CN100449000C - 2-酮-l-古洛糖酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸钠，并以高回收率回收2-酮-L-古洛糖酸的方法，该方法采用对无微生物发酵液进行控制性的阳离子交换处理，和/或调节所说的纯化发酵液的pH，然后直接使2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶。

Description

2-酮-L-古洛糖酸的生产方法
技术领域
本发明涉及生产2-酮-L-古洛糖酸钠，并以高回收率回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物的方法。
发明背景
已知，2-酮-L-古洛糖酸可以通过发酵由L-山梨糖和/或山梨糖醇生产。
FR 1 376 741涉及生产L-抗坏血酸(＝维生素C)的中间体，即2-酮-L-古洛糖酸的制备方法。
现已证实，该发酵混合物可直接用来将2-酮-L-古洛糖酸酯化为L-抗坏血酸。
EP 0 518 136描述了一种制备2-酮-L-古洛糖酸的方法，该方法包括培养微生物(A)和微生物(B)的混合培养物，其中微生物(A)属于葡糖酸杆菌属或醋杆菌属，微生物(B)能够由L-山梨糖生成2-酮-L-古洛糖酸，所说的两种微生物至少在整个培养周期的一部分时间内共存在培养基中。
EP 0 278 447涉及利用包括微生物氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的混合培养物，通过L-山梨糖的转化，发酵生产2-酮-L-古洛糖酸的方法。
EP 0 972 843涉及通过微生物发酵，由山梨糖醇生产2-酮-L-古洛糖酸的连续发酵方法，该方法中，含有山梨糖醇的营养培养基与能转化山梨糖醇为L-山梨糖的微生物在第一发酵容器中培养，然后将产生的发酵液连续地传送至第二个发酵容器，并在第二个发酵容器中与能将L-山梨糖转化为2-酮-L-古洛糖酸的微生物一起培养。
EP 0 213 591描述了一种分别生产2-酮-L-古洛糖酸和维生素C的方法，该方法还进一步描述了通过生成盐类或利用产物与杂质之间的不同性质，例如溶解度、吸收率和在两种不同溶剂中的分配系数来达到2-酮-L-古洛糖酸的分离。虽然使用吸附剂，例如使用离子交换树脂，被描述为最方便的产物分离方法之一，但这样得到的2-酮-L-古洛糖酸通常是不纯的。
EP 0 221 707涉及一种生产2-酮-L-古洛糖酸的方法，并描述了其收集的方法，通过过滤、离心或用活性碳处理并将溶液浓缩后，使发酵液除去细胞。溶剂抽提、层析、沉淀或盐析可以适当地结合和/或重复应用。
WO 01/09152涉及通过采用弱碱性离子交换树脂进行连续液相层析纯化2-酮-L-古洛糖酸的方法。该方法主要是涉及从水溶液回收基本上无水的2-酮-L-古洛糖酸。
EP 0 359 645涉及由含有2-酮-L-古洛糖酸钙盐的发酵液获得纯的2-酮-L-古洛糖酸的方法。所说的方法包括不溶物的分离、培养基的浓缩、加入浓硫酸沉淀硫酸钙、用阳离子交换树脂处理、用阴离子交换剂除去强酸离子、浓缩和通过结晶使2-酮-L-古洛糖酸分离。
EP 0 805 210涉及一种方法，该方法包括使2-酮-L-古洛糖酸钠从发酵液中结晶，将所得的结晶磨成粉状，然后悬浮在含有无水酸的低级醇中，最后将2-酮-L-古洛糖酸盐转化为2-酮-L-古洛糖酸的低级烷基酯。
还需要有一种获得高收率的2-酮-L-古洛糖酸，而且其中的纯化步骤是简单而且容易重复进行的方法。
本发明提供了这样的方法。
发明概述
本发明公开了一种通过发酵生产2-酮-L-古洛糖酸钠和回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶的方法，该方法包括以下步骤：
a)用发酵法将山梨糖醇转化为至少50g/L的2-酮-L-古洛糖酸钠；
b)除去发酵培养基中的微生物，由此得到减少了微生物的发酵液，优选得到无微生物的发酵液；
c)使减少了微生物的发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去蛋白，使蛋白浓度为2400ppm以下(测定干物质中的氮)，以获得纯化的发酵液；和/或调节纯化的发酵液的pH，以便在随后使水蒸发的期间，避免形成浓度高于3％(按干物质计)的维生素C；
d)使纯化的发酵液中的水蒸发，以得到浓缩的纯化发酵液，以及
e)通过从浓缩的纯化发酵液结晶，回收2-酮-L-古洛糖酸一水
合物结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为80％或更高。
本发明还涉及一种方法，在所说的方法中，通过采用阳离子交换树脂的离子交换处理，来实现转化为2-酮-L-古洛糖酸和除去蛋白。
此外，本发明涉及一种包括以下步骤的方法：
a)制备含有氮源和以山梨糖醇作为碳源的发酵培养基；
b)将微生物接种于发酵培养基，以转化山梨糖醇为山梨糖；
c)使微生物生长至发酵培养基中的L-山梨糖至少达到100g/L；
d)终止山梨糖醇向L-山梨糖的转化；
e)将混合的微生物培养物接种于发酵培养基，以转化L-山梨糖为2-酮-L-古洛糖酸钠；
f)使微生物生长至发酵培养基中的2-酮-L-古洛糖酸钠至少达到50g/L；
g)过滤除去发酵培养基中的微生物，由此得到减少了微生物的发酵液，优选得到无微生物的发酵液；
h)用阳离子交换树脂将减少了微生物的发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去蛋白，使蛋白浓度在2000ppm以下(测定干物质中的氮)，以获得纯化的发酵液，和/或调节纯化的发酵液的pH，以便在随后使水蒸发的期间，避免形成浓度高于2.5％(按干物质计)的维生素C，优选形成不高于1％(按干物质计)的维生素C；
