CN1564871A - 制备葡糖酸钙的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从葡萄糖制备葡糖酸的方法。本发明的一方面是提供一种包括使用酶的方法。本发明的方法对于用经济的方法制备适合用作食品强化剂的葡糖酸钙具有极大的益处。

Description

制备葡糖酸钙的方法
技术领域
本发明涉及通过酶促过程制备葡糖酸钙。
背景技术
在食物中，并非总是存在或可获得足量的微量营养素(维生素和矿物质)。这可能是因为农作物生长的土壤的特殊缺陷，微量营养素的生物利用度低下，不平衡的饮食或肠道寄生虫。推荐的营养摄入量(RNI)或推荐的每日限量(RDA)的目的是告知公众微量营养素摄入量的健康水平。
已经证实，某些营养素的摄入水平高于目前的RNI可对健康产生额外的好处。例如，钙摄入水平高于RNI与成年早期增加骨量和晚年降低骨质疏松症的风险相关。
足够的钙摄入量不但对预防和治疗骨质疏松症有益，而且可以降低几种疾病的风险，包括高血压、直肠癌和草酸肾结石。青少年和老年人特别容易受到钙摄入量不足的不利影响。最近的研究和饮食建议强调孕妇和儿童中足够钙营养的重要性，特别是在进行与青春期发育相关的快速生长和骨骼矿化的人群。目前，世界很多地区的儿童和青少年钙的饮食摄入量普遍低于推荐的最佳水平。
尽管食物中有足够的钙可以达到RNI的水平，调查数据表明很多人没有食用推荐数量的钙。例如，由于健康、文化或个人的原因，很多人没有食用奶制品而因此钙摄入水平低。
为了减轻微量营养素的缺乏，食品强化成为营养策略的重要因素。有效的食品强化流程通过提供多种必需营养素改善了食品提供的营养品质而纠正了其不足的摄入。
强化或富集，定义为加入一或多种维生素或矿物质到食品中而不管是否那食品已经含有那种物质，且涉及维生素A、B1、B2、B6、B12、C、D、E、K、烟酸、叶酸、泛酸和生物素和矿物质钠、钾、钙、磷、镁、铁、锌、碘、氯、铜、氟、锰、铬、硒、钴、钼、锡、钒、硅和镍。
食品强化由官方政府的计划所调控并被用作一种公众健康干涉(添加碘到盐)的工具，以恢复在食品加工过程中丢失的营养素(添加维生素A到低脂或脱脂牛奶)，确保替代食品具有相当的营养价值(添加维生素A到人造黄油)或确保特殊膳食如粗粮替代物、营养的补充物、低盐食品、无谷蛋白食品(gluten-free foods)、配制的流体食品和无糖食品的适当营养素组成。规章确定哪种强化是被允许的。
在人类膳食中，矿物质如钠、钾、钙和镁的存在具有显著的重要性。官方文件表明对于成年人摄入钠1.1-3.3克/天和钾1.9-5.6克/天被认为是安全的和足够的每天膳食摄入水平。对于钙和镁，推荐的每日限量(RDA)分别是0.8-1.2克/天和0.3-0.4克/天。通常，钠可达到足够水平并很容易以精制食盐形式得到补充。而特别是钙的情况更加复杂。
在人体内，钙主要存在于骨骼和牙齿中(99％)，且钙在细胞内液和外液、血液凝集、肌肉收缩、神经传导的许多酶促反应以及维持正常心跳和血压中起重要作用。
钙是体内最丰富的矿物，主要以磷酸钙的形式存在。骨骼是Ca2-和PO4 3-的巨大的储蓄池和缓冲器。血浆中Ca2-和PO4 3-的水平由甲状旁腺激素(PTH)和降钙素严格限制在一个窄的范围内，甲状旁腺激素是一种可增加骨骼钙的动员和肠道吸收并减少肾脏钙的排泄量的甲状旁腺肽，而降钙素是一种具有减少骨骼钙释放并增加肾脏钙和磷的排泄的甲状腺来源的肽。维生素A也主要与肠内钙的吸收有关。
