CN115197982A - 一种生产山梨糖的连续方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从D‑山梨糖醇连续生产山梨糖的新方法，所述方法具有显著的优点，例如高效率和低能耗，特别是提供了高转化率并避免了工业上长期实施中的污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过发酵从D-山梨糖醇生产山梨糖的连续方法。
背景技术
山梨糖是一种多用途的化工原材料，是通过D-山梨糖醇脱氢生产的。由氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)或醋杆菌属(Acetobacter)物种每年生产了约60,000吨(I.Zebiri等人，Eur.J.Org.Chem.2011(2011)2905-2910)。山梨糖主要用作维生素C生物合成中的起始材料。几乎所有维生素C生产商都已采用通过两步发酵法合成维生素C。在发酵的第一步骤中，氧化葡糖杆菌将D-山梨糖醇转化为山梨糖。第二步骤涉及在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的混合培养物中将山梨糖转化为2-酮-l-古洛糖酸(Y.B.Zhu等人，Bioresour.Technol.107(2012)399-404)。由氧化葡糖杆菌将D-山梨糖醇生物转化为山梨糖是通过两步发酵法工业化生产维生素C的关键步骤。
山梨糖可以通过以下两种工业方法生产：间歇法和连续法。在工业规模上，目前大多数山梨糖是使用分批法用游离细胞生产的(P.De Wulf等人，Biotechnol.Bioeng.69(2000)339-343)。由于该方法涉及一步催化，所以分批法的缺点是显而易见的，特别是对于每次分批循环后必须进行的清洁、灭菌和接种工序(D.Hekmat等人，Process Biochem.42(2007)71-76)。
由于强烈的底物抑制和生产抑制，连续法的性能往往不适用于工业发酵(Yamada等人，Journal of Fermentation Technology 56,29-34；和Mori,H.等人，Journal ofChemical Engineering Japan 14,65-70)。此外，对于连续发酵来说污染始终是问题。
因此，需要一种以连续方式生产L-山梨糖的有效方法。
发明内容
本发明提供了一种从D-山梨糖醇连续生产山梨糖的新方法，所述方法具有显著的优点，例如高效率和低能耗，特别是提供了高转化率并避免了工业上长期实施中的污染。
附图说明
图1示出了本发明的一个实施方式，该实施方式包括三级发酵，每一级发酵包含一个发酵容器(发酵器1、发酵器2和发酵器3)；
图2示出了本发明的第二个实施方式，该实施方式包括两级发酵，其中第一级发酵包含两个发酵容器(发酵器1-1和发酵器1-2)，并且第二级发酵包含一个发酵容器(发酵器2)；以及
图3示出了本发明的第三实施方式，该实施方式包括三级发酵，其中第一级发酵包含三个发酵容器(发酵器1-1、发酵器1-2和发酵器1-3)，第二级发酵包含两个发酵容器(发酵器2-1和发酵器2-2)，并且第三级发酵包含一个发酵容器(发酵器3)。
具体实施方式
具体地，本发明提供了一种通过发酵从D-山梨糖醇连续生产山梨糖的方法，其中所述方法包括以连续次序设置的至少两级发酵，并且其中发酵的pH值被控制在约3.5与约5.5之间。
在本发明中，该方法可包括两级、三级、四级、五级或更多级发酵，优选地其包括两级、三级或四级发酵。
在本发明的方法中，每一级发酵包含至少一个发酵容器，优选其包含两个、三个、四个或更多个发酵容器。
在根据本发明的发酵容器中，将原材料D-山梨糖醇、将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物和适用于培养所述微生物的营养培养基进料以用于发酵。
