CN101517066B - 一种利用谷氨酸棒杆菌生产l-精氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产L-精氨酸微生物和利用该微生物生产L-精氨酸的方法。该微生物为棒杆菌属的突变菌株，即谷氨酸棒杆菌CJR0500。该L-精氨酸生产方法包括在发酵培养基中30℃16小时活化该突变菌株谷氨酸棒杆菌CJR0500，然后摇瓶培养被活化的突变菌株72小时。

Description

一种利用谷氨酸棒杆菌生产L-精氨酸的方法
技术领域
本发明涉及产L-精氨酸微生物和利用该微生物生产L-精氨酸的方法。特别是，本发明涉及棒杆菌属的突变菌株，即产L-精氨酸谷氨酸棒杆菌CJR0500(Corynebacteriumglutamicum CJR0500)，以及利用该突变菌株生产L-精氨酸的方法。其中该突变菌株具有α-氨基丁酸抗性，且色氨酸可以刺激该菌生长。
背景技术
L-精氨酸是一种半必需氨基酸，在体内可以自然产生。L-精氨酸被广泛应用于医药、食品、动物饲料和其它产品中。L-精氨酸可用于改善肝脏功能和脑功能，以及治疗男性不育的药物，也可以作为复合氨基酸添加物的组份。同时，L-精氨酸作为食品添加剂已被用于鱼饼和保健饮料。近来，L-精氨酸被用于作为高血压患者的盐类替代品。
通过生物发酵生产L-精氨酸的传统方法基于直接利用碳源和氮源生产L-精氨酸。例如，可以利用属于短杆菌属(Brevibacterium)或棒杆菌属(Corynebacterium)的产谷氨酸微生物的突变菌株来生产L-精氨酸(Japanese Pat.Laid-Open PublicationNos.Sho57-163487，Sho60-83593和Sho62-265988)，或者通过细胞融合提高产氨基酸微生物的生长特性来生产L-精氨酸(Japanese Pat.La id-Open Publication No.Sho59-158185)。还可以使用转染了重组基因的菌株生产L-精氨酸(Japanese Pat.Laid-Open Publication No.Sho63-79597和U.S.Pat.No.4,775,623)。
发明内容
本发明人为得到一株比传统菌株高产L-精氨酸的菌株，对产谷氨酸菌株进行了广泛深入的研究，期望通过加强谷氨酸生物合成途径来提高精氨酸的产量。这种期望是基于代谢途径的性质，通过该途径需要一分子谷氨酸和一分子谷氨酰氨生物合成精氨酸，并且具有α-氨基丁酸抗性和异亮氨酸类似物抗性的菌株可以提高谷氨酸产量(Korean Pat.Laid-Open Publication No.2002-0038204)。因此，本发明人从父本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC-10680出发，诱导产生对α-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸盐具有抗性的突变菌株。谷氨酸棒杆菌KFCC-10680可以产生谷氨酸且具有磺胺类药物耐性和O-diazoleacetyl-L-se rine抗性(Korean Pat.Publication No.91-7818)。结果发现：突变菌株比父本菌株具有更高的L-精氨酸产量，而父本菌株对α-氨基丁酸没有抗性，从而产生了本发明。
技术方案
因此本发明的一个目的是提供谷氨酸棒杆菌的突变菌株CJR0500，该菌株可以产L-精氨酸，且具有α-氨基丁酸抗性、刀豆氨酸抗性和精氨酸氧肟酸盐抗性。
本发明的另一个目的是提供一个生产L-精氨酸的方法，包括在发酵培养基中活化该突变菌株，然后振荡培养该突变菌株。
本发明还有一个目的是提供突变菌株CJR0500，该菌株在L-色氨酸存在下可以缩短精氨酸发酵的时间。
优选实施方案
一方面，本发明涉及谷氨酸棒杆菌突变菌株CJR0500，该菌株可以产L-精氨酸，且具有α-氨基丁酸抗性、刀豆氨酸抗性和精氨酸氧肟酸盐抗性。
