JP5395811B2 - インドリルアルキルコハク酸アミド化合物の製造法 - Google Patents
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Description
で表されるコハク酸アミド化合物又はその塩が優れた発根促進作用を有し、植物成長調整剤として有用であることが知られている(特許文献1及び2)。
しかしながら、インドリルアルキルコハク酸アミドについての微生物による生産法についての報告はない。
従って、本発明の課題は、植物成長促進剤として有用なインドリルアルキルコハク酸アミド化合物の微生物による新たな製造法を提供することにある。
で表されるインドリルアルキルアミン類又はその塩を含有する培地中で、インドリルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を培養することを特徴とする、一般式(2)
で表されるインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法を提供するものである。
なお、寄託日は受領番号NITE AP−689株・NITE AP−690株は平成20年(2008)年12月5日であり、受領番号NITE AP−856・AP−857・ABP−858・ABP−859は平成21(2009)年12月25日である。
上記のうち、バチルス・チューリンゲンシスJCM20386株及びバチルス・ズブチリスJCM1465株は、独立行政法人 理化学研究所から購入できる菌株である。またその他の菌株は、土壌から分離されたものである。
なお、インドリルアルキルアミン類(1)の塩としては、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩等が挙げられるが、塩酸塩が好ましい。
培地中の含有量はマンガンイオン(Mn2+)として1〜2000ppm、特に2〜1000ppmが好ましい。なお、マンガンイオン(Mn2+)は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
これらの有機酸の培地中の濃度は0.1〜10質量%が好ましく、0.2〜1質量%がより好ましい。なお、有機酸又はその塩は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
培地には、バチルス属微生物の増殖に必要な炭素源、窒素源、ビタミン源、ミネラル源等を添加するのが好ましい。炭素源としては、グルコース、水飴、可溶性デンプンなどが用いられる。窒素源としては、トリプトン、ソイトン、酵母エキス、ペプトン、カゼイン、カゼイン消化物、肉エキス、コーンスチープリカー、アミノ酸液、大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができるが、トリプトファン含量の高いカゼイン、カゼイン消化物、酵母エキス、コーンスチープリカー等が好ましいことは言うまでもない。
ミネラル源としては、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などを用いることができる。また、これらを総合的に含有する培地としては、牛乳;チーズホエイ、大豆ホエイ等のホエイ等を用いることができる。培養方法としては、液体培地を用いて、振盪培養、撹拌培養を行えばよい。
当該溶液の酸濃度としては、0.01〜4Nが好ましく、1〜3Nがより好ましい。当該酸としては、蟻酸、酢酸、塩酸、硫酸等が挙げられる。
当該溶液のアルコール濃度としては、0〜80容量%が好ましく、0〜30容量%がより好ましい。当該アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール等が挙げられる。
当該溶液のアルコール又はケトン濃度としては、5〜99容量%が好ましく、10〜30容量%がより好ましい。当該アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール等が挙げられる。当該ケトンとしてはアセトン等が挙げられる。
また、培地条件によってはN−(フェネチル)コハク酸アミドが含まれる場合があるが、この場合も目的に応じて混合物のまま使用してもよいし、それぞれを分取して使用しても良い。
具体的には、接種源としては、当該菌株を通常のバチルス属微生物が増殖する条件で培養することによって得られた菌体及び/又は芽胞を含む培養液そのものや、遠心分離・膜分離などによって菌体及び/又は芽胞を濃縮したもの、あるいはさらに菌体及び/又は芽胞を水又は通常用いられる緩衝液で洗浄したものを用いることができる。これらの接種源はそのまま使用することもできるし、その乾燥物、凍結乾燥物を使用することもできる。また、ベントナイト、ゼオライト、クレーなどの無機物質担体、ピートモス、活性炭などの有機物担体に保持させて使用することもできる。
接種する対象としては植物体全般、水、土壌に使用することができるが、当該化合物の発根促進活性が高いことを利用する場合は、種子、根、挿し木の切り口断面などが好ましい。接種濃度としては接種源1gあたり菌数が1×104〜1×1011個となるようにした上で接種すればよい。
で表されるヒドロキシインドリルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩が発根促進作用を有することを見出している。