用于发酵的微生物可以是任何一种本领域已知的能够将D-山梨糖醇转化为L-山梨糖的微生物。微生物的示例包括但不限于葡糖杆菌属(Gluconobacter)和醋杆菌属的微生物，例如氧化葡糖杆菌、弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)、Gluconobactergluconicus、Gluconobacter rubiginosus、微白葡糖杆菌(Gluconobacter albidus)、工业葡糖杆菌(Gluconobacter industrius)、蜡状葡萄糖杆菌(Gluconobacter cerinus)、Gluconobacter diacetonicus、玫瑰色葡糖杆菌(Gluconobacter roseus,)、醋酸醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化醋杆菌(Acetobacter liquefaciens)。
优选地，微生物是氧化葡糖杆菌。更优选的微生物是氧化葡糖杆菌DSM 4025、氧化葡糖杆菌DSM 17078、氧化葡糖杆菌WSH-003、氧化葡糖杆菌DSM 2343、和/或氧化葡糖杆菌ATCC 621。最优选的微生物是氧化葡糖杆菌DSM 4025。
上述微生物保存在公共微生物保藏中心(培养物保藏中心)，并且任何人提出要求并支付要求的费用后均可获得。例如，氧化葡糖杆菌DSM 4025根据布达佩斯条约于1987年3月17日以DSM 4025号保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ),Mascheroder Weg 1B,D-38124，德国不伦瑞克(Braunschweig,Germany)；氧化葡糖杆菌DSM 17078根据布达佩斯条约于2005年1月26日保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen，DSMZ),Mascheroder Weg 1B,D-38124(也参见：WO2006084721A1)；并且氧化葡糖杆菌ATCC 621可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA)获得。
关于适用于本发明方法中所用微生物的培养的营养培养基，虽然没有施加特别的限制，但是含水营养培养基可包含碳源和氮源。可被所述微生物利用的其他无机盐、少量其他营养物等对于所述微生物的有利孵育来说是所需的。通常用于使微生物更好生长的各种营养物质可以适当地被包含在培养基中。
除了在本发明的方法中用作起始材料的D-山梨糖醇之外，作为碳源的其它物质也可以存在于营养培养基中，例如甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿拉伯糖醇等。
各种有机或无机物质也可用作该方法中的氮源，例如酵母提取物、肉膏、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等可以用作无机物。
优选地，在本发明的营养培养基中含有酵母提取物、玉米浆和/或碳酸钙。更优选地，本发明的营养培养基中含有酵母提取物或玉米浆和碳酸钙。
这些营养物的混合比率和每种成分的量可以随着所采用的微生物的一般性质、起始材料D-山梨糖醇的量、要接种的微生物中的一种微生物相对于另一种微生物的量和接种次数而变化，并且可以根据单独情况的细节来选择或确定孵育的其它条件。
发酵条件可以取决于所采用的特定微生物的物种和一般特征而变化。
在本发明中，发酵容器所含营养培养基中的起始材料D-山梨糖醇的合适浓度取决于所采用的微生物和任何情况下的发酵水平。优选地，在第一级发酵中营养培养基中的D-山梨糖醇的浓度为约100g/l至约500g/l，更优选约150g/l至约450g/l，更优选约160g/l至约400g/l，例如160g/l、180g/l、200g/l、250g/l、300g/l、320g/l、340g/l、360g/l、380g/l和400g/l。
在本发明中，发酵的温度合适地为约15℃至约45℃，优选约20℃至约40℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃和40℃。
在本发明中，发酵容器中培养基的pH值合适地为约3.5至约5.5，优选约3.8至约5.2，更优选约4.0至约5.0。本发明的发明人观察到在本发明的连续方法中控制发酵的pH值是至关重要的。
为了维持营养培养基的pH值，可以在发酵期间的合适时间以合适的量加入任何合适的酸性或碱性试剂，例如氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠。在本发明中，碳酸钠例如20-30重量％的水溶液是优选的。
