CN108456669A

CN108456669A - 一种核糖体结合位点、重组表达质粒、转化子及其应用

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Publication number: CN108456669A
Application number: CN201710091153.5A
Authority: CN
Inventors: 陈玲; 周豪宏; 刘修才
Original assignee: Shanghai Cathay Biotechnology Research and Development Center Co Ltd; Cathay Industrial Biotech Ltd
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: CN108456669B

Abstract

本发明第一方面涉及一种核糖体结合位点，第二方面涉及包含这种核糖体结合位点的重组表达质粒，第三方面涉及包含所述重组表达质粒的转化子，本发明还涉及这种转化子在发酵生产多肽，以及进一步发酵生产1,5‑戊二胺的方面的应用。本发明的技术要点在于所述核糖体结合位点的序列5’‑3’包含如下所示的序列之一：a)、GAGAGGAGGA；b)、AAGGGAAATT；c)、TTAAAGAGGG。本发明解决了目前的菌株的赖氨酸脱羧酶的表达量低，菌株体外转化赖氨酸的时间长的技术问题。

Description

一种核糖体结合位点、重组表达质粒、转化子及其应用

技术领域

本发明第一方面涉及一种核糖体结合位点，第二方面涉及包含这种核糖体结合位点的重组表达质粒，第三方面涉及包含所述重组表达质粒的转化子，本发明还涉及这种转化子在发酵生产多肽，以及进一步发酵生产1,5-戊二胺的方面的应用。

背景技术

赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase,简称LDC,EC 4.1.1.18)广泛存在于微生物，昆虫，动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。而1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法1,5-戊二胺生产主要采用以下两种方法，微生物发酵生产(简称一步法)和微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺(简称两步法)。

中国专利CN 105441497 A通过构建结构为(IPTG/乳糖)可诱导型启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因大量分泌表达。首先通过可以高产L-赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌株利用葡萄糖发酵生产L-赖氨酸，再通过加入IPTG/乳糖等诱导剂诱导赖氨酸脱羧酶分泌表达，催化L-赖氨酸转化为尸胺。这样可以实现利用葡萄糖一步法生产1,5-戊二胺，即微生物发酵生产L-赖氨酸并偶联催化L-赖氨酸脱羧反应生成1,5-戊二胺(简称一步法)。但该系统除了需要额外添加IPTG/乳糖外，泄漏表达的情况也比较严重，由于菌体本身耐受的1,5-戊二胺浓度有限，如果发酵体系中前期表达了赖氨酸脱羧酶转化生成的1,5-戊二胺过多，就会对菌体造成毒害，从而抑制菌体生长及利用葡萄糖生产L-赖氨酸的过程(Qian,et al.,Biotechnol.Bioeng.2011；108:93–103)。

然而，利用微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺不会存在这种问题，对于微生物体外酶催化赖氨酸生产1,5-戊二胺，中国专利CN104762336A将赖氨酸脱羧酶加入到赖氨酸发酵液中进行转化，大大简化了催化流程。如果能通过对产赖氨酸脱羧酶的细胞进行改造，加大细胞赖氨酸脱羧酶的表达量，将会进一步降低成本，提高L-赖氨酸转化效率及1，5-戊二胺的产量。

发明内容

为了筛选到不同赖氨酸脱羧酶表达量的突变菌株，可以采用非理性设计的方法对影响基因翻译水平的核糖体结合位点(RBS)进行突变，具体而言通过将酶蛋白的基因克隆到一个合适的表达载体中，再有目的性的设计合成一组随机引物对RBS序列进行随机突变，通过高通量筛选并结合酶活性检测方法，以获得具有预期表型的突变质粒。

本发明通过非理性设计的手段对赖氨酸脱羧酶基因起始密码子前的RBS位点进行随机突变，并结合高通量筛选与酶活测定的方法获得一组活性相比野生型赖氨酸脱羧酶出现增加的突变菌株，鉴定突变的RBS序列后，将突变质粒转化至蜂房哈夫尼等菌株中，可以实现微生物菌株提高赖氨酸脱羧酶的表达量，缩短体外转化赖氨酸的时间；对工业生产将会有重要的意义和帮助。

本发明的第一方面目的在于提出一种核糖体结合位点，以解决目前的菌株表达多肽如赖氨酸脱羧酶表达量低的技术问题。

一种核糖体结合位点，所述核糖体结合位点的序列5’-3’包含(或者是)如下所示的序列之一：a)、GAGAGGAGGA；

b)、AAGGGAAATT；

c)、TTAAAGAGGG。

本发明的第二方面目的在于提出一种重组表达质粒，以解决目前的菌株表达多肽如赖氨酸脱羧酶表达量低的技术问题。

一种重组表达质粒，包括重组表达质粒的目的基因及相应的核糖体结合位点，所述核糖体结合位点如上文任一技术方案所述，优选地，所述核糖体结合位点位于起始密码子上游-15到-6位。

进一步，所述的一种重组表达质粒，其骨架质粒是在宿主细胞中可复制的骨架质粒，当宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)和蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)中时，优选pUC、pBR322、pACYC质粒和它们的衍生质粒中的一种。