每日钙的丢失必须通过膳食摄入来恢复。已经证实的钙来源是食品(天然产生的和/或食品强化剂)、矿物质补充剂和其他来源如抗酸剂(用于治疗胃溃疡和胃酸反流)。对于大多数人来说，膳食钙最大的来源是牛奶(1.2-1.4钙/升)和其他乳制品。但是，特别是欲达到1.2-1.5克/天(美国RNI)的钙摄入量，钙的其他来源是重要的。大多数蔬菜包含钙，虽然只有很低密度。因此，需要比较大的供给才能与典型乳制品达到的总摄入量相等。
足够的钙不仅依赖于摄入量，而且依赖于食品中钙在肠内吸收并被身体利用的程度，称为生物利用度(bioavailability)。即使通过每日饮食摄入了充足的钙，在理论上足以维持体内钙的平衡，体内也可能出现钙缺乏。通常，蔬菜钙的生物利用度是高的。菠菜除外，它含有大量的草酸盐，导致钙实际上不能被生物利用。一些高肌醇六磷酸食品，如全糠谷类，钙的生物利用也很低。
虽然维生素D和甲状旁腺激素与肠道内主动吸收过程相关，磷酸盐在基于扩散的被动吸收中扮演重要角色。这种吸收过程被溶解的钙的浓度正激活：钙化合物的溶解度越大，被动吸收作用越强。
由于低pH环境，胃里几乎所有摄取的和存在的钙基本都是离子形式。但是，当钙进入肠，环境接近中性(pH6-7，依赖于存在的磷酸盐的量，钙可能沉淀为不溶性的磷酸钙)。身体不能吸收这些沉淀的磷酸钙。当食品中或肠内钙：磷酸盐比例低于1时，很可能出现沉淀。在欧洲，这个比例大约为0.6，在美国这个数字甚至更低。因此，食品中钙添加剂对于多种因素都是有益的。
已经推出了几个用钙强化的产品。这些产品(最显著的是橙汁)已强化达到与牛奶相似的钙浓度。有限的研究显示在这些产品中钙的生物利用度至少可与牛奶相比。有关各种钙强化剂的生物利用度数据还是不完全的。几个研究指出碳酸钙、硫酸钙、柠檬酸钙和乳酸钙之间具有相同的生物利用度，然而其他研究显示有机钙盐比无机盐如碳酸钙拥有更高的生物利用度。通常，生物利用度由以前所提及的钙化合物的溶解度决定。溶解度定义为某一化合物在有化合物的晶体形式存在的水中的溶解浓度，即可溶形式和晶体形式处于热动平衡。
关于强化食品的主要问题包括鉴定适当的载体，选择适当的强化化合物，决定强化物制备和强化过程中使用的工艺以及对食品味道的影响和消费者的满意度。对特定的强化应用，适当钙源的选择常常基于各自产品的许多相关性质的考虑，如味道、钙含量、生物利用度、吸收性(通常10-40％)、生物利用度和对钙而言最重要的是决定生物利用度和吸收性的溶解度。显然，经济因素是另一个重要的考虑因素。理想的钙强化剂显示每升超过3克钙的溶解度。
来源于牡蛎贝壳或石灰石的碳酸钙，因为它的高钙含量和低成本，被广泛使用为钙添加剂。但是，碳酸钙具有在胃内生成CO2的缺点，往往产生白垩的口感，终产品有一点苦、滑腻或柠檬味道，并且在食品中可生成沉淀。最重要的是，碳酸钙的低溶解度(＜0.1克/升25℃)并因此具有低吸收性。磷酸钙，如磷酸二钙(dicalcium phosphate)有沙砾口感，味淡，且溶解度很低(＜0.1克/升25℃)。
一些有机钙盐如乳酸钙和葡糖酸钙具有高溶解度并可被机体更好地吸收。柠檬酸三钙(tricalcium citrate)具有高钙含量和中性味道，但是溶解度最低(0.2克/升，25℃)。在另一方面，乳酸钙有高溶解度(9.3克/升，25℃)，这使它非常有利于在食品中获得高钙含量。但是，乳酸钙有点苦味。葡糖酸钙与乳酸钙相比有稍低的溶解度(3.5克/升，25℃)，并且它被认为是在味道上最中性的钙盐之一，它可在食品中高水平添加而不产生负面影响。葡糖酸钙也很容易与人体相容。它基本上没有任何毒性或收敛性，并因此具有很好的耐受性。
葡糖酸钙是葡糖酸的钙盐。为了使产品注册为强化食品，必须高纯度制备，即无未注册的副产品存在。葡糖酸钙一个重要的缺点是它的生产相对昂贵。文献描述了葡糖酸盐的几个制备过程。美国专利4,845,208描述了使用基于钯的催化剂，通过醛糖氧化反应生产醛糖糖酸的方法。这个方法的缺点是使用了昂贵且具有毒性的催化剂以及形成几个副产品。
