BR0212542B1 - Método para a preparação de gluconato de cálcio, mistura de sal de gluconato/sal de ácido orgânico, lactato/gluconato de cálcio, produto de alimento fortificado com cálcio, e, suco de laranja - Google Patents

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“MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE GLUCONATO DE CÁLCIO, MISTURA DE SAL DE GLUCONATO/SAL DE ÁCIDO ORGÂNICO, LACTATO/GLUCONATO DE CÁLCIO, PRODUTO DE ALIMENTO FORTIFICADO COM CÁLCIO, E, SUCO DE LARANJA” A invenção refere-se à preparação de gluconato de cálcio através de um processo enzimático.

Micronutrientes (vitaminas e sais minerais) nem sempre estão presentes ou disponíveis em quantidades suficientes em alimentos. Isto, entre outros, poderá ser devido à déficits específicos no solo no qual as culturas são cultivadas, a uma biodisponibilidade baixa de micronutrientes, a dietas não balanceadas ou a parasitas intestinais. A ingestão de nutrientes (RNIs) ou de doses diárias recomendadas (RDA) se destinam a informar o público a respeito dos níveis saudáveis de ingestão de micronutrientes.

Foi reconhecido que a ingestão de alguns nutrientes a níveis acima dos níveis atuais de RNIs poderão apresentar benefícios adicionais à saúde. Níveis de ingestão de cálcio acima dos RNIs são, por exemplo, associados com uma massa aumentada de ossos na vida do adulto jovem e em riscos reduzidos de osteoporose anos mais tarde. A ingestão adequada de cálcio poderá ser benéfica não somente para a prevenção e o tratamento de osteoporose, mas também para a redução do risco de várias doenças, incluindo a hipertensão, câncer colo-retal e cálculos renais oxálicos. Adolescentes e os mais velhos são especialmente vulneráveis aos efeitos adversos da ingestão inadequada de cálcio. Estudos recentes e recomendações de dietas têm enfatizado a importância da nutrição adequada de cálcio em mulheres grávidas e em crianças, especialmente aqueles que sofrem com o crescimento rápido e a mineralização de ossos associados com o desenvolvimento na puberdade. A ingestão atual de dieta de cálcio por crianças e adolescentes em muitas partes do mundo poderá estar bem abaixo dos níveis ótimos recomendados.

Embora exista usualmente uma quantidade adequada de cálcio para atender os níveis de RNI no fornecimento de alimentos, dados de pesquisas indicam que muitas pessoas não estão consumindo as quantidades recomendadas de cálcio. Por exemplo, muitos indivíduos não consomem produtos de laticínios por várias razões de saúde, de cultura ou pessoal, e portanto têm baixa ingestão de cálcio.

Para suavizar as deficiências de micronutrientes, o fortalecimento de alimentos tomou-se um elemento essencial em estratégias de nutrição. Um programa efetivo de fortificantes de alimentos melhora a qualidade nutricional de um fornecimento de alimentos através do fornecimento de fontes de nutrientes essenciais e corrige a ingestão inadequada dos mesmos. O fortalecimento, ou enriquecimento, é definido como a adição de uma ou mais vitaminas ou minerais em um produto alimentício, independentemente dos alimentos já conterem aquela substância, e se refere às vitaminas A, Bl, B2, B6, BI2, C, D, E, K, niacina, foleato, ácido pantotênico e biotina e os minerais sódio, potássio, cálcio, fósforo, magnésio, ferro, zinco, iodo, cloreto, cobre, fluoreto, manganês, cromo, selênio, cobalto, molibdênio, estanho, vanádio, sílica e níquel. O fortalecimento de alimentos é controlado por programas oficiais do governo e é utilizado como uma ferramenta para intervenções públicas de saúde (adição de iodo em sal), para restaurar nutrientes perdidos durante o processamento de alimentos (adição de vitamina A em leite com baixo teor de gordura ou desnatado), para assegurar a equivalência nutricional de alimentos substitutivos (adição de vitamina A em margarina) ou para assegurar a composição apropriada de nutrientes de alimentos especiais de dietas tais como substitutos de refeições, suplementos nutricionais, alimentos com baixo teor de sódio, alimentos isentos de glúten, dietas formuladas líquidas e alimentos isentos de açúcar. Os regulamentos determinam que fortificantes são permitidos. A presença de sais minerais, como sódio, potássio, cálcio e magnésio, na dieta do ser humano é de importância fundamental. Documentos oficiais afirmam que a ingestão em adultos de 1,1 - 3,3 g/dia de sódio e 1,9 - 5,6 g/dia de potássio são considerados níveis de ingestão de dietas diárias seguras e adequadas. Para o cálcio e magnésio, as doses diárias recomendadas (RDA) são de 0,8 - 1,2 g/dia e 0,3 - 0,4 g/dia, respectivamente. O sódio geralmente está presente em níveis suficientes e pode facilmente ser suplementado na forma de sal de mesa. A situação para o cálcio, especialmente, é mais complexa.

No corpo humano o cálcio está presente primeiramente nos ossos e dentes (99%), e tem um papel importante em várias reações enzimáticas nos fluidos intra e extracelulares, na coagulação do sangue, na contração de músculos, na transmissão de nervos e na manutenção de uma pulsação do coração e da pressão sanguínea regulares. O cálcio é o mineral mais abundante no corpo e está presente, predominantemente, na forma de fosfato de cálcio. O osso atua como um grande reservatório e de acúmulo para Λ Λ Λ 1 Ca e P04 '. Os níveis de plasma de Ca' e P04 ' são mantidos dentro de limites estreitos através de um peptídeo paratireóide chamado de hormônio paratireóide (PTH) o qual aumenta a mobilização de cálcio no osso e a absorção intestinal e reduz a excreção renal de cálcio, e um segundo peptídeo de origem tireóide, calcitonina, que tem uma ação oposta, reduzindo a liberação de cálcio do osso e aumentando a excreção de cálcio e de fósforo pelos rins. A vitamina A está também envolvida, principalmente na absorção intestinal de cálcio.