在上述技术方案的基础上进一步，所述重组表达质粒的目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；又进一步，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步，所述裂合酶是脱羧酶，又更进一步，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。再更进一步，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是可以来源于微生物，动物或植物的细胞，如来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiellaoxytoca)的赖氨酸脱羧酶基因；所述赖氨酸脱羧酶基因也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。进一步优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；更进一步优选地，所述赖氨酸脱羧酶基因是来源于大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶基因CadA/LdcI(SEQ ID No:1)。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。

本发明的第三方面目的在于提出一种转化子，以解决目前的菌株表达多肽如赖氨酸脱羧酶表达量低的技术问题。

一种转化子，所述转化子的重组表达质粒是如上文任一项技术方案所述的重组表达质粒。

或者，一种转化子，所述转化子的基因组包含目的基因及相应的核糖体结合位点，所述核糖体结合位点如上文所述，优选地，所述核糖体结合位点位于起始密码子上游-15到-6位；所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；进一步优选地，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶是脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。

进一步，所述转化子的重组表达质粒的目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸，又进一步，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是来源于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(K.oxytoca)的赖氨酸脱羧酶基因；更进一步，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；又更进一步，所述cadA基因是来源于大肠杆菌(E.coli)的cadA基因。

在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子的宿主菌为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，进一步优选是大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

本发明的第四方面目的在于提出一种发酵生产多肽的方法，以解决目前的方法使用的菌株表达多肽(如赖氨酸脱羧酶)表达量低的技术问题。

一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一技术方案所述的转化子；

B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。

进一步，所述的一种发酵生产多肽的方法，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：1)培养如上文任一技术方案所述的转化子，所述转化子的重组表达质粒的目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸；

2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

本发明的第五方面目的在于提出一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，以解决目前的方法使用的菌株表达赖氨酸脱羧酶的表达量低，菌株体外转化赖氨酸的时间长的技术问题。

一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：

I)按照上述发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1)生成赖氨酸脱羧酶；

II)用步骤I)中得到的菌液或菌体，或用来自所述菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。

本发明的第六方面目的在于提出一种mRNA，以解决目前的菌株表达多肽(如赖氨酸脱羧酶)表达量低的技术问题。

一种mRNA，其特征在于，所述mRNA的序列包括与权利要求1所述的核糖体结合位点对应的序列。

本发明的有益效果：

本发明基于非理性设计的方法，结合随机突变与高通量筛选的方法，后续利用赖氨酸转化率和赖氨酸脱羧酶表达水平检测可以得到一系列能够调控赖氨酸脱羧酶不同表达强度的核糖体结合位点，带有这些核糖体结合位点的重组赖氨酸脱羧酶表达质粒，以及得到一系列赖氨酸脱羧酶不同表达水平的突变菌株。其中赖氨酸脱羧酶表达水平提高(本发明至少提高68％)的突变菌株可以用于体外赖氨酸转化，显著缩减体外微生物将赖氨酸全部转化完的时间。本发明的赖氨酸脱羧酶表达水平提高的突变菌株，实质上是核糖体与mRNA的RBS位点的结合能力得到提高。本发明不但可以用于提高赖氨酸脱羧酶的表达量，还可以用于提高其它多肽的表达量。

附图说明

图1是同等OD的野生型与突变菌株赖氨酸脱羧酶CadA的SDS-PAGE分析(赖氨酸脱羧酶单体分子量约80kDa)；

图2是不同浓度戊二胺对菌体生长的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合附图，详细说明本发明。

本发明中采用如下定义：

1.本发明中所使用的碱基序列，核苷酸、氨基酸(单字母)的缩写，是基于国际理论和应用化学联合会及国际生物联合会对生物化学命名的规定，可参考European Journalof Biochemistry 1984年底138卷第9期的＂准备含碱基序列和氨基酸序列的说明书的指导＂一文中的缩写，以及在生物技术领域中通用的缩写。

2.RBS序列表示方法：

如无特殊说明，RBS序列均为5’-3’表示，本说明书中给出的鉴定得到的序列(见表2)为ATG之前的碱基，其中RBS用黑体下划线指出。

本发明的第一方面提出了一种核糖体结合位点，该核糖体结合位点，所述核糖体结合位点的序列5’-3’包含如下所示的序列之一：

a)、GAGAGGAGGA；

b)、AAGGGAAATT；

c)、TTAAAGAGGG。

本发明的第二方面提出了一种重组表达质粒，该重组表达质粒，包括重组表达质粒的目的基因及相应的核糖体结合位点，所述核糖体结合位点如上文任一技术方案所述。优选地，所述核糖体结合位点位于起始密码子上游-15到-6位。所述的一种重组表达质粒，其骨架质粒是在宿主细胞中可复制的骨架质粒，当宿主细胞是大肠杆菌和哈夫尼菌中时，优选pUC、pBR322、pACYC质粒(均购自宝生物工程(大连)有限公司)和它们的衍生质粒中的一种。pUC质粒优选例如pUC18和pUC19质粒。所述重组表达质粒的目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；又进一步，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步，所述裂合酶是脱羧酶，又更进一步，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。再更进一步，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是可以来自微生物，动物或植物的细胞，如来源于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(K.oxytoca)的赖氨酸脱羧酶基因；所述赖氨酸脱羧酶基因也可以来源于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。进一步优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；更进一步优选地，所述赖氨酸脱羧酶基因是来源于大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶基因CadA/LdcI(SEQ ID No:1)。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段.。