美国专利5,102,795描述了使用溴化钠和一种中和碱(neutralizingbase)的电化学氧化葡萄糖生成葡糖酸的方法。目前，使用这个方法制备葡糖酸盐，但问题是，需要将溴化钠或溴化物从终产品中分离。
国际专利申请96/35800描述了一个生产高纯度葡糖酸盐的制备过程(在反应混合物中无副产品形成)。在那篇出版物中，联合使用葡糖氧化酶和过氧化氢酶将葡萄糖酶促转化为葡糖酸，用氢氧化钠中和来获得产率接近100％和几乎不含杂质的葡糖酸钠。葡糖酸钠是高度可溶的(380克/升，20℃)，那篇国际专利申请的发明者可以实现将273克/升葡萄糖全部转化为葡糖酸(以液体葡糖酸钠形式)。虽然，钠离子可被钙离子交换而获得葡糖酸钙，因为钙沉淀物的问题，这样的过程是不切实际的，事实上，一个单价离子被一个二价离子交换，附在树脂上，以这种方法工业制备葡糖酸钙是不吸引人的。而且，离子交换是昂贵的单元操作，生产过程产生废弃的盐。
国际专利申请97/24454描述，使用一个加压反应器系统和黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡糖氧化酶和滕黄微球菌(Micrococcus luteus)来源的过氧化氢酶，将最初pH6.0的450克/升浓度的葡萄糖酶促转化为葡糖酸(以液体葡糖酸钠形式)。但是，这个过程不能制备高产量的葡糖酸钙，因为葡糖酸钙的溶解度(30克/升，20℃)比相应的钠盐低一个数量级。
同样，Shah和Kothari(Biotechnol.Lett.1993；15：35-40)以及Klewicki和Krol(Pol.J.Food Nutr.Sci.1999；8：71-79)等人描述了通过微生物发酵制备葡糖酸钙。这些方法的缺点是需要从形成的副产品中纯化葡糖酸钙后产品和从产品中分离微生物。
制备葡糖酸钙优选酶促过程，因为其具有高度特异性并生成高纯度的产物。但是，葡糖酸钙在所需最佳酶促转换(pH5-7，30-35℃)条件下的溶解度只有40克/升。为了获得工业产量的产品，需要大的反应器，且葡糖酸钙结晶浓缩需要蒸发大量的水。增加最初的葡萄糖浓度并将形成的葡糖酸钙即时结晶化致使反应混合物的粘度增加以及氧转移和酶促转化速率同时减小。增强搅拌来恢复氧转移和克服粘度问题，例如使用Rushton叶轮搅拌将增加设备成本和升高使用设备的损坏风险和终产物中伴随金属的污染(铬和镍)。这些缺点致使以工业规模酶促制备葡糖酸钙不引人注意。
本发明揭示在酶促转化葡萄糖为葡糖酸钙过程中防止结晶形成的方法，致使能够以酶促过程经济地制备葡糖酸钙。
附图说明
图1显示依据本发明实施例制备葡糖酸钙所涉及的反应方程式。
本发明提供了制备葡糖酸钙的方法，包括经葡糖酸-δ-内酯将葡萄糖通过酶促反应转化为葡糖酸，随后，向反应混合物中加入钙碱，在该反应混合物中将葡糖酸转化为葡糖酸钙，该反应混合物进一步包括在食品中可使用的有机酸盐以及水。该新方法的优点是反应条件导致每单位生产体积产生高产量的葡糖酸钙，且没有葡糖酸钙结晶形成。
已经发现，原则上使用任何可被用于食品的任何有机酸盐是本发明的优点。词语“可用于食品”是指人类或动物通过食品摄入而进食后基本上不产生有害的后果。通常，这个词语指基本上无毒的盐类。适当盐类的具体例子包括乳酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐或其组合。下文参考乳酸盐图示说明了本发明。这不应该被认为是对本发明中其他相关盐类使用的限制。虽然，使用乳酸盐已经获得非常有利的结果，其他的有机酸盐产生原则上相似的结果。