As perdas diárias de cálcio devem ser repostas através da ingestão de dietas. As fontes reconhecidas de cálcio são fontes alimentícias (de ocorrência natural e/ou como fortificantes alimentícios), suplementos minerais e fontes miscelâneas tais como antiácidos (para o tratamento de úlceras gástricas e refluxo ácido). A maior fonte de cálcio dietético para muitas pessoas é o leite (1,2 -1,4 g de cálcio/1) e outros produtos de laticínios.

Outras fontes de cálcio são, no entanto, importantes, especialmente para se obter ingestões de cálcio de 1,2 - 1,5 g/dia (US RNI). A maior parte dos vegetais contém cálcio, apesar de ser em baixa densidade. Assim sendo, refeições relativamente grandes são necessárias para se alcançar a ingestão total obtida com refeições típicas de produtos laticínios. A adequação de cálcio depende não somente das quantidades ingeridas, mas também da porção de cálcio no alimento que pode ser absorvida através dos intestinos e é utilizável no corpo, chamada de biodisponibilidade. Mesmo se a ingestão diária de alimentos contém cálcio o suficiente para teoricamente manter o equilíbrio de cálcio no corpo de forma adequada, poderá ocorrer uma falta de cálcio no corpo. A biodisponibilidade de cálcio de vegetais geralmente é elevada. Uma exceção é o espinafre, que tem alto teor de oxalato, fazendo com que o seu cálcio seja virtualmente não biodisponível. Alguns alimentos com alto teor de pivalato, tais como cereais de farelo integral, poderão também ter uma fraca biodisponibilidade de cálcio.

Embora a vitamina D e o hormônio paratireóide estejam envolvidos no processo ativo de absorção intestinal, os fosfatos têm uma função principal na absorção passiva baseada em difusão. Este processo de absorção é estimulado positivamente pela concentração de cálcio dissolvido: quanto maior for a solubilidade do composto de cálcio, mais forte será a absorção passiva.

Quase que todo o cálcio ingerido e presente no estômago está . essencialmente na forma iônica por causa das condições de pH baixo. No entanto, quando o cálcio entra no intestino, as condições são mais neutras (pH 6 - 7) e o cálcio poderá ser precipitado como fosfato de cálcio insolúvel, dependendo da quantidade de fosfato presente. O corpo não é capaz de absorver este fosfato de cálcio precipitado. A precipitação possivelmente ocorrerá quando a relação de cálcio:fosfato no alimento ou no intestino for inferior a 1. Na Europa esta relação é em tomo de 0,6 e nos Estados Unidos este número é ainda menor. Assim sendo, o suplemento de cálcio em alimentos é benéfico por várias razões. Vários produtos que são fortificados com cálcio têm sido apresentados. Estes produtos, mais notavelmente o suco de laranja, são fortificados, para alcançarem uma concentração de cálcio semelhante àquela do leite. Estudos limitados sugerem que a biodisponibilidade de cálcio destes produtos é pelo menos comparável com aquela do leite. Os dados de biodisponibilidade dos vários fortificantes de cálcio não são conclusivos. Vários estudos indicam uma biodisponibilidade igual entre o carbonato de cálcio, sulfato de cálcio, citrato de cálcio e lactato de cálcio enquanto que outras investigações mostram que os sais orgânicos de cálcio poderão possuir uma biodisponibilidade maior do que os sais inorgânicos, tais como o carbonato de cálcio. Geralmente, a biodisponibilidade é determinada pela solubilidade de um composto de cálcio, conforme mencionado anteriormente. A solubilidade é definida como a concentração solúvel de um certo composto em água na presença da forma cristalina do composto, isto é, as formas solúvel e cristalina estão em equilíbrio termodinâmico.

Os problemas principais envolvidos no fortalecimento de alimentos incluem a identificação de veículos adequados, a escolha de compostos fortificantes apropriados, a determinação de tecnologias a serem utilizadas na produção do fortificante e a influência no gosto e na satisfação do consumidor pelo produto alimentício. A escolha da fonte apropriada de cálcio para uma aplicação específica de fortalecimento usualmente é baseada na consideração de várias propriedades associadas com o produto respectivo, como o gosto, o teor de cálcio, a biodisponibilidade, a absorção (usualmente 10 - 40%), a biodisponibilidade e, muito importante no caso do cálcio, a solubilidade, que determina a biodisponibilidade e a sua absorção.

Considerações econômicas são evidentemente outros fatores importantes. Um fortificante de cálcio idealmente apresenta uma solubilidade em excesso de 3 g de Ca2+ por litro. O carbonato de cálcio, de conchas de ostras ou de calcário, é o suplemento de cálcio mais largamente utilizado por causa do seu alto teor de cálcio e baixo custo. No entanto, o carbonato de cálcio tem a desvantagem de produzir CO2 no estômago, tende a produzir uma sensação de giz na boca, poderá fornecer um gosto ácido, de sabão ou de limão no produto acabado, e poderá produzir sedimentos no produto alimentício. Mais importante, o carbonato de cálcio tem uma solubilidade pobre (< 0,1 g/1 a 25°C) e portanto tem uma baixa absorção. Os fosfatos de cálcio, tais como o fosfato dicálcico apresentam uma sensação arenosa na boca, têm um aroma suave e têm também uma solubilidade pobre (< 0,1 g/1 a 25°C).

