JP3976832B2 - ２−ケト−ｌ−グロン酸の単離方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水性発酵溶液に溶解している２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩の一水和物を、発酵溶液から結晶化し、次に塩をアルコール媒質中強酸と反応させることによって２−ケト−Ｌ−グロン酸をプロトン化することによって、水性発酵溶液に溶解している２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を遊離酸のアルコール溶液に変換する新規方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
知られているように、２−ケト−Ｌ−グロン酸（ＫＧＡ）は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）製造のための重要な出発物質である。ＫＧＡの製造のための発酵法では、発酵に好ましい条件を維持するために、代謝産物として得られるＫＧＡを、塩基（例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウム）を加えることによって中和する。発酵生成物は、水性の、バイオマスを含有する発酵溶液であり、ここではＫＧＡ塩、つまり２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム又はカルシウム〔それぞれ、ＮａＫＧＡ又はＣａ（ＫＧＡ)2〕が、溶解した形で存在している。
【０００３】
アスコルビン酸又はアルコルビン酸塩の工業的製造のためには、発酵により生産されたＫＧＡを、有機溶媒に移さなければならない。溶媒としては、低級アルカノールが好都合に使用される。このアルコールをＫＧＡによりエステル化し、次に塩基を加えることによって、アスコルビン酸塩が、高収率で得られる。この替わりに、強酸性条件下で、有機溶媒中、ＫＧＡをアスコルビン酸に変換することもできる。しかし、収率は、概してやや低い〔Helv. Chim. Acta 17, 311-328 (1934) を参照〕。
【０００４】
発酵溶液を処理する方法はいずれも、以下の３工程に基づく：
１．存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム又はカルシウムを、プロトン化して遊離酸とし（例えば、ＮａＫＧＡ＋Ｈ+ →ＫＧＡ＋Ｎａ+)；
２．水を除去し；
３．発酵溶液中に存在するバイオマス、溶解しているタンパク質、そしてその他の汚染物質を除去する。
【０００５】
工程を行う順序、そしてその特異的性能は、それぞれの方法に特徴的である。
【０００６】
プロトン化（工程１）は、酸を添加することによって、水性発酵溶液中で行うことができる。米国特許（ＵＳＰ）３３８１０２７号及びヨーロッパ特許公開（ＥＰ）３５９６４５号によると、Ｃａ（ＫＧＡ)2に硫酸を加え、沈殿したカルシウム塩を分離することによって、溶解したＫＧＡを得る。プロトン化は、カチオン交換樹脂を用いることによっても、行うことができる。ＥＰ３５９６４５号によると、水性のＣａ（ＫＧＡ)2含有発酵溶液に、カチオン交換体を通過させ、カルシウムイオンを完全に除去する。カチオン交換体を使用する場合、カチオン交換体を十分長く使用することができるように、例えば微細濾過によって、バイオマスをあらかじめ完全に除去しておかなければならない（工程３）。
【０００７】
プロトン化生成物は、そのｐＨ値が２．０よりも有意に低い、水性のＫＧＡ含有溶液である（ＫＧＡのｐＫs 値は、２．５４である）。次に、ＫＧＡを、結晶化、抽出（例えば、ＥＰ３５９０４２号により）、又は吸着（例えば、中国特許公開１０９７７３１Ａ：Chem. Abs. 124, 56570 を参照）により単離し、それによって水から分離する（工程２）。ＫＧＡを高収率で結晶化することは困難である。その溶解性が非常に高いからである（例えば、３０℃で４８０g/l)。抽出と吸着は、発酵に由来する汚染物質が存在する場合は特に工業的に困難な工程である。したがって、ＥＰ３５９０４２号によると、抽出前に、バイオマスを完全に除去しなければならない。
【０００８】
ＥＰ４０３９９３号によると、単離したが精製してはいないＫＧＡを、アスコルビン酸ナトリウムの製造に使用することができる。バイオマス及びタンパク質などの汚染物質は、以降の工程において、重炭酸ナトリウム又は重炭酸カリウムを加えて、非エステル化ＫＧＡを沈殿させることによって、除去する。
【０００９】
これまで知られている方法のいずれにおいても、ＫＧＡのプロトン化を最初に行い、次に水を除去する。しかし、逆に行う、つまり最初に発酵溶液からＮａＫＧＡ又はＣａ（ＫＧＡ)2を単離して水を除去し（工程２）、更にプロトン化を行う（工程１）のも原則として可能である。したがって、２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物（ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ）の結晶化は、特開昭５２−６６６８４号及び特開昭５３−６２８９４号公報により公知であり、溶解性（例えば、３０℃で２５０g/l)から考慮すると、ＫＧＡ・Ｈ2 Ｏの結晶化におけるよりも有意に高い収率が予想される。更に、両方の物質とも、一水和物として結晶化するが、これは通常考慮しない。この操作過程、つまり工程１の前に工程２を行うことについては、ＮａＫＧＡが、ほとんど溶解性を有さないため、有機溶媒中でＮａＫＧＡを完全にプロトン化することは困難である。
【００１０】
しかし、有機溶媒中でＮａＫＧＡをプロトン化する試みは、多少は報告されている。
【００１１】
ＥＰ９１１３４号によると、結晶性ＮａＫＧＡは、エタノールとアセトン混合物中、ガス状塩化水素を使用することによって、ＫＧＡに変換することができる。同様に生成する塩化ナトリウムを分離する。反応の以降の過程では、結晶性アスコルビン酸への転位が、強酸性反応条件下では速やかに起こり、望ましくない副生成物が得られるため、収率は、６０〜８２％と低い。
【００１２】
ＵＳＰ５３９１７７０号によると、メタノール中、ＮａＫＧＡを、４０％以上過剰量の濃硫酸と反応させることができる（実施例１０）。メチルエステルへのエステル化を含む反応時間は、６５℃で４．５時間にも達し、収率は、９１．９％である。その後、ｐＨを４まで上昇させ、硫酸ナトリウムを分離する。ＥＰ４０３９９３号によると、反応時間が長く、大量の過剰量の酸を使用するため、かなりの量の分解生成物が生じることが予想される。
【００１３】
ＥＰ４０３９９３号には、ＫＧＡ５０％及びＮａＫＧＡ５０％の混合物を、メタノール中、約５０％過剰量の硫酸と反応させることが開示されている（実施例５）。還流条件下、１時間の反応時間の後に、混合物を濾過する。得られる硫酸ナトリウムの収率は、理論値の約６０％に相当する。したがって、最大５０％ものＫＧＡを、ナトリウム塩の形で使用することができる。基本的には、この方法は、ＫＧＡの用途を提供するものであり、ＮａＫＧＡは、以降の工程で再使用することができる。
【００１４】
後者の二つの方法においては、大量に過剰量の硫酸を使用することと、強酸性条件下での反応時間が長いことが短所である。化学量論的量の硫酸を、したがって緩やかな条件下で加える場合、通常は、かなりの割合のＮａＫＧＡが、生じる硫酸ナトリウムに含まれたままで残るため、収率が低下する。
【００１５】
ＵＳＰ５３９１７７０号によると、アスコルビン酸のナトリウム塩（ＮａＡＳＣ）もまた、メタノール中、硫酸を加えることによって、プロトン化してアスコルビン酸とすることができる。この場合、ＮａＫＧＡは、不純物として、９％ほどまで存在する。溶媒であるメタノール中、アルコルビン酸の収率は、９１％と９６％の間である（実施例１２、１４及び１５）。一方、メタノール７５％と水２５％の溶媒混合物中では、アスコルビン酸の収率は、９９％である（実施例２）。明らかに、純粋な溶媒における方が、溶媒混合物におけるよりも、その収率はかなり低い。含水量が１５〜２５％であるのが好ましいのが示されているからである。これは、純粋な溶媒と比較すると、溶媒混合物中におけるＮａＡＳＣの溶解度が高い（例えば、溶媒混合物中では、４０℃で約２重量％、純粋な溶媒中では、約０．３重量％である）ためである。
【００１６】
溶解度が低い場合、物質の移送が妨げられ、溶解しにくい塩と硫酸との反応により、非常に溶解しにくい硫酸ナトリウム（メタノール中、溶解度は、０．０２４重量％）が生じることも、同様に収率が低い結果を招く。物質移送の問題は、ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏが関与する反応の場合にもかなり生じると予想される。その溶解度は、アスコルビン酸ナトリウムのそれよりもかなり低いからである（４０℃でメタノール中、＜０．０１重量％、９０％メタノール／１０％水中で＜０．１重量％）。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、最も単純かつ可能な方法で、水性の、非精製発酵ブロスに存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、アルコール溶液中の遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸に高収率、高純度で変換することを可能とする方法を提供するものである。同時に、従来の技術が有する短所、特にバイオマス、タンパク質などを、例えば微少濾過によって完全に除去し、カチオン交換体を用いて、水性発酵溶液から金属イオンを除去し、更に２−ケト−Ｌ−グロン酸を結晶化又は乾燥することを避けることができる。更に、容易に入手できる化学物質のみを使用し、工程数もできるだけ減らすことができる。