本发明首次提供了一个酶促制备葡糖酸钙的引入注意的工业化方法。这个方法不需要钠-钙离子交换程序并且没有产物的后产品纯化。本发明涉及在存在一或多种乳酸盐的条件下制备高纯度和高可溶性葡糖酸钙的新的选择性过程。
本发明者已证实在乳酸钙存在的条件下，由酶促反应自葡萄糖制备得到的葡糖酸钙具有的溶解度在20℃时超过225克/公斤溶液。这比在无乳酸钙存在下(30克/升，20℃)由酶促反应制备的葡糖酸钙的溶解度大大提高，并产生无结晶的清澈的溶液，总钙含量超过46克总钙/公斤溶液。依据本发明，在反应混合物中酶促生产葡糖酸钙的产量可达到特别高的水平，当酶促转换产生了65％(重量)的葡糖酸钙和35％(重量)的乳酸钙的混合物。在反应混合物中存在的乳酸钙的量过低或过高将导致每公斤反应混合物产生低量的葡糖酸钙。但是，在将葡萄糖酶促转化为葡糖酸时仅仅存在乳酸盐即可使得反应混合物中形成大量的葡糖酸钙，且不形成葡糖酸钙沉淀。而且，依据本发明的方法制备的葡糖酸钙基本上是纯的，不需要额外的纯化步骤。在反应产物中，乳酸盐的存在没有限制葡糖酸钙作为注册钙强化剂的应用，因为乳酸盐本身是已注册的食品化合物。因此，反应产物中的乳酸盐不需要从葡糖酸钙产物中去除或分离。因为以乳酸盐的形式提供额外的微量营养素，额外乳酸金属盐的存在有利于应用依据本发明的方法制备的葡糖酸钙作为食品强化剂。
在乳酸盐存在时，酶促过程使用葡糖氧化酶和过氧化氢酶混合酶将葡萄糖转换为葡糖酸。在酶促转化时，钙碱(如氧化钙、氢氧化钙和/或碳酸钙)用来中和生成的葡糖酸并作为钙源。酶促反应期间，乳酸盐的存在可防止葡糖酸钙和/或乳酸钙结晶并使得终浓度达到很高水平(溶解的葡糖酸钙-乳酸钙甚至高于360克/公斤反应混合物)。
本发明涉及用于食品强化用途的葡糖酸钙盐的生产过程。
本发明提供了在乳酸盐存在时，从葡萄糖制备葡糖酸钙的新的、高效的和经济的方法。
本发明涉及的方法包括以下步骤：
-制备葡萄糖、酶和乳酸盐的水混合物，
-酶促转化葡萄糖为葡糖酸，
-通过加入钙碱将葡糖酸转化为葡糖酸钙。
转化是通过至少2个酶的混合物的联合作用实现的，至少包括葡糖氧化酶(EC 1.1.3.4)和过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)。本发明的一方面是酶来自任何适当的和商业上可获得的来源。酶的方便的来源是微生物源如真菌来源或细菌来源。本发明中便于使用的含有葡糖氧化酶和过氧化氢酶的制剂例如是OxyGO 1500(Genencor Inc.，美国)或Novozyme 771(NovoNordisk A/S，丹麦)。或者，可使用葡糖氧化酶制剂和过氧化氢酶制剂的组合。对葡糖氧化酶，例如是葡糖氧化酶G9010(Sigma，美国)是可使用的。在本发明中便于使用的过氧化氢酶，例如是过氧化氢酶T100(Genencor Inc.，美国)。对葡糖氧化酶的替代物，可使用其他酶，如己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)或葡糖寡糖氧化酶，或任何其他通过氧催化葡萄糖氧化产生反应产物葡糖酸和过氧化氢的酶。
在反应混合物中使用的酶的量可在所需时间期间生产本发明的化合物。酶的来源可选择为能够在应用的反应环境下产生最佳的转化率。
在本发明中使用的葡萄糖可以结晶形式或糖浆形式加到反应混合物中。反应混合物中的最初葡萄糖浓度可达到180克/升反应混合物。优选地，反应混合物中的全部转化成葡糖酸钙前的最初葡萄糖浓度高于30g/l反应混合物。
反应混合物中存在的乳酸盐可来自任何适当的来源，可能是任何乳酸盐如乳酸的碱金属盐和/或碱土金属盐，如钠、钾、钙和/或镁盐或其混合物。乳酸盐可以结晶乳酸盐形式添加到反应混合物中。或者，乳酸以溶解的乳酸形式给予，并在酶促转化反应开始前被任何适当的碱如碱金属盐碱和/或碱土金属盐碱如钙碱中和。