该突变菌株通过如下方式诱导：具有磺胺类药物耐性和O-diazoleacetyl-L-serine抗性的父本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC-10680，用诱变常用方法N-甲基-N-硝基-N亚硝基胍(NTG)进行处理，然后涂布于添加了α-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸盐的低限培养基上(见注意事项1)。然后，筛选能够分别在500mg/L，500mg/L，10mg/L对以上三种物质均具有抗性的突变菌株。
下文将更详细叙述突变菌株的诱导。父本菌株在活化培养基(见注意事项2)中进行活化培养16小时。活化的菌株在种子培养基(见注意事项3)中培养14小时，种子培养基121℃灭菌5分钟。取5mL种子培养液用100mM柠檬酸缓冲液进行洗涤，然后用200mg/L的NTG处理20分钟，再用100mM磷酸缓冲液洗涤。NTG处理过的菌株涂布于低限培养基(见注意事项1)上，由此评估其生存能力。发现该菌株具有85％死亡率。为了获得对α-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸盐都具有抗性的突变菌株，将NTG处理的菌株涂布于添加了刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸盐和α-氨基丁酸浓度分别为500mg/L，500mg/L和10mg/L的低限培养基上，30℃培养5天。出现的菌落接种于含有产精氨酸的培养基(见注意事项4)的锥形瓶中，培养72小时。筛选产精氨酸且对刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸盐和α-氨基丁酸都具有抗性的突变菌株，并命名为谷氨酸棒杆菌CJR0500(Corynebacterium glutamicum CJR0500)。
本案申请人将该突变菌株谷氨酸棒杆菌CJR0500(Corynebacterium glutamicumCJR0500)于20006年3月15日保存于韩国微生物培养中心(KCCM)，使其可以被本领域技术人员得到，保藏编号为KCCM-10741P。
另一方面，本发明涉及生产精氨酸的方法，包括通过在发酵培养基中30℃16小时活化培养该突变菌株，然后振荡培养被活化的菌株72个小时。采用此方法，L-精氨酸的产量可以进一步提高(实施例1)。
另一方面，本发明涉及突变菌株CJR0500，该菌株在L-色氨酸存在下，具有更短的发酵时间。
发酵培养基中L-色氨酸的添加可以进一步缩短精氨酸的发酵时间。因此与不添加L-色氨酸的培养基相比在相同的发酵时间内具有更高水平的L-精氨酸产量(实施例3)。
本发明的微生物具有如下的性质：
注意事项1.低限培养基：1.0％葡萄糖，0.4％硫酸铵，0.04％硫酸镁，0.1％磷酸二氢钾，0.1％尿素，0.0001％硫胺素，200μg/L生物素，2％琼脂，pH7.0。
注意事项2.活化培养基：1％肉提取物，1％多聚蛋白胨，0.5％NaCl，0.5％酵母提取物，2％琼脂，pH7.2。
注意事项3.种子培养基：5％葡萄糖，1％细菌蛋白胨，0.25％NaCl，1％酵母提取物，3μg/L生物素，0.4％尿素，pH7.0。
注意事项4.L-精氨酸生产培养基：4.0％葡萄糖，3％硫酸铵，0.3％尿素，0.1％磷酸二氢钾，0.1％磷酸氢二钾，0.025％七水硫酸镁，2.0％CSL(玉米浸提液)，200μg/L生物素，pH7.2。
通过NTG诱变，突变菌株谷氨酸棒杆菌CJR0500的精氨酸产量被提高，且能够抗刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸盐和α-氨基丁酸，该突变菌株的抗刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸盐和α-氨基丁酸性质如表1所示。
表1.刀豆氨酸、精氨酸氧肟酸盐和α-氨基丁酸抗性比较
在低限培养基上L-色氨酸浓度与突变菌株生长率的关系如下表2所示。如表2所示，突变菌株谷氨酸棒杆菌CJR0500的生长需要L-色氨酸。
表2.生长率与色氨酸浓度的关系
实施例
通过下列实施例可以更好的理解本发明。这些例子用于说明本发明，但不能理解为限制本发明。
实施例1
所用菌株：KFCC-10680和CJR0500
