ES2316804T3 - Procedimiento de produccion para iturina a y sus homologos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para producir iturina A y sus homólogos, que comprende cultivar un microbio Bacillus que presenta la capacidad de producir iturina A y sus homólogos en un medio líquido que contiene 2% en peso o más de soja en polvo o su extracto para permitir que el microbio acumule iturina A y sus homólogos en el medio en una concentración de 1,5 g/l o mayor, en el que el microbio Bacillus que presenta la capacidad de producir iturina A y sus homólogos es un microbio Bacillus que no presenta capacidad para acumular surfactina en una cantidad superior a 50 ppm cuando se cultiva en un medio que contiene soja pulverizada o su extracto como fuente de nitrógeno, y en el que el microbio Bacillus que presenta la capacidad para producir iturina A y sus homólogos es un microbio Bacillus que puede desarrollarse en un medio que contiene 1,5 g/l o más de iturina A y sus homólogos.
Description
Procedimiento de producción para iturina A y sus
homólogos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir iturina A y sus homólogos cultivando un
microbio perteneciente al género Bacillus en un medio líquido
que contiene soja o su extracto como fuente de nitrógeno a efectos
de acumular iturina A y sus homólogos en altas concentraciones en
dicho medio líquido. Además, la presente invención se refiere a un
producto de cultivo que contiene iturina A y sus homólogos, a una
sustancia sólida que contiene iturina A y sus homólogos obtenida
secando el producto de cultivo, y a los procedimientos de
aplicación del mismo.
Es conocido convencionalmente el hecho de que
los microbios pertenecientes al género Bacillus,
particularmente el Bacillus subtilis, producen iturina A y
sus homólogos (véase, por ejemplo, Besson et al, Journal of
Antibiotics, 1978, Vol. 31, p.284-288).
Iturina A y sus homólogos se refiere a un grupo
de compuestos que presentan la estructura representada a
continuación por la fórmula 1 y que presentan actividades
antimicrobianas sobre hongos, particularmente sobre los microbios
patogénicos de vegetales, de tal modo que han atraído la atención
como componentes excelentes para prevenir las enfermedades en
vegetales.
(R representa un grupo alquilo
lineal o ramificado con 3 a 10 átomos de
carbono).
Los ejemplos de procedimientos para producir
iturina A y sus homólogos incluyen los descritos en
JP-A-59-212416,
JP-A-7-143897
(patente US nº 5.470.827 y nº 5.494.809), etc.
Sin embargo, los microbios Bacillus
producen iturina A y sus homólogos con productividades demasiado
bajas para aplicarlos a la producción a escala industrial. En
consecuencia, muchos investigadores han dedicado esfuerzos a
incrementar las productividades con las que se producen la iturina A
y sus homólogos.
Hatada et al dan a conocer un
procedimiento para producir una sustancia basada en iturina A
mediante cultivo aeróbico de cepa nº
NA-apb-1 de Bacillus subtilis
en un medio nutriente
(JP-B-63-20519). En
dicha publicación se indican como fuentes de nitrógeno peptona,
extracto de carne, extracto de levadura, hidrolizados de caseína,
licor de almidón de maíz, harina de gluten y fuentes de nitrógeno
inorgánicas, y se describe el hecho de que se obtienen 270 mg de
iturina A a partir de 30 l de un filtrado de cultivo obtenido
cultivando la cepa en un medio que contiene peptona, extracto de
carne y extracto de levadura. Sandrin et al dan a conocer el
hecho de que se pueden obtener 480 mg/l de iturina A y sus homólogos
en un medio sintético que contiene prolina como fuente de nitrógeno
(Biotechnology and Applied Biochemistry, 1990, Vol. 12,
p.370-375).
Hbid et al dan a conocer un procedimiento
que alcanza un rendimiento de iturina A y sus homólogos de 1.388
mg/l en un medio que contiene peptona (Applied Biochemistry and
Biotechnology, 1996, Vol. 57/58, p.571-579). Phae
et al dan a conocer un procedimiento que alcanza un
rendimiento de iturina A y sus homólogos de 620 mg/l (Journal of
Fermentation and Bioengineering, 1991, Vol. 71,
p.118-121).
Por otro lado, como procedimiento para cultivar
un microbio Bacillus en un medio líquido que contiene soja
en polvo o su extracto, los inventores de la presente invención han
dado a conocer un procedimiento de producción para la surfactina
(JP-A-2002-176993).
Sin embargo, dicha publicación no da a conocer nada sobre la
iturina A y sus homólogos. Además, el documento
JP-A-59-212416 da a
conocer la realización de un cultivo en un medio que contiene 1% de
soja en polvo a efectos de obtener 300 mg de iturina A y sus
homólogos a partir de 16 l del caldo de cultivo. Sin embargo, la
cantidad de iturina A obtenida es sólo ligeramente mayor que la
cantidad obtenida mediante un procedimiento de cultivo conocido.