【００１８】
本発明の範囲において、上記の要件を満たし、２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩をバイオマスのあまり除去されていない発酵溶液から結晶化し、得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液に変換する方法を今や発見した。２−ケト−Ｌ−グロン酸のプロトン化、及び金属イオンの除去は、この場合では、アルコール媒質中での反応によってのみ行う。アルコール媒質に懸濁した２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物（ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ）を、低含水量の酸と収率良く反応させて、溶解した遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸（ＫＧＡ）と不溶性の塩を得るための特定の反応条件を今や発見した。この方法により初めて、水性発酵溶液からのＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏの結晶化が実施可能となったのである。発酵溶液にカチオン交換体を通過させたり、ＫＧＡを結晶化又は乾燥するなどの、従来の方法では必要であった必須工程が、これによって避けることができる。本発明による方法の結果、ＫＧＡが、アルコール溶液中に存在し、どのような方法によってもＫＧＡを高収率で直接エステル化し、アスコルビン酸に変換することができる。したがって、一連の方法工程は、本発明による方法を特徴とする。つまり、最初にＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを発酵ブロスから結晶化し、結晶水以外の水を完全に除去（工程２、上記を参照）し、そして強酸（低含水量）、例えば硫酸を添加することによって、溶媒である低級アルカノール中で、プロトン化（工程１）を完全に行う。溶解しにくい酸の塩、例えば硫酸ナトリウムが生じるが、これは速やかに除去することができる。所望のＫＧＡ溶液が残留し、上述したように、これを直接エステル化し、アスコルビン酸に変換することができる。使用するＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ及び生成物（例えば、硫酸ナトリウム）の溶解性が非常に低いにもかかわらず、９７％を超える収率が得られる、プロトン化のための特殊な反応条件もまた、特徴的である。この点から、物質としてのＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏに関する、特異的で従来知られていなかった特性を、以下に詳細に説明するように、利用している。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、水性発酵溶液中に存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、遊離酸のアルコール溶液に変換し、所望であれば、該酸のアルキルエステルに変換する方法であって、
ａ）水性発酵溶液から、蒸発、冷却又は置換を含む結晶化（以降、「蒸発、冷却又は置換による結晶化」と称する）によって２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を回収し、所望であればこのようにして得られた結晶化物を粉砕することによって粉状にし、
ｂ１）工程ａ）で得られた、場合により粉砕された２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を、低級アルコールに懸濁し、結晶を膨潤させ、次に低含水量の酸を加えて、ｐＨ測定値を１．５以上とするか、又は
ｂ２）工程ａ）で得られた、場合により粉砕された２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を、ほぼ化学量論的量の低含水量の酸と共に、湿潤粉砕システム（wet grinding system)を用いて、低級アルコールに加えて、ｐＨ測定値を１．５以上とするか、又は
ｂ３）生成物流（product stream）の再使用を含む工程ｂ１）及びｂ２）の組み合わせを行い、
ｃ）工程ｂ１）、ｂ２）又はｂ３）で形成された、加えた酸との塩を分離して、２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液を得、そして所望であれば、
ｄ）２−ケト−Ｌ−グロン酸をアルコールでエステル化するために、工程ｃ）で得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液を、触媒量の酸又は酸性カチオン交換体で処理して、対応する２−ケト−Ｌ−グロン酸の低級アルキルエステルを得ることを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明による方法を実施する前に行う発酵により、バイオマスを含有する不透明な発酵ブロスを得る。発酵ブロス中に存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩の結晶化〔工程ａ）〕は、原則として、このブロスから直接行うことができる；しかし、遠心分離によりバイオマスの少なくとも９０％をあらかじめ分離しておくのが好都合であることが認められている。この場合には、不透明であるが、スラッジを含まない発酵溶液が得られる。しかし、結晶化の前にバイオマスと溶解しているタンパク質を完全に除去する必要はない。
【００２１】
方法工程ａ）による水性発酵ブロス又は溶液からのナトリウム塩の結晶化は、発酵ブロス又は溶液を濃縮し、溶液を冷却し、又は別の溶媒を加えることによって、つまり蒸発、冷却又は置換結晶化によって、それ自体公知の方法で好都合に行うことができる。通例の付加的条件も、この場合守るべきであろう。したがって、例えば、蒸発結晶化は、減圧下、そして同時に低温、好ましくは約３５℃〜約６０℃の範囲の温度で行うべきである（生成物の分解をできるだけ避けるため）。結晶化は、連続的又はバッチ法により行うことができるが、連続的に行うのが好ましい。連続的蒸発結晶化が、好ましい結晶化法である。したがって、結晶化物は、濾過又は遠心分離などの固体／液体分離操作により母液から分離することができる。得られるＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ結晶化物は、このような条件下で通常は、９８％を超える純度を有しており、更に少量の有機汚染物質（窒素＜５００ppm)を有しているが、これは以降有利な方法で除去することができる。
【００２２】
次の工程〔ｂ）〕では、結晶形状、又は場合により、粉砕によって小さいサイズになった形状の結晶化物を、まず低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール又は１，２−エタンジオール（グリコール）、好ましくはメタノールに懸濁する。ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏは、水の放出と共に、無水物（ＮａＫＧＡ）に変換されて、多量の非常に細い（＜２μm)針状物質を形成することが認められた。これらの針状物質は、使用した一水和物よりもかなり大きい表面積を有するため、表面積に依存する反応が好ましい。この新たな、針形結晶の生成を伴った脱水の様式は、従来は、温度上昇によって観察されるのみであった〔この点については、M. Kuhnert-Brandstaetter, Theromicroscopy of Organic Compounds, Wilsons and Wilson's Comprehensive Analytical Chemistry, G. Svehla (Ed.), Elsevier, Amsterdam, Vol. 16, S. 355（1982）記載の「メタンドリオールの脱水（Dehydration of Methandriol）を参照〕。以下に記載する反応は、ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏの特異的特性に基づいて調整したものである：
１．脱水
２ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ（溶解していない）→
２ＮａＫＧＡ（溶解していない、針状物質）＋２Ｈ2 Ｏ
２．プロトン化
２ＮａＫＧＡ（溶解していない、針状物質）＋Ｈ2 ＳＯ4 →
２ＫＧＡ（溶解している）＋Ｎａ2 ＳＯ4 （溶解していない）
【００２３】
プロトン化には、低含水量の強酸を使用する。加える、「低含水量の」酸の含水量は、本方法においては、原則として決定的なものではない。しかし、得られる２−ケト−Ｌ−グロン酸／アルコール溶液中の水の濃度によって、以降のエステル化の平衡が決定される。工業的経済的観点から、低含水量の酸、つまり濃縮と表示されている、低含水量の酸を使用するのが好ましい。低含水量の酸としては、例えば硫酸、硝酸、塩酸及びリン酸（それぞれ濃縮されたもの）などの濃縮された鉱酸、並びにガス状塩化水素を好都合に考慮することができる。濃硫酸又は塩酸、特に＞９５％硫酸を使用するのが好ましく、工程ｂ）においては、対応する酸のナトリウム塩、例えば硫酸ナトリウム（これは、アルコール媒質中ではほとんど溶解せず、したがって容易に分離することができる）が生成する。この酸を、化学量論的量又はわずかに過剰である量（一般的には、５％未満の過剰量）加えるのが好ましい。