发酵培养基(与注意事项4中的培养基成份相同)：4.0％葡萄糖，3％硫酸铵，0.3％尿素，0.1％磷酸二氢钾，0.1％磷酸氢二钾，0.025％七水硫酸镁，2.0％CSL(玉米浸提液)，200μg/L生物素，pH7.2。
发酵与结果：24mL发酵培养基分装于250mL锥形摇瓶中，121℃灭菌15分钟。每个菌株都在种子培养基(注意事项3)中30℃培养16小时。1mL活化的菌株接种于灭菌的发酵培养基中，30℃振荡培养72小时。检测发酵液中精氨酸产量，结果如下表3所示。
表3
  KFCC-10680   CJR0500
  精氨酸产量   0.9g/L   2.8g/L
实施例2
所用菌株：KFCC-10680和CJR0500
发酵培养基：10.0％葡萄糖，4％硫酸铵，0.3％尿素，0.1％磷酸二氢钾，0.1％磷酸氢二钾，0.025％七水硫酸镁，2.0％CSL(玉米浸提液)，200μg/L生物素，pH7.2。
发酵与结果：24mL发酵培养基分装于250mL锥形摇瓶中，121℃灭菌15分钟。每个菌株都在种子培养基(注意事项3)中30℃培养16小时。活化的菌株(1mL)接种于灭菌的发酵培养基中，30℃振荡培养72小时。检测发酵液中精氨酸产量，结果如下表4所示。具有α-氨基丁酸抗性的突变菌株比其没有抗性的父本菌株具有更高的精氨酸产量。
表4
  KFCC-10680   CJR0500
  精氨酸产量   1.0g/L   3.5g/L
实施例3
所用菌株：KFCC-10680和CJR0500
发酵培养基：10.0％葡萄糖，4％硫酸铵，0.3％尿素，0.1％磷酸二氢钾，0.1％磷酸氢二钾，0.025％七水硫酸镁，2.0％CSL(玉米浸提液)，200μg/L生物素，50mg/L色氨酸，pH7.2。
发酵与结果：24mL发酵培养基分装于250mL锥形摇瓶中，121℃灭菌15分钟。每个菌株都在种子培养基(注意事项3)中30℃培养16小时。活化的菌株(1mL)接种于灭菌的发酵培养基中，30℃振荡培养64小时。检测发酵液中精氨酸产量，结果如下表5所示。色氨酸的加入能够刺激突变菌株CJR0500的生长，从而使L-精氨酸的产量在短时间内达到较高水平。
表5
  KFCC-10680   CJR0500
  精氨酸产量   0.8g/L   3.45g/L
如上所述，突变菌株谷氨酸棒杆菌CJR0500具有更高的L-精氨酸产量，且具有α-氨基丁酸抗性。而且，由于添加色氨酸可以缩短精氨酸的发酵时间，因此在相同的发酵时间内，可以使精氨酸产量达到较高的水平，该突变菌株十分有用。
工业应用
如上所述，突变菌株谷氨酸棒杆菌CJR0500具有更高的L-精氨酸产量，且具有α-氨基丁酸抗性。而且，由于添加色氨酸可以缩短精氨酸的发酵时间，因此在相同的发酵时间内，可以使精氨酸产量达到较高的水平，该突变菌株十分有用。
关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格
致：CJ株式会社       由下页签章的国际保存管理机构根
韩国，首尔，中区，   据条约7.1的规定颁发的保藏证明
南大门路5街500号
Figure G2007800261885D00061
1.根据第6.4条的要求，该日期是该国际保藏机构得到的状态的日期；当保藏是在布达佩斯条约之外所作的，在国际保藏机构获得该状态后，被转成布达佩斯条约的保藏，该日期是国际保藏机构收到该微生物日期。

Claims (3)

1.一种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株CJR0500，已保藏于韩国微生物培养中心，保藏编号为KCCM-10741P，其中该突变株产生L-精氨酸，且对α-氨基丁酸、刀豆氨酸和精氨酸氧肟酸盐具有抗性。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株CJR0500，其中通过添加L-色氨酸进一步刺激所述突变株的生长。
3.一种生产L-精氨酸的方法，其中包括在发酵培养基中30℃16小时活化权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株CJR0500，然后振荡培养该突变株72小时。
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