Alguns sais orgânicos de cálcio como o lactato de cálcio, e o gluconato de cálcio apresentam uma solubilidade mais elevada e são melhor absorvidos pelo corpo. O citrato tricálcico apresenta um teor elevado de cálcio e um gosto neutro, mas é 0 menos solúvel (0,2 g/1 a 25°C). O lactato de cálcio, por outro lado, é altamente solúvel (9,3 g/1 a 25°C) fazendo com que o mesmo seja muito benéfico para se obter um teor elevado de cálcio em um produto alimentício. No entanto, 0 lactato de cálcio é reconhecido como tendo sabor ácido. O gluconato de cálcio é algo menos solúvel (3,5 g/1 a 25°C) como o lactato de cálcio e é considerado como sendo um dos sais de cálcio mais neutros com relação ao gosto, em vista de níveis elevados de adição em produtos alimentícios sem qualquer impacto negativo no gosto. O gluconato de cálcio é também muito compatível com o corpo humano. Ele essencialmente não mostra nenhuma toxidez ou adstringência, e portanto é bem tolerado. O gluconato de cálcio é o sal de cálcio do ácido glucônico.

Para que o produto seja registrado como um fortificante alimentício, ele deve ser preparado com alta pureza, isto é, sem a presença de subprodutos que não são registrados. Uma desvantagem importante do gluconato de cálcio é que ele é relativamente dispendioso de ser produzido. Vários processos para a produção de gluconato são descritos na literatura. A patente U.S. 4.845.208 descreve um processo para a produção de ácidos aldônicos através da oxidação de aldose, utilizando-se um catalisador com base em paládio. A desvantagem deste método é o uso de catalisadores muito dispendiosos e tóxicos e na formação de vários subprodutos. A patente U.S. 5.102.795 descreve a oxidação eletroquímica de glucose em ácido glucônico utilizando-se brometo de sódio e uma base neutralizante. Este método é utilizado atualmente para a produção de gluconatos mas sofre com o problema do brometo de sódio ou brometo ter que ser separado do produto final.

Um processo de produção que gera gluconatos como alta pureza (sem a formação de subprodutos na mistura da reação) é descrito na solicitação internacional de patente 96/35800. Naquela publicação, uma combinação de enzimas de glucose e oxidase catalase é utilizada para converter enzimaticamente a glucose em ácido glucônico, ao mesmo tempo sendo neutralizada com hidróxido de sódio para obter-se o gluconato de sódio com um rendimento próximo de 100% e praticamente sem impurezas. O gluconato de sódio é altamente solúvel (380 g/1 a 20°C) e os inventores daquela solicitação internacional de patente foram capazes de obter uma conversão completa de 273 g/1 de glucose em ácido glucônico (na forma de gluconato de sódio líquido). Apesar dos íons de sódio poderem ser trocados por íons de cálcio para se obter o gluconato de cálcio, tal processo é impraticável por causa dos problemas da precipitação de cálcio e do fato de que um íon monovalente deve ser trocado por um íon divalente, ligado na resina, e a produção industrial de gluconato de cálcio desta forma não é atraente. Além disso, a troca de íons e uma operação unitária dispendiosa e o processo gera rejeitos de sais. O pedido internacional de patente 97/24454 descreve a conversão enzimática de glucose em ácido glucônico (na forma de gluconato de sódio líquido) até concentrações iniciais de glucose de 450 g/1 em um pH de 6,0 utilizando-se um sistema de reator pressurizado e glucose oxidase da Aspergillus niger e catalase da Micrococcus luteus. No entanto, este processo não permite produções com rendimentos elevados de gluconato de cálcio por que a solubilidade do gluconato de cálcio (30 g/1 a 20°C) é de magnitude menor do que aquela do sal de sódio correspondente. O gluconato de cálcio também pode ser preparado por fermentação microbiológica, conforme descrito por Shah e Kothari (Biotechnol. Lett. 1993; 15:35-40) e por Klewicki e Krol (Pol. J. Food Nutr.

Sei. 1999; 8:71-79). A desvantagem deste procedimento é relacionada com a necessidade de se purificar o gluconato de cálcio após a produção dos subprodutos formados e se separar os microorganismos do produto.

Para a produção de gluconato de cálcio é preferível um processo enzimático por causa da sua especificidade elevada e da pureza resultante elevada do produto. No entanto, a solubilidade do gluconato de cálcio nas condições requeridas para a conversão enzimática (pH 5-7, 30- 35°C) é somente de 40 g/1. Para se obter quantidades industriais do produto, são necessários grandes reatores e a concentração dos cristais de gluconato de cálcio requer a evaporação de grandes quantidades de água. O aumento da concentração inicial de glucose e a cristalização instantânea do gluconato de cálcio formado resulta em uma viscosidade aumentada da mistura da reação e uma redução concomitante nas quantidades de oxigênio transferido e de conversão enzimática. A intensificação da agitação para restaurar a transferência de oxigênio e superar os problemas de viscosidade, por exemplo, utilizando-se turbinas Rushton para a agitação elevará os custos de equipamento e elevará o risco de danos nos equipamentos usados e a contaminação metálica concomitante (cromo ou níquel) do produto final.

Estas desvantagens fizeram com que a produção enzimática de gluconato de cálcio em escala industrial se tomasse desinteressante. A presente invenção apresenta um método para evitar a formação de cristais durante a conversão enzimática de glucose em gluconato de cálcio fazendo com que o processo enzimático para a produção de gluconato de cálcio se tome economicamente favorável. A figura 1 mostra as equações da reação envolvida na produção de gluconato de cálcio de acordo com uma realização da presente invenção. A presente invenção apresenta um método para a preparação de gluconato de cálcio, compreendendo a conversão enzimática de glucose em ácido glucônico através da glucono-delta-lactona, seguido pela conversão do ácido glucônico em gluconato de cálcio em uma mistura da reação na qual é administrada uma base de cálcio e a qual compreende ainda um sal de um ácido orgânico que é aceitável para uso em alimentos, e água. Uma vantagem do novo método é que as condições da reação resultam em rendimentos muito elevados de gluconato de cálcio por unidade de volume produzido sem a formação de cristais de gluconato de cálcio.