【００２４】
低級アルコールにナトリウム塩を懸濁すると、塩の結晶が膨潤する。
【００２５】
反応１．及び２．を促進する反応条件は、本発明による方法に特徴的である。以下は、３種類の方法、ｂ１）、ｂ２）及びｂ３）に関する。
ｂ１）ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ結晶をまずアルコール溶媒に懸濁して、膨潤させる（ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを、表面積のより大きい針形結晶へ変換する）と、高収率となる。この場合、針状物質は、使用する原料の粒径、及び撹拌強度に応じて、数秒から数時間以内に生成する。好ましくは、微細原料（＜１００μm)又は／及び強力撹拌機もしくは分散機のいずれかを用いる。通常、針状物質は、１０分間よりも有意に短い期間内に生成する。好ましくは、溶媒（低級アルコール）に対して１０重量％未満のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを使用する。針状物質の形成のため、懸濁液が非常に撹拌しにくいからである。１．及び２．の反応を繰り返すか、又はそのほかの再使用により、より高い濃度が得られる。針状物質形成の終了時に、低含水量の酸を導入し、それによってｐＨ値を１．５以上、好ましくは２．５〜３．５の間とする。より低いｐＨ値では、より多量のＮａＫＧＡが塩に取り込まれ、望ましくない副生成物が、より多量に生成する（特に硫酸の場合）。
【００２６】
ｂ２）ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏと酸を同時に加える場合に、高収率となる。しかし、例えば回転子−固定子分散器、ホモジナイザー、超音波装置又は同様の装置を用いるなどして、湿潤粉砕（wet milling)により粒径を小さくした場合のみである。反応があまり早く進行し過ぎず、反応を促進する針状物質生成が、少なくとも微視的程度で起きるために、ｐＨ値は、やはり１．５以上、好ましくは２．５〜３．５以上である必要がある。反応時間は、通常は２０分未満である；湿潤粉砕の後では、より長い時間が必要である。得られた塩の平均粒径は、最大１０μm 、好ましくは＜３μm である必要がある。
【００２７】
湿潤粉砕に高エネルギーを導入することが必要であることは、方法ｂ２）の欠点である。しかし、単純な反応操作、特に、方法ｂ１）におけるように撹拌が困難である懸濁化を避けることができるのが、好都合である。
【００２８】
ｂ３）方法ｂ１）及びｂ２）を組み合わせて使用するのが、好都合である。例えば、針状物質形成又は酸の添加のいずれかを、連続した反応器中で行うことができ、湿潤粉砕も更に一つの反応器中で行うことができる。更に、連続工程において、針状物質の生成〔方法ｂ１）〕を最初の工程で行い、酸の添加と共に行う湿潤粉砕〔方法ｂ２）〕を、次の工程で行うことができる。
更に、溶解しにくい塩を、例えばハイドロサイクロン（hydrocyclone）を用いて、選択的に再使用することができる。この方法により、溶解しにくい塩の滞留時間を延長し、達成収率を更に引き上げる。かなりの量のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを含有する硫酸ナトリウムもまた、溶媒に懸濁することができる。典型的な針状物質の生成と、低含水量の酸との反応は、方法ｂ１）により、高収率で行うことができる。
【００２９】
第２の工程としては、工程ｂ１）又は工程ｂ２）を行うのが好ましい。
【００３０】
３種類の方法ｂ１）〜ｂ３）のいずれにも、温度制限を行う必要はない。しかし、好ましくは、温度は、約２０℃〜約７０℃の範囲内とする。ＫＧＡは、低温では、良好な溶解性を示さないが、高温では分解する。一般的には、実質的にエステル化反応が起きないように、反応条件を選択する。２−ケト−Ｌ−グロン酸〔工程ｄ）〕のエステル化が所望であれば、不溶性の塩、例えば硫酸ナトリウムの分離後、触媒として酸の存在下、公知の方法でエステル化を問題なく行うことができる。
【００３１】
ｐＨ値は、水溶液についてのみ、定義する。ここで述べるｐＨ値は、電解質として３M 塩化カリウム溶液と共に、ｐＨガラス電極を用いた場合の測定値を示す。他は同一の条件で、その他の測定装置を使用した場合、これとは異なるｐＨ値が測定される。したがって、ｐＨ範囲を規定することには問題がある。通常は、有意に５％未満のエステルが、ｐＨ値＞１．５で得られる。
【００３２】
遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸は、選択した反応条件下で、反応媒質に溶解するはずである。
【００３３】
工程ｃ）において溶解しにくい塩を分離し、そして場合によって、工程ｄ）で２−ケト−Ｌ−グロン酸をエステル化することは、それぞれの場合、公知の方法で行うことができる。したがって、塩の分離は、濾過及び／又は遠心分離、好ましくは遠心分離により行うことができる。しかし、基本的に、すべての固体／液体分離法が、＜１０μm の粒子で考えられる。得られたＫＧＡの透明な溶液は、次に、触媒量の酸を加えるか、又は酸性イオン交換体を用いることによって（例えば、ＥＰ６７１４０５号により）、対応するエステルに変換することができる。
【００３４】
好都合には、無水溶媒と濃縮酸（低含水量）を用いる。水が、以降のエステル化の平衡に不都合に影響を及ぼすからである。３７％濃塩酸又は再使用物質流（recycled substance stream)の場合、ある程度の水が存在するのは勿論である。しかし、含水量は、１０％を超えないのが好ましい。
【００３５】
本発明による本方法により、ビタミンＣ製造のために非常に重要であり、水性発酵溶液中溶解した塩として存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸を、相対的に簡単かつ経済的な方法で、遊離酸のアルコール溶液に変換することができる。このようにして得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸の溶液は、非常に高い純度を有し、公知の方法でアスコルビン酸に変換することができる。
【００３６】
本発明による方法の根本的な利点とは、まだバイオマスを含有する不透明な発酵溶液を、２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物の高収率（つまり、９０％より有意に高い）での結晶化のため、最初の工程〔ａ）〕で使用することができるという点である。工程ｂ）において次に行う、低含水量の酸との反応（プロトン化）によって、溶解しにくい塩が生成し、これによりバイオマス又はタンパク質の残渣を、かなり分離することができる。したがって、実質的にバイオマスを含有しない、アルコールに２−ケト−Ｌ−グロン酸を含有する透明な溶液を、工程ｂ）において高収率で得ることができる。したがって、水相からバイオマス又はタンパク質を完全に分離することは避けることができる。
【００３７】
【実施例】
水性発酵溶液から、２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、遊離酸のアルコール溶液に変換するための以下の実施例により、本発明による方法の好都合な実施態様が示されるが、これらは、いかなる方法によっても限定することを意図するものではない。温度はすべて摂氏（℃）で示す。
【００３８】
実施例１
２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩（一水和物として；以降はＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏとする）を、以下のように発酵ブロスから結晶化した。
水性の、バイオマス含有発酵ブロス２，１９５ｇを、１２，０００ｇで１０分間遠心分離して、不透明な上清２，１６０ｇとスラッジ３５ｇ（１．５％に相当）を得た。上清を減圧下、２０℃で濃縮し、分離した最初の結晶化物を濾取し、水で洗浄した。洗浄水は、残存している溶液と合わせた。これを２０℃で再び濃縮し、２回目の結晶化物を濾取し、水で洗浄した。３回目及び４回目の結晶化物についても同様の方法で、洗浄液を再使用し、濃縮、濾過、及び洗浄を行った。
【００３９】
遠心分離した、不透明な発酵ブロス２，１６０ｇの結晶化により、以下の生成物を得た。
１回目の結晶化物：１３２．９０ｇ、純度９９．３％（収率５４％）
２回目の結晶化物：６０．１７ｇ、純度＞９９．５％（全体的収率７８．９％）
３回目の結晶化物：２９．７０ｇ、純度９６．６％（全体的収率９０．６％）
４回目の結晶化物：１５．００ｇ、純度７９．５％（全体的収率９５．５％）
３回目までの結晶化の全体的収率は、９１％であり、平均純度は、約９９％であった。
【００４０】
実施例２