Se desconoce el hecho de que el cultivo de un
microbio Bacillus que presenta la capacidad para producir
iturina A y sus homólogos en un medio líquido que contiene soja en
polvo o su extracto en una cantidad de 2% en peso o mayor permite
la acumulación de iturina A y sus homólogos en dicho medio en una
concentración de 1,5 g/l o mayor.
El documento WO 9850422 da a conocer un
procedimiento para producir compuestos de iturina A, que comprende
el cultivo de un microbio Bacillus subtilis.
La productividad de iturina A y sus homólogos
obtenida convencionalmente resulta insuficiente para aplicaciones
industriales, de tal modo que existe una demanda de un procedimiento
de producción que permita una mayor productividad.
Correspondientemente, un objetivo de la presente
invención consiste en dar a conocer un procedimiento para producir
iturina A y sus homólogos cultivando un microbio Bacillus que
produce iturina A y sus homólogos y permite a dicho microbio
acumular iturina A y sus homólogos en el caldo de cultivo en
concentraciones elevadas.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en dar a conocer un producto de cultivo que contiene iturina A y
sus homólogos, un producto sólido del mismo y un procedimiento para
utilizarlos.
Para alcanzar los objetivos anteriormente
mencionados, los inventores de la presente invención han llevado a
cabo intensos estudios de diversos componentes en los medios de
cultivo. Como resultado, han descubierto que el cultivo de un
microbio Bacillus que produce iturina A y sus homólogos en un
medio que contiene 2% en peso o más de soja pulverizada o su
extracto como fuente de nitrógeno produce una acumulación de iturina
A y sus homólogos en el caldo de cultivo en concentraciones
elevadas, llevando a cabo de este modo la presente invención.
Es decir, la presente invención se refiere a
procedimientos para producir iturina A y sus homólogos, a cultivos
que contienen iturina A y sus homólogos, y a sólidos que contienen
iturina A y sus homólogos, descritos a continuación.
1. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos, que comprende cultivar un microbio Bacillus que
presenta la capacidad de producir iturina A y sus homólogos en un
medio líquido que contiene 2% en peso o más de soja en polvo o su
extracto a efectos de permitir que el microbio acumule iturina A y
sus homólogos en el medio en una concentración de 1,5 g/l o mayor,
en el que el microbio Bacillus que presenta la capacidad de
producir iturina A y sus homólogos es un microbio Bacillus
que no presenta capacidad para acumular surfactina en una cantidad
mayor de 50 ppm cuando se cultiva en un medio que contiene soja
pulverizada o su extracto como fuente de nitrógeno, y en el que el
microbio Bacillus que presenta capacidad para producir
iturina A y sus homólogos es un microbio Bacillus que puede
desarrollarse en un medio que contiene 1,5 g/l o más de iturina A y
sus homólogos.
2. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según el punto 1 anterior, en el que se añaden al medio
líquido de 0 a 3% en peso de fosfatos, en términos de
K_{2}HPO_{4}.
3. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según los puntos 1 ó 2 anteriores, en el que el microbio
es Bacillus subtilis.
4. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según cualquiera de los puntos 1 a 3 anteriores, en el
que el microbio es Bacillus subtilis con número de acceso
FERM BP-08427.
5. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según el punto 1 anterior, en el que el medio líquido que
contiene 2% en peso o más de soja en polvo o su extracto contiene,
por lo menos, un elemento seleccionado entre el grupo que consiste
en maltosa, jarabe de almidón, almidón soluble, dextrina, glucosa,
sucrosa y fructosa.
6. Microbio Bacillus que presenta
capacidad para producir iturina A y sus homólogos y no presenta
capacidad para acumular surfactina en una cantidad mayor de 50 ppm
cuando se cultiva en un medio que contiene soja pulverizada o su
extracto como fuente de nitrógeno, en el que el microbio
Bacillus que presenta capacidad para producir iturina A y
sus homólogos es un microbio Bacillus que puede desarrollarse
en un medio que contiene 1,5 g/l o más de iturina A y sus
homólogos.
7. Microbio Bacillus según el punto 6
anterior, que es Bacillus subtilis con número de acceso FERM
BP-08427.
8. Cultivo que contiene iturina A y sus
homólogos, y el microbio Bacillus según los puntos 6 ó 7
anteriores.
9. Sólido que contiene iturina A y sus
homólogos, que se puede obtener secando el cultivo según el punto 8
anterior.
10. Agente para prevenir enfermedades de los
vegetales, que comprende el cultivo que contiene iturina A y sus
homólogos, o el sólido obtenido del mismo, según los puntos 8 ó 9
anteriores.
11. Procedimiento para prevenir una enfermedad
de vegetales, que comprende utilizar el cultivo que contiene
iturina A y sus homólogos, o el sólido obtenido del mismo, según los
puntos 8 ó 9 anteriores, en una forma no purificada.
A continuación, la presente invención se
describe con detalle.