i)使纯化的发酵液中的水蒸发，以获得浓缩的纯化发酵液，以及
j)从浓缩的纯化发酵液中结晶，回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为80％或更高。
本发明涉及一种方法，其中在步骤g)中的过滤是微量过滤；在步骤h)中所述的纯化的发酵液含有的蛋白不大于1800ppm(测定干物质中氮)；并调节pH为1.5以上，以及在步骤j)中2-酮-L-古洛糖酸的收率为85％或更高。
本发明还涉及一种方法，其中在步骤b)中的微生物属于葡糖酸杆菌属，以及在步骤e)中的微生物混合培养物属于葡糖酸杆菌属和芽孢杆菌属的混合培养物。
本发明具体地涉及一种方法，其中在步骤e)中的微生物是氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合培养物，其中氧化葡糖酸杆菌优选根据“布达佩斯条约”已于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG(比利时微生物协调保藏中心/Bacteria Collection Laboratorium voorMicrobiologie Universiteit Gent by Cerestar HoldingB.V.Nijverheidsstraat 1，NL-4551 LA Sas van Gent，TheNetherlands)、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌SCB 329；苏云金芽孢杆菌优选根据“布达佩斯条约”已于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG(比利时微生物协调保藏中心/Bacteria CollectionLaboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent by CerestarHolding B.V.Nijverheidsstraat 1，NL-4551 LA Sas van Gent，TheNetherlands)、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV 393，并且在所说的混合培养物中，在微生物生长初期，葡糖酸杆菌菌落与芽孢杆菌菌落的存在比率为300∶1-1∶10。
此外，本发明还涉及用于生产2-酮-L-古洛糖酸的氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合培养物，其中的氧化葡糖酸杆菌优选已于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌SCB 329；苏云金芽孢杆菌优选已于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV393。
本发明具体地涉及所说的微生物混合培养物中，在微生物生长的初期，其葡糖酸杆菌菌落与芽孢杆菌菌落的存在比为25∶1。
本发明涉及于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG的用于生产2-酮-L-古洛糖酸的氧化葡糖酸杆菌SCB 329，其保藏号为LMG P-20356。
本发明还涉及于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG的用于生产2-酮-L-古洛糖酸的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV 393，其保藏号为LMGP-20355。
本发明进一步涉及于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的微生物氧化葡糖酸杆菌和于2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的微生物苏云金芽孢杆菌(SCB933)TCV 393在生产2-酮-L-古洛糖酸中的用途。
最后，本发明涉及其中所说的微生物以混合培养物的方式应用于生产2-酮-L-古洛糖酸的用途。
发明的详述
本发明公开了一种通过发酵生产2-酮-L-古洛糖酸钠和回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶的方法，该方法包括以下步骤：
a)用发酵法将山梨糖醇转化为至少50g/L的2-酮-L-古洛糖酸钠；
b)除去发酵培养基中的微生物，由此得到减少了微生物的发酵液，优选得到无微生物的发酵液；
c)使减少了微生物的发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去蛋白，使蛋白浓度为2400ppm以下(测定干物质中的氮)，以获得纯化的发酵液；和/或调节纯化的发酵液的pH，以便在随后使水蒸发的期间，避免形成浓度高于3％(按干物质计)的维生素C；
d)使纯化的发酵液中的水蒸发，以得到浓缩的纯化发酵液，以及
e)通过从浓缩的纯化发酵液结晶，回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为80％或更高。
为了回收发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸，将发酵液的微生物分离除去，然后在无微生物的发酵液中将产生的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸。