本发明的第三方面提出了一种转化子，该转化子的重组表达质粒是如上文任一项技术方案所述的重组表达质粒；或者所述转化子的基因组包含目的基因及相应的核糖体结合位点，所述核糖体结合位点如上文所述，优选地，所述核糖体结合位点位于起始密码子上游-15到-6位；所述目的基因如上文所述的重组表达质粒的目的基因。优选地，所述转化子的重组表达质粒的目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)的赖氨酸脱羧酶基因；又进一步，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；更进一步，所述cadA基因是来源于大肠杆菌(E.coli)的cadA基因。

所述转化子的宿主菌为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，进一步优选是大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

本发明的第四方面提出了一种发酵生产多肽的方法，该发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一技术方案所述的转化子，所述转化子的重组表达质粒的目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸；

B)从步骤A)中得到的菌液或菌体中得到多肽。

进一步，所述的一种发酵生产多肽的方法，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如上文任一技术方案所述的转化子；

2)从步骤1)中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

本发明的第五方面提出了一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，该发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：

本发明的目的在于通过对赖氨酸脱羧酶核糖体结合位点(RBS)进行随机突变的方法构建一系列不同翻译水平的赖氨酸脱羧酶表达载体，结合高通量筛选与酶活测定的手段鉴定到一组能够调控赖氨酸脱羧酶翻译的RBS。将含有这些突变位点的赖氨酸脱羧酶表达质粒转化入蜂房哈夫尼菌株中，可以得到一系列不同赖氨酸脱羧酶表达水平的重组菌株。

本发明首先以大肠杆菌(E.coli MG1655K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)基因组为模板克隆出赖氨酸脱羧酶CadA编码基因基因，并将其构建到合适的表达载体中，使其可以在大肠杆菌E.coli BL21或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)中成功表达。进而利用合成随机引物并对质粒进行扩增的方法对其5’端的RBS序列进行突变，并通过高通量筛选的方法获得一组赖氨酸脱羧酶赖氨酸转化率升高或降低的突变菌株。通过测序的方法鉴定突变的RBS的序列。进一步将由于RBS突变导致的赖氨酸脱羧酶基因表达强度增强的质粒转化至蜂房哈夫尼菌中，可以获得赖氨酸脱羧酶表达水平提高的重组菌株。

在一些实施方案中，用于筛选由于RBS突变导致不同表达强度的赖氨酸脱羧酶突变体时所选的宿主细胞可以是微生物、植物或动物细胞，优选微生物细胞。在一些实施方案中，用于筛选由于RBS突变导致不同表达强度的赖氨酸脱羧酶突变体时选择作为宿主的微生物可以是大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，天蓝色链霉菌(S.coelicolor)，蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，优选大肠杆菌BL21(E.coli BL21(DE3))。

在一些实施方案中，用于验证由于RBS突变导致不同赖氨酸脱羧酶表达强度的突变质粒时所选的宿主细胞可以是微生物，植物，或动物细胞，优选微生物细胞。在一些实施方案中，用于验证由于RBS突变导致不同赖氨酸脱羧酶表达强度的突变质粒时选择作为宿主的微生物可以是大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，天蓝色链霉菌(S.coelicolor)，蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，优选蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

在一些实施案例中，利用这些由于RBS突变导致不同赖氨酸脱羧酶表达强度的突变质粒表达赖氨酸脱羧酶的宿主细胞优选蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。该菌株为适用于工业规模生产的工业菌株。工业菌株可以在放大实验中进行培养，包括摇瓶和发酵罐中进行培养，培养的规模可以足够大。

在一些实施方案中，培养菌体的温度可以是任何能够让菌体生长的温度，较合适的温度是20～40度，优选30～40度，更优选35～40度。培养的时间可以是约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天或者约10天。

在一些实施案例，转化子的培养基含有多肽，蛋白胨，维生素，微量元素和矿物质，这样的培养基可以包括但不局限于常用的LB培养基(由胰蛋白胨，酵母提取物和氯化钠溶解于水制成)。

在一些实施方案中，细胞赖氨酸转化率采用核磁共振方法检测赖氨酸催化赖氨酸转化生成的1,5-戊二胺的量来计算。

以下实施例对比例中提到的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标Axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标INVITROGEN；有特别说明的除外。

如无特殊说明，以下实施例、对比例中提到的转化方法如下：将10μl的连接产物或2μl的质粒加入至100μl的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB培养基。涂布至相对应的抗性平板上。

OD₆₀₀(OD_562nm)测量方法：将3ml的未培养细胞的培养基加入到1cm宽的比色皿中，在UV-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)中600nm(562nm)下吸收光(ABS)校零。将比色皿洗净晾干后加入2.9ml未培养细菌的培养基，加入0.1ml的发酵液混匀后在UV-8000紫外可见分光光度计中测试600nm(562nm)下的吸收光值。仪器显示数值乘以30即为发酵液的OD₆₀₀(OD_562nm)。

