uma fonte bem conhecida de espécies bacterianas hiper-produtoras de amoníaco, mas o enriquecimento de uma população mista capaz de amonificação com uma eficiência semelhante à das populações derivadas de MB não foi possível. As amostras de solo também deram origem a populações amonificantes eficientes e ineficientes dependendo das condições utilizadas.

[142] Temperaturas de 30 a 60 °C, mais exatamente de 37 a 55 °C, e pH de 5 a 11, mais exatamente pH de 6 a 9, foram os melhores na amonificação bacteriana com as populações aqui descritas. Em particular, a inoculação de material orgânico com uma população bacteriana substancialmente semelhante a S1 resulta em bons rendimentos de amonificação. Adicional ou alternativamente, o contacto de material orgânico com uma população bacteriana constituída por, relativamente à população total, 53 a 91% de Sporanaerobacter acetigenes e 8 a 34% de Clostridium spp. resulta em bons rendimentos de amonificação. A amonificação funciona em condições anaeróbicas, microaeróbicas, e aeróbicas utilizando as populações mistas.

[143] INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[144] Muitas referências são citadas ao longo deste pedido, cada uma das quais é aqui incorporada integralmente por referência.

[145] DECLARAÇÃO DE DEPÓSITO

[146] Culturas do(s) seguinte(s) material(is) biológico(s) foram depositadas junto do seguinte depositário internacional:

[147] Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

[148] Uppsalalaan 8

[149] 3584 CT Utrecht

[150] The Netherlands

[151] em condições que satisfazem os requisitos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes. Acesso ao Depositário Internacional

REFERÊNCIAS

[152] Chen, G.J., Russell, J.B. 1989. More monensin-sensitive, ammonia- producing bacteria from the rumen. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1052-1057.

[153] Dowd, S.E., Wolcott, R.D., Sun, Y., McKeehan, T., Smith, E., Rhoads, D. 2008a. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS ONE 3(10): e3326.

[154] Dowd, S.E., Sun, Y., Secor, P.R., Rhoads, D.D., Wolcott, B.M., James, G.A., Wolcott, R.D. 2008b. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology 8: 43.

[155] Regulamento (CE) n.° 1069/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho de 21 de outubro de 2009 que estabelece regras sanitárias relativas aos subprodutos animais e produtos derivados não destinados ao consumo humano e que revoga o Regulamento (CE) n.° 1774/2002 (Regulamento relativo aos subprodutos animais). Jornal Oficial da Uníon Europeia L300: 1-33.

[156] Eschenlauer, S.C.P., McKain, N., Walker, N.D., McEwan, N.R., Newbold, C.J., Wallace, R.J. 2002. Ammonia production by ruminal microorganisms and eem umeration, isolation, and characterization of bacteria capable of growth on peptides and amino acids from the sheep rumen. Appl. Environ. Microbiol. 68(10): 4925-4931.

[157] Regulamento (UE) N.° 142/2011 de 25 de fevereiro de 2011 que aplica o Regulamento (CE) n.° 1069/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho que define regras sanitárias relativas a subprodutos animais e produtos derivados não destinados ao consumo humano e que aplica a Diretiva 97/78/CE do Conselho no que se refere a certas amostras e certos artigos isentos de controlos veterinários nas fronteiras ao abrigo da referida diretiva. Jornal Oficial da Uníon Europeia L54: 1-354.

[158] Fouts, D.E., Szpakowski, S., Purushe, J., Torralba, M., Waterman, R.C., MacNeil, M.D., Alexander, L.J., Nelson, K.E. 2012. Next generation sequencing to define prokaryotic and fungal diversity in the bovine rumen. PLoS One 7(11): e48289.

[159] Krause, D.O., Russell, J.B. 1996. An rRNA approach for assessing the role of obligate amino acid-fermenting bacteria in ruminal amino acid deamination. Appl. Environ. Microbiol. 62, 815-821.

[160] Russell, J.B., Strobel, H.J., Chen, G.J. 1988. Enrichment and isolation of a ruminal bacterium with a very high specific activity of ammonia production. Appl. Environ. Microbiol. 54, 872-877.

[161] Wolcott, R., Gontcharova, V., Sun, Y., Dowd, S.E. 2009. Evaluation of the bacterial diversity among and within individual venous leg ulcers using bacterial tag-encoded FLX and Titanium amplicon pyrosequencing and metagenomic approaches. BMC Microbiology 9: 226.

Claims (14)

1. Processo de produção de amoníaco ou amônia a partir de um material orgânico, em que compreende:fermentar um meio aquoso compreendendo material orgânico na presença de uma população bacteriana mista capaz de amonificação, em que a fermentação se realiza em condições, e durante um período de tempo suficiente, para produzir um produto de fermentação que compreende amoníaco ou amônia;em que o material orgânico compreende compostos azotados adequados para conversão em amoníaco ou amônia,caracterizado por a população bacteriana mista ser substancialmente semelhante a uma população bacteriana mista isolada de S1 (CBS No. de acesso 136063), em que a população bacteriana mista substancialmente semelhante possui um coeficiente de correlação de pelo menos 0,90, em relação a S1

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fermentação ser conduzida a uma temperatura desde 30 até 60 graus Celsius e a um pH desde cerca de 5 até cerca de 11.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fermentação ser conduzida a uma temperatura desde 40 até 50 graus Celsius e a um pH desde cerca de 6 a cerca de 9.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a população bacteriana mista substancialmente semelhante ter um coeficiente de correlação de pelo menos 0,95 relativamente para a população bacteriana mista de S1 (Acesso CBS N.° 136063).

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fermentação ser conduzida a uma temperatura desde cerca de 40°C até cerca de 55 °C.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o processo compreender adicionalmente a recuperação de amoníaco ou amônia do produto de fermentação.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o amoníaco ou amônia ser recuperado mecanicamente ou ser precipitado.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o amoníaco ou amônia ser recuperado pelos passos de:(a) separação dos produtos de fermentação sólidos e líquidos;(b) recolhimento do produto de fermentação líquido que compreende amoníaco ou amônia-água, ou recolher uma mistura de gás libertada durante o processo de fermentação ou durante o passo de separação (a); e(c) recuperação do amoníaco ou amônia.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os compostos nitrogenados serem aminas ou proteínas.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material orgânico ser selecionado do grupo constituído por farinha de carne e ossos (MBM), farinhas de origem animal, subprodutos de origem animal, resíduos de matadouro, soro de leite, resíduos urbanos, farinha de peixe, correntes de efluentes das indústrias alimentar e de fermentação, e suas combinações.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os resíduos da indústria alimentar serem selecionados do grupo constituído por subprodutos de origem animal, farinhas de origem animal e resíduos alimentares.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fermentação ser conduzida em condições aeróbicas ou anaeróbicas.

13. População bacteriana mista caracterizada por a população bacteriana mista ter um coeficiente de correlação de pelo menos 0,95 em relação a uma isolada população bacteriana mista de S1 (Acesso CBS N.° 136063).

14. População bacteriana mista caracterizada por a população bacteriana mista ser uma população bacteriana mista isolada de S1, depositada na Autoridade Depositária Internacional dos Países Baixos sob o número 10 da CBS n° 136063.

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