2-酮-L-古洛糖酸的回收率明显地取决于微生物发酵液的纯度。为了得到80％或更高回收率的2-酮-L-古洛糖酸，本发明说明了一种纯化的步骤，该步骤包括两种处理方法之一的任何一种，这两种处理方法可以分别应用或依次应用。
在2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸的期间，将残留的蛋白除去，使其浓度在2400ppm氮(干物质计，用Mitsubishi TN-05分析仪测定)以下。其次，调节所说的纯化的无微生物发酵液的pH，从而在随后使水蒸发的期间，避免形成维生素C，或使其浓度不高于4％(按干物质计)。结果，通过除去蛋白和/或调节纯化的发酵液的pH，获得高回收率的2-酮-L-古洛糖酸。
通过除去残留的蛋白，使其在纯化的发酵液中的浓度达到2400ppm以下，这样，由于提高了纯化的发酵液的纯度，以及降低了该纯化的发酵液的粘度，使随后的结晶步骤变得更为容易。
通过调节上述的纯化的发酵液的pH，避免了维生素C的形成，或使其浓度不高于3％，而且该浓缩的纯化发酵液有较高的纯度，这样，可以便于结晶和提高回收率。
依次使用两种处理方法，即除去纯化的发酵液的残留蛋白和调节上述的纯化的发酵液的pH，具有累加的效果，2-酮-L-古洛糖酸的回收率必定高于80％。
2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，以及蛋白质的除去可以通过应用包括阳离子交换离子的离子交换处理来进行。该离子交换处理是简化的，而且不需要阴离子交换剂。
纯化处理对2-酮-L-古洛糖酸回收率的正影响与所用的发酵工艺无关。发酵可以采用间歇式或连续进行。
山梨糖醇发酵为2-酮-L-古洛糖酸钠可以是一步发酵，例如，在EP 0 518 136中所述，或者该发酵转化可以是二步连续发酵，例如，在EP 0 972 843中所述。
本发明具体地涉及一种包括以下步骤的方法：
a)制备含有氮源和以山梨糖醇作为碳源的发酵培养基；
b)将微生物接种于发酵培养基，以转化山梨糖醇为山梨糖；
c)使微生物生长至发酵培养基中的L-山梨糖至少达到100g/L；
d)终止山梨糖醇向L-山梨糖的转化；
e)将混合的微生物培养物接种于发酵培养基，以转化L-山梨糖为2-酮-L-古洛糖酸钠；
f)使微生物生长至发酵培养基中的2-酮-L-古洛糖酸钠至少达到50g/L；
g)过滤除去发酵培养基中的微生物，由此得到减少了微生物的发酵液，优选得到无微生物的发酵液；
h)用阳离子交换树脂将减少了微生物的发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去蛋白，使蛋白浓度在2000ppm以下(测定干物质中的氮)，以获得纯化的发酵液，和/或调节纯化的发酵液的pH，以便在随后使水蒸发的期间，避免形成浓度高于2.5％(按干物质计)的维生素C，优选形成不高于1％(按干物质计)的维生素C；
i)使纯化的发酵液中的水蒸发，以获得浓缩的纯化发酵液，以及
j)从浓缩的纯化发酵液中结晶，回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为80％或更高。
由D-山梨糖醇发酵生产L-山梨糖是已知的方法，该方法是众所周知的Reichstein方法中的一部分。已知有许多种由D-山梨糖醇生产L-山梨糖的葡糖酸杆菌菌株。
该发酵继续进行至发酵培养基中的L-山梨糖至少达到100g/L。
通过HPLC(Ca柱)分析L-山梨糖的形成。
在两个发酵步骤之间，发酵液可在50℃以上的温度进行巴氏消毒，优选在高于80℃的温度进行巴氏消毒。
L-山梨糖转化为2-酮-L-古洛糖酸的特征在于使用微生物氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合培养物，更优选使用2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌和2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV 393的混合培养物。
在生长初期，混合培养物中葡糖酸杆菌菌落与芽孢杆菌菌落的数量比可以在300∶1-1∶10的范围，优选在所说的混合微生物培养物中，在生长的初期，葡糖酸杆菌菌落与芽孢杆菌菌落的存在比率为25∶1。
2-酮-L-古洛糖酸的生产是通过在含有L-山梨糖以及适合的营养成分的培养基中，培养混合的微生物培养物而完成。或者，该方法可进行如下：先培养混合微生物，然后使从培养物回收的完整细胞或无细胞提取物与L-山梨糖接触。
发酵温度为约25℃-35℃。
培养基通常含有碳源、氮源、无机物、维生素、微量元素和其他生长促进因子。
各种有机或无机物可以用作氮原，例如，酵母提取物、肉类提取物、胨、酪蛋白、玉米浆、氨基酸、硝酸盐、尿素、铵盐等。可以用作无机物质的有硫酸镁、硫酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等。
发酵过程可以在pH 5-8、优选在约6-8进行，随后产生2-酮-L-古洛糖酸的相应盐类，优选为钠盐。
使微生物生长至发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠至少达到50g/L。
本发明的方法描述了一种发酵方法，其中微生物是在泡罩塔或空气提升式反应器中生长。
通过HPLC(H+-柱)分析2-酮-L-古洛糖酸的形成。
除去发酵液中的微生物，以得到无微生物的发酵液，该分离步骤可通过过滤法，优选微量过滤法进行。