En la presente invención, iturina A y sus
homólogos significa derivados representados por la siguiente fórmula
(1), incluyendo compuestos relacionados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(R representa un grupo alquilo
lineal o ramificado con 3 a 10 átomos de
carbono).
Según la presente invención, el cultivo de un
microbio que produce iturina A y sus homólogos en un medio,
añadiendo soja en polvo o su extracto como fuente de nitrógeno en
una cantidad de 2% en peso o más a dicho medio, permite la
acumulación en concentraciones elevadas de iturina A y sus análogos
en dicho medio. Hasta donde llega el conocimiento de los presentes
inventores, la técnica por la cual se cultiva un microbio
Bacillus en un medio que contiene soja pulverizada o su
extracto como fuente de nitrógeno es convencionalmente conocida.
Sin embargo, los presentes inventores han sido los primeros en
descubrir la técnica novedosa por la que un microbio que produce
iturina A y sus homólogos se cultiva en un medio que contiene 2% en
peso o más de soja pulverizada o su extracto como fuente de
nitrógeno a efectos de acumular iturina A y sus homólogos en
concentraciones elevadas en dicho
medio.
medio.
El microbio Bacillus utilizado en la
presente invención no está particularmente limitado, siempre y
cuando produzca iturina A y sus homólogos. Dado que la iturina A y
sus homólogos se acumulan en el medio en concentraciones elevadas,
resulta necesario que dicho microbio puede desarrollarse en
presencia de una concentración elevada de iturina. En consecuencia,
el microbio Bacillus es un microbio que presenta la capacidad
para producir iturina A y sus homólogos y que puede desarrollarse
en un medio que contiene 1,5 g/l de iturina A y sus homólogos.
Además, como otro ejemplo preferente, el microbio Bacillus es
un microbio Bacillus que presenta capacidad para producir
iturina A y sus homólogos pero no presenta capacidad para producir
surfactina. "No presenta la capacidad para producir
surfactina", en la presente memoria, significa que cuando un
microbio se cultiva en un medio que contiene soja pulverizada o su
extracto como fuente de nitrógeno, la cantidad de acumulación de
surfactina es de 50 ppm o menor. Los ejemplos preferentes de
microbio Bacillus que presenta la capacidad para producir
iturina A y sus homólogos y que puede desarrollarse en un medio que
contiene 1,5 g/l o más de iturina y sus homólogos incluyen el
Bacillus subtilis con número de acceso FERM
BP-08427.
El Bacillus subtilis con número de acceso
FERM BP-08427, aislado a partir de compost, presenta
las siguientes características micológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
- (1)
- Forma del bacterio: barra,
- (2)
- Tamaño del bacterio: 0,7 a 0,9 x 1,5 a 3,0 \mum,
- (3)
- Polimorfismo: no
- (4)
- Motilidad: sí
- (5)
- Esporas: presentes,
- \quad
- Forma de las esporas: elípticas o cilíndricas
- (6)
- Tinción Gram: positiva
- (7)
- Resistencia a ácidos: negativo
- \quad
- Colonia circular con un diámetro de 1 a 2 mm, con perímetro ondulado, viscosa, sin tendencia expansiva.
- (1)
- Reducción de nitratos: positivo
- (2)
- Test VP: positivo
- (3)
- Producción de indola: negativo
- (4)
- Utilización de ácido cítrico: positivo
- (5)
- Utilización de ácido succínico: negativo
- (6)
- Utilización de ácido propiónico: negativo
- (7)
- Utilización de ácido tartárico: negativo
- (8)
- Ureasa: negativo
- (9)
- Oxidasa: positivo
- (10)
- Catalasa: positivo
- (11)
- Intervalo de crecimiento: pH 5 a 9, temperatura 20 a 50ºC
- (12)
- Medio NaCl 10%: crecimiento
- (13)
- Cultivo anaeróbico: negativo
- (14)
- Reacción de yema de huevo: negativo
- (15)
- Hidrólisis de almidón: positivo
- (16)
- Descomposición de arginina: positivo
- (17)
- Descomposición de tirosina: negativo
- (18)
- Licuefacción de gelatina: positivo
- (19)
- Descomposición de esculina: positivo
- (20)
- Test OF: oxidativo
- (21)
- Producción de ácido a partir de glucosa: negativo
\vskip1.000000\baselineskip
El Bacillus subtilis con número de acceso
FERM BP-08427 se depositó en el National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology, en AIST Tsukuba
Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón
(código postal: 305-8566) (nº de acceso FERM
P-19032) y se transfirió del depósito original al
depósito internacional el 10 de julio de 2003 (nº FERM
BP-08427).
Además, en la presente invención, los mutantes
obtenidos por mutación espontánea de la cepa de Bacillus
subtilis depositada también se pueden utilizar preferentemente.