实施例1

1.1、赖氨酸脱羧酶基因cadA的克隆

使用引物cadA--SacI-F和cadA--XbaI-R(表1所示的引物)将赖氨酸脱羧酶(SEQID No:1)编码基因cadA(SEQ ID No:2)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)的基因组中扩增出来，通过SacI和XbaI双酶切后，连入同样双酶切的pUC18质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)中得到连接产物。利用CaCl₂法制备E.coliBL21(购自宝生物工程(大连)有限公司)的感受态细胞，并用热激法将连接产物转化至E.coli BL21细胞中，利用LB培养基中添加100μg/ml的氨苄抗生素进行筛选，克隆PCR和测序验证(验证cadA序列正确)后，抽提质粒即得到pCIB60质粒。

以质粒pCIB60为模板，进一步利用cadA-F2和cadA-R2对pCIB60质粒中cadA基因的5’序列进行优化(优化是指为了使CadA可以顺利表达，cadA基因的5’端上游序列由

5’-ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’替换为

5’-ATTTCACACAGGAAACAGCT-3’)。PCR扩增后，利用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行消化，同样利用热激法转化至E.coli BL21中，测序验证(验证cadA基因的5’端上游序列由5’-ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’替换为了5’-ATTTCACACAGGAAACAGCT-3’)后得到质粒pCIB71。

表1.本发明中所用到的引物。

1.2赖氨酸脱羧酶基因CadA编码序列前RBS随机突变库的构建及其筛选

利用1.1中所构建的质粒pCIB71作为模板，利用随机引物cadA-RBS-F和cadA-RBS-R(表1)进行扩增，在此过程中引入突变。现有技术(见Schurr T,Nadir E,MargalitH.Identification and characterization of E.coli ribosomal binding sites byfree energy computation..Nucleic Acids Research,1993,21(21):4019-4023)预测绝大多数基因起始密码子(ATG)前的-7到-12位为核糖体结合位点(RBS)，本发明将-6到-15位这段序列认为是RBS。

PCR体系配制(50μl)：

25μlMax DNA聚合酶(2×Premix,宝生物工程(大连)有限公司)

1μl正向引物cadA-RBS-F(10μM)

1μl反向引物cadA-RBS-R(10μM)

1μl模板DNA(400ng)

22μl ddH₂O至总体积为50μl.

PCR程序：95℃变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min 30s，35个循环；72℃终延伸，7min。

扩增结束后，利用Axygen PCR cleanup试剂盒对PCR产物进行清洁。限制性内切酶DpnI酶切，37℃过夜(16h)后，酶切产物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)中，构建突变体库。

抽提突变体库中的重组赖氨酸脱羧酶突变基因的质粒，并重新转化至E.coliBL21菌株中(同时转化pCIB71质粒至E.coli BL21菌株中，获得菌株CIB71作为对照)，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行初筛，具体而言随机挑取约1000个单克隆于含有液体LB(+100μg/ml氨苄青霉素)的96孔深孔板中37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)培养过夜(16h)。利用排枪各取600μl的LB培养液至一个新的96孔深孔板中(同时设置反应开始不加入、反应结束后加入对照菌株的菌液的反应孔作为空白对照)，并加入400μl的赖氨酸盐酸溶液(浓度400g/L)和辅酶PLP(磷酸吡哆醛，终浓度为0.1mM)，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)反应2hrs，根据赖氨酸脱羧酶催化过程中1,5-戊二胺的生成会伴随pH的升高，反应结束后于每个反应孔中滴加酸碱指示剂(指示剂B：1mg溴百里香酚蓝溶于10ml去离子水中；指示剂C：10mg中性红溶于10ml乙醇中；指示剂C和B按1：1体积比混合)，根据指示剂颜色挑取明显相对未突变的对照菌株CIB71的pH升高的多或少(但相对空白对照仍有颜色变化)的突变株进行复筛和测序鉴定突变RBS序列。

1.3RBS突变体文库筛选结果及突变位点测序鉴定

对构建的CadA易错PCR突变体文库进行初筛，1000个单克隆中有51个在96孔深孔板中生长不起来的判定为假阳性克隆；其余949个克隆中共筛选到15个克隆颜色变化明显强于对照菌株的突变株，筛选到14个单克隆颜色变化明显低于未突变的对照菌株CIB71的突变株。对这29个克隆进行两次复筛(复筛方法与初筛同)。复筛后从中确定了3个克隆明显有低于对照的赖氨酸脱羧酶活性。有3株单克隆明显高于对照的赖氨酸脱羧酶活性。

进一步将这6个克隆接种至5ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)进行培养，37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)过夜(16h)。抽提质粒后对赖氨酸脱羧酶基因前的序列进行测序鉴定突变RBS序列，测序结果如下表2所示。

表2：CadA易错突变体文库中筛选到的6株突变体突变位点鉴定。

1.4赖氨酸脱羧酶CadA突变蛋白赖氨酸转化率测定

将1.3提取的6个克隆的质粒和对照pCIB71质粒分别转化至蜂房哈夫尼(H.alvei)的感受态细胞中，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。进一步分别各挑取5个单克隆，利用5ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)进行培养，37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)过夜(16h)。分别取600μl的各克隆的LB培养液至EP管中，并加入400μl的赖氨酸盐酸溶液(浓度为400g/l)和辅酶PLP(磷酸吡哆醛，终浓度为0.1mM)，自然pH(约为6.7)，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)反应2hrs，反应结束后对反应液进行12000rpm离心3min(常温离心机，型号Beckman coulter microfuge 16centrifuge，下同)，取500μl的反应液上清于核磁管中，并加入100μl D₂O：DMSO＝30：1(质量比)作为内标，利用核磁共振检测反应体系中剩余的赖氨酸的量，以此计算生成的1,5-戊二胺的量和赖氨酸转化率(计算1,5-戊二胺的摩尔量除以剩余的赖氨酸和1,5-戊二胺的总摩尔量)，进而计算相对CIB71的相对赖氨酸转化率，结果如表3所示。