遠心分離し、不透明な、濃縮前の発酵ブロスを、真空下、５５℃で、６リットルの晶析装置中、連続的に結晶化させた。定常状態で、発酵溶液１，５５０g/h を、１７．０重量％２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム（ＮａＫＧＡ）に連続して加えた（１．２２mol に相当）。ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ含有率９９％の乾燥結晶化物が、平均２４１g/h(１．０２mol/h に相当）分離した。また、ＮａＫＧＡ１１．９％を含有する母液１８０g/h(１．０２mol/h)を得た。すすぎ水、及び精製溶液において、合わせて更に０．０８mol/h のＮａＫＧＡを回収した。母液の窒素含有率は、＞１重量％であった。結晶は、窒素１８０ppm を含有していた。
【００４１】
実施例３
含有率９９％のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ４０．０ｇ（１６９mmol）を、撹拌しながら、室温で、メタノール４００ｇに懸濁した。撹拌困難な、濃い懸濁液が生じた。２０分後、９５％硫酸８．７３ｇ（８５mmol）を５分以内に、最低ｐＨ２．０で加えた。１０分後、ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ２０．０ｇ（８５mmol）を更に加え、５分後、９５％硫酸４．４ｇ（４２mmol）を加え、混合物を更に１０分間撹拌した。ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ２０ｇと９５％硫酸４．４ｇを更にもう一度加えた。室温で７５分間撹拌後、溶液を濾過した。２−ケト−Ｌ−グロン酸の含有率が３．６％（ＫＧＡ；５mmol）である硫酸ナトリウム２５．２１ｇが分離した。得られた濾液には、ＫＧＡ３２９mmolと２−ケト−Ｌ−グロン酸メチル（ＭｅＫＧＡ）３mmolが含まれており、これは、収率９８％に相当した。濾過残渣中に確認されたＫＧＡと合わせると、回収率は、ほぼ１００％であった。
【００４２】
実施例４
含有率９９．０％のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９５％硫酸１７．６３ｇ（１７mmol）を、２０〜３５℃、２．５を超えるｐＨ値で、１５分以内に、メタノール３９０ｇに加えた。回転子−固定子系を有する分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。６０分間の分散後、懸濁液を濾過し、濾過残留物を少量のメタノールで洗浄した。硫酸を制御しながら加える間、ｐＨ値は、２．５で一定に保持されていた。７５分後に、ｐＨ値は、２．６と測定された。得られた濾液は、ＫＧＡ ３３０mmolを含有しており、これは、収率９８％に相当した。ＫＧＡ含有率５．７％の濾過残留物（硫酸ナトリウム）２５．４５ｇが得られ、これは７mmolに相当していた。測定可能なＭｅＫＧＡの含有率は、濾液中０．０４％（１mmol）であり、濾液残留物中には検出されなかった。濾液残留物中に確認されたＫＧＡと合わせた、濾液中のＫＧＡとＭｅＫＧＡの回収率は、したがってほぼ１００％であった。
【００４３】
実施例５
含有率９９％のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ７５．０ｇ（３１７mmol）及び９５％硫酸１６．３８ｇ（１５９mmol）を、６０℃、ｐＨ値２．５で、６分以内に、メタノール３７５ｇに加えた。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。加えた後、混合物を更に１０分間分散し、次に濾過し、濾過残留物を、メタノール約１０mlで洗浄し、減圧下で乾燥した。得られた濾液は、ＫＧＡ３０３mmol及びＭｅＫＧＡ５mmolを含有しており、これは収率９７％に相当していた。ＫＧＡ含有率６．２％の濾過残留物（硫酸ナトリウム）２４．１４ｇが得られ、これは８mmolに相当していた。ＭｅＫＧＡの測定可能な含有率は、濾液中０．２７％（０．５mmol）であり、濾過残留物中では０．０４％であった。したがって、濾液中のＫＧＡ及びＭｅＫＧＡと、濾過残留物中に認められるＫＧＡ及びＭｅＫＧＡの回収率は、ほぼ１００％であった。
【００４４】
実施例６
実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９６％硫酸１４．００ｇ（１７８mmol）を、６５℃、２．５を超えるｐＨ値で、４分間以内に、メタノール４００ｇに加えた。更に硫酸４．１４ｇ（４１mmol）（全体で、化学量論的に５％過剰）を２分間かけて加えたが、その間にｐＨ値は２．０に低下した。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。１０分後、混合物を濾過し、濾過残留物をメタノール４０mlで洗浄した。濾液は、ＫＧＡ３１４mmol及びＭｅＫＧＡ１２．１mmolを含有していた。ＫＧＡ７．５mmol及びＭｅＫＧＡ０．５mmolを含有する乾燥濾過残留物（硫酸ナトリウム）２５．０２ｇを得た。収率は、９６．４％であり、回収率は９８．８％であった。
【００４５】
実施例７
実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９６％硫酸１５．４０ｇ（１５１mmol）を、６５℃、２．５を超えるｐＨ値で、４分間以内に、１，２−エタンジオール４００ｇに加えた。更に硫酸１．８８ｇ（４１mmol）を１分以内に加えたが、その間にｐＨ値は、２．３に低下した。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。１０分後、混合物を濾過し、濾過残留物を少量の１，２−エタンジオールで洗浄した。ＫＧＡ２．３重量％（ＫＧＡ２．４mmolに相当）を含有する、乾燥濾過残留物（硫酸ナトリウム）１９．８４ｇを得た。溶媒の沸点が高いため、濾液は、十分に分析することができなかった。
【００４６】
実施例８
実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９６％硫酸９．９２ｇ（９７mmol）を、６５℃、ｐＨ値２．５で、５分間以内に、含水量８％のメタノール４３２ｇに加えた。更に硫酸７．３６ｇ（７２mmol）を３分間以内に加えたが、その際ｐＨ値は、最低１．９であり、最終的に２．３であった。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。１０分後、懸濁液を濾過し、濾過残留物をメタノール２０mlで洗浄した。ＫＧＡ５．７％（６．９mmol）及びＭｅＫＧＡ ０．２％（０．２mmol）を含有する、乾燥濾過残留物２３．４３ｇを得た。濾液は、ＫＧＡ３２５mmol及びＭｅＫＧＡ３．５mmolを含有していた。
【００４７】
実施例９
ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ、ＮａＫＧＡ及びＫＧＡを合計１７．０mmol（ＫＧＡ３９．７％に相当）含有する硫酸ナトリウム１０．０ｇを、２０℃でメタノール１００mlに懸濁した。濃い懸濁液が２０分後に生成した。９５％硫酸０．８２ｇ（７９mmol）を、ｐＨ値が常に２．０を超えているように、徐々に加えた。１時間撹拌後、ｐＨ値は、２．３であった。懸濁液を濾過し、濾過残留物を少量のメタノールで洗浄した。これにより、ＫＧＡ ０．１２％を含有する濾過残留物（硫酸ナトリウム）７．０ｇを得た。真空下で濾液の溶媒を留去して、ＫＧＡ８１．４％及びＭｅＫＧＡ６．５％を含有する生成物３．４７ｇを得た。
【００４８】
実施例１０
連続１０回の実験のそれぞれにおいて、１リットルの反応容器にメタノール４００ｇを入れ、それぞれ前の実験から得た硫酸ナトリウムをそこに懸濁した。それぞれの場合、実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３．３８mmol）を６０℃で５分間かけて加え、それぞれの場合、９５％硫酸１７．５ｇ（１６９mmol）を、約２．５のｐＨ値で、１０分以内に加えた。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。更に５分間反応させた後、混合物を濾過し、湿った濾過残留物（硫酸ナトリウム）を以降の実験に使用した。最後の実験において、濾過残留物をメタノール４００mlで洗浄し、乾燥した。最後の実験により、ＫＧＡ３．９％及びＭｅＫＧＡ ０．３％（０．０５mmol）を含有する、乾燥した濾過残留物（硫酸ナトリウム）２４０ｇを得た。濾液と洗浄水、合わせて３，５７０ｇは、ＫＧＡ１６．６％（３．０６mol)、ＭｅＫＧＡ１．４９％（０．２５mol)及び窒素１１ppm を含有していた。硫酸ナトリウムでは、窒素３５０ppm が測定された。硫酸ナトリウムの平均粒径は、一連の実験の間、１０μm(１回目の実験）から３．７μm(１０回目の実験）へ低下していた。
【発明の属する技術分野】
本発明は、水性発酵溶液に溶解している２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩の一水和物を、発酵溶液から結晶化し、次に塩をアルコール媒質中強酸と反応させることによって２−ケト−Ｌ−グロン酸をプロトン化することによって、水性発酵溶液に溶解している２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を遊離酸のアルコール溶液に変換する新規方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