Dichos mutantes se pueden obtener como cepas mutantes espontáneas
seleccionando aquellas que presenten una morfología de colonia
modificada en un medio de placa o haciendo reaccionar un factor
químico o físico de inducción de mutación con la cepa de Bacillus
subtilis depositada, a efectos de producir un stock de cepas
bacterianas con rendimientos modificados de iturina A y sus
homólogos y, a partir de las mismas, aislar una colonia que presente
una mayor productividad.
Como factor químico inductor de mutación, por
ejemplo, se pueden utilizar EMS (metanosulfonato de etilo), sulfato
de dietilo, o NTG
(N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).
Como factor físico inductor de mutación, se pueden utilizar rayos
ultravioleta, rayos gamma, rayos X, etc., en una cantidad requerida
a efectos de inducir una mutación.
Un ejemplo de procedimiento para producir un
stock de mutantes es un procedimiento en el que células de
Bacillus subtilis desarrolladas hasta una etapa logarítmica
en un medio nutriente tal como NB (Nutrient Broth; fabricado por
Difco Laboratories, Inc.) se recogen y suspenden en solución salina
fisiológica tras el lavado, se añade una cantidad inductora de
mutación de NTG a las células a efectos de inducir una mutación, y a
continuación las células se recogen nuevamente, se lavan a efectos
de eliminar el NTG y se cultivan en un medio nutriente tal como NB
(Nutrient Broth; fabricado por Difco Laboratories, Inc.) a efectos
de obtener un stock de cepas mutantes.
Los ejemplos de procedimientos para aislar una
colonia con una productividad aumentada incluyen un procedimiento
en el que un stock apropiadamente diluido de mutantes se esparce a
efectos de cultivar células de Bacillus subtilis en un medio
de placa preparado añadiendo agar a un medio tal como TBAB (Agar
Triptosa Base Sangre; fabricado por Difco Laboratories, Inc.) o con
sangre de oveja añadida al mismo, y una colonia con una zona nítida
alrededor de la colonia mayor que otras colonias se aísla a efectos
de seleccionar cepas mutantes que pueden producir iturina A y sus
homólogos en concentraciones elevadas.
Posteriormente, la productividad de iturina A y
sus homólogos del mutante de Bacillus subtilis aislado de
este modo se puede confirmar cultivando la cepa de Bacillus
subtilis depositada como control en un tubo de ensayo.
A continuación se describe el procedimiento para
producir iturina A y sus homólogos según la presente invención. El
procedimiento para producir iturina A y sus homólogos según la
presente invención se puede llevar a cabo muy convenientemente, por
ejemplo, del modo siguiente. La cepa de Bacillus subtilis
depositada se cultiva en un medio nutriente, tal como un medio L a
una temperatura de 25 a 42ºC, preferentemente de 28 a 38ºC, durante
aproximadamente 5 a aproximadamente 24 horas, y el caldo de cultivo
obtenido en una cantidad de 0,1 a 10% en peso, preferentemente de
0,5 a 7% en peso, más preferentemente de 1 a 5% en peso, se inocula
en un medio que contiene soja en polvo o su extracto como fuente de
nitrógeno. El mismo se cultiva a una temperatura de 25 a 42ºC,
preferentemente de 28 a 35ºC, durante aproximadamente 30 a
aproximadamente 150 horas. En caso de que la temperatura esté fuera
del intervalo de temperaturas mencionado anteriormente, la
producción de iturina A y sus homólogos disminuye considerablemente
de modo no deseado.
En la presente invención, la expresión "soja
en polvo o su extracto" se refiere a polvo de soja en grano,
obtenido pulverizando soja o soja desgrasada, polvo de soja
pulverizado, obtenido pulverizando soja hasta obtener un polvo
fino, extractos de los mismos (por ejemplo, extractos en agua
caliente), hidrolizados (por ejemplo, hidrolizados por ácido,
hidrolizados por enzima), etc. La concentración de soja en polvo o
su extracto es deseablemente de 2% en peso o más. Sin embargo, por
otro lado, dado que la soja en polvo o su extracto en una
concentración demasiado elevada puede provocar una esterilización
insuficiente, resulta deseable que la concentración de la soja en
polvo o su extracto no exceda de 20% en peso. Consecuentemente, la
concentración de la soja en polvo o su extracto para obtener una
productividad elevada es de 2 a 20% en peso, preferentemente de 3 a
17% en peso, más preferentemente de 4 a 14% en peso.
El medio utilizado en la presente invención
puede contener, además de la soja en polvo o su extracto,
habitualmente fuentes de carbono catabolizables utilizadas, fuentes
de nitrógeno catabolizables y sales inorgánicas, etc. Además, se
pueden añadir aminoácidos y/o vitaminas, etc., en caso
necesario.