表3.核磁检测3株CadA突变株与野生型菌株相比的赖氨酸转化率及OD₆₀₀。

如表3所示，相同的反应时间内，含有突变RBS质粒pCIB71-RBS1，pCIB71-RBS2和pCIB71-RBS3的突变株的赖氨酸转化率分别是对照CIB71菌株的38％，58％和75％，且这三株突变株与对照相比生长无显著差异。由此分析是由于RBS突变导致赖氨酸脱羧酶表达水平下降，从而引起了突变株CIB71-RBS-1，CIB71-RBS-2和CIB71-RBS-3细胞反应赖氨酸转化率下降。而CIB71-RBS-4，CIB71-RBS-5，CIB71-RBS-6这三株突变菌株与对照相比赖氨酸转化率都有显著提高，分别是对照的189％，168％和177％；CIB71-RBS-4，CIB71-RBS-5，CIB71-RBS-6这三株突变株的生长与对照相比无显著变化，为了进一步验证这三株突变株相对对照赖氨酸转化率的提高是单纯因为RBS的突变引起的赖氨酸脱羧酶基因表达量的提高，而不是由于菌体生长速度增加引起的转化率提高，进一步通过蛋白表达水平分析进行确定。

1.5突变赖氨酸脱羧酶CadA的提取及SDS-PAGE电泳分析

利用1.4中CIB71，CIB71-RBS-1，CIB71-RBS-2，CIB71-RBS-3，CIB71-RBS-4，CIB71-RBS-5，CIB71-RBS-6突变株的菌液，并根据1.4中测定的菌株的OD将这几株菌的OD调整为相同的水平，取同样体积(4ml)的同样OD的野生型和突变株的菌液，12000rpm离心10min，弃上清。按如下步骤提取各菌株的胞内蛋白：

1)用1ml的buffer 1(Buffer 1(pH 8):50mM Tris-HCl pH 8；25mM NaCl；2mMEDTA)重悬菌体(以下简称样品)；

2)-20℃冻存1hr；

3)37℃，15min融化样品；

4)加5μl溶菌酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)，并继续在37℃孵育3hrs，期间颠倒混匀几次；

5)-20℃冻存1hr；

6)37℃，15min融化样品；

7)加入1μl的DNase I(购自宝生物工程(大连)有限公司)，继续在37℃孵育1hrs；

8)12000rpm离心10min，取上清至一个新的EP管中，确保上清不含有细胞碎片；

9)上清保存在4℃冰箱，备用；沉淀用1ml的buffer 1悬浮，备用。

分别取各菌株的胞内蛋白上清各64μl，加入16μl的5×SDS-PAGE上样缓冲液(配方：250mM Tris-HCl(pH6.8)，10％(w/v)SDS,0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油，5％(v/v)β-巯基乙醇)于沸水浴中煮沸变性10min，短暂冷却后，12000rpm离心2min，取10μl上清进行SDS-PAGE分析，结果如附图1所示。可以看出突变株CIB71-RBS-1，CIB71-RBS-2和CIB71-RBS-3上清中的赖氨酸脱羧酶CadA表达量与对照CIB71相比有明显下降的趋势，从蛋白表达水平上验证了突变的RBS使得赖氨酸脱羧酶的翻译速率出现了显著下降；而CIB71-RBS-4，CIB71-RBS-5和CIB71-RBS-6突变株表达的赖氨酸脱羧酶与对照相比出现显著提高，也从蛋白水平上验证了这三个突变的RBS使得赖氨酸脱羧酶的翻译速率出现了显著上升。

对比例1

不同浓度的1,5-戊二胺对微生物生长的抑制

将能够表达赖氨酸脱羧酶CadA的质粒pCIB71转化至大肠杆菌CIB103-2菌株中得到CIB103-71菌株。其中CIB103-2菌株的具体构建方法如下：

1.构建四环素外排泵(tetracycline effluxpump)表达载体骨架：

利用引物psyn-1和psyn-2合成启动子序列(SEQ ID NO:10)，其中引物psyn-1包启动子序列和一段与pUC18同源的序列，引物psyn-2包含一段与pUC18同源的序列，这两个PCR引物用于扩增合成的启动子序列和pUC18载体的一部分序列，其中包括多克隆位点，限制性内切酶EcoRI和ScaI用于消化扩增出来的DNA片段，进一步连接入pUC18中构建得到pCIB10。

2.构建四环素外排泵表达载体：

利用引物tetA-F和tetA-R四环素外排泵TetA(SEQ ID NO:11)编码基因(tetA，SEQID NO:12)，从大肠杆菌克隆载体pBR322中扩增得到，利用SacI和XbaI双酶切后连接至pCIB10质粒中得到pCIB20。