500mL容バッフル付き三角フラスコに0質量%、0.01質量%、0.03質量%、0.1質量%又は0.3質量%のトリプタミンを添加したTryptic Soy Broth(ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下TSB)を各300mL×2本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめTSBで前培養したBacillus thuringiensis JCM20386株を接種した。温度27℃、回転数80rpmで10日間振とう培養した。培養温度は27℃とし、回転数80rpmで10日間振とう培養した。
この結果から、本菌株はTSBのみで培養しても培養液中にIESAを生産していたことが証明された。これはTSB中に培地原料として添加されているカゼイン由来のトリプトファンが約1質量%含まれるものに由来すると考えられる。さらに、トリプタミンの添加区ではIESA生産量が飛躍的に向上することも同時に証明された。
これらの結果から、表1のIESAは物理化学的な構造解析によってもIESAであることが証明された。
500mL容バッフル付き三角フラスコにトリプトファンを1質量%添加したNutrient Broth(ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下NB)を各300mL×2本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめNBで前培養したBacillus thuringiensisB−3株(北海道別海町土壌由来、(独)製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号NITE AP−689)及びB. cereusB−6株(北海道別海町由来、同受領番号NITE AP−690)のうちいずれかを接種し、実施例1と同様に培養を行った。
培地をコーンスチープリカー(和光純薬社製)を3容量%添加したTSBとし、菌株をB−3株とした以外は実施例2と同様に培養、粗精製、分析を行った。
その結果、0.102mg/LのIESAが検出された。
培地を、NB、NBにトリプタミンを10mM添加したもの、NBにトリプタミンを10mM添加とフェネチルアミンを3mM添加したもの、NBにトリプタミンを10mM添加とフェネチルアミンを10mM添加したものとし、それ以外は実施例1と同様にそれぞれ培養、粗精製を行った。
この結果から、本発明の方法によればIESAとPESAを同時に生産させることも可能であることが証明された。また、IESAを優先的に生産させたい場合はフェネチルアミン添加量を少なくした方が有利であることが判明した。また、双方の基質濃度と生産物との関係は競合阻害と考えられるため、IESA生合成酵素とPESA生合成酵素は同一である可能性が推察される。
500mL容バッフル付き三角フラスコにトリプタミンを0.1質量%添加したNBを300mL×2本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめNBで前培養したBacillus subtilisJCM1465株を接種し、実施例1と同様に培養、粗精製を行った。粗精製後のサンプルは実施例4と同様にHPLCによる精製、分析を行った。その結果、0.032mg/LのIESAが検出された。
このことから、適当な濃度のトリプタミンを培地に添加すればB. subtilisを用いてもIESAを生産できることが明らかとなった。
培地を、NBにトリプトファンを1質量%添加したもの、NBにトリプトファンを1質量%、硫酸マンガン5水和物(MnSO4・5H2O)を0.3質量%(マンガンイオン濃度として684ppm)添加し、水酸化ナトリウム水溶液でpH6.8に調整したものとし、菌株をB−3株とした以外は実施例5と同様にそれぞれ培養、粗精製、分析を行った。その結果、硫酸マンガン無添加区で0.643mg/L、硫酸マンガン添加区で3.704mg/LのIESAが検出された。
このことから、マンガンイオンの添加によりIESA生産量は5倍以上高まったことが確認された。
基本培地を食塩(NaCl)0.5質量%、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)0.25質量%、ブドウ糖(glucose)0.25質量%、硫酸マンガン五水和物(0.3質量%,マンガンイオン濃度として684ppm)水溶液とした。これに(1)酵母エキス(Yeast extracts、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製)3容量%、(2)トリプトン(Tryptone、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製)3質量%、(3)ソイトン(Soytone、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製)3質量%、(4)ソイトン3質量%およびグルタミン酸1質量%をそれぞれ加え、pH7.2に調整したものを培地とし、菌株をB−3株とした以外は実施例5と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表4に示した。
本結果から、培地にマンガンイオンを添加しておくことで、酵母エキス、トリプトン、ソイトンなど広範な窒素源からIESAを生産できることが確認された。
(1)成分無調整牛乳(日本ミルクコミュニティ(株)製)そのもの、(2)当該牛乳にL−リンゴ酸(L−malic acid)を0.3質量%添加したもの、(3)上記牛乳に硫酸マンガン五水和物を0.3質量%(マンガンイオン濃度として684ppm)添加したもの、(4)上記牛乳にL−リンゴ酸(L−malic acid)0.3質量%と硫酸マンガン五水和物0.3質量%添加したものをそれぞれ調製し、pH7.2に調整して培地とし、菌株をB−3株とした以外は実施例5と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表5に示した。