Los ejemplos de fuentes de carbono
catabolizables incluyen glucosa, maltosa, sucrosa, fructosa, almidón
soluble, jarabe de almidón, dextrina, molasas, extracto de patata,
malta, turba, remolacha, aceite vegetal, licor de procesados de
maíz, fructosa, jarabe, azúcar, azúcar líquido, azúcar invertido,
alcoholes, ácidos orgánicos, sales de ácidos orgánicos, alcanos u
otras fuentes generales de carbono. Dichas fuentes se pueden
utilizar individualmente o en combinación. Entre ellas, resultan
preferidas maltosa, almidón soluble, jarabe de almidón y dextrina.
Las mismas se pueden utilizar en concentraciones habitualmente
comprendidas entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50% en
peso, preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40%
en peso.
Además, como fuentes de nitrógeno
catabolizables, se pueden utilizar aquellas que contienen nitrógeno
inorgánico u orgánico, por ejemplo, sales de amonio tales como
nitrato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de
amonio, carbonato de amonio y bicarbonato de amonio, amoníaco,
nitrato de sodio, nitrato de potasio, glutamato de sodio, urea,
peptona, extracto de carne, licor de procesados de maíz,
hidrolizados de caseína, harina de plumas y extracto de levadura.
Dichas fuentes se pueden utilizar ventajosamente en concentraciones
habitualmente comprendidas entre 0,01 y 30% en peso, preferentemente
entre 0,1 y 10% en peso.
Además, como componentes inorgánicos, se pueden
añadir cationes o aniones, tales como ion potasio, ion sodio, ion
magnesio, ion fosfato, ion hierro, ion manganeso, ion calcio, ion
zinc, ion cobalto, ion níquel, ion cobre, ion molibdeno, ion
sulfato, ion cloruro, o ion nitrato. La cantidad de componente
inorgánico a añadir puede variar en función de las condiciones de
cultivo. Habitualmente, la sal de magnesio se añade hasta una
concentración de aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 2% en
peso, y en caso de sales distintas de fosfato, la sal se añade
hasta una concentración de aproximadamente 0,1 ppm a aproximadamente
1.000 ppm. Los iones fosfato se pueden añadir como sales de
fosfato. Si la sal de fosfato se añade en una concentración mayor de
3% en peso, en términos de K_{2}HPO_{4}, la concentración de
iturina A acumulada y sus homólogos disminuye. En consecuencia,
resulta deseable que la sal de fosfato se añada hasta una
concentración de 3% en peso o menor. Más preferentemente, resulta
preferente un medio sin la adición de ion fosfato.
Los ejemplos de aminoácidos a añadir incluyen
L-glicina, L-alanina,
L-valina, L-leucina,
L-isoleucina, L-serina,
L-treonina, L-fenilalanina,
L-tirosina, L-cisteína, cistina,
L-metionina, L-triptófano,
L-histidina, L-prolina, ácido
L-aspártico, L-asparagina, ácido
L-glutámico, L-glutamina,
L-arginina, L-lisina,
D-valina, D-isoleucina, etc. Se
pueden añadir uno o varios de los mismos. El aminoácido se añade
hasta una concentración de aproximadamente 0,001 a aproximadamente
5% en peso, preferentemente de aproximadamente 0,01 a
aproximadamente 1% en peso.
Como vitamina, se pueden añadir una o más de
entre biotina, tiamina, riboflavina, piridoxina, ácido nicotínico,
nicotinamida, ácido pantoténico, piridoxal,
mio-inositol, colina, ácido fólico, cobalamina,
cianocobalamina, etc. La vitamina se añade hasta una concentración
de 0,1 a 100 ppm, preferentemente de 1 a 50 ppm.
En el cultivo según la presente invención, el
medio mencionado anteriormente se coloca en un recipiente tal como
un tubo de ensayo, un matraz o un tanque de fermentación, y se lleva
a cabo el cultivo con aireación vigorosa.
En caso de cultivo utilizando un recipiente tal
como un tubo de ensayo o un matraz, la aireación se lleva a cabo
agitando vigorosamente, y el pH inicial del medio se ajusta a entre
6,5 y 8,0. En el caso en el que se lleva a cabo producción de
concentración elevada utilizando un recipiente tal como un tanque de
fermentación, el cultivo se lleva a cabo bajo un flujo de aire
estéril con agitación. En el caso en el que se produce espuma en un
alcance tal que el cultivo resulta difícil, se puede añadir un
agente antiespumante de utilización común.
El pH del medio se mantiene entre 6,0 y 9,0,
preferentemente entre 6,5 y 8,0, más preferentemente entre 6,8 y
7,3. El ajuste del pH se lleva a cabo por adición de una solución
acuosa básica, tal como una solución acuosa de amoníaco, una
solución acuosa de hidróxido de potasio, una solución acuosa de
carbonato de sodio, o una solución acuosa de carbonato de potasio.
Entre las mismas, resulta preferente utilizar una solución acuosa
de amoníaco. Ventajosamente, la concentración de solución acuosa de
amoníaco está comprendida entre aproximadamente 8 y aproximadamente
25% en peso. Llevando a cabo dicho cultivo en condiciones
preferentes, un cultivo que contiene iturina A y sus homólogos, que
contiene iturina A y homólogos en una concentración de 1,5 g/l o
mayor, se puede obtener en de 30 a 150
horas.
horas.