Verificou-se que, em princípio, o uso de qualquer sal de um ácido orgânico que pode ser utilizado em alimentos produz as vantagens da invenção. A frase "aceitável para uso em alimentos" significa que o consumo por seres humanos ou animais pela ingestão em alimentos não essencialmente leva a efeitos prejudiciais. Em geral, a frase refere-se a sais essencialmente não tóxicos. Exemplos específicos de sais adequados incluem sais de lactatos, sais de citratos, sais de maleatos e combinações dos mesmos. Na descrição que se segue, a invenção é ilustrada por referência a sais de lactatos. Isto de nenhuma forma deve ser interpretado como restrição com relação ao uso de outros sais, no contexto da invenção. Apesar de terem sido obtidos resultados muito favoráveis utilizando-se um sal de lactato, outros sais de ácidos orgânicos levam principalmente a resultados semelhantes. A presente invenção apresenta pela primeira vez um método industrialmente atraente para a preparação enzimática de gluconato de cálcio. O método não requer nenhum procedimento de troca de íons de sódio por cálcio e nenhuma purificação posterior da produção do produto. A presente invenção refere-se a um novo processo seletivo para a produção de gluconato de cálcio de alta pureza e de alta solubilidade na presença de um ou mais sais de lactato.

Os presentes inventores demonstraram, inter alia, que quando preparado a partir de glucose através de uma reação enzimática na presença de lactato de cálcio, o gluconato de cálcio apresenta uma solubilidade em excesso de 225 g/kg de solução a 20°C. Isto é consideravelmente maior do que a solubilidade de gluconato de cálcio produzido por uma reação enzimática na ausência de lactato de cálcio (30 g/1 a 20°C) e resulta em soluções transparentes sem cristais e com um teor alto de cálcio, acima de 46 g de cálcio total/kg de solução. O rendimento enzimático de gluconato de cálcio na mistura da reação de acordo com a presente invenção poderá atingir, especialmente, níveis elevados, quando a conversão enzimática resulta em uma mistura de 65% em peso de gluconato de cálcio e 35% em peso de lactato de cálcio. Quantidades consideravelmente menores ou consideravelmente maiores de lactato de cálcio presentes na mistura da reação resultam em quantidades menores de gluconato de cálcio produzido por quilo de mistura da reação. No entanto, a mera presença de sais de lactato durante a conversão enzimática de glucose em ácido glucônico permite a geração de quantidades vantajosamente elevadas de gluconato de cálcio na mistura da reação sem a formação de precipitados de gluconato de cálcio. Além disso, o gluconato de cálcio produzido de acordo com um método da invenção é essencialmente puro e não requer etapas adicionais de purificação. A presença de sais de lactato no produto da reação não limita a aplicação do gluconato de cálcio como um fortificante de cálcio registrado, por que os próprios sais de lactato são um composto alimentício registrado. Assim sendo, os sais de lactato no produto da reação não necessitam ser removidos ou separados do produto de gluconato de cálcio. A presença de sais metálicos adicionais de lactato é benéfica para a aplicação do gluconato de cálcio produzido por um método de acordo com a invenção como um fortificante alimentício, por que os micronutrientes adicionais poderão ser fornecidos na forma de sais de lactato. O processo enzimático utiliza uma mistura das enzimas de glucose oxidase e catalase para converter a glucose em ácido glucônico na presença de um sal de lactato. Durante a conversão enzimática, um produto à base de cálcio (por exemplo, óxido de cálcio, ou hidróxido de cálcio e/ou carbonato de cálcio) é utilizado para fins de neutralizar o ácido glucônico em desenvolvimento e para servir como uma fonte de cálcio. A presença do sal de lactato durante as reações enzimáticas evita a cristalização de gluconato de cálcio e/ou lactato de cálcio e assim sendo, podem ser alcançadas grandes concentrações finais (mesmo acima de 360 g de gluconato de cálcio-lactato de cálcio combinados e dissolvidos por quilo de mistura da reação). A presente invenção refere-se a um processo para produzir sal de gluconato de cálcio que pode ser utilizado em aplicações de fortificação de alimentos. A presente invenção apresenta um processo novo, efetivo e econômico, para a produção de gluconato de cálcio a partir de glucose na presença de sais de ácido lático. A invenção refere-se, inter alia, a um método compreendendo as etapas de - preparação de uma mistura de glucose, enzimas e um sal de lactato em água, - a conversão enzimática de glucose em ácido glucônico - a conversão do ácido glucônico em gluconato de cálcio através da adição de uma base de cálcio. A conversão é realizada pela ação combinada de uma mistura de pelo menos duas enzimas, pelo menos compostas de glucose oxidase (EC 1.1.3.4) e catalase (EC 1.11.1.6). Um aspecto da presente invenção é que as enzimas poderão ser de qualquer fonte adequada e são disponíveis comercialmente. Uma fonte conveniente das enzimas é uma fonte microbiológica, como uma fonte de fungos ou uma fonte bacteriana. Uma preparação de enzima contendo ambas a glucose oxidase e a catalase que pode ser utilizada beneficamente na presente invenção é, por exemplo, a OxyGO 1500 (Genencor Inc., USA) a Novozyme 771 (Novo Nordisk A/S, Dinamarca). Altemativamente, uma combinação de uma preparação de glucose oxidase e uma preparação de catalase poderão ser utilizadas. Por exemplo, como glucose oxidase, é disponível a glucose oxidase G9010 (Sigma, USA). Uma enzima de catalase que pode ser utilizada beneficamente na presente invenção é, por exemplo, a catalase T100 (Genencor Inc., USA).

Como uma alternativa para a glucose oxidase, poderão ser utilizadas outras enzimas, tais como a hexose oxidase (EC 1.1.3.5) ou a glucooligossacarídeo oxidase, ou qualquer outra enzima que catalise a oxidação de glucose com oxigênio resultando nos produtos da reação, ácido glucônico e peróxido de hidrogênio.