本发明的另一方面，通过微生物发酵碳水化合物随后与适当的碱如碱金属盐碱和/或碱土金属盐碱如钙碱中和获得适合的乳酸盐而预先获得乳酸盐。依据本发明的这样一个实施方案，优选的碳水化合物是葡萄糖。本发明的这样一个实施方案的微生物发酵可在本领域已知的条件下，用任何能够从碳水化合物发酵制备乳酸盐的微生物如乳酸菌进行。优选的这样的微生物是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
转化反应开始时，可能存在足够量的乳酸盐可在反应混合物中产生最佳的葡糖酸钙水平。或者，为了维持葡糖酸盐和乳酸盐的一定比率，乳酸盐或乳酸可以在反应过程中的连续的步骤中给予或连续给予。
本发明的方法可在本领域技术人员熟知的任何类型的反应器中进行。这些包含实验室或工业规模的具有自动化调节pH、添加碱和控制温度的发酵罐，但是，它们也可包括分别添加反应物的静态反应容器。而且，在反应器内可以使用搅拌器促进反应物的彻底混合。反应物可在一个步骤或多个步骤中添加。反应物也可在转化反应期间连续添加到反应器中。
为了在期望的时间内产生具有所需性质的产物或产生本发明的物质，本发明中使用的反应条件可能不同。技术人员可能改变的反应条件，包括但是不限于温度、pH、通风水平、氧分压、压力、二氧化碳水平、粘度和类似条件。
在转化反应期间，本发明中可使用的反应混合物温度是可维持酶正常功能的温度。这样的温度可在0-50℃之间选择。有利的使用温度是30-40℃之间。依据本发明的方法，工业制备葡糖酸钙的转化反应的温度可最佳化为导致酶的高转化率和产生高溶解度水平的葡糖酸钙。
转化期间反应混合物的pH可被调节，即控制，这可通过添加一或多种碱且加入的量达到能够维持酶正常功能而实现。首先，在转化反应期间给予所述一或多种碱以维持适当的支持酶正常的功能的pH值。它们也可以在酶促转化反应之前给予。在本发明中使用的中和生成的葡糖酸的适合的碱包括碱金属阳离子和/或碱土金属阳离子。
在转化反应过程中添加到反应混合物中的碱的另一个功能是可为葡糖酸钙提供钙源。这个钙源可在酶促转化反应开始之前立即或反应期间连续给予。对于这个钙源，钙碱的使用有极大的益处，虽然也可使用其他钙源。钙碱作为钙源与用于维持适当的pH值的碱是一样的，但是它也可以是不同的碱。优选的，中和碱是钙碱如碳酸钙。最优选地，钙碱是氢氧化钙。依据本发明的一个优选的实施方案，加入足够量的可在反应混合物中产生超过30克/升的葡糖酸钙的钙碱，相当于单独来源于葡糖酸钙的钙离子浓度超过3.1克/升，20℃。给予反应混合物的钙碱总量相当于单独来源于葡糖酸钙的钙离子浓度超过3.6克/升，40℃。
反应可不进行缓冲或通过使用本领域技术人员熟知的适当缓冲液进行缓冲。在转化反应中，反应混合物的pH优选地维持在3和9之间，更优选地是4和6之间。
通过氧气或另外适当的氧气来源如空气进行鼓泡以实现通风。在反应器中使用超高压可增加反应混合物中的氧分压。使用的有益的溶解氧分压(DOT)优选的是高于50％，更优选的高于70％，最优选的高于80％。
转化进程之后，监测反应物消耗量如加入反应器容器中的中和碱的数量或检测氧气消耗率。当制备了足够高水平的葡糖酸或让反应直到所有葡萄糖被转化后停止反应。
完成转化后，或制备了足够的葡糖酸钙，优选地从反应混合物中去除酶。从反应混合物中去除酶可采用本领域熟知的方法。在本发明的一个优选的实施方案中，通过加热使温度超过40℃，优选超过50℃，使酶失活和沉淀。通过离心去除沉淀的酶。采用过滤去除酶沉淀具有极大的益处。