知られているように、２−ケト−Ｌ−グロン酸（ＫＧＡ）は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）製造のための重要な出発物質である。ＫＧＡの製造のための発酵法では、発酵に好ましい条件を維持するために、代謝産物として得られるＫＧＡを、塩基（例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウム）を加えることによって中和する。発酵生成物は、水性の、バイオマスを含有する発酵溶液であり、ここではＫＧＡ塩、つまり２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム又はカルシウム〔それぞれ、ＮａＫＧＡ又はＣａ（ＫＧＡ)2〕が、溶解した形で存在している。
【０００３】
アスコルビン酸又はアルコルビン酸塩の工業的製造のためには、発酵により生産されたＫＧＡを、有機溶媒に移さなければならない。溶媒としては、低級アルカノールが好都合に使用される。このアルコールをＫＧＡによりエステル化し、次に塩基を加えることによって、アスコルビン酸塩が、高収率で得られる。この替わりに、強酸性条件下で、有機溶媒中、ＫＧＡをアスコルビン酸に変換することもできる。しかし、収率は、概してやや低い〔Helv. Chim. Acta 17, 311-328 (1934) を参照〕。
【０００４】
発酵溶液を処理する方法はいずれも、以下の３工程に基づく：
１．存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム又はカルシウムを、プロトン化して遊離酸とし（例えば、ＮａＫＧＡ＋Ｈ+ →ＫＧＡ＋Ｎａ+)；
２．水を除去し；
３．発酵溶液中に存在するバイオマス、溶解しているタンパク質、そしてその他の汚染物質を除去する。
【０００５】
工程を行う順序、そしてその特異的性能は、それぞれの方法に特徴的である。
【０００６】
プロトン化（工程１）は、酸を添加することによって、水性発酵溶液中で行うことができる。米国特許（ＵＳＰ）３３８１０２７号及びヨーロッパ特許公開（ＥＰ）３５９６４５号によると、Ｃａ（ＫＧＡ)2に硫酸を加え、沈殿したカルシウム塩を分離することによって、溶解したＫＧＡを得る。プロトン化は、カチオン交換樹脂を用いることによっても、行うことができる。ＥＰ３５９６４５号によると、水性のＣａ（ＫＧＡ)2含有発酵溶液に、カチオン交換体を通過させ、カルシウムイオンを完全に除去する。カチオン交換体を使用する場合、カチオン交換体を十分長く使用することができるように、例えば微細濾過によって、バイオマスをあらかじめ完全に除去しておかなければならない（工程３）。
【０００７】
プロトン化生成物は、そのｐＨ値が２．０よりも有意に低い、水性のＫＧＡ含有溶液である（ＫＧＡのｐＫs 値は、２．５４である）。次に、ＫＧＡを、結晶化、抽出（例えば、ＥＰ３５９０４２号により）、又は吸着（例えば、中国特許公開１０９７７３１Ａ：Chem. Abs. 124, 56570 を参照）により単離し、それによって水から分離する（工程２）。ＫＧＡを高収率で結晶化することは困難である。その溶解性が非常に高いからである（例えば、３０℃で４８０g/l)。抽出と吸着は、発酵に由来する汚染物質が存在する場合は特に工業的に困難な工程である。したがって、ＥＰ３５９０４２号によると、抽出前に、バイオマスを完全に除去しなければならない。
【０００８】
ＥＰ４０３９９３号によると、単離したが精製してはいないＫＧＡを、アスコルビン酸ナトリウムの製造に使用することができる。バイオマス及びタンパク質などの汚染物質は、以降の工程において、重炭酸ナトリウム又は重炭酸カリウムを加えて、非エステル化ＫＧＡを沈殿させることによって、除去する。
【０００９】
これまで知られている方法のいずれにおいても、ＫＧＡのプロトン化を最初に行い、次に水を除去する。しかし、逆に行う、つまり最初に発酵溶液からＮａＫＧＡ又はＣａ（ＫＧＡ)2を単離して水を除去し（工程２）、更にプロトン化を行う（工程１）のも原則として可能である。したがって、２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物（ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ）の結晶化は、特開昭５２−６６６８４号及び特開昭５３−６２８９４号公報により公知であり、溶解性（例えば、３０℃で２５０g/l)から考慮すると、ＫＧＡ・Ｈ2 Ｏの結晶化におけるよりも有意に高い収率が予想される。更に、両方の物質とも、一水和物として結晶化するが、これは通常考慮しない。この操作過程、つまり工程１の前に工程２を行うことについては、ＮａＫＧＡが、ほとんど溶解性を有さないため、有機溶媒中でＮａＫＧＡを完全にプロトン化することは困難である。
【００１０】
しかし、有機溶媒中でＮａＫＧＡをプロトン化する試みは、多少は報告されている。
【００１１】
ＥＰ９１１３４号によると、結晶性ＮａＫＧＡは、エタノールとアセトン混合物中、ガス状塩化水素を使用することによって、ＫＧＡに変換することができる。同様に生成する塩化ナトリウムを分離する。反応の以降の過程では、結晶性アスコルビン酸への転位が、強酸性反応条件下では速やかに起こり、望ましくない副生成物が得られるため、収率は、６０〜８２％と低い。
【００１２】
ＵＳＰ５３９１７７０号によると、メタノール中、ＮａＫＧＡを、４０％以上過剰量の濃硫酸と反応させることができる（実施例１０）。メチルエステルへのエステル化を含む反応時間は、６５℃で４．５時間にも達し、収率は、９１．９％である。その後、ｐＨを４まで上昇させ、硫酸ナトリウムを分離する。ＥＰ４０３９９３号によると、反応時間が長く、大量の過剰量の酸を使用するため、かなりの量の分解生成物が生じることが予想される。
【００１３】
ＥＰ４０３９９３号には、ＫＧＡ５０％及びＮａＫＧＡ５０％の混合物を、メタノール中、約５０％過剰量の硫酸と反応させることが開示されている（実施例５）。還流条件下、１時間の反応時間の後に、混合物を濾過する。得られる硫酸ナトリウムの収率は、理論値の約６０％に相当する。したがって、最大５０％ものＫＧＡを、ナトリウム塩の形で使用することができる。基本的には、この方法は、ＫＧＡの用途を提供するものであり、ＮａＫＧＡは、以降の工程で再使用することができる。
【００１４】
後者の二つの方法においては、大量に過剰量の硫酸を使用することと、強酸性条件下での反応時間が長いことが短所である。化学量論的量の硫酸を、したがって緩やかな条件下で加える場合、通常は、かなりの割合のＮａＫＧＡが、生じる硫酸ナトリウムに含まれたままで残るため、収率が低下する。
【００１５】
ＵＳＰ５３９１７７０号によると、アスコルビン酸のナトリウム塩（ＮａＡＳＣ）もまた、メタノール中、硫酸を加えることによって、プロトン化してアスコルビン酸とすることができる。この場合、ＮａＫＧＡは、不純物として、９％ほどまで存在する。溶媒であるメタノール中、アルコルビン酸の収率は、９１％と９６％の間である（実施例１２、１４及び１５）。一方、メタノール７５％と水２５％の溶媒混合物中では、アスコルビン酸の収率は、９９％である（実施例２）。明らかに、純粋な溶媒における方が、溶媒混合物におけるよりも、その収率はかなり低い。含水量が１５〜２５％であるのが好ましいのが示されているからである。これは、純粋な溶媒と比較すると、溶媒混合物中におけるＮａＡＳＣの溶解度が高い（例えば、溶媒混合物中では、４０℃で約２重量％、純粋な溶媒中では、約０．３重量％である）ためである。
【００１６】
溶解度が低い場合、物質の移送が妨げられ、溶解しにくい塩と硫酸との反応により、非常に溶解しにくい硫酸ナトリウム（メタノール中、溶解度は、０．０２４重量％）が生じることも、同様に収率が低い結果を招く。物質移送の問題は、ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏが関与する反応の場合にもかなり生じると予想される。その溶解度は、アスコルビン酸ナトリウムのそれよりもかなり低いからである（４０℃でメタノール中、＜０．０１重量％、９０％メタノール／１０％水中で＜０．１重量％）。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、最も単純かつ可能な方法で、水性の、非精製発酵ブロスに存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、アルコール溶液中の遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸に高収率、高純度で変換することを可能とする方法を提供するものである。同時に、従来の技術が有する短所、特にバイオマス、タンパク質などを、例えば微少濾過によって完全に除去し、カチオン交換体を用いて、水性発酵溶液から金属イオンを除去し、更に２−ケト−Ｌ−グロン酸を結晶化又は乾燥することを避けることができる。更に、容易に入手できる化学物質のみを使用し、工程数もできるだけ減らすことができる。
【００１８】