As quantidades de enzima utilizadas na mistura da reação podem ser preparações para produzir o composto da invenção em um período de tempo desejado. A fonte de enzimas poderá ser escolhida para resultar em valores ótimos de conversão nas condições de reação aplicadas. A glucose utilizada no contexto da presente invenção, poderá ser administrada na mistura da reação em uma forma cristalina ou na forma de um xarope. A concentração inicial de glucose na mistura da reação poderá ser de até 180 g/1 da mistura da reação. De preferência, a concentração inicial de glucose na mistura da reação antes da conversão completa em gluconato de cálcio é acima de 30 g/1 da mistura da reação. O sal de lactato presente na mistura da reação poderá ser de qualquer fonte adequada e poderá ser qualquer sal de lactato, como um sal alcalino metálico e/ou sal alcalino terroso metálico de lactato, como um sal de sódio, potássio, cálcio e/ou magnésio ou uma combinação dos mesmos. O sal de ácido lático poderá ser administrado na mistura da reação como um sal cristalino de lactato. Altemativamente, o ácido lático poderá ser administrado como ácido lático na forma dissolvida e poderá ser neutralizado antes do início da reação de conversão enzimática por qualquer base adequada como uma base de sal alcalino metálico e/ou base de sal alcalino terroso metálico, por exemplo, uma base de cálcio.

Em um outro aspecto da invenção, o sal de ácido lático poderá ser obtido antecipadamente por fermentação microbiológica de um carboidrato, seguido por neutralização com uma base adequada, como uma base de sal alcalino metálico e/ou uma base de sal alcalino terroso metálico, como por exemplo uma base de cálcio, para obter-se um sal adequado de lactato. Em tal realização de acordo com a invenção, um carboidrato preferido é a glucose. Uma fermentação microbiológica de tal realização da invenção poderá ser realizada nas condições conhecidas na técnica e com qualquer microorganismo capaz de produzir lactato pela fermentação de carboidrato, como a bactéria de ácido lático. Um microorganismo preferidos é o Lactobacillus rhamnosus. O sal de lactato poderá estar presente no início da reação de conversão em quantidades suficientes para gerar níveis ótimos de gluconato de cálcio na mistura da reação. Altemativamente, o sal de lactato ou o ácido lático poderão ser administrados em etapas consecutivas ou continuamente durante o transcorrer da reação para manter uma certa proporção entre o gluconato e o lactato. O método da presente invenção poderá ser realizado em qualquer tipo de reator disponível por aqueles adestrados na técnica. Este poderá ser composto de fermentadores de laboratório ou em escala industrial, com controles automáticos de pH, de adição de álcali e de temperatura, mas eles também poderão ser compostos de vasos estáticos de reatores nos quais são adicionados os reagentes como administrações separadas.

Adicionalmente, poderão ser colocados no reator agitadores, para facilitar a mistura apropriada dos reagentes. Os reagentes poderão ser adicionados em uma etapa ou eles poderão ser adicionados em etapas múltiplas. Os reagentes poderão também ser adicionados continuamente ao reator durante a reação de conversão.

As condições da reação que poderão ser utilizadas no contexto da presente invenção podem ser variadas para produzir um produto com as propriedades desejadas ou para produzir a substância da invenção no período de tempo desejado. As condições da reação que poderão ser variadas pelo artesão incluem, mas não são limitadas à temperatura, pH, nível de aeração, tensão de oxigênio, pressão, nível de dióxido de carbono, viscosidade, e semelhantes.

As temperaturas da mistura da reação que podem ser utilizadas durante a reação de conversão, no contexto da presente invenção, são aquelas que suportam o funcionamento apropriado das enzimas. Qualquer uma de tais temperaturas poderão ser escolhidas entre 0°C e 50°C. As temperaturas que podem ser utilizadas beneficamente estão entre 30°C e 40°C. As temperaturas da reação de conversão durante a produção industrial de gluconato de cálcio de acordo com um método da invenção poderão ser otimizadas para resultarem em altas taxas de conversão pelas enzimas e resultarem em níveis elevados de solubilidade do gluconato de cálcio produzido. O pH da mistura da reação durante a conversão poderá ser regulado, isto é, controlado, pela adição de uma ou mais bases em tal valor que suporte o funcionamento apropriado das enzimas. Principalmente, as referidas uma ou mais bases são administradas durante o transcorrer da reação de conversão para manter valores apropriados de pH que suportam o funcionamento apropriado das enzimas. Eles poderão ser administrados antes do início da reação de conversão enzimática. Bases adequadas utilizadas no contexto da presente invenção para a neutralização do ácido glucônico desenvolvido incluem anions alcalino metálicos e/ou anions alcalino terroso metálicos.

Uma função adicional da base adicionada na mistura da reação durante o transcorrer da reação de conversão poderá ser fornecer uma fonte de cálcio para o gluconato de cálcio. Esta fonte de cálcio poderá ser administrada de uma só vez, antes do início da reação de conversão enzimática ou continuamente durante a reação. Para esta fonte de cálcio, pode ser utilizada uma base de cálcio com grandes benefícios, apesar de outras fontes de cálcio poderem também ser utilizadas. A base de cálcio utilizada como uma fonte de cálcio poderá ser idêntica à base utilizada para manter os valores apropriados de pH, mas ela poderá também ser uma base diferente. De preferência, a base neutralizante é uma base de cálcio como carbonato de cálcio. Mais de preferência, a base de cálcio é o hidróxido de cálcio. Em uma realização preferida de acordo com a invenção, a base de cálcio é administrada em uma quantidade suficiente para a produção de uma quantidade de gluconato de cálcio acima de 30 g/1 da mistura da reação, que é equivalente a uma concentração de íons de cálcio em excesso de 3,1 g/1 a 20°C derivados somente de gluconato de cálcio. A quantidade total de base de cálcio administrada para a mistura da reação é equivalente a uma concentração de íons de cálcio acima de 3,6 g/1 a 40°C derivados somente de gluconato de cálcio. A reação poderá não ser tamponada ou ser tamponada utilizando-se soluções tampão adequadas disponíveis para o artesão adestrado. Durante a reação de conversão, o pH da mistura da reação, de preferência, é mantido entre 3 e 9, mais de preferência entre 4 e 6. A aeração poderá ser conseguida borbulhando-se oxigênio ou outra fonte apropriada de oxigênio, como ar. A tensão de oxigênio na mistura da reação poderá ser aumentada utilizando-se uma sobrepressão no reator.