在本发明中，在发酵容器中发酵可以以约0.1v./v./min.(气体体积/反应器体积/分钟)至约1.5v./v./min.，优选约0.2v./v./min.至约1.25v./v./min.，更优选约0.4v./v./min.至约1.0v./v./min.的空气流量进行。优选地，第一级发酵具有较高的空气流量，例如约0.8v./v./min.至约1.5v./v./min.，更优选约1.0v./v./min.至约1.2v./v./min.，并且附加级发酵具有较低的空气流量，例如约0.1v./v./min.至约0.8v./v./min.，更优选约0.2v./v./min.至0.4v./v./min.。
在本发明中，在发酵期间发酵容器中液体流的稀释率可以为约0.025h-1至约0.25h-1，优选约0.05h-1至约0.2h-1，更优选约0.075h-1至约0.15h-1，例如0.075h-1、0.08h-1、0.085h-1、0.09h-1、0.095h-1、0.1h-1、0.11h-1、0.12h-1、0.125h-1、0.13h-1、0.135h-1、0.14h-1、0.145h-1和0.15h-1。
根据本发明的发酵可以在约0.1巴至约3巴，优选约0.2巴至约2巴，更优选约0.3巴至约1.5巴的压力下进行。优选地，发酵在第一级发酵中在约1.0巴至约2.0巴，例如1.5巴的压力下进行，并且在附加级发酵中在约0.3巴至约0.5巴的压力下进行。
根据本发明的发酵优选在搅拌下进行。发酵容器中的搅拌速度可以为约150r/min至约300r/min，优选约200r/min至约250r/min。
在本发明的方法中，将原材料D-山梨糖醇、微生物和营养培养基进料到第一级发酵的发酵容器中以开始发酵。当大部分(例如至少70％)D-山梨糖醇被转化为山梨糖时，将含有D-山梨糖醇的营养培养基连续供应到第一级发酵的发酵容器中，并且与此同时将第一级发酵的发酵容器中的发酵液连续转移到第二级发酵的发酵容器中。
如本领域任何技术人员所预期的，当本发明的方法包括多于两级发酵时，当达到发酵参数，例如，附加的一定百分比的D-D-山梨糖醇被转化为山梨糖时，或者当发酵容器足够满时，发酵液也被连续地从上一级发酵的发酵容器转移到下一级发酵的发酵容器。
在本发明的一个实施方式中，该方法包括三级发酵，并且每一级包含一个发酵容器。此类实施方式在图1中示出。
如图1所示，该方法包含以连续次序设置的发酵器1、2和3。将营养培养基、山梨糖醇和微生进料到发酵器1中。在发酵期间，将营养培养基和山梨糖醇连续供应到发酵器1中，将发酵器1中的发酵液连续转移到发酵器2中，并且还将发酵器2中的发酵液连续转移到发酵器3中。
在本发明的第二实施方式中，该方法包括两级发酵，其中第一级发酵包含两个发酵容器，并且第二级发酵包含一个发酵容器。此类实施方式在图2中示出。
如图2所示，发酵器1-1和1-2在第一级发酵中并行设置，它们与第二级发酵中的发酵器2连接。在发酵期间，将营养培养基和山梨糖醇连续供应到发酵器1-1和1-2中，并且将发酵器1-1和1-2中的发酵液连续转移到发酵器2中。
在本发明的第三个实施方式中，该方法包括三级发酵，其中第一级发酵包含三个发酵容器，第二级发酵包含两个发酵容器，并且第三级发酵包含一个发酵容器。此类实施方式在图3中示出。
如图3所示，发酵器1-1、1-2和1-3在第一级发酵中并行设置，发酵器2-1和2-2在第二级发酵中并行设置，并且发酵器3设置在第三级发酵中。在发酵期间，将营养培养基和山梨糖醇连续供应到发酵器1-1、1-2和1-3中，将发酵器1-1、1-2和1-3中的发酵液连续转移到发酵器2-1和2-2中，并且还将发酵器2-1和2-2中的发酵液连续转移到发酵器3中。
在本发明的方法中，将向第一级发酵的发酵容器供应营养培养基的速率调节至将发酵液从上一级发酵的发酵容器转移至下一级发酵的发酵容器的速率，使得每一级发酵的发酵容器中的工作体积保持基本上恒定。
任选地，还将营养培养基供应到第二级或附加级发酵的发酵容器中。供应到第二级或附加级发酵的营养培养基合适地与第一级发酵中使用的营养培养基基本上相同，除了它包含或不包含山梨糖醇。在一个优选实施方式中，将在营养物及其浓度方面具有不同组成的营养培养基以可变的速率从单独的储存容器供应到不同级发酵的发酵容器中，以便使得能够建立用于微生物在发酵液中生长的最佳条件。