此外，所说的方法其特征在于：在步骤h)中，纯化的发酵液含有的蛋白不超过1800ppm(测定干物质中的氮)，以及pH调节为高于1.5，而2-酮-L-古洛糖酸的回收率为85％或更高。
具体地说，可用阳离子交换树脂进行处理，使纯化的发酵液的pH不低于1.5。将微生物减少的、或无微生物的发酵液加入阳离子交换树脂中，直至纯化的发酵液的pH保持在1.5以上；或继续进行处理至pH降至1.5以下，然后在纯化的发酵液中加入碱使pH提高至1.5以上。所加的碱可以是任何一种碱金属的氢氧化物、碱金属碳酸盐或碳酸氢盐、和/或碱土金属碳酸盐或碳酸氢盐，优选氢氧化钠或氢氧化钾。
在另外一种方法中，通过在纯化的发酵液中加入减少微生物或无微生物的发酵液原料，使纯化的发酵液的pH调节至1.5以上。为了避免‘外源材料’的加入，该原料(＝未纯化的无微生物发酵液)的加入量最高为纯化的发酵液总体积的10％，以将最终pH调节至1.5以上。
通过调节纯化的发酵液的pH，在蒸发纯化的发酵液中的水期间，与不调节pH的方法相比，完全避免了维生素C的形成，或形成维生素C的趋向减少了至少40％。
维生素C的浓度不高于3％，优选不高于2.5％，最优选不高于1％(按干物质计)。
降低纯化的发酵液中的残留蛋白浓度至2400ppm以下，优选2000ppm以下，更优选1800ppm以下可用下述方法实现：用阳离子交换树脂对发酵液进行纯化，使树脂的容量由结合的氮量所控制，而在较小程度上由结合的钠离子控制。这种方法保证了只有在洗去糖分之后，氮的突然增加才开始。所有结合在柱上的氮都集中在柱上很窄的带内，纯化的发酵液中的残留蛋白量在2400ppm以下(用MitsubishiTN-05分析仪测定干物质中的总氮)。用结合的钠离子控制阳离子交换树脂的容量会增加纯化的发酵液的体积，但从残留蛋白方面考虑，纯度会降低。因此，后一种方法造成2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶的回收率降低。
应用本发明的处理方法可以获得高回收率的2-酮-L-古洛糖酸，其回收率高于80％，优选至少高于85％。
本发明还涉及用于生产2-酮-L-古洛糖酸的氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合培养物，其中氧化葡糖酸杆菌优选2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌SCB
329，苏云金芽孢杆菌优选2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV 393。
此外，在所说的混合微生物培养物生长初期，氧化葡糖酸杆菌菌落与苏云金芽孢杆菌菌落存在的比率为25∶1。
本发明涉及用于生产2-酮-L-古洛糖酸的2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌SCB 329。
本发明还涉及用于生产2-酮-L-古洛糖酸的2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV 393。
本发明进一步涉及2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的微生物氧化葡糖酸杆菌SCB 329和2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的微生物苏云金芽孢杆菌(SCB933)TCV 393在生产2-酮-L-古洛糖酸中的用途。
最后，本发明涉及所述微生物用于混合培养物中生产2-酮-L-古洛糖酸的用途。
本发明有以下优点：
-即使在缺乏钙离子的条件下进行发酵，也能获得高回收率的2-
酮-L-古洛糖酸，因而是无石膏的工艺过程；
-通过微量过滤将微生物完全除去；
-通过单一的阳离子交换树脂处理，使2-酮-L-古洛糖酸钠完全转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去残留的蛋白和/或调节纯化的发酵液的pH，以避免随后形成维生素C，从而可达到高的回收率；
-由于不必用阴离子交换剂处理，简化了离子交换处理过程；
-所说的纯化的发酵液达到的纯度使2-酮-L-古洛糖酸一水合物可直接从含水介质中结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率高达80％或更高；
-该工艺过程完全不使用任何有机溶剂；
-2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶的纯度至少为99.5％；
-2-酮-L-古洛糖酸一水合物可以直接用来转化为维生素C。
本发明通过以下的实施例来说明。
实施例1描述了D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的发酵。
实施例2描述了发酵的第二部分，即L-山梨糖转化为2-酮-L-古洛糖酸钠。
实施例3描述了阳离子交换树脂处理，其中残留蛋白的含量降至2400ppm氮以下(用Mitsubishi TN-05分析仪测定)，然后直接结晶。
实施例4描述了阳离子交换树脂处理和通过加入无微生物的发酵液原料，将pH调至1.5以上，以避免维生素C的形成。
实施例5描述了通过加入NaOH调节pH。
实施例6和7为比较例，分别说明了残留蛋白含量在2400ppm以上时，回收率较低，以及洗脱剂的pH未调节时，会形成维生素C。
实施例
实施例1-D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的发酵