Uma tensão de oxigênio dissolvido (DOT) que pode ser utilizada beneficamente é de preferência acima de 50%, mais de preferência, acima de 70%, mais de preferência acima de 80%. O progresso da conversão poderá ser seguido monitorando-se o consumo de reagentes, tais como a quantidade de base neutralizante adicionada ao vaso de reação ou monitorando-se a taxa de consumo de oxigênio. A reação pode ser interrompida quando níveis suficientemente elevados de ácido glucônico são produzidos ou poderá ser deixada em execução até que toda a glucose seja convertida.

Depois de se completar a conversão, ou quando é produzido gluconato de cálcio suficiente, as enzimas de preferência são removidas da mistura da reação. A remoção das enzimas da mistura da reação poderá ocorrer por qualquer método adequado conhecido na técnica. Em uma realização preferida de acordo com a invenção, as enzimas são desativadas e precipitadas pelo aquecimento a uma temperatura acima de 40°C, de preferência acima de 50°C. A remoção das enzimas precipitadas poderá ocorrer por centrifugação. Os precipitados de enzima podem ser removidos, com grandes benefícios, por filtração. A mistura da reação, transparente e isenta de enzima, contendo o gluconato de cálcio, poderá então ser seca para obter-se o sal de gluconato.

Em uma realização preferida de acordo com a invenção, o líquido contendo gluconato de cálcio é seco por pulverização utilizando-se métodos conhecidos na técnica. Em outra realização preferida de acordo com a invenção, é obtido um sal de gluconato de cálcio como uma mistura seca de um sal de gluconato e um sal de lactato de cálcio. Opcionalmente, a referida mistura poderá ser descobrida por métodos conhecidos pelo artesão adequado.

Um método de acordo com a invenção poderá levar a misturas de sais de gluconato e sais de um ácido orgânico, o que é aceitável para uso em alimentos em uma relação em peso de 5:95 a 95:5. Exemplos específicos vantajosos destas misturas incluem misturas de gluconato de cálcio e de lactato de cálcio, de gluconato de cálcio e lactato de magnésio, de gluconato de cálcio e citrato de cálcio, de gluconato de cálcio e citrato de magnésio, de gluconato de cálcio e maleato de cálcio, e de gluconato de cálcio e maleato de magnésio. É também possível utilizar-se um ou mais ácidos orgânicos com as suas bases minerais, na mistura da reação, adicionados durante a reação enzimática ou posteriormente. Se desejado, no entanto, o gluconato de cálcio preparado de acordo com a invenção poderá ser ainda mais purificado, por exemplo, pela remoção do sal de um ácido orgânico, o que é aceitável para uso em alimentos. A invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos Método analítico Análises O cálcio e o magnésio foram determinados por espectrometria de absorção atômica. O gluconato e o lactato foram estimados por HPLC. Os açúcares de redução foram analisados de acordo com Luff Choorl apresentados como % de glucose/g peso seco. O índice de refração foi medido de acordo com a escala Brix.

Glucose oxidase - catalase (GOC/Cat) Em todas as experiências foi utilizada a preparação comercial - OxyGO 1500 - da Genencor International. Esta preparação de enzima continha > 1500 unidades titrimétricas de glucose oxidase/ml e > 400 unidades Baker de catalase/ml, de acordo com o fabricante.

Condições enzimâticas de reação Todas as reações de enzima foram realizadas em fermentadores de laboratório (Applikon) com adição automatizada, pH controlado, de álcali (ponto de ajuste do pH =5,0) e ajuste de controle de temperatura a 35°C. O DOT (tensão de oxigênio dissolvido) foi ajustado em 80% pelo controle automático do fluxo de ar (1-2 1/min) e da velocidade do agitador (600 - 1250 RPM). A reação foi monitorada pela quantidade de consumo de oxigênio e de álcali.

Exemplo 1. Preparação de gluconato/lactato de cálcio.

Foi preparada uma solução adicionando-se 237,6 g de glucose.H20, 60 g de ácido lático (90%) e 516,6 g de água desmineralizada no fermentador. O ácido lático foi neutralizado com controle automático de pH e uma suspensão a 10% (peso/volume) de Ca (OH)2, até que foi alcançado um pH de 5,0. Um total de 180 ml de Ca(OH)2 foram requeridos. A reação enzimática foi iniciada pela adição de 3,0 ml de GOD/Cat e ocorreu um consumo instantâneo de oxigênio e álcali causado pela conversão oxidativa de glucose em ácido glucônico. Durante a reação enzimática, foi utilizada uma suspensão a 10% (peso/volume) de Ca(OH)2 para neutralizar o ácido glucônico desenvolvido. Depois de 11,5 horas a reação foi completada, conforme indicado pela interrupção do consumo de álcali e oxigênio. Durante a reação enzimática foram consumidos 462 ml de Ca(OH)2. Depois disso, foi realizada a inativação da enzima pelo aquecimento da mistura da reação durante 30 minutos a 80°C, o que resultou na precipitação de material de proteínas, originário da preparação da enzima adicionada. Então, o líquido foi resfriado até a temperatura ambiente, o pH foi ajustado a 6,8 através da adição de Ca(OH)2. Posteriormente, a mistura foi filtrada em um filtro profundo Seitz para remover a proteína precipitada.