包含葡糖酸钙的清澈和无酶的反应混合物可被干燥而获得葡糖酸盐。依据本发明的一个优选的实施方案，采用本领域熟知的方法喷雾干燥含有葡糖酸钙的液体。在另一个依据本发明的优选的实施方案中，获得的葡糖酸钙盐的形式为钙的葡糖酸盐和乳酸盐的干燥混合物。任选地，所述混合物可用本领域技术人员熟知的方法脱色。
本发明的方法可产生的混合物中的葡糖酸盐和可用于食品的有机酸盐的比率为5∶95到95∶5。这些混合物的特别有利的例子包括葡糖酸钙和乳酸钙混合物、葡糖酸钙和乳酸镁混合物、葡糖酸钙和柠檬酸钙混合物、葡糖酸钙和柠檬酸镁混合物、葡糖酸钙和苹果酸钙混合物、以及葡糖酸钙和苹果酸镁混合物。同样，在反应混合物中可能使用一种或多种具有矿物碱的有机酸，在酶促反应期间或之后添加。但是，如果需要，本发明方法制备的葡糖酸钙可被进一步纯化，如去除可用于食品的有机酸盐。
本发明通过如下非限制性的实施例阐明。
实施例
分析方法
分析
钙和镁采用原子吸收光谱法测定。采用HPLC测量葡糖酸盐和乳酸盐。还原糖依据Luff Schoorl方法分析显示为％葡萄糖/克干重。依据白利标度(Brix scale)测量折射率。
葡糖氧化酶-过氧化氢酶(GOC/Cat)
所有实验中，使用Genencor国际公司的商品制剂OxyGO 1500。依据厂商说明书，这个酶的制剂包含≥1500滴定单位的葡糖氧化酶/ml和≥400Baker单位的过氧化氢酶/ml。
酶促反应条件
在自动化的、可控制pH的、添加碱的(调节pH点＝5.0)和温度控制设定为35℃的实验室发酵罐(Applikon)内完成所有酶促反应。通过自动控制气流(1-2升/分)和叶轮速度(600-1250RPM)将DOT(溶解氧分压)设置为80％。通过氧气和碱的消耗量监控反应。
实施例1制备葡糖酸钙/乳酸钙
加入237.6克葡萄糖.H2O，60克乳酸(90％)和516.6克去离子水到发酵罐中配制溶液。通过自动化控制pH和10％(w/v)Ca(OH)2悬液，中和乳酸，直到达到pH5.0。总共需要180ml Ca(OH)2。
添加3.0ml GOD/Cat开始酶促反应，立即出现因氧化转化葡萄糖为葡糖酸而产生的氧和碱的即时消耗。在酶促反应期间，使用10％(w/v)Ca(OH)2悬液中和生成的葡糖酸。11.5小时后，碱和氧气消耗停止显示反应完成。在酶促反应期间，消耗了462ml Ca(OH)2。之后，80℃加热反应混合物30分钟灭活酶，导致来源于添加的酶制剂的蛋白质物质的沉淀。然后，液体冷却到环境温度，通过加入Ca(OH)2调节pH为6.8。随后，使用Seitz depth滤器过滤混合物去除沉淀的蛋白质。
结果获得一个清澈、无色的、含有乳酸葡糖酸钙的液体。这个24°Brix溶液包含0.6M钙(24g/L)、0.4 M乳酸根(36g/L)和0.8M葡糖酸根(156g/L)。
喷雾干燥以上所述溶液，结果获得白色粉末，其具有如下组分：
水分         3.62％
钙           10.26％
乳酸根       658mg/g(按现状)
葡糖酸根     125mg/g(按现状)
还原糖       0.23％。
实施例2制备葡糖酸钙/乳酸钙。
在一个相似的实验中，如实施例2所述，在酶促反应中获得更高浓度的乳酸葡糖酸钙。
加入279克葡萄糖.H2O，75克乳酸(90％)和271克去离子水到发酵罐中制成溶液。以240ml氢氧化钙悬液中和乳酸。加入2.25ml GOD/Cat开始酶促转化，并且在18小时后额外加入0.1ml这种酶。总的酶促反应时间是21小时，期间使用560ml Ca(OH)2中和产生的葡糖酸。
因此，获得的溶液包含0.75M钙(30克/升)、0.5M乳酸根(44.5克/升)和1.0M葡糖酸根(195克/升)，并且因此，含有大约270克/升干物质。