3.赖氨酸合成途径上三个蛋白LysC，DapA和LysA阅读框的构建：

大肠杆菌基因组中编码赖氨酸生物合成途径上的三个蛋白的基因，lysC，dapA和lysA：天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC编码)，二氢吡啶二羧酸合酶(DapA或DHDPS，由dapA编码)，二氨基庚酸脱羧酶(LysA，由lysA编码)，这三个基因克隆至质粒载体中，由此三个蛋白LysC(SEQ ID NO:13),DapA(SEQ ID NO:15),LysA(SEQ ID NO:17)可以实现在大肠杆菌中的过表达。首先利用引物lysC-F和lysC-R将基因lysC(SEQ ID NO:14)从大肠杆菌E.coliMG1655K12的基因组中扩增出来，用SacI和BamHI双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pUC18中得到质粒pCIB7。利用引物dapA-F和dapA-R将基因dapA(SEQ ID NO:16)从大肠杆菌E.coli MG1655K12的基因组中扩增出来，用BamHI和XbaI双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pCIB7中得到质粒pCIB8。利用引物lysA-F和lysA-R将基因lysA(SEQ IDNO:18)从大肠杆菌E.coli MG1655K12的基因组中扩增出来，用XbaI和SalI双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pCIB8中得到质粒pCIB9。再进一步利用lysC-F和lysA-R将这三个基因一并从pCIB9中扩增出来，并利用SacI和SalI双酶切消化，连接至同样双酶切的质粒pCIB10中得到pCIB32。

4.天冬氨酸激酶编码基因突变载体构建：

为了提高赖氨酸的产量，进一步对天冬氨酸激酶基因(LysC或AKIII，由lysC,SEQID NO:18编码)进行突变，具体而言，利用引物318-F,318-R,323-F,323-R扩增得到LysC-1(LysC-M318I,G323D，SEQ.ID NO:21)编码基因lysC-1(SEQ ID NO:20)，并通过替换pCIB32中的野生型lysC，得到质粒pCIB43。突变后的LysC-1能够进一步减弱赖氨酸的反馈抑制。

5.构建赖氨酸合成通路中另外三种蛋白Asd，DapB和AspC的共表达载体：

进一步，对赖氨酸合成通路中的另外三个基因asd，dapB和aspC进行过表达。这些基因分别编码下列三个蛋白：天冬氨酸盐半醛脱氢酶(Asd(SEQ ID NO:21)，由asd编码)，二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB或DHDPR(SEQ ID NO:23),由dapB编码)，天冬氨酸转氨酶(AspC(SEQ ID NO:25),由aspC编码)。利用引物asd-F和asd-R将asd(SEQ ID NO:22)从大肠杆菌MG1655K12基因组中扩增出来，利用SacI和BamHI双酶切后，连接至pUC18中构建得到pCIB12；利用引物dapB-F和dapB-R将dapB(SEQ ID NO:24)从大肠杆菌MG1655K12基因组中扩增出来，利用BamHI和XbaI双酶切后，连接至pCIB12中构建得到pCIB13；利用引物aspC-F和aspC-R将aspC(SEQ ID NO:26)从大肠杆菌MG1655K12基因组中扩增出来，利用XbaI和SalI双酶切后，连接至pCIB13中构建得到pCIB31；利用引物tetA-F3和tetA-R3，以质粒pCIB20为模板，扩增得到tetA编码基因，利用XhoI和SphI双酶切后连入pCIB31构建得到pCIB59。

6.构建赖氨酸合成通路中六个基因共表达质粒：

利用引物LAL-F and LAL-R从pCIB43中将lysC-1,dapA,and lysA一起扩增出来，ApaI和KpnI双酶切后，与同样双酶切的质粒pCIB59连接，得到pCIB103-2质粒。

7.构建CIB103-2菌株：

将构建好的pCIB103-2质粒转化至大肠杆菌BL21中，得到大肠杆菌CIB103-2菌株。

分别挑取CIB103-71菌株的单克隆至含有不同浓度(0,5,10,15,20,25,30,35,40g/L)的1,5-戊二胺的培养基(5mL液体培养基中含有4％<质量百分数,以下组分同>葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD.),0.05％L-蛋氨酸,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸,10μg/mL四环素)中，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)培养过夜(24h)，利用分光光度计测定各1,5-戊二胺浓度条件下菌体的OD_562nm。结果如附图2所示，可以看出，当1,5-戊二胺浓度从0至20g/L逐渐增加时，菌体的OD急剧下降；当1,5-戊二胺浓度超过20g/L后，几乎检测不到菌体生长。