根据本发明的方法生产的山梨糖可以通过本身已知的常规方法进行分离和纯化，或者其可以经转移以储存或在下一个工业步骤中使用。
任选地，来自任何级发酵的含有山梨糖的发酵液可以被灭菌。这可以通过将发酵容器中的发酵液加热至约80℃至约150℃，优选90℃至130℃的温度来实现，或者通过在已经将发酵液从发酵容器中取出(排出)后，但在将所述发酵液引入下一个发酵容器/或储存或进入下一个工业步骤之前，加热至此类温度来实现。
与分批发酵相比，本发明的连续发酵具有明显的优点，例如高效率和低能耗。特别地，本发明的方法提供了高转化率并避免了污染，污染是本领域中长期存在的难题。根据实验，本发明的方法已经连续实施大于1400小时，并且没有污染发生。
通过以下实施例进一步说明本发明，在所述实施例中百分比以重量/体积为基础表示。
实施例1：营养培养基的制备
制备用于第一级发酵的含水种子培养基，所述含水种子培养基含有28.6％的D-山梨糖醇、0.14％的酵母提取物、0.1％的碳酸钙、0.087％的冰醋酸和0.025％的消泡剂(GPE-3000)。将所述含水种子培养基在121℃灭菌35分钟，然后冷却到35℃备用。
将一满接种环的氧化葡糖杆菌DSM 4025转移到1:1摇瓶中的300ml种子培养基中。将烧瓶在28℃振荡孵育2天。
制备用于在发酵期间使用的含水培养基，所述含水培养基含有32％的D-山梨糖醇、0.25％的酵母提取物和0.015％的消泡剂(GPE-3000)。将所述含水培养基在124℃灭菌2分钟，然后冷却到40℃备用。
实施例2
组装如图3所示的生物反应器系统。发酵器配备有气体供应和搅拌器。将生物反应器通过以下连续步骤投入运行：
1.在合适的分隔间中于121℃高压灭菌20分钟。
2.在无菌条件下，向每个发酵器1-1、发酵器1-2和发酵器1-3中充入600mL实施例1中所述的种子培养基，以在以下条件下开始发酵：pH＝4.0、温度＝35℃、空气流量＝1.0v./v./min.、压力＝1.5巴，和搅拌速度：220r/min。
3.当发酵器1-1、发酵器1-2或发酵器1-3中的pH值低于4.0时，加入25％碳酸钠水溶液以维持pH值在4.0。
4.当山梨糖醇的转化率达到90％时，在无菌条件下以稀释率＝0.085h-1将实施例1中所述的培养基连续泵入发酵器1-1、发酵器1-2和发酵器1-3中。与此同时从发酵器1-1、发酵器1-2和发酵器1-3的底部排出发酵液并将其连续泵入发酵器2-1和发酵器2-2，以用于在以下条件下进一步发酵：pH＝3.5-4.0、温度＝35℃、稀释率＝0.125h-1，空气流量＝0.4v./v./min.，压力＝1.0巴，和搅拌速度：220r/min。
5.当发酵器2-1和发酵器2-2约70％(体积)充满来自发酵器1-1、发酵器1-2和发酵器1-3的发酵液时，将发酵液从底部排出并连续泵入发酵器3，以用于在以下条件下进一步发酵：pH＝3.5-4.0、温度＝35℃、稀释率＝0.125h-1、空气流量＝0.4v./v./min.，和压力＝0.3-0.5巴。
6.当发酵器3约70％(体积)充满来自发酵器2-1和发酵器2-2的发酵液时，将发酵液从底部排出并连续泵入储存罐。
用高效液相色谱法测量发酵期间山梨糖醇和山梨糖的浓度。结果在表1中显示。
表1
| 发酵级 | 1 | 2 | 3 |
| 山梨糖醇的总转化率 | 77.3％ | 99.27％ | 99.92％ |
Claims (18)
1.一种通过发酵从D-山梨糖醇连续生产山梨糖的方法，其中所述方法包括以连续次序设置的至少两级发酵，并且其中所述发酵的pH值被控制在约3.5至约5.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括两级、三级或四级发酵。
3.根据权利要求1所述的方法，其中每一级发酵包含两个、三个、四个或更多个发酵容器。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括三级发酵，并且每一级发酵包含一个发酵容器。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括两级发酵，并且第一级发酵包含两个发酵容器，并且第二级发酵包含一个发酵容器。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括三级发酵，并且第一级发酵包含三个发酵容器，第二级发酵包含两个发酵容器，并且第三级发酵包含一个发酵容器。
