CN106085917A

CN106085917A - 一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基及其制备方法

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Publication number: CN106085917A
Application number: CN201610595088.5A
Authority: CN
Inventors: 宋艳
Original assignee: 宋艳
Current assignee: Sichuan Jinke pharmaceutical limited liability company
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2016-07-26
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基，由培养基经菌种发酵得到，其中，所述培养基中的碳源包括毛叶山桐子粕，氮源包括菜籽粕；所述菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种以上。本发明以毛叶山桐子粕作为碳源、菜籽粕作为氮源，经过酵母菌和根霉菌中的两种发酵以后即可获得枯草芽孢杆菌扩繁培养基，以该培养基培养枯草芽孢杆菌时能够获得较高的活菌数，同时采用毛叶山桐子粕和菜籽粕，极大地降低了生产成本。实验结果表明，本发明提供的扩繁培养基用于培养枯草芽孢杆菌时，活菌数与常规培养基相当，但是成本大幅降低。

Description

一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于菌种扩繁技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基及其制备方法。

背景技术

现代研究及应用表明，枯草芽孢杆菌不仅列入饲料添加剂允许种类，其对养殖动物具有增强免疫力，安全无残，且养殖用水修复上也非常有效。但是应用中活菌数量直接关系到效果，因此，规模化生产对应用尤为重要。而扩繁培养基中通常碳源采用葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、米粉等；氮源采用蛋白冻、牛肉浸膏、豆粕粉、酵母粉、鱼粉等，用量大、单价相对高，导致生产成本高，成为枯草芽孢杆菌等益生素广泛应用的瓶颈。

目前，枯草芽孢杆菌常用的扩繁培养基组成为：

碳源：面粉23％～40％、米粉13％～40％组合；

氮源：鱼粉7％～10％、酵母粉6％～10％、豆粕粉6％～10％任意两种组合；

无机盐：氯化钠0.08％～0.25％、氯化钾0.25％～1.9％、硫酸镁0.5％～2.3％、碳酸钙0.08％～2.3％、磷酸二氢钾0.1％～0.3％、碳酸氢钠0.08％～1.3％组合；

余量为纯化水。

但是，该扩繁培养基成本较高。

毛叶山桐子为优质高产的木本油料，是当今大力发展的油料作物。以山桐子发展趋势，按每吨山桐子油0.7吨粕计，10年后，年存山桐子粕将上千万吨。山桐子榨油后得到的粕中粗蛋白质含量6～9.3％、粗纤维含量21.18％，同时含有丰富的粗脂肪、黄酮类、铜、铁、锰、锌等物质，其资源丰富且价格低廉，无霉性和副作用。但毛叶山桐子粕直接饲用时可降解利用程度低，只能作反刍动物饲料原料廉价出售，或堆埋发酵做肥料，其附加值低、资源化浪费严重。由于毛叶山桐子是新兴发展作物，其油研究应用报道较多，粕几乎没有报道。

菜籽粕是油菜籽榨油后的副产物，其粗蛋白含量在32％以上，粗纤维含量在12％以下。但菜籽粕含有较多有毒有害物质，如异硫氰酸酯、硫氰酸酯、恶唑烷硫酮、腈、芥子碱、单宁、植酸等，可引起动物甲状腺肿大，抑制动物生长，极大的限制其增值应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基及其制备方法，本发明提供的培养基在保证枯草芽孢杆菌活菌数的基础上极大降低了生产成本。

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基，由培养基经菌种发酵得到，其中，所述培养基中的碳源包括毛叶山桐子粕，氮源包括菜籽粕；

所述菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种以上。

本发明以毛叶山桐子粕作为碳源、菜籽粕作为氮源，经过酵母菌和根霉菌中的两种发酵以后即可获得枯草芽孢杆菌扩繁培养基，以该培养基培养枯草芽孢杆菌时能够获得较高的活菌数，同时采用毛叶山桐子粕和菜籽粕，极大地降低了生产成本。

在本发明中，所述培养基除了包括碳源、氮源，还包括无机盐和水；其中，碳源除了毛叶山桐子粕，优选还包括面粉和米粉；氮源为菜籽粕；无机盐优选包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙、磷酸二氢钾和碳酸氢钠。