氧化葡糖酸杆菌NRRL B72在含有75ml培养基的Roux烧瓶中，在28℃下培养2天，该培养基由下列成份组成：50g/L D-山梨糖醇(Cerestar C☆16122)、3.75g/L(ds(干物质))玉米浆、0.45g/L(NH4)2SO4、0.11g/L(NH4)2HPO4、0.08g/L MgSO4.7H2O、1.0g/L醋酸钙一水合物和20g/L琼脂，灭菌前用浓醋酸将pH调至5.0。
将细胞回收到50ml 0.9％的NaCl溶液内，并接种于含有1.35L培养基的2L发酵罐中，该培养基包含100g/L D-山梨糖醇(Cerestar C☆16122)、3.75g/L(ds)玉米浆、0.45g/L(NH4)2SO4、0.11g/L的(NH4)2HPO4、0.08g/L MgSO4.7H2O、1.0g/L醋酸钙一水合物和100ppm消泡剂。
在32℃、1.0VVM(通气量)和700RPM下培养24小时后，取300ml培养物接种于含有13.7L培养基的20L发酵罐中，该培养基由下列成份组成：230g/L D-山梨糖醇(Cerestar C☆16122)、5.25g/L(ds)玉米浆、0.45g/L(NH4)2SO4、0.11g/L(NH4)2HPO4、0.08g/L MgSO4.7H2O、1.0g/L醋酸钙一水合物和100ppm消泡剂，灭菌后，用40％(W/V)的氢氧化钠将pH调至5.0-5.2。在35℃和0.5VVM下继续进行发酵，直至起始的山梨糖醇完全耗尽。通过改变RPM将pO2控制在50％(在最大转化期间，pO2下降至50％以下)。
转化起始的山梨糖醇需要21小时，收率为96％(重量)。在山梨糖醇转化为L-山梨糖结束后，进行巴氏灭菌，使生物物质失活(60℃，2小时)。
实施例2-L-山梨糖转化为2-酮-L-古洛糖酸钠的发酵
2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌SCB 329在含有75ml培养基的Roux烧瓶中培养，培养基由下列成份组成：10.0g/L结晶L-山梨糖、2.0g/L结晶葡萄糖、5.0g/L酵母提取物、5.0g/L大米胨、0.5g/L KH2PO4、0.2g/L MgSO4.7H2O、20g/LMOPS(3-N-吗啉代丙磺酸)和20g/L琼脂，灭菌前将培养基的pH值调至7.5。在28℃培养24小时后，将2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌(SCB 933)TCV 393沿纵向穿刺2次，接种入同一个烧瓶中，在28℃继续培养24小时。
得到的氧化葡糖酸杆菌与苏云金芽孢杆菌的比率为25∶1。
将氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌回收到50mlNaCl溶液中，并接种于含0.7L培养基的挡板烧瓶内，该培养基由下列成份组成：15.0g/L结晶L-山梨糖、2.0g/L葡萄糖、1.5g/L(ds)玉米浆、5.0g/L酵母提取物、5.0g/L大米胨、4.0g/L尿素、5.0g/L KH2PO4、0.2g/LMgSO4.7H2O和4.0g/L碳酸钙。L-山梨糖和葡萄糖分别灭菌。蛋白和盐混合物的pH在灭菌前进行调节，使其灭菌后的pH为6.8。上述种子培养物(1)在28℃、150RPM的横向振摇下培养24小时。
将28ml种子培养物1转入含1.4L培养基的2L发酵罐中，该培养基与上述培养基相同，并添加0.3g/L硅基消泡剂。发酵罐在28℃、0.7VVM和850RPM下发酵14小时，得到种子培养物2。
将140ml的该种子培养物2接种于含1.26L培养基的第二个2L发酵罐中，该培养基由下列成份组成：30g/L L-山梨糖醇、2.0g/L葡萄糖、14.0g/L(ds)玉米浆、5.0g/L酵母提取物、0.5g/L KH2PO4、0.1g/LMgSO4.7H2O、0.2g/L硅基消泡剂，pH6.8(灭菌后加入氢氧化钠调节)。该种子培养物3在28℃、0.7VVM和850RPM下培养14小时。通过加入氢氧化钠，使pH保持在6.8。
培养14小时后，将84ml种子培养物3转入含1.316ml培养基的2L发酵罐中，除了酵母提取物的浓度增加至10.0g/L以外，该培养基与种子培养物3所用的培养基相同。培养参数也与种子培养物3的相同，得到种子培养物4。
0.7L种子培养物4接种于含有10.5L培养基的20L生产发酵罐中，该培养基由下列成份组成：890g巴氐灭菌的山梨糖(由实施例1所得)、168g(ds)玉米浆、3.1g酵母提取物、7.0g KH2PO4、1.4gMgSO4.7H2O、4.2g硅基消泡剂。L-山梨糖用无菌方式加入无菌的蛋白和盐的混合物中。接种前将培养基的pH值调节至7.0。通气量保持在0.5VVM，通过改变RPM将pO2控制在40％。通过加入氢氧化钠，使pH保持在7.0。用10％的硅基消泡剂溶液控制泡沫的形成。发酵12小时后，通过无菌方式加入580g巴氏灭菌的L-山梨糖。使残留的L-山梨糖浓度达到低于1g/L需要36小时，得到96％(重量收率)的2-酮-L-古洛糖酸。
实施例3-用阳离子交换树脂纯化-结晶
1)阳离子交换处理
41.2kg d.s.为12.4％的无微生物发酵液(＝微量过滤的滤液)通过含有17L强阳离子交换树脂(
Figure C0282042500161
S 2528)的柱，得到50.3kg d.s.为8.8％的纯化的无微生物发酵液。
在Mitsubishi TN-05分析仪上分析该溶液的氮含量。
所得的结果示于表1中。
表1
  滤液   纯化的滤液
  d.s.(％)   12.4   8.8
  比重(kg/l)   1.066   1.042
  KGA(％按ds)   82.5   82.5
  N ppm按ds   4100   1800