本発明の範囲において、上記の要件を満たし、２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩をバイオマスのあまり除去されていない発酵溶液から結晶化し、得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液に変換する方法を今や発見した。２−ケト−Ｌ−グロン酸のプロトン化、及び金属イオンの除去は、この場合では、アルコール媒質中での反応によってのみ行う。アルコール媒質に懸濁した２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物（ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ）を、低含水量の酸と収率良く反応させて、溶解した遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸（ＫＧＡ）と不溶性の塩を得るための特定の反応条件を今や発見した。この方法により初めて、水性発酵溶液からのＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏの結晶化が実施可能となったのである。発酵溶液にカチオン交換体を通過させたり、ＫＧＡを結晶化又は乾燥するなどの、従来の方法では必要であった必須工程が、これによって避けることができる。本発明による方法の結果、ＫＧＡが、アルコール溶液中に存在し、どのような方法によってもＫＧＡを高収率で直接エステル化し、アスコルビン酸に変換することができる。したがって、一連の方法工程は、本発明による方法を特徴とする。つまり、最初にＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを発酵ブロスから結晶化し、結晶水以外の水を完全に除去（工程２、上記を参照）し、そして強酸（低含水量）、例えば硫酸を添加することによって、溶媒である低級アルカノール中で、プロトン化（工程１）を完全に行う。溶解しにくい酸の塩、例えば硫酸ナトリウムが生じるが、これは速やかに除去することができる。所望のＫＧＡ溶液が残留し、上述したように、これを直接エステル化し、アスコルビン酸に変換することができる。使用するＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ及び生成物（例えば、硫酸ナトリウム）の溶解性が非常に低いにもかかわらず、９７％を超える収率が得られる、プロトン化のための特殊な反応条件もまた、特徴的である。この点から、物質としてのＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏに関する、特異的で従来知られていなかった特性を、以下に詳細に説明するように、利用している。
【００１９】
したがって、本発明の目的は、水性発酵溶液中に存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、遊離酸のアルコール溶液に変換し、所望であれば、該酸のアルキルエステルに変換する方法であって、
ａ）水性発酵溶液から、蒸発、冷却又は置換を含む結晶化（以降、「蒸発、冷却又は置換による結晶化」と称する）によって２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を回収し、所望であればこのようにして得られた結晶化物を粉砕することによって粉状にし、
ｂ１）工程ａ）で得られた、場合により粉砕された２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を、低級アルコールに懸濁し、結晶を膨潤させ、次に低含水量の酸を加えて、ｐＨ測定値を１．５以上とするか、又は
ｂ２）工程ａ）で得られた、場合により粉砕された２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を、ほぼ化学量論的量の低含水量の酸と共に、湿潤粉砕システム（wet grinding system)を用いて、低級アルコールに加えて、ｐＨ測定値を１．５以上とするか、又は
ｂ３）生成物流（product stream）の再使用を含む工程ｂ１）及びｂ２）の組み合わせを行い、
ｃ）工程ｂ１）、ｂ２）又はｂ３）で形成された、加えた酸との塩を分離して、２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液を得、そして所望であれば、
ｄ）２−ケト−Ｌ−グロン酸をアルコールでエステル化するために、工程ｃ）で得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液を、触媒量の酸又は酸性カチオン交換体で処理して、対応する２−ケト−Ｌ−グロン酸の低級アルキルエステルを得ることを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明による方法を実施する前に行う発酵により、バイオマスを含有する不透明な発酵ブロスを得る。発酵ブロス中に存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩の結晶化〔工程ａ）〕は、原則として、このブロスから直接行うことができる；しかし、遠心分離によりバイオマスの少なくとも９０％をあらかじめ分離しておくのが好都合であることが認められている。この場合には、不透明であるが、スラッジを含まない発酵溶液が得られる。しかし、結晶化の前にバイオマスと溶解しているタンパク質を完全に除去する必要はない。
【００２１】
方法工程ａ）による水性発酵ブロス又は溶液からのナトリウム塩の結晶化は、発酵ブロス又は溶液を濃縮し、溶液を冷却し、又は別の溶媒を加えることによって、つまり蒸発、冷却又は置換結晶化によって、それ自体公知の方法で好都合に行うことができる。通例の付加的条件も、この場合守るべきであろう。したがって、例えば、蒸発結晶化は、減圧下、そして同時に低温、好ましくは約３５℃〜約６０℃の範囲の温度で行うべきである（生成物の分解をできるだけ避けるため）。結晶化は、連続的又はバッチ法により行うことができるが、連続的に行うのが好ましい。連続的蒸発結晶化が、好ましい結晶化法である。したがって、結晶化物は、濾過又は遠心分離などの固体／液体分離操作により母液から分離することができる。得られるＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ結晶化物は、このような条件下で通常は、９８％を超える純度を有しており、更に少量の有機汚染物質（窒素＜５００ppm)を有しているが、これは以降有利な方法で除去することができる。
【００２２】
次の工程〔ｂ）〕では、結晶形状、又は場合により、粉砕によって小さいサイズになった形状の結晶化物を、まず低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール又は１，２−エタンジオール（グリコール）、好ましくはメタノールに懸濁する。ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏは、水の放出と共に、無水物（ＮａＫＧＡ）に変換されて、多量の非常に細い（＜２μm)針状物質を形成することが認められた。これらの針状物質は、使用した一水和物よりもかなり大きい表面積を有するため、表面積に依存する反応が好ましい。この新たな、針形結晶の生成を伴った脱水の様式は、従来は、温度上昇によって観察されるのみであった〔この点については、M. Kuhnert-Brandstaetter, Theromicroscopy of Organic Compounds, Wilsons and Wilson's Comprehensive Analytical Chemistry, G. Svehla (Ed.), Elsevier, Amsterdam, Vol. 16, S. 355（1982）記載の「メタンドリオールの脱水（Dehydration of Methandriol）を参照〕。以下に記載する反応は、ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏの特異的特性に基づいて調整したものである：
１．脱水
２ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ（溶解していない）→
２ＮａＫＧＡ（溶解していない、針状物質）＋２Ｈ2 Ｏ
２．プロトン化
２ＮａＫＧＡ（溶解していない、針状物質）＋Ｈ2 ＳＯ4 →
２ＫＧＡ（溶解している）＋Ｎａ2 ＳＯ4 （溶解していない）
【００２３】
プロトン化には、低含水量の強酸を使用する。加える、「低含水量の」酸の含水量は、本方法においては、原則として決定的なものではない。しかし、得られる２−ケト−Ｌ−グロン酸／アルコール溶液中の水の濃度によって、以降のエステル化の平衡が決定される。工業的経済的観点から、低含水量の酸、つまり濃縮と表示されている、低含水量の酸を使用するのが好ましい。低含水量の酸としては、例えば硫酸、硝酸、塩酸及びリン酸（それぞれ濃縮されたもの）などの濃縮された鉱酸、並びにガス状塩化水素を好都合に考慮することができる。濃硫酸又は塩酸、特に＞９５％硫酸を使用するのが好ましく、工程ｂ）においては、対応する酸のナトリウム塩、例えば硫酸ナトリウム（これは、アルコール媒質中ではほとんど溶解せず、したがって容易に分離することができる）が生成する。この酸を、化学量論的量又はわずかに過剰である量（一般的には、５％未満の過剰量）加えるのが好ましい。
【００２４】
低級アルコールにナトリウム塩を懸濁すると、塩の結晶が膨潤する。
【００２５】
反応１．及び２．を促進する反応条件は、本発明による方法に特徴的である。以下は、３種類の方法、ｂ１）、ｂ２）及びｂ３）に関する。