7.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述发酵的微生物选自葡糖杆菌属和醋杆菌属的微生物，例如氧化葡糖杆菌DSM 4025、氧化葡糖杆菌DSM 17078、氧化葡糖杆菌WSH-003、氧化葡糖杆菌DSM 2343和/或氧化葡糖杆菌ATCC 621。
8.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述发酵的营养培养基包含酵母提取物、玉米浆和/或碳酸钙。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一级发酵中的所述营养培养基中D-山梨糖醇的浓度为约100g/l至约500g/l，更优选约150g/l至约450g/l，更优选约160g/l至约400g/l，例如160g/l、180g/l、200g/l、250g/l、300g/l、320g/l、340g/l、360g/l、380g/l和400g/l。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述发酵的温度合适地为约15℃至约45℃，优选约20℃至约40℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃和40℃。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述发酵的pH值合适地为约3.8至约5.2，更优选约4.0至约5.0。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中添加氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠以维持所述营养培养基的pH值。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一级发酵具有约0.8v./v./min.至约1.5v./v./min.，更优选约1.0v./v./min.至约1.2v./v./min.的空气流量，并且附加级发酵具有约0.1v./v./min.至约0.8v./v./min.，更优选约0.2v./v./min.至0.4v./v./min.的空气流量。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在发酵期间所述发酵容器中液体流的稀释率为约0.025h-1至约0.25h-1，优选约0.05h-1至约0.2h-1，更优选约0.075h-1至约0.15h-1，例如0.075h-1、0.08h-1、0.085h-1、0.09h-1、0.095h-1、0.1h-1、0.11h-1、0.12h-1、0.125h-1、0.13h-1、0.135h-1、0.14h-1、0.145h-1和0.15h-1。
15.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述发酵在所述第一级发酵中在约1.0巴至约2.0巴，例如1.5巴的压力下进行，并且在所述附加级发酵中在约0.3巴至约0.5巴的压力下进行。
16.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在所述发酵期间，将含有D-山梨糖醇的营养培养基连续供应至所述第一级发酵的所述发酵容器，与此同时将所述发酵液从上一级发酵的发酵容器连续转移至下一级发酵的发酵容器中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中将向所述第一级发酵的所述发酵容器供应所述营养培养基的速率调节至将所述发酵液从上一级发酵的发酵容器转移至下一级发酵的发酵容器的速率，使得每一级发酵的发酵容器中的工作体积保持基本上恒定。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将来自每一级发酵的含有山梨糖的发酵液灭菌。
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