  pH   5.7   1.5
2)结晶
39.1kg纯化的无微生物发酵液在减压下浓缩至浓度62.5％d.s.。
将5.5kg上述浓缩液转移至间歇式冷却结晶器中。冷却程序如下：
在1小时内由60℃冷却至50℃，随后在3小时内，由50℃冷却至25℃。
在冷却周期的终点，将糖膏定量转移至在1750g力下进行操作的间歇式实验室离心机中，回收得到1702g 2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，纯度为99.2％，总含水量为10％。
将剩下纯度为68％的母液浓缩至71％d.s.。
将2665g浓缩液转移至冷却结晶器中，然后按第一次结晶同样的温度分布进行结晶。
将糖膏离心后再产生990g结晶，纯度为98.9％，含水量为11％。
2-酮-L-古洛糖酸的总回收率为85％。
实施例4-通过加入无微生物的发酵液原料调节pH
47kg维生素C含量为0.54％(按d.s.计)的微量过滤滤液(pH＝1.5，d.s.＝8％)与5L无微生物的发酵液(pH＝5.3，d.s.＝11.2％，维生素C＝0.44％，按d.s.计)原料(未纯化)混合。所得混合物的pH为1.83；维生素含量为0.53％(按d.s.计)，总干物质为8.7％。
将此混合物在20L的小真空锅中浓缩至重量为6.3kg、干物质含量为60.8％的最终体积。浓缩期间液体的温度在50℃左右，到接近结束时，升高至60℃-65℃。
在浓缩步骤的终点，维生素C的终浓度为0.97％(按干物质计)。
将上述浓缩液转移至冷却结晶器中，按下述温度分布进行操作：在60℃的温度下保持3小时，在2小时内由60℃冷却至45℃，然后在12小时内由45℃冷却至10℃。
在结晶周期的终点，浓缩的纯化无微生物发酵液中的维生素C含量按干物质计为2.37％。
实施例5-通过加入NaOH调节pH
在31900g微量过滤滤液(pH＝1.27，ds＝12.8％)中，加入150g 31％的NaOH溶液，pH提高至1.35。然后在旋转蒸发器中，真空下浓缩至7000g，ds为60％。在蒸发期间液体的温度在50℃左右，到接近结束时，升高至60℃-65℃。蒸发结束时的维生素C含量按ds计为2.6％。
将上述溶液转移至加入1g晶种的冷却结晶器中，并按下述进行操作：在60℃下保持3小时以上，以降低过饱和程度，在2小时内，由60℃冷却至45℃，然后在12小时内由45℃冷却至10℃。
所得的糖膏进行离心，得到1950g 2-酮-L-古洛糖酸结晶，含水量为10.5％，纯度为99.8％。
剩余的母液按以上所述连续进行二次浓缩和结晶的步骤，分别得到610g含水量为9.9％、纯度为99.3％和477g含水量为10.7％、纯度为96.5％的2-酮-L-古洛糖酸。
这样，总回收率为85.3％。
实施例6(比较例)-阳离子交换树脂-结晶
1)阳离子交换处理-氮含量不低于2400ppm(按ds计)
使47.8kg微量过滤滤液(＝2.7倍床体积)通过17L强阳离子交换树脂(S2528)，得到57.7kg ds为8.9％的纯化的无微生物发酵液，其氮含量按d.s.计为2400ppm(用Mitsubishi TN-05分析仪测定)。
所得的结果示于表2。
表2
  滤液   纯化后
  d.s.(％)   12.4   8.9
  比重(kg/l)   1.066   1.042
  KGA％   82.5   82.5
  N ppm，按ds计   4100   2400
  pH   5.7   1.5
2)结晶
将39.1g纯化的无微生物发酵液在减压下浓缩至ds为62.5％。
将5.5kg上述的浓缩液转移至间歇式冷却结晶器中。采用以下冷却程序：在1小时内，由60℃冷却至50℃，然后在3小时内，由50℃冷却至25℃。
在冷却周期的终点，将糖膏定量转移至1750g力下操作的间歇式实验室离心机中，回收到1690g 2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，纯度为99.2％，
总含水量为10％。
将纯度为67.5％的剩余母液浓缩至ds为71％。
将2700g浓缩液转移至冷却结晶器中，然后按第一次结晶同样的温度分布进行结晶。
由于蛋白含量较高，使悬浮物的粘度增加，从而造成在糖膏离心时，母液难以与结晶分离。因此，为了能够回收结晶，必须将悬浮物稀释。
稀释的糖膏离心后得到820g结晶，其纯度为98.9％，含水量为11％。
2-酮-L-古洛糖酸的总回收率为79％。
实施例7-不调节pH
维生素C含量按ds计为1.68％的31900g微量过滤滤液(pH＝1.27，d s＝12.8％)在旋转蒸发器中，在真空下浓缩至7000g，ds为57.5％。蒸发期间的液体温度为50℃左右，到接近结束时，升高至60℃-65℃。蒸发结束后，维生素C的含量按ds计为3.1％。将上述液体转移至加入1g晶种的冷却结晶器中，并按下述进行操作：在60℃下保持3小时，降低过饱和程度，在2小时内，由60℃冷却至45℃，然后在12小时内由45℃冷却至10℃。
将糖膏离心，并分析母液的维生素C含量，按ds计，该含量为5.9％。回收得到1740g 2-酮-L-古洛糖酸结晶，其含水量为10.6％，
纯度为99.8％。
剩余的母液按以上所述连续再进行二次浓缩和结晶的步骤，得到的结晶物分别是714g含水量为9.8％、纯度为99.3％和355g含水量为10％、纯度为97.7％的结晶。
结果，总回收率为79％。最终母液的维生素C含量按ds计为14％。
比利时微生物协调保藏中心-BCCM/LMG-中心
BCCM/LMG/BP/4/表格的第1页01-89原始保藏收据
                                                 