在一个实施例中，所述培养基包括：25wt％～35wt％的毛叶山桐子粕；10wt％～20wt％的面粉；10wt％～20wt％的米粉；30wt％～45wt％的菜籽粕；0.08wt％～0.25wt％的氯化钠；0.25wt％～1.9wt％的氯化钾；0.5wt％～2.3wt％的硫酸镁；0.08wt％～2.3wt％的碳酸钙；0.1wt％～0.3wt％的磷酸二氢钾；0.08wt％～1.3wt％的碳酸氢钠；余量的水。

在本发明中，所述菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种，优选选自酿酒酵母、毕赤酵母、红酵母、假丝酵母和少孢根霉中的两种以上，更优选选自酿酒酵母和少孢根霉。

将上述菌种在上述培养基中进行发酵，即可获得枯草芽孢杆菌扩繁培养基。在本发明中，所述发酵温度为37℃，所述发酵时间为36h～72h。

本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基的制备方法，包括以下步骤：

将作为培养基碳源的毛叶山桐子粕和作为培养基氮源的菜籽粕消毒后加入菌种和培养基的其他组分混合后进行发酵，获得枯草芽孢杆菌扩繁培养基；

其中，菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种以上。

本发明首先将毛叶山桐子粕和菜籽粕消毒，具体步骤为：将毛叶山桐子粕和菜籽粕装入发酵罐中，罐体密封后通入121～123℃的饱和蒸汽，当罐体压力达到0.5～2.0MPa后维持0.5～10min。

然后向其中加入菌种和培养基的其他组分混合后进行发酵。其中，所述菌种为液体菌液，按照以下方法制备：将培养活化的酿酒酵母、毕赤酵母、红酵母、假丝酵母、少孢根霉菌种用无菌生理盐水制成悬浮液，接种到发酵培养基中，培养20～24h，分别得到发酵菌；将上述任意二种以上发酵菌混合得到液体菌液。

在本发明中，所述培养基包括：25wt％～35wt％的毛叶山桐子粕；10wt％～20wt％的面粉；10wt％～20wt％的米粉；30wt％～45wt％的菜籽粕；0.08wt％～0.25wt％的氯化钠；0.25wt％～1.9wt％的氯化钾；0.5wt％～2.3wt％的硫酸镁；0.08wt％～2.3wt％的碳酸钙；0.1wt％～0.3wt％的磷酸二氢钾；0.08wt％～1.3wt％的碳酸氢钠；余量的水。

在本发明中，所述发酵温度为37℃，所述发酵时间为36h～72h。

本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌的培养方法，包括：

将作为培养基碳源的毛叶山桐子粕和作为培养基氮源的菜籽粕消毒后加入菌种和培养基的其他组分混合后进行发酵，获得扩繁培养基；其中，菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种以上；

向所述扩繁培养基中加入枯草芽孢杆菌菌种液进行培养。

按照上述方法获得扩繁培养基后，将其消毒，加入枯草芽孢杆菌菌液进行培养。具体而言，所述消毒具体为：向扩繁培养基中通入121～123℃的饱和蒸汽，当压力达到0.5～2.0Mpa后维持5～15min，消毒并灭活扩繁培养基中的发酵菌。

枯草芽孢杆菌菌液按照以下方法制备：将培养活化的枯草芽孢杆菌菌种用无菌生理盐水制成悬浮液，接种到发酵培养基中，培养20～24h，得到枯草芽孢杆菌菌液。

在本发明中，枯草芽孢杆菌菌液的加入量为扩繁培养基的0.3wt％～5wt％，所述培养的时间为24h～36h，所述培养的温度为26℃～33℃。

实验结果表明，本发明提供的扩繁培养基用于培养枯草芽孢杆菌时，活菌数与常规培养基相当，但是成本大幅降低。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

培养基配方：

碳源：30％毛叶山桐子粕，13％面粉，13％米粉；

氮源：40％菜籽粕；

无机盐：0.2％氯化钠、0.5％氯化钾、0.8％硫酸镁、0.1％碳酸钙、0.2％磷酸二氢钾、0.2％碳酸氢钠；

余量水。

制备方法：

将毛叶山桐子粕、菜籽粕装入发酵罐中，罐体密封后通入121～123℃的饱和蒸汽，当罐体压力达到1.5MPa后维持10min，加入酿酒酵母和少孢根霉的混合菌液、面粉、米粉、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙、磷酸二氢钾、碳酸氢钠，其中，酿酒酵母和少孢根霉的混合菌液按照以下方法制备：将培养活化的酿酒酵母和少孢根霉菌种用无菌生理盐水制成悬浮液，接种到发酵培养基培养20h，分别得到酿酒酵母发酵液和少孢根霉发酵液，将二者混合得到；将上述物料混合均匀后调节水分至60％，制成混合物料，37℃培养36～72小时，得到扩繁培养基。