加热和过滤以后，如实施例2所述，液体在4℃储存过夜，未见任何肉眼可见的结晶。随后，喷雾干燥溶液，生成白色粉末的组分几乎与实施例2中所述相同。
实施例3葡糖酸钙/乳酸镁的制备。
将349.2克葡萄糖.1H2O，140.4克乳酸(90％)和688克去离子水加入发酵罐。使用自动化控制pH和20％(w/v)Mg(OH)2悬液中和乳酸，直到pH5.0。中和乳酸需要204g Mg(OH)2悬液。
加入3.0ml GOD/Cat开始酶促反应。酶促反应期间，使用20％(w/v)CaCO3悬液中和生成的葡糖酸。19.5小时后，额外加入0.5ml葡糖氧化酶到反应器中，21.5小时和22.5小时重复操作。24小时后，碱和氧气消耗的终止指示反应完成。在酶促反应期间，消耗了386.1ml CaCO3。
加热和过滤后，如实施例2所述，喷雾干燥清澈的无色的液体，生成白色粉末组分为
水分       7.4％
钙         70.4mg/g(按现状)
镁         22.8mg/g(按现状)
乳酸根     161mg/g(按现状)
葡糖酸根   572mg/g(按现状)
还原糖     0.23％。
实施例4乳酸钙发酵/葡糖酸钙的酶促反应。
在一个反应容器中，葡萄糖发酵制成乳酸钙，随后酶促转化葡萄糖为葡糖酸钙。最终，使用鼠李糖乳杆菌株ATCC 10863进行发酵。发酵罐内加入257.5克葡萄糖.1H2O，20克酵母提取物和水至终体积2000ml。加入100ml过夜培养的无氧生长的预培养物起始发酵，该培养物包含：鼠李糖乳杆菌ATCC 10863，4.6％葡萄糖，3％酵母提取物，2.5％ CaCO3和0.1％ MnCL2.4H2O。发酵期间，反应温度设定为37℃，使用20％(W/V)Ca(OH)2悬液中和生成的乳酸使pH调节为5.7。叶轮速度设置为100RPM并且不用通风。发酵期间，使用了440克Ca(OH)2悬液。24小时后，为了抑制细菌，在70℃加热反应混合物30分钟停止反应。
加入847.5克葡萄糖.1H2O，452.5克水和8ml GOD/Cat到发酵肉汤内完成随后的酶促反应。如前所述完成通风(见：酶促反应条件)。酶促反应22.5、23.5和24.5小时后，分别加入2、2和1ml额外部分的葡糖氧化酶。反应在26.5小时完成。酶促反应期间，共使用了819.1克Ca(OH)2悬液。
生成的肉汤离心去除细菌生物量(bacterial biomass)。上清80℃加热30分钟，期间使用10克/升活性炭处理使溶液脱色。经Seitz depth滤器过滤后，获得清澈、淡黄色液体，喷雾干燥。
生成的白色粉末有如下组分：
水分        4.6％
钙          103mg/g(按现状)
乳酸根      156mg/g(按现状)
葡糖酸根    643mg/g(按现状)
还原糖      0.29％。
实施例5制备高乳酸盐比例的葡糖酸钙/乳酸钙。
加入275克葡萄糖H2O和750克去离子水到发酵罐制成溶液。加入3ml GOD/Cat起始反应。同时，使用水泵以30ml/hr流速将50％乳酸溶液(用274克90％的乳酸和220克去离子水制成)缓慢加入发酵罐。加入所有乳酸需要22小时。
采用自动化pH控制和25％(w/v)CaCO3悬液的方法，酶促反应产生的葡糖酸以及缓慢加入的乳酸在整个过程中都被中和并维持在pH 5.0。
28小时后，碱和氧气消耗的终止指示酶促反应完成。在过程中，共加入820克碳酸钙悬液。溶液的pH值调节到7.0，并如实施例1所述加热和过滤。
生成的清澈的和无色的液体包含3.9M钙、1.3M乳酸根和0.66M葡糖酸根(156克/升钙、117克/升乳酸根、129克/升葡糖酸根)。