布达佩斯条约用于专利程序的微生物国际保藏单位
按照7.1条规定由国际保藏单位BCCM/LMG颁发的对下一页底认定物的原始保藏收据
国际表格BCCM/LMG/BP/4/
Figure C0282042500211
                                            
至：保藏人名称：CERESTAR HOLDING B.V.
地址：Nijverheidsstraat 1
      NL-4551LA Sas van Gent
      Nederland
I.微生物的认定：
申请人所给出的分类参考：
  Gluconobacter oxydans SCB 329
I.2国际保藏单位所给出的保藏号：
  LMG P-20356
比利时微生物协调保藏中心-BCCM/LMG-中心
BCCM/LMG/BP/4/表格的第2页01-89原始保藏收据
                                                     
II.科学描述和/或建议的分类命名
上述I中的认定的微生物伴有：
(在所用的方块中划X)：
Figure C0282042500221
科学描述
Figure C0282042500222
建议的分类命名
III.收据和接受
本国际保藏单位接受上述I项中所认定的微生物，其由该单位在
(原始保藏日)收到：
2001年4月24日
IV.国际保藏单位
比利时微生物协调保藏中心(BCCM)
Laboratorlum voor Mlcrohlologle-Bacterlēnverzamellng(LMG)
Unlversltelt Gent
K.L.Ledeganckstraat 35
B-9000 Gent，Belglum
有权代表国际保藏单位者或者受权官员签字：
Dr.D.Janssens ，curator IDA
日期：2001年5月21日
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BCCM/LMG/BP/9/表格的第1页01-89存活证明
                                                      
布达佩斯条约用于专利程序的微生物国际保藏单位
VI按照10.2条规定由国际保藏单位BCCM/LMG颁发的如下认定物的存活证明
国际表格BCCM/LMG/BP/9/
                                      
至：存活证明颁发方：
名称：JC de Troostembergh
地址：CERESTAR France
      Havenstraat 84
      B-1800 Vilvoorde
I.保藏人：
I.1名称：CERESTARHOLDING B.V.
I.2地址：Nijverheidsstraat1
         NL-4551LA Sas van Gent
II.微生物的认定：
II.1国际保藏单位所给出的保藏号：
  LMG p-20356
II.2原始保藏日(或进行了新的保藏或转移，其中最近的日期)：
2001年4月24日
III.存活证明
II中所认定微生物存活于下列日期进行了试验：
2001年5月2日
(根据10.2(a)(ii)和(iii)，所给出的日期以最近的存活试验为准)
在上述日期，所述微生物为：(在所用方块中划X)
Figure C0282042500232
存活
□不再存活
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BCCM/LMG/BP/9/表格的第2页01-89存活证明
                                                           
IV.进行存活试验的条件：
(如果该信息被要求填写或如果试验结果为负面的，请填写)
Figure C0282042500241
V.国际保藏单位
比利时微生物协调保藏中心(BCCM)
Laboratorlum Voor Mlcroblologle-Bacterlēnverzamellng(LMG)
Unlversltelt Gent
K.L.Ledeganckstraat 35
B-9000 Gent，Belglum
有权代表国际保藏单位者或者受权官员签字：
Figure C0282042500242
Dr.D.Janssens，curator IDA
日期：2001年5月21日
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BCCM/LMG/BP/4/表格的第1页01-88原始保藏收据
                                                         
布达佩斯条约用于专利程序的微生物国际保藏单位
按照7.1条规定由国际保藏单位BCCM/LMG颁发的对下一页底认定物的原始保藏收据
国际表格BCCM/LMG/BP/4/
Figure C0282042500251
                                         
至：保藏人名称：：CERESTAR HOLDING B.V.
地址：：Nijverheidsstraat 1
        NL-4551LA Sasvan Gent
        Nederland
I.微生物的认定：
申请人所给出的分类参考：
  Bacillus thuringiensis(SCB 933)TCV 393
I.2国际保藏单位所给出的保藏号：
  LMG P-20355
比利时微生物协调保藏中心-BCCM/LMG-中心
BCCM/LMG/BP/4/表格的第2页01-88原始保藏收据
                                                   
II.科学描述和/或建议的分类命名
上述I中的认定的微生物伴有：
(在所用的方块中划X)：
Figure C0282042500261
科学描述
Figure C0282042500262
建议的分类命名
III.收据和接受
本国际保藏单位接受上述I项中所认定的微生物，其由该单位在
(原始保藏日)收到：
2001年4月24日
IV.国际保藏单位
比利时微生物协调保藏中心(BCCM)
Laboratorlum voor Mlcroblologle-Bacterlēnverzamellng(LMG)
Unlversltelt Gent
K.L.Ledeganckstraat 35
B-9000 Gent，Belglum
有权代表国际保藏单位者或者受权官员签字：
Figure C0282042500263
Dr.D.Janssens，curator IDA
日期：2001年5月21日
比利时微生物协调保藏中心-BCCM/LMG-中心
BCCM/LMG/BP/9/表格的第1页01-88存活证明
                                                     