Como um resultado, foi obtido um líquido claro, incolor, contendo gluconato lactato de cálcio. Esta solução a 24 ° Brix continha 0,6 M de cálcio (24 g/1), 0,4 M de lactato (36 g/1) e 0,8 M de gluconato (156 g/1). A solução mencionada acima foi seca por pulverização e como resultado foi obtido um pó branco, que tinha a seguinte composição: Umidade 3,62% Cálcio 10,26% Lactato 658 mg/g como está Gluconato 125 mg/g como está Açúcares redutores 0,23% Exemplo 2. Preparação de gluconato/lactato de cálcio Em uma experiência semelhante, conforme mencionado no exemplo 2, foi obtida uma concentração mais elevada de lactato gluconato de cálcio durante a reação enzimática.

Foi preparada uma solução adicionando-se 279 g de glucose.H20, 75 g de ácido lático (90%) e 271 g de água desmineralizada no fermentador. O ácido lático foi neutralizado com 240 ml de suspensão de hidróxido de cálcio. A conversão enzimática foi iniciada pela adição de 2,25 ml de GOD/Cat e foi feita uma adição extra de 0,1 ml desta enzima depois de 18h. O tempo de reação enzimática total foi de 21h, durante o qual 560 ml de Ca(OH)2 foram utilizados para neutralizar o ácido glucônico produzido. A solução assim obtida continha 0,75 M de cálcio (30 g/1), 0,5 M de lactato (44,5 g/1) e 1,0 M de gluconato (195 g/1), e portanto, continha aproximadamente 270 g/1 de material seco.

Depois de aquecimento e filtração, conforme mencionado no exemplo 2, o líquido foi estocado durante a noite a 4°C, sem qualquer indicação visual de cristalização.

Posteriormente, a solução foi seca por pulverização, resultando em um pó branco com a composição seguinte que tinha uma composição aproximadamente a mesma da mencionada no exemplo 2.

Exemplo 3. Preparação de gluconato de cálcio/lactato de magnésio Uma quantidade de 349,2 g de glucose. 1H20, 140,4 g de ácido lático (90%) e 688 g de água desmineralizada foi adicionada ao fermentador. O ácido lático foi neutralizado com controle automático de pH e uma suspensão a 20% (peso/volume) de Mg(OH)2, até que foi alcançado um pH de 5,0. Foram requeridas 204 g de suspensão de Mg(OH)2 para a neutralização do ácido lático. A reação enzimática foi iniciada pela adição de 3,0 ml de GOD/Cat. Durante a reação enzimática foi utilizada uma suspensão de CaC03 a 20% (peso/volume) para neutralizar o ácido glucônico desenvolvido. Depois de 19,5 horas 0,5 ml extra de glucose oxidase foram adicionados ao reator, o que foi repetido a 21,5 e 22,5 horas. A reação foi completada depois de 24h, conforme indicado pelo término do consumo de álcali e oxigênio. Durante a reação enzimática, foram consumidos 386,1 mm de CaC03.

Depois de aquecimento e filtração, conforme mencionado no exemplo 2, o líquido claro e incolor foi seco por pulverização, resultando em um pó branco com a seguinte composição: Umidade 7,4% Cálcio 70,4 mg/g como está Magnésio 22,8 mg/g como está Lactato 161 mg/g como está Gluconato 572 mg/g como está Açúcares redutores 0,23% Exemplo 4. Lactato de cálcio fermentativamente/gluconato de cálcio enzimaticamente Em um vaso de reação, foi preparado fermentativamente lactato de cálcio a partir de glucose, seguidos por uma conversão enzimática da glucose em gluconato de cálcio. Para este fim, foi realizada uma fermentação, utilizando-se a família Lactobacillus rhamnosus ATCC 10863.

Foram adicionados ao fermentador 257,5 g de glucose. 1H20, 20 g de extrato de levedura e água, até um volume final de 2.000 ml. A fermentação foi iniciada pela adição de 100 ml de uma pré-cultura desenvolvida anaerobicamente durante a noite contendo: família 10863 de Lactobacillus rhamnosus, 4,6% de glucose, 6% de extrato de levedura, 2,5% de CaCCb e 0,1% de MnCL2.4H20. Durante a fermentação a temperatura da reação foi ajustada em 37°C, o pH foi ajustado em 5,7 utilizando-se uma suspensão a 20% (peso/volume) de Ca(OH)2 para neutralizar o ácido lático desenvolvido. A velocidade do agitador foi ajustada em 100 RPM e não foi utilizada nenhuma aeração. Durante a fermentação, foram utilizadas 440 g de uma suspensão de Ca(OH)2. Depois de 24h a reação foi interrompida por aquecimento da mistura da reação durante 30 minutos a 70°C, para desativar a bactéria. A reação enzimática posterior foi realizada pela adição de 847,5 g de glucose. 1H20, 452,5 g de H20 e 8 ml de GOD/Cat no caldo de fermentação. A aeração foi realizada conforme mencionado anteriormente (ver: Condições da reação enzimática). Depois de 22,5, 23,5 e 24,5 horas de reação enzimática foram adicionadas porções extras de glucose oxidase de 2, 2 e 1 ml, respectivamente. A reação foi terminada em 26,5 horas. Um total de 819,1 g de suspensão de Ca(OH)2 foram utilizadas durante a reação enzimática. O caldo resultante foi processado por centrifugação para remover a biomassa de bactérias. O sobrenadante foi aquecido a 80°C durante 30 minutos durante o qual ele foi tratado com 10 g/1 de carvão ativado para descolorir a solução. Depois de filtrado através de um filtro profundo Seitz, foi obtido um líquido claro, muito ligeiramente amarelado, que foi seco por pulverização. O pó branco resultante tinha a seguinte composição: Umidade 4,6% Cálcio 103 mg/g como está Lactato 156 mg/g como está Gluconato 643 mg/g como está Açúcares redutores 0,29% Exemplo 5. Preparação de lactato com relação elevada de gluconato de cálcio - lactato de cálcio Foi preparada uma solução através da adição de 275 g de glucose.H20 e 750 g de água desmineralizada no fermentador. A reação foi iniciada pela adição de 3 ml de GOD/Cat. Simultaneamente foi adicionada lentamente ao fermentador uma solução de ácido lático a 50% (feita pela adição de 274 g de ácido lático a 90% e 220 g de água desmineralizada) através de bombeamento com uma vazão de 30 ml/hora. A adição de todo o ácido lático levou 22h.