Secando el cultivo mencionado anteriormente
mediante un procedimiento conocido, tal como liofilización o secado
por pulverización, se puede obtener un sólido que contiene iturina A
y sus homólogos. El cultivo que contiene iturina A y sus homólogos,
o el sólido que contiene iturina A y sus homólogos, que exhibe un
efecto de prevenir enfermedades en vegetales cuando se aplica a la
tierra de cultivo o a las hojas de la plantación, resulta útil. El
cultivo que contiene iturina A y sus homólogos y el sólido que
contiene iturina A y sus homólogos entran también dentro del
alcance de la presente invención.
Además, la iturina A y sus homólogos se pueden
recuperar del cultivo que contiene iturina A y sus homólogos y se
pueden purificar. Dicha purificación se puede llevar a cabo mediante
un procedimiento conocido, por ejemplo, un procedimiento en el que
un cultivo se vuelve ácido por adición de ácido sulfúrico, ácido
clorhídrico, ácido nítrico o similares, a efectos de precipitar la
iturina A y sus homólogos, sometiéndose a continuación los
precipitados a tratamiento de extracción con un disolvente orgánico,
tal como metanol, etanol o cloroformo, tratamiento con carbono
activado, tratamiento de cristalización y/o similares.
La iturina A y sus homólogos obtenidos según la
presente invención se pueden utilizar no solamente como agentes
para prevenir enfermedades en vegetales, sino también como
detergentes, tensoactivos, humidificantes, espesantes,
solubilizadores, agentes antiestáticos, agentes antiniebla,
lubricantes, etc. La iturina A y sus homólogos obtenidos según la
presente invención son útiles como ingrediente de composición para
cosméticos, alimentos, productos farmacéuticos, sustancias químicas
agrícolas, etc.
A continuación, la presente invención se
describe con mayor detalle mediante los ejemplos. Sin embargo, la
presente invención no debe considerarse limitada a dichos
ejemplos.
La cepa de Bacillus subtilis depositada
se inoculó en 5 mm de un medio L (10 g de peptona, 5 g de extracto
de levadura, 5 g de cloruro de sodio y agua hasta alcanzar 1 litro),
y se incubó a 35ºC a 300 rpm durante 16 horas. A continuación, el
cultivo obtenido se inoculó en 5 ml del mismo medio a 1% v/v y se
incubó a 35ºC a 300 rpm hasta que el OD660 alcanzó el valor 0,2. A
continuación, las células se recuperaron mediante centrifugación.
El sobrenadante se descartó. Las células recuperadas se lavaron con
5 ml de tampón PBS (0,8% p/v de NaCl, 0,02% p/v de KCl, 0,144% p/v
de Na_{2}HPO_{4} y 0,024% p/v de K_{2}HPO_{4}, ajustado a pH
7,4 con HCl) tres veces y se suspendieron nuevamente en 0,5 ml del
mismo tampón.
Se añadieron 0,05 ml de una solución acuosa de
2.000 ppm de
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
a la suspensión y la mezcla se dejó reposar a 30ºC durante 10
minutos. Dicha suspensión se centrifugó, se descartó el sobrenadante
y las células se lavaron con 5 ml del mismo tampón tres veces y se
suspendieron de nuevo en 1 ml de un medio L fresco. La suspensión
se añadió a 4 ml de un medio L y se sometió a crecimiento celular a
35ºC durante una noche. A continuación, se añadieron 2,5 ml de una
solución acuosa de glicerol al 50% en peso a la suspensión, se
dispusieron alícuotas de la misma en viales para crioconservación y
se congelaron a -135ºC para conservarlos como transformantes.
A continuación, los transformantes conservados
diluidos con agua esterilizada se colocaron en placas a una
concentración de 50.000/placa sobre medio de placa de agar,
conteniendo cada uno de ellos 5% p/v de sangre de oveja, 4% p/v de
glucosa, 0,1% p/v NB (fabricado por Difco Laboratories, Inc.) y 0,1%
p/v de extracto de levadura (Applied Environmental Microbiology,
42:408-412 (1981)), de tal modo que se obtuvieron
aproximadamente 200 colonias/placa. Tras la incubación a 35ºC
durante un periodo de 20 a 48 horas, se observaron zonas claras
formadas alrededor de las colonias desarrolladas y se seleccionaron
50.000 colonias que formaban grandes zonas claras.
La cepa de Bacillus subtilis depositada y
las 50.000 colonias obtenidas se depositaron en medio L de placa y
se dejaron crecer a 35ºC durante una noche. Se introdujeron
alícuotas de 1 ml de un medio con la siguiente composición A en
tubos de ensayo, en cada uno de los cuales se inoculó un asa de
inoculación del medio L de placa, y se incubaron a 35ºC durante 72
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo se centrifugó y la iturina A y sus
homólogos contenidos en el sobrenadante se determinaron mediante un
procedimiento HPLC en las siguientes condiciones:
Tamaño de muestra: 10 \mul
Columna: Shodex Silica C18P4E, 4,6 mm x 250 mm,
fabricada por Showa Denko K. K.