实施例6制备葡糖酸钙/乳酸钙/柠檬酸钙
依据实施例2的酶促反应方法，生产高浓度葡糖酸钙和乳酸钙溶液，包含大约28％的干物质。添加活性炭到这个混合物，然后，加热到90℃灭活和沉淀酶。随后，混合物冷却到40℃。
当连续搅拌时，每2公斤这种混合物中加入250克一水柠檬酸和200克CaCO3。CO2停止形成后，用Seitz depth滤器过滤溶液。生成的清澈的和几乎无色的溶液包含大约38％的干物质并且pH为5.2。
喷雾干燥溶液，生成白色粉末(萄糖酸钙/乳酸钙/柠檬酸钙)。粉末有7.2％的水分含量和基于干物质的15.3％的钙含量。粉末可在冷水中完全溶解。

Claims (25)

1、制备葡糖酸钙的方法，包括将葡萄糖酶促转化为葡糖酸，继而在加入了一种钙碱的反应混合物中将葡糖酸转化为葡糖酸钙，该反应混合物进一步包括至少一种可用于食品的有机酸盐以及水。
2、权利要求1的方法，其中使用葡糖氧化酶和过氧化氢酶进行所述的酶促转化。
3、权利要求1或2的方法，其中在反应混合物中制备的所述葡糖酸钙的浓度高于40克/升并且基本上是完全溶解的。
4、前述权利要求中任一项的方法，其中在反应混合物中制备的所述葡糖酸钙的浓度高于100克/升并且基本上是完全溶解的。
5、前述权利要求中任一项的方法，其中在反应混合物中制备的所述葡糖酸钙的浓度高于200克/升并且基本上是完全溶解的。
6、前述权利要求中任一项的方法，其中所述的至少一种可用于食品的有机酸盐选自乳酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐或其组合。
7、权利要求6的方法，其中所述的盐是乳酸盐。
8、权利要求7的方法，其中所述的乳酸盐以乳酸盐结晶的形式加入。
9、权利要求6的方法，其中将葡糖酸、乳酸、柠檬酸和一种钙碱的组合用作所述的至少一种有机酸盐。
10、权利要求7的方法，其中所述的至少一种乳酸盐是通过用一种碱金属碱和/或碱土金属碱中和乳酸而获得的。
11、权利要求10的方法，其中所述的乳酸是通过厌氧微生物转化一种碳水化合物而获得的。
12、权利要求10的方法，其中所述的碳水化合物是葡萄糖。
13、前述权利要求中任一项的方法，其中所述的至少一种可用于食品的有机酸盐是钙盐。
14、前述权利要求中任一项的方法，其中在0-50℃之间的一温度下进行所述的酶促转化。
15、前述权利要求中任一项的方法，其中在30-40℃之间的一温度下进行所述的酶促转化。
16、前述权利要求中任一项的方法，其中在pH3-9之间的一pH下进行所述的酶促转化。
17、前述权利要求中任一项的方法，其中在pH4-6之间的一pH下进行所述的酶促转化。
18、前述权利要求中任一项的方法，其中向反应混合物中加入的所述钙碱的量相当于40℃时单独来源于葡糖酸钙的钙离子终浓度超过3.6克/升。
19、前述权利要求中任一项的方法，其中所述的钙碱是氢氧化钙。
20、前述权利要求中任一项的方法，其中通过加热沉淀继而过滤以去除所述反应混合物中的酶。
21、前述权利要求中任一项的方法，其中通过喷雾干燥去除所述的水而获得葡糖酸盐/有机酸盐混合物。
22、权利要求21的方法，其中所述葡糖酸盐/有机酸盐混合物被任选地脱色。
23、由前述权利要求中任一项的方法获得的葡糖酸盐/有机酸盐混合物。
24、权利要求23的葡糖酸盐/有机酸盐混合物，其中所述的葡糖酸盐与有机酸盐的重量比为从5∶95至95∶5。
25、权利要求23或24的葡糖酸盐/有机酸盐混合物，其中所述的有机酸盐是柠檬酸盐或苹果酸盐。
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