本結果よりB-3株により牛乳そのものを培地としてもIESAを生産することが可能であることが明らかとなった。また、その生産量はマンガンイオンやリンゴ酸を添加することによりさらに向上することが判明した。
(1)チーズホエイからUF膜(Ultrafiltration Membrane)を用いてタンパク質を回収した際の透過液であるホエイUF膜パーミエイト(雪印乳業(株)なかしべつ工場製)にL−リンゴ酸(L−malic acid)0.3質量%と硫酸マンガン五水和物を0.3質量%(マンガンイオン濃度として684ppm)添加したもの、(2)乳清パウダーFC06(雪印乳業(株)製)12質量%水溶液、(3)当該乳清パウダー12質量%水溶液にL−リンゴ酸0.3質量%と硫酸マンガン五水和物を0.3質量%添加したものをそれぞれ調製し、pH7.2に調整して培地とした。これにB−3株を接種し、実施例5と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表6に示した。
本結果から、ホエイUF膜パーミエイトそのものを培地とし、マンガンイオンとL−リンゴ酸を添加した場合に、IESAを生産することができることが判明した。また、乳清パウダーといったホエイを培地とした場合、B−3株によってIESAを生産することができるが、マンガンイオンとL−リンゴ酸を添加すればその生産量を飛躍的に向上させることができることが明らかとなった。
タンパク質濃縮ホエイパウダーWPC34C(ホエイ中タンパク質を膜濃縮後、スプレードライ乾燥したもの;雪印乳業(株)製)3質量%、食塩(NaCl)0.5質量%、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)0.25質量%、ブドウ糖0.25質量%を蒸留水に溶解したものをホエイタンパク質基礎培地とした。
(1)この基礎培地そのもの、(2)基礎培地にL−リンゴ酸0.3質量%を添加したもの、(3)基礎培地にL−リンゴ酸0.3質量%および硫酸マンガン五水和物0.3質量%(マンガンイオン濃度として684ppm)を添加したもの、(4)基礎培地にD−リンゴ酸0.3質量%および硫酸マンガン五水和物0.3%を添加したもの、(5)基礎培地にフマル酸0.3質量%および硫酸マンガン五水和物0.3質量%を添加したものを、それぞれ調製し、すべてpH 7.2とした。これにB−3株を接種し、実施例5と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表7に示した。
本結果から、B−3株を用いることによって、ホエイタンパク質そのものを培地としてもIESAを生産することができることが確認された。また、その生産量はマンガンイオンと有機酸を添加することによりさらに向上し、有機酸としてはL−リンゴ酸以外にもD−リンゴ酸、フマル酸でも効果的であることが判明した。
(1)セミ脱塩乳清パウダーFC10(雪印乳業(株)製)12質量%水溶液、(2)当該セミ脱塩乳清パウダー12質量%水溶液に硫酸マンガン五水和物を0.3質量%(マンガンイオン濃度として684ppm)添加したもの、(3)上記水溶液に硫酸マンガン五水和物0.3質量%とD−リンゴ酸0.3質量%を添加したもの、(4)上記水溶液に硫酸マンガン五水和物0.3質量%とL−リンゴ酸0.3質量%を添加したもの、(5)上記水溶液に硫酸マンガン五水和物0.3質量%とフマル酸0.3質量%を添加したものを、それぞれ調製し、pH7.2に調整して培地とした。これにB−3株を接種し、実施例5と同様に培養、粗精製、分析を行った。結果は表8に示した。
本結果から、B−3株を用いることによって、ホエイそのものを培地としてもIESAを生産することができることが確認された。また、その生産量はマンガンイオンと有機酸を添加することによりさらに向上し、有機酸としてはL−リンゴ酸以外にもD−リンゴ酸、フマル酸でも効果的であることが判明した。
セミ脱塩乳清パウダーFC10(雪印乳業(株)製)12質量%水溶液に硫酸マンガン五水和物を0.3質量%(マンガン濃度として684ppm)添加し、pH7.2に調整した培地(実施例11の(2)に相当)を300mL調製し、500mL用バッフル付き三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌した。
上記の培地に、あらかじめNBで前培養したBacillus thuringiensis B−2株(北海道別海町土壌由来)、同B−9株(北海道長沼町土壌由来)、同B−10株(北海道別海町土壌由来)、同B-18株(北海道由仁町土壌由来、(独)製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号NITE ABP−858)、同B-21株(北海道由仁町土壌由来)、同B-22株(北海道長沼町土壌由来)、同B-24株(北海道別海町土壌由来、(独)製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号NITE AP−857)、同B-26株(北海道標津町土壌由来)、同B-33株(北海道長沼町土壌由来)、同B-36株(北海道標津町土壌由来)、同B-59株(北海道標津町土壌由来);B. cereus B−7株(北海道長沼町土壌由来)、同B−15株(北海道長沼町土壌由来)、同B-16株(北海道長沼町土壌由来、(独)製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号NITE AP−856);B. megaterium B−32株(北海道由仁町土壌由来、(独)製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号NITE ABP−859)をそれぞれ接種し、実施例1と同様に培養した。