布达佩斯条约用于专利程序的微生物国际保藏单位
按照10.2条规定由国际保藏单位BCCM/LMG颁发的如下认定物的存活证明
国际表格BCCM/LMG/BP/9/
                                    
至：存活证明颁发方：
名称：：JC de Troostembergh
地址：：CERESTAR France
        Havenstraat 84
        B-1800Vilvoorde
I.保藏人：
I.1名称：：CERESTAR HOLDING B.V.
I.2地址：：Nijverheidsstraat 1
           NL-4551LA Sas van Gent
II.微生物的认定：
II.1国际保藏单位所给出的保藏号：
  LMG p-20355
II.2原始保藏日(或进行了新的保藏物或转移，其中最近的日期)：
2001年4月24日
III.存活证明
II中所认定微生物于下列日期进行了存活试验：
2001年5月2日
(根据10.2(a)(ii)和(iii)，所给出的日期以最近的存活试验为准)
在上述日期，所述微生物为：(在所用方块中划X)
存活
□不再存活
比利时微生物协调保藏中心-BCCM/LMG-中心
BCCM/LMG/BP/9/表格的第2页01-88存活证明
                                                         
IV.进行存活试验的条件：
(如果该信息被要求填写或如果试验结果为负面的，请填写)
Figure C0282042500281
V.国际保藏单位
比利时微生物协调保藏中心(BCCM)
Laboratorlum voor Mlcroblologle-Bacterlēnverzamellng(LMG)
Unlversltelt Gent
K.L.Ledeganckstraat 35
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Dr.D.Janssens，curator IDA
日期：2001年5月21日

Claims (15)

1.一种通过发酵生产2-酮-L-古洛糖酸钠和回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶的方法，该方法包括以下步骤：
a)在微生物存在下，在发酵培养基中将山梨糖醇发酵，以把山梨糖醇转化为至少50g/L的2-酮-L-古洛糖酸钠；
b)除去发酵培养基中的微生物，由此得到减少了微生物的发酵液；
c)使减少了微生物的发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去蛋白，使蛋白浓度为2400ppm以下，以测定干物质中的氮而计，以获得纯化的发酵液，并且将纯化的发酵液的pH调节至1.5以上，以便在随后使水蒸发的期间，避免形成浓度高于3％的维生素C，按干物质计；
d)使纯化的发酵液中的水蒸发，得到浓缩的纯化发酵液，
以及
e)使浓缩的纯化发酵液结晶，回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为80％或更高。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所说方法的步骤c)中，通过用阳离子交换树脂的离子交换处理来实现转化为2-酮-L-古洛糖酸和除去蛋白。
3.一种通过发酵生产2-酮-L-古洛糖酸钠和回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶的方法，该方法包括以下步骤：
a)制备含有氮源和以山梨糖醇作为碳源的发酵培养基；
b)将微生物接种于发酵培养基，以转化山梨糖醇为L-山梨糖；
c)使微生物生长至发酵培养基中L-山梨糖至少达到100g/L；
d)终止山梨糖醇向L-山梨糖的转化；
e)将微生物接种于发酵培养基，以转化L-山梨糖为2-酮-L-古洛糖酸钠；
f)使微生物生长至发酵培养基中的2-酮-L-古洛糖酸钠至少达到50g/L；
g)过滤除去发酵培养基中的微生物，由此得到减少了微生物的发酵液；
h)用阳离子交换树脂将减少了微生物的发酵液中的2-酮-L-古洛糖酸钠转化为2-酮-L-古洛糖酸，并除去蛋白，使蛋白浓度在2000ppm以下，以测定干物质中的氮而计，以获得纯化的发酵液，并且将纯化的发酵液的pH调节至1.5以上，以便在随后使水蒸发的期间，避免形成浓度高于2.5％的维生素C，按干物质计；
i)使纯化的发酵液中的水蒸发，以获得浓缩的纯化发酵液，
以及
j)从浓缩的纯化发酵液中结晶，回收2-酮-L-古洛糖酸一水合物结晶，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为80％或更高。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤g)中的过滤是微量过滤，在步骤h)中所说的纯化的发酵液中含有的蛋白不超过1800ppm，以测定干物质中的氮而计，调节后的pH高于1.5，以及在步骤j)中，2-酮-L-古洛糖酸的回收率为85％或更高。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤e)中的微生物是氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合培养物，并且在所说的混合培养物中，在生长初期微生物氧化葡糖酸杆菌菌落与苏云金芽孢杆菌菌落存在的比率是300∶1-1∶10。
6.用于生产2-酮-L-古洛糖酸的氧化葡糖酸杆菌和苏云金芽孢杆菌的混合培养物，其中在所述混合培养物中，在生长初期微生物氧化葡糖酸杆菌与苏云金芽孢杆菌菌落存在的比率是25∶1。
7.用于生产2-酮-L-古洛糖酸的2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌。
8.用于生产2-酮-L-古洛糖酸的2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌。
9.由2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMGP-20356的微生物氧化葡糖酸杆菌和2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的微生物苏云金芽孢杆菌来生产2-酮-L-古洛糖酸的方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所说的微生物以混合培养物的方式应用。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中，所述发酵液是无微生物的发酵液。
12.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤g)中，所述发酵液是无微生物的发酵液。
13.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤h)中，维生素C的浓度不高于1％，按干物质计。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述氧化葡糖酸杆菌包括2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20356的氧化葡糖酸杆菌，并且所述苏云金芽孢杆菌包括2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌。
15.根据权利要求6所述的混合培养物，其中所述氧化葡糖酸杆菌包括2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMGP-20356的氧化葡糖酸杆菌，并且所述苏云金芽孢杆菌包括2001年4月24日保藏在BCCM/LMG、保藏号为LMG P-20355的苏云金芽孢杆菌。
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