ｂ１）ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ結晶をまずアルコール溶媒に懸濁して、膨潤させる（ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを、表面積のより大きい針形結晶へ変換する）と、高収率となる。この場合、針状物質は、使用する原料の粒径、及び撹拌強度に応じて、数秒から数時間以内に生成する。好ましくは、微細原料（＜１００μm)又は／及び強力撹拌機もしくは分散機のいずれかを用いる。通常、針状物質は、１０分間よりも有意に短い期間内に生成する。好ましくは、溶媒（低級アルコール）に対して１０重量％未満のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを使用する。針状物質の形成のため、懸濁液が非常に撹拌しにくいからである。１．及び２．の反応を繰り返すか、又はそのほかの再使用により、より高い濃度が得られる。針状物質形成の終了時に、低含水量の酸を導入し、それによってｐＨ値を１．５以上、好ましくは２．５〜３．５の間とする。より低いｐＨ値では、より多量のＮａＫＧＡが塩に取り込まれ、望ましくない副生成物が、より多量に生成する（特に硫酸の場合）。
【００２６】
ｂ２）ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏと酸を同時に加える場合に、高収率となる。しかし、例えば回転子−固定子分散器、ホモジナイザー、超音波装置又は同様の装置を用いるなどして、湿潤粉砕（wet milling)により粒径を小さくした場合のみである。反応があまり早く進行し過ぎず、反応を促進する針状物質生成が、少なくとも微視的程度で起きるために、ｐＨ値は、やはり１．５以上、好ましくは２．５〜３．５以上である必要がある。反応時間は、通常は２０分未満である；湿潤粉砕の後では、より長い時間が必要である。得られた塩の平均粒径は、最大１０μm 、好ましくは＜３μm である必要がある。
【００２７】
湿潤粉砕に高エネルギーを導入することが必要であることは、方法ｂ２）の欠点である。しかし、単純な反応操作、特に、方法ｂ１）におけるように撹拌が困難である懸濁化を避けることができるのが、好都合である。
【００２８】
ｂ３）方法ｂ１）及びｂ２）を組み合わせて使用するのが、好都合である。例えば、針状物質形成又は酸の添加のいずれかを、連続した反応器中で行うことができ、湿潤粉砕も更に一つの反応器中で行うことができる。更に、連続工程において、針状物質の生成〔方法ｂ１）〕を最初の工程で行い、酸の添加と共に行う湿潤粉砕〔方法ｂ２）〕を、次の工程で行うことができる。
更に、溶解しにくい塩を、例えばハイドロサイクロン（hydrocyclone）を用いて、選択的に再使用することができる。この方法により、溶解しにくい塩の滞留時間を延長し、達成収率を更に引き上げる。かなりの量のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏを含有する硫酸ナトリウムもまた、溶媒に懸濁することができる。典型的な針状物質の生成と、低含水量の酸との反応は、方法ｂ１）により、高収率で行うことができる。
【００２９】
第２の工程としては、工程ｂ１）又は工程ｂ２）を行うのが好ましい。
【００３０】
３種類の方法ｂ１）〜ｂ３）のいずれにも、温度制限を行う必要はない。しかし、好ましくは、温度は、約２０℃〜約７０℃の範囲内とする。ＫＧＡは、低温では、良好な溶解性を示さないが、高温では分解する。一般的には、実質的にエステル化反応が起きないように、反応条件を選択する。２−ケト−Ｌ−グロン酸〔工程ｄ）〕のエステル化が所望であれば、不溶性の塩、例えば硫酸ナトリウムの分離後、触媒として酸の存在下、公知の方法でエステル化を問題なく行うことができる。
【００３１】
ｐＨ値は、水溶液についてのみ、定義する。ここで述べるｐＨ値は、電解質として３M 塩化カリウム溶液と共に、ｐＨガラス電極を用いた場合の測定値を示す。他は同一の条件で、その他の測定装置を使用した場合、これとは異なるｐＨ値が測定される。したがって、ｐＨ範囲を規定することには問題がある。通常は、有意に５％未満のエステルが、ｐＨ値＞１．５で得られる。
【００３２】
遊離２−ケト−Ｌ−グロン酸は、選択した反応条件下で、反応媒質に溶解するはずである。
【００３３】
工程ｃ）において溶解しにくい塩を分離し、そして場合によって、工程ｄ）で２−ケト−Ｌ−グロン酸をエステル化することは、それぞれの場合、公知の方法で行うことができる。したがって、塩の分離は、濾過及び／又は遠心分離、好ましくは遠心分離により行うことができる。しかし、基本的に、すべての固体／液体分離法が、＜１０μm の粒子で考えられる。得られたＫＧＡの透明な溶液は、次に、触媒量の酸を加えるか、又は酸性イオン交換体を用いることによって（例えば、ＥＰ６７１４０５号により）、対応するエステルに変換することができる。
【００３４】
好都合には、無水溶媒と濃縮酸（低含水量）を用いる。水が、以降のエステル化の平衡に不都合に影響を及ぼすからである。３７％濃塩酸又は再使用物質流（recycled substance stream)の場合、ある程度の水が存在するのは勿論である。しかし、含水量は、１０％を超えないのが好ましい。
【００３５】
本発明による本方法により、ビタミンＣ製造のために非常に重要であり、水性発酵溶液中溶解した塩として存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸を、相対的に簡単かつ経済的な方法で、遊離酸のアルコール溶液に変換することができる。このようにして得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸の溶液は、非常に高い純度を有し、公知の方法でアスコルビン酸に変換することができる。
【００３６】
本発明による方法の根本的な利点とは、まだバイオマスを含有する不透明な発酵溶液を、２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物の高収率（つまり、９０％より有意に高い）での結晶化のため、最初の工程〔ａ）〕で使用することができるという点である。工程ｂ）において次に行う、低含水量の酸との反応（プロトン化）によって、溶解しにくい塩が生成し、これによりバイオマス又はタンパク質の残渣を、かなり分離することができる。したがって、実質的にバイオマスを含有しない、アルコールに２−ケト−Ｌ−グロン酸を含有する透明な溶液を、工程ｂ）において高収率で得ることができる。したがって、水相からバイオマス又はタンパク質を完全に分離することは避けることができる。
【００３７】
【実施例】
水性発酵溶液から、２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、遊離酸のアルコール溶液に変換するための以下の実施例により、本発明による方法の好都合な実施態様が示されるが、これらは、いかなる方法によっても限定することを意図するものではない。温度はすべて摂氏（℃）で示す。
【００３８】
実施例１
２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩（一水和物として；以降はＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏとする）を、以下のように発酵ブロスから結晶化した。
水性の、バイオマス含有発酵ブロス２，１９５ｇを、１２，０００ｇで１０分間遠心分離して、不透明な上清２，１６０ｇとスラッジ３５ｇ（１．５％に相当）を得た。上清を減圧下、２０℃で濃縮し、分離した最初の結晶化物を濾取し、水で洗浄した。洗浄水は、残存している溶液と合わせた。これを２０℃で再び濃縮し、２回目の結晶化物を濾取し、水で洗浄した。３回目及び４回目の結晶化物についても同様の方法で、洗浄液を再使用し、濃縮、濾過、及び洗浄を行った。
【００３９】
遠心分離した、不透明な発酵ブロス２，１６０ｇの結晶化により、以下の生成物を得た。
１回目の結晶化物：１３２．９０ｇ、純度９９．３％（収率５４％）
２回目の結晶化物：６０．１７ｇ、純度＞９９．５％（全体的収率７８．９％）
３回目の結晶化物：２９．７０ｇ、純度９６．６％（全体的収率９０．６％）
４回目の結晶化物：１５．００ｇ、純度７９．５％（全体的収率９５．５％）
３回目までの結晶化の全体的収率は、９１％であり、平均純度は、約９９％であった。
【００４０】
実施例２
遠心分離し、不透明な、濃縮前の発酵ブロスを、真空下、５５℃で、６リットルの晶析装置中、連続的に結晶化させた。定常状態で、発酵溶液１，５５０g/h を、１７．０重量％２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム（ＮａＫＧＡ）に連続して加えた（１．２２mol に相当）。ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ含有率９９％の乾燥結晶化物が、平均２４１g/h(１．０２mol/h に相当）分離した。また、ＮａＫＧＡ１１．９％を含有する母液１８０g/h(１．０２mol/h)を得た。すすぎ水、及び精製溶液において、合わせて更に０．０８mol/h のＮａＫＧＡを回収した。母液の窒素含有率は、＞１重量％であった。結晶は、窒素１８０ppm を含有していた。
【００４１】
実施例３