なお、上記菌株は実施例2と同様の方法で遺伝子同定を行った。
本結果から、マンガンを添加したホエイを培地として用いることによってB. thuringiensis、B. cereus、B. megateriumを用いてIESAを生産することが出来ることが確認された。特にB. thuringiensisB−18株(NITE ABP−858)の生産能力が極めて高いことが明らかとなった。
まず、標品となるN−[2-(5−水酸化インドール−3−イル)エチル]コハク酸アミド(Bufobutanoic acid、以下BBA)を下記の通り化学合成した。
無水コハク酸1.55gにアセトン30mLを加え、室温にて撹拌しながら、5−水酸化トリプタミン塩酸塩(セロトニン塩酸塩、シグマアルドリッチジャパン(株)社製)3gとトリエチルアミン1.97mLをアセトン50mLに溶解したものをゆっくりと加え、さらに30分撹拌を続けた。反応後、溶媒は減圧下で留去し、残滓を5%炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルとで溶解し、分液ロート中で分液した。酢酸エチル相を棄却した後、水相は濃塩酸を用いてpH2.5に調整し、酢酸エチルで抽出を行った。酢酸エチル相は無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した後、溶媒を減圧下にて留去した。得られた合成物はHPLC(カラム、YMC−Pack C8 内径20mm×長さ250mm(YMC社製);移動相、1容量%酢酸含有50容量%メタノール;流速、6.0mL/分)を用いて精製し、保持時間12〜14分の溶出液を分取した。分取した画分は減圧乾固し、五酸化二燐共存下のデシケータ内で減圧乾燥し、1.1gのBBAを得た。
得られた培養液は実施例1と同様に遠心分離後、ダイヤイオンHP−20カラムへの吸着を行った。このカラムは10容量%イソプロパノール500mLでBBAを溶出し、溶出液は実施例1と同様に溶媒抽出を行った。得られたサンプルは少量の20容量%メタノールに溶解し、別途メタノールで洗浄後、20容量%メタノールを通液して調製したSepPak tC18カートリッジ(Waters社製)を通過させ、さらに20容量%メタノール20mLで溶出することにより精製した。
このことから、基質のインドリル基に水酸基を有していても、当該微生物によって対応するコハク酸アミド体を生産させることができることが明らかとなった。
BBA処理区では濃度依存的に顕著な発根数の増加が認められた。このことから、上記のBBA培養液を発根促進剤や植物成長調整剤として利用することが可能であることが確認された。
Bacillus thuringiensis B−18株(受領番号NITE ABP−858)をNB10mL中、27℃、3日間培養し、培養液を15,000rpm、10分遠心分離した。上澄を棄却した後、10mLの滅菌水を加え、よく懸濁し、再度遠心分離することにより菌体の洗浄を行った。この洗浄をさらに2回繰り返したものに、滅菌水10mLを加え、十分懸濁し、接種源とした。
一方、トマト品種ハウス桃太郎(タキイ種苗)種子を80容量%エタノールに1分浸漬し、ついで滅菌水で洗浄し、ついで1容量%次亜塩素酸ナトリウムに5分浸漬し、ついで滅菌水で2回洗浄することで種子消毒を行ったのち、あらかじめ滅菌したゲルライト(和光純薬社製)1質量%を含む培地表面に播種した。
27℃で3日間培養した後、発芽が確認された種子3粒を接種源に10秒間浸漬した後、あらかじめゲルライト1質量%培地100mLを外径40mm×高さ130mmの植物培養試験管(旭テクノグラス社製)に入れて滅菌、固化したものに置床した(2反復)。蛍光灯による連続光下(2200ルックス、20℃)で14日間栽培したのち、総根長をルートスキャナー(Comair社製)で測定した。結果は表11に示した。B−18株の処理によって総根長が明らかに増加しているほか、目視による観察でも側根数の増加が認められた。
Claims (6)
- R1及びR2がそれぞれ独立して水素原子又は水酸基であり、nが1である請求項1記載の製造法。
- 培地中にマンガンイオン(Mn2+)を1〜2000ppm含有せしめることを特徴とする請求項1又は2記載の製造法。
- 培地中に有機酸又はその塩を含有せしめることを特徴とする請求項1〜3いずれかに記載の製造法。
- 請求項1記載の一般式(1)で表されるインドリルアルキルアミン類又はその塩を生合成する植物体、種子、該植物体栽培用水又は土壌に、インドリルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を施用し、インドリルアルキルコハク酸アミドを合成させることを特徴とする植物成長調整方法。
- バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)B−18(受託番号NITE BP−858)株、バチルス・チューリンゲンシスB−24(NITE P−857)株、又はバチルス・セレウス(Bacillus cereus)B−16(NITE P−856)株。
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