Temperatura de columna: 40ºC
Eluente: acetonitrilo : solución acuosa de ácido
trifluoroacético 10 mM = 35:75 (v/v)
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Detector: detector UV
Longitud de onda: 205 nm
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación se llevó a cabo preparando una
curva de calibración utilizando muestras estándar de iturina A y
sus homólogos (preparadas por Sigma-Aldrich
Co.).
Se obtuvo una cepa mutante (mutante 1) que
produce iturina A y sus homólogos con una productividad elevada,
que muestra una concentración aumentada de iturina A acumulada y sus
homólogos en comparación con las cepas originales depositadas de
cepa de Bacillus subtilis.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de surfactina en el
sobrenadante del cultivo del ejemplo de preparación 1 se determinó
mediante un procedimiento HPLC en las siguientes condiciones:
Tamaño de muestra: 20 \mul
Columna: Shodex Silica C18P4E, 4,6 mm x 250 mm,
fabricada por Showa Denko K. K.
Temperatura de columna: 40ºC
Eluente: acetonitrilo : solución acuosa de ácido
trifluoroacético 19 mM = 80:20 (v/v)
Velocidad de flujo: 1,0 ml/min
Detector: detector UV
Longitud de onda: 205 nm
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación se llevó a cabo preparando una
curva de calibración utilizando muestras estándar de iturina A y
sus homólogos (preparadas por Sigma-Aldrich
Co.).
Se obtuvo una cepa mutante (mutante 2) que no
produce sustancialmente surfactina, siendo la concentración de
surfactina acumulada de 50 ppm o menor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se dispusieron cepas de la cepa de Bacillus
subtilis depositada en medio L de placa y se dejaron crecer a
35ºC durante una noche. Se introdujeron alícuotas de 1 ml de un
medio con la siguiente composición B en tubos de ensayo en cada uno
de los cuales se inoculó un asa de inoculación del medio L de placa,
y se incubaron a 35ºC durante 72 horas.
*La fuente de nitrógeno se selecciona de entre
el grupo que consiste en soja en polvo, nitrato de potasio, nitrato
de amonio, sulfato de amonio, urea, glutamato de sodio y peptona
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo se centrifugó y las concentraciones
de iturina A y sus homólogos contenidas en el sobrenadante se
determinaron mediante un procedimiento HPLC.
La concentración de iturina A acumulada y sus
homólogos en cada caso utilizando una fuente de nitrógeno fue la
siguiente:
Ejemplo
2
Se dispusieron cepas de la cepa de Bacillus
subtilis depositada en medio L de placa y se dejaron crecer a
35ºC durante una noche. Se introdujeron alícuotas de 1 ml de un
medio con las siguientes composiciones C, D y E, respectivamente,
en tubos de ensayo en cada uno de los cuales se inoculó un asa de
inoculación del medio L de placa, y se incubaron a 35ºC durante 72
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo se centrifugó y las concentraciones
de iturina A y sus homólogos contenidas en el sobrenadante se
determinaron mediante un procedimiento HPLC.
La concentración de iturina A acumulada y sus
homólogos en cada caso utilizando el medio fue la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se dispusieron cepas de la cepa de Bacillus
subtilis depositada en medio L de placa y se dejaron crecer a
35ºC durante una noche. Se introdujeron alícuotas de 1 ml de un
medio con la siguiente composición F, a las que se añadió la
siguiente fuente de carbono en tubos de ensayo, en cada uno de los
cuales se inoculó un asa de inoculación del medio L de placa, y se
incubaron a 35ºC durante 72 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
**La fuente de carbono se selecciona de entre el
grupo compuesto por maltosa, almidón soluble, jarabe de almidón,
dextrina, glucosa, sucrosa y fructosa
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo se centrifugó y las concentraciones
de acumulación de iturina A y sus homólogos contenidas en el
sobrenadante se determinaron mediante un procedimiento HPLC.
Las concentraciones de acumulación de iturina A
y sus homólogos en cada caso utilizando la fuente de carbono fueron
las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se dispusieron cepas de la cepa de Bacillus
subtilis depositada en medio L de placa y se dejaron crecer a
35ºC durante una noche. Se introdujeron alícuotas de 1 ml de un
medio con la siguiente composición G, a las que se añadió
K_{2}HPO_{4} con la concentración (1) a (6) en tubos de ensayo,
en cada uno de los cuales se inoculó un asa de inoculación del
medio L de placa, y se incubaron a 35ºC durante 72 horas.