Através do controle automático de pH e de uma suspensão a 25% (peso/volume) de CaC03, tanto o ácido glucônico, produzido pela reação enzimática, como o ácido lático que foi adicionado lentamente, foram neutralizados e mantidos em um pH de 5,0 durante todo o processo. A reação da enzima foi completada depois de 28h, conforme indicado pela interrupção do consumo de álcalis e oxigênio. Um total de 820 g de suspensão de carbonato de cálcio foram adicionadas durante o processo.

Então o pH da solução foi ajustado em 7,0 e ela foi aquecida e filtrada conforme mencionado no exemplo 1. A solução transparente e incolor resultante continha 3,9 M de cálcio, 1,3 M de lactato e 0,66 M de gluconato (156 g/litro de cálcio, 117 g/litro de lactato, 129 g/litro de gluconato).

Exemplo 6. Preparação de gluconato/lactato/citrato de cálcio De acordo com o método de reação do exemplo 2, foi preparada uma solução altamente concentrada de gluconato de cálcio e lactato de cálcio, contendo aproximadamente 28% de substância seca. Foi adicionado a esta mistura carvão ativado, a qual foi então aquecida a 90°C para inativar e precipitar as enzimas. Posteriormente, a mistura foi resfriada a 40°C.

Foram adicionadas a 2 kg desta mistura 250 g de monoidrato de ácido cítrico e 200 g de CaC03 enquanto se agitava continuamente. Depois que a formação de C02 terminou, a solução foi filtrada em um filtro profundo Seitz. A solução resultante transparente e quase que incolor continha aproximadamente 38% de substância seca e tinha um pH de 5,2. A solução foi seca por pulverização, resultando em um pó branco (gluconato/lactato/citrato de cálcio). O pó tinha um teor de umidade de 7,2% e um teor de cálcio de 15,3% com base na substância seca. O pó era completamente solúvel em água fria.

Claims (28)

1. Método para a preparação de gluconato de cálcio, caracterizado pelo fato de compreender a conversão enzimática de glucose em ácido glucônico, seguido pela conversão de ácido glucônico em gluconato de cálcio em uma mistura de reação na qual uma base de cálcio é administrada em uma quantidade suficiente para a produção de uma quantidade de gluconato de cálcio acima de 30 g/1 da mistura reacional e a qual compreende ainda pelo menos um sal de um ácido orgânico que é aceitável para uso em alimentos, e água.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida conversão enzimática é realizada utilizando-se glucose oxidase e catalase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido gluconato de cálcio é produzido em concentrações acima de 40 g/1 na mistura de reação e está essencialmente completamente dissolvido.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido gluconato de cálcio é produzido em concentrações acima de 100 g/1 na mistura da reação e está essencialmente completamente dissolvido.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido gluconato de cálcio é produzido em concentrações acima de 200 g/1 na mistura da reação e está essencialmente completamente dissolvido.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um sal de um ácido orgânico que é aceitável para uso em alimentos é escolhido do grupo de sais de lactatos, sais de citratos, sais de maleatos, e combinações dos mesmos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o sal é um sal de lactato.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o sal de lactato é administrado como um sal de lactato cristalino.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é utilizada uma combinação de ácido glucônico, ácido lático, ácido cítrico e uma base de cálcio como pelo menos o único sal de um ácido orgânico.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um sal de lactato é obtido por neutralização de ácido lático com uma base de metal alcalino e/ou base de metal alcalino terroso.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido ácido lático é obtido por conversão microbiológica anaeróbica de um carboidrato.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido carboidrato é glucose.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um sal de um ácido orgânico que é aceitável para uso em alimentos é um sal de cálcio.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a referida conversão enzimática é realizada em uma temperatura entre 0 e 50°C.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a referida conversão enzimática é realizada em uma temperatura entre 30 e 40°C.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a referida conversão enzimática é realizada em um pH entre 3 e 9.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a referida conversão enzimática é realizada em um pH entre 4 e 6.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a referida base de cálcio é administrada na mistura da reação em uma quantidade equivalente a uma concentração iônica final de cálcio de mais de 3,6 g/1 a 40°C derivada somente do gluconato de cálcio.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a referida base de cálcio é hidróxido de cálcio.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que as enzimas são removidas da mistura da reação por precipitação térmica seguida por filtração.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a referida água é removida por secagem por pulverização para obter-se uma mistura de sal de gluconato/sal de ácido orgânico.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida mistura de sal de gluconato/sal de ácido orgânico opcionalmente é descolorida.

23. Mistura de sal de gluconato/sal de ácido orgânico, caracterizada pelo fato de ser obtenível por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que o sal de gluconato e o sal de ácido orgânico estão presentes em uma relação em peso de 5:95 a 95:5, em que o gluconato de cálcio está presente acima de 30 g/1 da mistura e em que o sal de ácido orgânico é um sal de citrato ou de maleato.

24. Lactato/Gluconato de cálcio, caracterizado pelo fato de que compreende uma relação de gluconato de cálcio/lactato de cálcio de 65/35 com base em % em peso.

25. Produto de alimento fortificado com cálcio, caracterizado pelo fato de que compreende uma mistura de sal de gluconato/ácido orgânico obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

26. Suco de laranja, caracterizado pelo fato de que compreende uma mistura de sal de gluconato/ácido orgânico obtida por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

27. Produto de alimento fortificado com cálcio, caracterizado pelo fato de que compreende lactato/gluconato de cálcio como definido na reivindicação 24.

28. Suco de laranja, caracterizado pelo fato de que compreende lactato/gluconato de cálcio como definido na reivindicação 24.