比较例1

培养基配方：

碳源：30％毛叶山桐子粕，13％面粉，13％米粉；

氮源：40％菜籽粕；

无机盐：0.2％氯化钠、0.5％氯化钾、0.8％硫酸镁、0.1％碳酸钙、0.2％磷酸二氢钾、0.2％碳酸氢钠

余量水。

制备方法：

将毛叶山桐子粕、菜籽粕、面粉和米粉匀浆，获得浆料；氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙分别溶解后再与上述浆料混合，用磷酸二氢钠和碳酸氢钠调pH值为7.5～8.0，获得培养基。

比较例2

培养基配方：

碳源：33％面粉，33％米粉；

氮源：10％鱼粉，10％酵母粉；

余量水。

制备方法：

将面粉和米粉匀浆再加入鱼粉和酵母粉进行匀浆，获得浆料；氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙分别溶解后再与上述浆料混合，用磷酸二氢钠和碳酸氢钠调pH值为7.5～8.0，获得培养基。

实施例2

将实施例1、比较例1和比较例2制备的培养基导入发酵罐中，搅拌条件下加热至121～123℃消毒45min，冷却至常温备用。

分别向实施例1、比较例1和比较例2制备的培养基中加入2wt％的不同菌株的枯草芽孢杆菌菌液，混合均匀后调节水分至50％制成混合物料，培养36h，得到发酵物料。

分别对所述发酵物料进行镜检形态观察，比较例2的发酵物料中枯草芽孢杆菌已大部分形成芽孢，且形态较好；比较例1的发酵物料中单个营养体、成链状营养体、芽孢共同存在，活菌量少。

分别检测发酵物料中活菌数，结果参见表1，表1为本发明实施例及比较例提供的发酵物料中的活菌数。

表1本发明实施例及比较例提供的发酵物料中的活菌数(亿/毫克)

表1中，各菌株购于四川省工业菌种保藏中心。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基，其特征在于，由培养基经菌种发酵得到，其中，所述培养基中的碳源包括毛叶山桐子粕，氮源包括菜籽粕；

所述菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种以上。

2.根据权利要求1所述的扩繁培养基，其特征在于，所述培养基包括：25wt％～35wt％的毛叶山桐子粕；10wt％～20wt％的面粉；10wt％～20wt％的米粉；30wt％～45wt％的菜籽粕；0.08wt％～0.25wt％的氯化钠；0.25wt％～1.9wt％的氯化钾；0.5wt％～2.3wt％的硫酸镁；0.08wt％～2.3wt％的碳酸钙；0.1wt％～0.3wt％的磷酸二氢钾；0.08wt％～1.3wt％的碳酸氢钠；余量的水。

3.根据权利要求1所述的扩繁培养基，其特征在于，所述菌种选自酿酒酵母、毕赤酵母、红酵母、假丝酵母和少孢根霉中的两种以上。

4.根据权利要求1所述的扩繁培养基，其特征在于，所述发酵温度为37℃，所述发酵时间为36h～72h。

5.一种枯草芽孢杆菌扩繁培养基的制备方法，包括以下步骤：

其中，菌种选自酵母菌和根霉菌中的两种以上。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养基包括：25wt％～35wt％的毛叶山桐子粕；10wt％～20wt％的面粉；10wt％～20wt％的米粉；30wt％～45wt％的菜籽粕；0.08wt％～0.25wt％的氯化钠；0.25wt％～1.9wt％的氯化钾；0.5wt％～2.3wt％的硫酸镁；0.08wt％～2.3wt％的碳酸钙；0.1wt％～0.3wt％的磷酸二氢钾；0.08wt％～1.3wt％的碳酸氢钠；余量的水。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述菌种选自酿酒酵母、毕赤酵母、红酵母、假丝酵母和少孢根霉中的两种以上。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为37℃，所述发酵时间为36h～72h。

9.一种枯草芽孢杆菌的培养方法，包括：

向所述扩繁培养基中加入枯草芽孢杆菌菌种液进行培养。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述培养的时间为24h～36h，所述培养的温度为26℃～33℃。