Después de ajustar a pH 7 con carbonato de
sodio, el cultivo se centrifugó y las concentraciones de acumulación
de iturina A y sus homólogos contenidas en el sobrenadante se
determinaron mediante un procedimiento HPLC. La concentración de
acumulación de iturina A y sus homólogos en cada caso en el que se
añadió K_{2}HPO_{4} con cada concentración fue la
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La cepa de Bacillus subtilis depositada,
el mutante 1 y el mutante 2 se dispusieron en medio L de placa y se
dejaron crecer a 35ºC durante una noche. Un asa de inoculación de
cada medio se inoculó en un matraz con deflector al que se
añadieron 50 ml de un medio L, y se incubó a 35ºC a 150 rpm durante
8 horas. Se preparó un medio con la siguiente composición H en un
tanque de fermentación de 5 l y se le añadió cada cultivo de medio
L de placa. Mientras se ajustaba el pH a un valor comprendido entre
6,5 y 7,5 con agua de amoníaco al 20% y se llevó a cabo la
incubación a 35ºC durante 150 horas.
El cultivo se centrifugó y las concentraciones
de acumulación de iturina A y sus homólogos contenidas en el
sobrenadante se determinaron mediante un procedimiento HPLC. Las
cantidades de iturina A y sus homólogos fueron las siguientes:
A partir de los resultados, resulta evidente que
cada una de estas cepas puede crecer en presencia de 1,5 g/l o más
de iturina A.
Según la presente invención, la iturina A y sus
homólogos, que son útiles en diversos campos industriales tales
como los productos farmacéuticos, sustancias químicas agrícolas,
alimentos, cosméticos y productos químicos, se pueden producir
utilizando materias primas y medio no costosos con unas
concentraciones drásticamente aumentadas en comparación con los
procedimientos convencionales.
Además, según la presente invención, que permite
la producción de iturina A y sus homólogos en una concentración
elevada, en el campo de las sustancias químicas agrícolas y de
prevención de enfermedades en vegetales, el cultivo en sí se puede
utilizar en aplicaciones en las que un cultivo convencional no puede
ser utilizado como tal debido a una concentración suficiente.
Claims (11)
1. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos, que comprende cultivar un microbio Bacillus que
presenta la capacidad de producir iturina A y sus homólogos en un
medio líquido que contiene 2% en peso o más de soja en polvo o su
extracto para permitir que el microbio acumule iturina A y sus
homólogos en el medio en una concentración de 1,5 g/l o mayor, en
el que el microbio Bacillus que presenta la capacidad de
producir iturina A y sus homólogos es un microbio Bacillus
que no presenta capacidad para acumular surfactina en una cantidad
superior a 50 ppm cuando se cultiva en un medio que contiene soja
pulverizada o su extracto como fuente de nitrógeno, y en el que el
microbio Bacillus que presenta la capacidad para producir
iturina A y sus homólogos es un microbio Bacillus que puede
desarrollarse en un medio que contiene 1,5 g/l o más de iturina A y
sus homólogos.
2. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según la reivindicación 1, en el que se añaden al medio
líquido de 0 a 3% en peso de fosfatos, en términos de
K_{2}HPO_{4}.
3. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según la reivindicación 1 ó 2, en el que el microbio es
Bacillus subtilis.
4. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que
el microbio es Bacillus subtilis con número de acceso FERM
BP-08427.
5. Procedimiento para producir iturina A y sus
homólogos según la reivindicación 1, en el que el medio líquido que
contiene 2% en peso o más de soja en polvo o su extracto contiene,
por lo menos, un elemento seleccionado de entre el grupo
constituido por maltosa, jarabe de almidón, almidón soluble,
dextrina, glucosa, sucrosa y fructosa.
6. Microbio Bacillus que presenta la
capacidad para producir iturina A y sus homólogos y no presenta la
capacidad para acumular surfactina en una cantidad superior a 50
ppm cuando se cultiva en un medio que contiene soja pulverizada o
su extracto como fuente de nitrógeno, en el que el microbio
Bacillus que presenta la capacidad para producir iturina A y
sus homólogos es un microbio Bacillus que puede desarrollarse
en un medio que contiene 1,5 g/l o más de iturina A y sus
homólogos.
7. Microbio Bacillus según la
reivindicación 6, que es Bacillus subtilis con número de
acceso FERM BP-08427.
8. Cultivo que contiene iturina A y sus
homólogos, y el microbio Bacillus según la reivindicación 6 ó
7.
9. Sólido que contiene iturina A y sus
homólogos, que se puede obtener secando el cultivo según la
reivindicación 8.
10. Agente para prevenir enfermedades de los
vegetales, que comprende el cultivo que contiene iturina A y sus
homólogos, o el sólido obtenido del mismo, según la reivindicación 8
ó 9.
11. Procedimiento para prevenir una enfermedad
de vegetales, que comprende utilizar el cultivo que contiene iturina
A y sus homólogos, o el sólido obtenido del mismo, según la
reivindicación 8 ó 9 en una forma no purificada.
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