含有率９９％のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ４０．０ｇ（１６９mmol）を、撹拌しながら、室温で、メタノール４００ｇに懸濁した。撹拌困難な、濃い懸濁液が生じた。２０分後、９５％硫酸８．７３ｇ（８５mmol）を５分以内に、最低ｐＨ２．０で加えた。１０分後、ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ２０．０ｇ（８５mmol）を更に加え、５分後、９５％硫酸４．４ｇ（４２mmol）を加え、混合物を更に１０分間撹拌した。ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ２０ｇと９５％硫酸４．４ｇを更にもう一度加えた。室温で７５分間撹拌後、溶液を濾過した。２−ケト−Ｌ−グロン酸の含有率が３．６％（ＫＧＡ；５mmol）である硫酸ナトリウム２５．２１ｇが分離した。得られた濾液には、ＫＧＡ３２９mmolと２−ケト−Ｌ−グロン酸メチル（ＭｅＫＧＡ）３mmolが含まれており、これは、収率９８％に相当した。濾過残渣中に確認されたＫＧＡと合わせると、回収率は、ほぼ１００％であった。
【００４２】
実施例４
含有率９９．０％のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９５％硫酸１７．６３ｇ（１７mmol）を、２０〜３５℃、２．５を超えるｐＨ値で、１５分以内に、メタノール３９０ｇに加えた。回転子−固定子系を有する分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。６０分間の分散後、懸濁液を濾過し、濾過残留物を少量のメタノールで洗浄した。硫酸を制御しながら加える間、ｐＨ値は、２．５で一定に保持されていた。７５分後に、ｐＨ値は、２．６と測定された。得られた濾液は、ＫＧＡ ３３０mmolを含有しており、これは、収率９８％に相当した。ＫＧＡ含有率５．７％の濾過残留物（硫酸ナトリウム）２５．４５ｇが得られ、これは７mmolに相当していた。測定可能なＭｅＫＧＡの含有率は、濾液中０．０４％（１mmol）であり、濾液残留物中には検出されなかった。濾液残留物中に確認されたＫＧＡと合わせた、濾液中のＫＧＡとＭｅＫＧＡの回収率は、したがってほぼ１００％であった。
【００４３】
実施例５
含有率９９％のＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ７５．０ｇ（３１７mmol）及び９５％硫酸１６．３８ｇ（１５９mmol）を、６０℃、ｐＨ値２．５で、６分以内に、メタノール３７５ｇに加えた。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。加えた後、混合物を更に１０分間分散し、次に濾過し、濾過残留物を、メタノール約１０mlで洗浄し、減圧下で乾燥した。得られた濾液は、ＫＧＡ３０３mmol及びＭｅＫＧＡ５mmolを含有しており、これは収率９７％に相当していた。ＫＧＡ含有率６．２％の濾過残留物（硫酸ナトリウム）２４．１４ｇが得られ、これは８mmolに相当していた。ＭｅＫＧＡの測定可能な含有率は、濾液中０．２７％（０．５mmol）であり、濾過残留物中では０．０４％であった。したがって、濾液中のＫＧＡ及びＭｅＫＧＡと、濾過残留物中に認められるＫＧＡ及びＭｅＫＧＡの回収率は、ほぼ１００％であった。
【００４４】
実施例６
実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９６％硫酸１４．００ｇ（１７８mmol）を、６５℃、２．５を超えるｐＨ値で、４分間以内に、メタノール４００ｇに加えた。更に硫酸４．１４ｇ（４１mmol）（全体で、化学量論的に５％過剰）を２分間かけて加えたが、その間にｐＨ値は２．０に低下した。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。１０分後、混合物を濾過し、濾過残留物をメタノール４０mlで洗浄した。濾液は、ＫＧＡ３１４mmol及びＭｅＫＧＡ１２．１mmolを含有していた。ＫＧＡ７．５mmol及びＭｅＫＧＡ０．５mmolを含有する乾燥濾過残留物（硫酸ナトリウム）２５．０２ｇを得た。収率は、９６．４％であり、回収率は９８．８％であった。
【００４５】
実施例７
実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９６％硫酸１５．４０ｇ（１５１mmol）を、６５℃、２．５を超えるｐＨ値で、４分間以内に、１，２−エタンジオール４００ｇに加えた。更に硫酸１．８８ｇ（４１mmol）を１分以内に加えたが、その間にｐＨ値は、２．３に低下した。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。１０分後、混合物を濾過し、濾過残留物を少量の１，２−エタンジオールで洗浄した。ＫＧＡ２．３重量％（ＫＧＡ２．４mmolに相当）を含有する、乾燥濾過残留物（硫酸ナトリウム）１９．８４ｇを得た。溶媒の沸点が高いため、濾液は、十分に分析することができなかった。
【００４６】
実施例８
実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３３８mmol）及び９６％硫酸９．９２ｇ（９７mmol）を、６５℃、ｐＨ値２．５で、５分間以内に、含水量８％のメタノール４３２ｇに加えた。更に硫酸７．３６ｇ（７２mmol）を３分間以内に加えたが、その際ｐＨ値は、最低１．９であり、最終的に２．３であった。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。１０分後、懸濁液を濾過し、濾過残留物をメタノール２０mlで洗浄した。ＫＧＡ５．７％（６．９mmol）及びＭｅＫＧＡ ０．２％（０．２mmol）を含有する、乾燥濾過残留物２３．４３ｇを得た。濾液は、ＫＧＡ３２５mmol及びＭｅＫＧＡ３．５mmolを含有していた。
【００４７】
実施例９
ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ、ＮａＫＧＡ及びＫＧＡを合計１７．０mmol（ＫＧＡ３９．７％に相当）含有する硫酸ナトリウム１０．０ｇを、２０℃でメタノール１００mlに懸濁した。濃い懸濁液が２０分後に生成した。９５％硫酸０．８２ｇ（７９mmol）を、ｐＨ値が常に２．０を超えているように、徐々に加えた。１時間撹拌後、ｐＨ値は、２．３であった。懸濁液を濾過し、濾過残留物を少量のメタノールで洗浄した。これにより、ＫＧＡ ０．１２％を含有する濾過残留物（硫酸ナトリウム）７．０ｇを得た。真空下で濾液の溶媒を留去して、ＫＧＡ８１．４％及びＭｅＫＧＡ６．５％を含有する生成物３．４７ｇを得た。
【００４８】
実施例１０
連続１０回の実験のそれぞれにおいて、１リットルの反応容器にメタノール４００ｇを入れ、それぞれ前の実験から得た硫酸ナトリウムをそこに懸濁した。それぞれの場合、実施例２に記載の方法で得た結晶性ＮａＫＧＡ・Ｈ2 Ｏ ８０．０ｇ（３．３８mmol）を６０℃で５分間かけて加え、それぞれの場合、９５％硫酸１７．５ｇ（１６９mmol）を、約２．５のｐＨ値で、１０分以内に加えた。回転子−固定子系のついた分散器を、湿潤粉砕のための反応容器中で操作した。更に５分間反応させた後、混合物を濾過し、湿った濾過残留物（硫酸ナトリウム）を以降の実験に使用した。最後の実験において、濾過残留物をメタノール４００mlで洗浄し、乾燥した。最後の実験により、ＫＧＡ３．９％及びＭｅＫＧＡ ０．３％（０．０５mmol）を含有する、乾燥した濾過残留物（硫酸ナトリウム）２４０ｇを得た。濾液と洗浄水、合わせて３，５７０ｇは、ＫＧＡ１６．６％（３．０６mol)、ＭｅＫＧＡ１．４９％（０．２５mol)及び窒素１１ppm を含有していた。硫酸ナトリウムでは、窒素３５０ppm が測定された。硫酸ナトリウムの平均粒径は、一連の実験の間、１０μm(１回目の実験）から３．７μm(１０回目の実験）へ低下していた。
Claims (2)
- 水性発酵溶液中に存在する２−ケト−Ｌ−グロン酸のナトリウム塩を、遊離酸のアルコール溶液に変換し、所望であれば、該酸のアルキルエステルに変換する方法であって、
ａ）水性発酵溶液から、蒸発、冷却又は置換による結晶化によって２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を回収し、所望であればこのようにして得られた結晶化物を粉砕することによって粉状にし、
ｂ１）工程ａ）で得られた、場合により粉砕された２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を、低級アルコールに懸濁し、結晶を膨潤させ、次に低含水量の酸を加えて、ｐＨ測定値を１．５以上とするか、又は
ｂ２）工程ａ）で得られた、場合により粉砕された２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム一水和物を、ほぼ化学量論的量の低含水量の酸と共に、湿潤粉砕システムを用いて、低級アルコールに加えて、ｐＨ測定値を１．５以上とするか、又は
ｂ３）生成物流の再使用を含む工程ｂ１）及びｂ２）の組み合わせを行い、
ｃ）工程ｂ１）、ｂ２）又はｂ３）で形成された、加えた酸との塩を分離して、２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液を得、そして所望であれば、
ｄ）２−ケト−Ｌ−グロン酸をアルコールでエステル化するために、工程ｃ）で得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸のアルコール溶液を、触媒量の酸又は酸性カチオン交換体で処理して、対応する２−ケト−Ｌ−グロン酸の低級アルキルエステルを得る
ことを特徴とする方法。 - 請求項１記載の方法により得られた２−ケト−Ｌ−グロン酸又は２−ケト−Ｌ−グロン酸低級アルキルエステルの、アスコルビン酸製造のための使用。
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