实施例2

赖氨酸生产菌株一步法生产1,5-戊二胺

将野生型质粒pCIB71和随机突变筛选到的含有能够引起赖氨酸酸脱羧酶表达量降低的RBS序列的突变质粒(pCIB71-RBS1，pCIB71-RBS2，pCIB71-RBS3)分别转化至能够生产赖氨酸的大肠杆菌CIB103-2中，分别得到CIB103-71，CIB103-71-RBS1，CIB103-71-RBS2和CIB103-71-RBS3菌株。以CIB103-2菌株作为对照，分别挑取单克隆至5mL液体培养基中(含有4％<质量百分数,以下组分同>葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD.)，0.05％L-蛋氨酸,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸,10μg/mL四环素,100μg/mL氨苄青霉素)，于37℃，250rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)培养过夜(24h)。第二天，每个菌株再分别转接至100ml新鲜的含有30g/L葡萄糖,0.7％(质量百分数)Ca(HCO₃)₂,10μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的培养基中于37℃，170rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号SPH-211B)继续培养72小时，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸和1,5-戊二胺的含量(表4)。如表4所示，随着突变株CIB103-71-RBS3，CIB103-71-RBS2和CIB103-71-RBS1菌株表达的赖氨酸脱羧酶的量逐渐降低，1,5-戊二胺的产量逐渐升高，也就意味着更多的赖氨酸发生了转化，由此可能降低了赖氨酸对赖氨酸合成相关的酶的阻遏，赖氨酸的产量也会进一步增加并转化为1,5-戊二胺，体现在测定的L-赖氨酸和1,5-戊二胺的总量逐渐升高。

表4.检测能同时表达赖氨酸合成蛋白及赖氨酸脱羧酶的菌株赖氨酸和1,5-戊二胺的水平。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> 一种核糖体结合位点、重组表达质粒、转化子及其应用

<130> PA16011-1

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 715

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 2

<211> 2148

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA-RBS

<400> 3

ggataacaat ttcacacagg aaacagct 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA RBS-1

<400> 4

ggataacaat ttcgtcatca aaacagct 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA RBS-2

<400> 5

ggataacaat ttccgcaaag atacagct 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA RBS-3

<400> 6

ggataacaat ttcaaagatt taccagct 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA RBS-4

<400> 7

ggataacaat ttcgagagga ggacagct 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA RBS-5

<400> 8

ggataacaat ttcaagggaa attcagct 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA RBS-6

<400> 9

ggataacaat ttcttaaaga gggcagct 28

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter

<400> 10

agtttattct tgacatgtag tgagggggct ggtataat 38

<210> 11

<211> 396

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TetA

<400> 11

Met Lys Ser Asn Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Thr Leu

1 5 10 15

Asp Ala Val Gly Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu

20 25 30

Arg Asp Ile Val His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu

35 40 45

Leu Ala Leu Tyr Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly

50 55 60

Ala Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu

65 70 75 80

Leu Gly Ala Thr Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu

85 90 95

Trp Ile Leu Tyr Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr

100 105 110

Gly Ala Val Ala Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp

115 120 125

Arg Ala Arg His Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met

130 135 140

Val Ala Gly Pro Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His

145 150 155 160

Ala Pro Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu

165 170 175

Gly Cys Phe Leu Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met

180 185 190

Pro Leu Arg Ala Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly

195 200 205

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Gln Ala Met Leu Ser Arg Gln Val Asp Asp Asp His Gln Gly Gln Leu

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Gln Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ile Ile Gly Pro

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245 250 255

Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg

260 265 270

Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile

275 280 285

Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val

290 295 300

Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala

305 310 315 320

Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn

325 330 335

Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln

340 345 350

<210> 22

<211> 1104

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 22

atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60

atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120

ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180

gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240

atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300

ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360

gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420

ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480

taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540

catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600

gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660

ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720

gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780

gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840

aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900

tgggcgaaag tcgttccgaa cgatcgggaa atcactatgc gtgagctaac cccagctgcc 960

gttaccggca cgctgaccac gccggtaggc cgcctgcgta agctgaatat gggaccagag 1020

ttcctgtcag cctttaccgt gggcgaccag ctgctgtggg gggccgcgga gccgctgcgt 1080

cggatgcttc gtcaactggc gtaa 1104

<210> 23

<211> 273

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 23

Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg

1 5 10 15

Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln

20 25 30

Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp

35 40 45

Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser

50 55 60

Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr

65 70 75 80

Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly

85 90 95

Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln

100 105 110

Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn

115 120 125

Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala

130 135 140

Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His

145 150 155 160

Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu

165 170 175

Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr

180 185 190

Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe

195 200 205

Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe

210 215 220

Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg

225 230 235 240

Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly

245 250 255

Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn

260 265 270

Leu

<210> 24

<211> 822

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 24

atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60

ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggagcgtgaa 120

ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180

accgtgcaaa gcagcctcga tgcggtaaaa gatgattttg atgtgtttat cgattttacc 240

cgtccggaag gtacgctgaa ccatctcgct ttttgtcgcc agcatggcaa agggatggtg 300

atcggcacta cggggtttga cgaagccggt aaacaagcaa ttcgtgacgc cgctgccgat 360

attgcgattg tctttgctgc caattttagc gttggcgtta acgtcatgct taagctgctg 420

gagaaagcag ccaaagtgat gggtgactac accgatatcg aaattattga agcacatcat 480

agacataaag ttgatgcgcc gtcaggcacc gcactggcaa tgggagaggc gatcgcccac 540

gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600

cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660

accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgt ctggagatca cccataaggc gtccagccgt 720

atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780

ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttgt aa 822

<210> 25

<211> 396

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 25

Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly

20 25 30

Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser

35 40 45

Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn

50 55 60

Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu

65 70 75 80

Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg

85 90 95

Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp

100 105 110

Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro

115 120 125

Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val

130 135 140

Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp

145 150 155 160

Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu

165 170 175

Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu

180 185 190

Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro

195 200 205

Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp

210 215 220

Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val

225 230 235 240

Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly

245 250 255

Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe

260 265 270

Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala

275 280 285

His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg

290 295 300

Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg

305 310 315 320

Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg

325 330 335

Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly

340 345 350

Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr

355 360 365

Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn

370 375 380

Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu

385 390 395

<210> 26

<211> 1191

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 26

atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60

cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120

ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180

accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240

ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300

ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360

aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420

ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480

gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540

tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600

tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660

ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720

gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780

gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840

gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900

gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960

atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020

atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080

ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140

acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-SacI-F

<400> 27

tccgagctca tgaacgttat tgcaatattg 30

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-XbaI-R

<400> 28

gcctctagac cacttccctt gtacgagc 28

<210> 29

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-F2

<400> 29

atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaat 44

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-R2

<400> 30

agctgtttcc tgtgtgaaat 20

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-RBS-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 31

cggataacaa tttcnnnnnn nnnncagcta tgaacgttat tgcaatattg aatcacatg 59

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer cadA-RBS-R

<400> 32

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca ac 32

<210> 33

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer psyn-1

<400> 33

ggcgaattca gtttattctt gacatgtagt gagggggctg gtataatgag ctcggtaccc 60

ggggat 66

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer psyn-2

<400> 34

ggcagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtg 34

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer tetA-F

<400> 35

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa atctaacaat gcgctcatc 49

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer tetA-R

<400> 36

ggctctagat caacgacagg agcacgatc 29

<210> 37

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer lysC-F

<400> 37

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgtc tgaaattgtt gtctcc 46

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer lysC-R

<400> 38

ggcggatcct tactcaaaca aattactatg cag 33

<210> 39

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer dapA-F

<400> 39

ggcggatcca cacaggaaac agaccatgtt cacgggaagt attgtc 46

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer dapA-R

<400> 40

ggctctagat tacagcaaac cggcatgc 28

<210> 41

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer lysA-F

<400> 41

ggctctagaa cacaggaaac agaccatgcc acattcactg ttcagc 46

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer lysA-R

<400> 42

ggcgtcgact taaagcaatt ccagcgccag 30

<210> 43

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer tetA-F3

<400> 43

ggcctcgaga gtttattctt gacatgtagt gagg 34

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer tetA-R3

<400> 44

ggcgcatgct caacgacagg agcacgatc 29

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 318-F

<400> 45

cagcctgaat atactgcatt ctc 23

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 318-R

<400> 46

gagaatgcag tatattcagg ctg 23

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 323-F

<400> 47

gcattctcgc gatttcctcg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 323-R

<400> 48

cgaggaaatc gcgagaatgc 20

<210> 49

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer asd-F

<400> 49

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaatgttggt tttatcgg 48

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer asd-R

<400> 50

ggcggatcct tacgccagtt gacgaagc 28

<210> 51

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer dapB-F

<400> 51

ggcggatcca cacaggaaac agaccatgca tgatgcaaac atccg 45

<210> 52

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer dapB-R

<400> 52

ggctctagat tacaaattat tgagatcaag tacatctc 38

<210> 53

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer aspC-F

<400> 53

ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt tgagaacatt accgcc 46

<210> 54

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer aspC-R

<400> 54

ggcgcatgcg acctcgaggt agtcgactta cagcactgcc acaatcg 47

<210> 55

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LAL-F

<400> 55

ggcggtacca gtttattctt gacatgtagt gagg 34

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LAL-R

<400> 56

ggcgggccct taaagcaatt ccagcgcca 29

Claims

1.一种核糖体结合位点，其特征在于，所述核糖体结合位点的序列5’-3’包含/是如下所示的序列之一：

a)、GAGAGGAGGA；

b)、AAGGGAAATT；

c)、TTAAAGAGGG。

2.一种重组表达质粒，包括重组表达质粒的目的基因及相应的核糖体结合位点，其特征在于，所述核糖体结合位点如权利要求1任一技术方案所述；优选地，所述核糖体结合位点位于起始密码子上游-15到-6位。

3.如权利要求2所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒的骨架质粒是选自pUC、pBR322、pACYC质粒和它们的衍生质粒中的一种。

4.如权利要求2-3任一项所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒的目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；进一步优选地，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶是脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。

5.根据权利要求4所述的一种重组表达质粒，其特征在于，所述转化子的重组表达质粒的目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸；优选地，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)的赖氨酸脱羧酶基因；进一步优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；更进一步优选地，所述cadA基因是来源于大肠杆菌(E.coli)的cadA基因。

6.一种转化子，其特征在于，所述转化子的基因组包含目的基因及相应的核糖体结合位点，所述核糖体结合位点如权利要求1所述，优选地，所述核糖体结合位点位于起始密码子上游-15到-6位；所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；进一步优选地，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶是脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶；

或者，所述转化子的重组表达质粒是如权利要求2-5任一项所述的重组表达质粒。

7.如权利要求6所述的转化子，其特征在于，所述转化子的重组表达质粒是如权利要求5任一项技术方案所述的重组表达质粒。

8.如权利要求6或7所述的转化子，所述转化子的宿主菌为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，进一步优选是大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

9.一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)培养权利要求6-8任一项所述的转化子；

B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。

10.如权利要求9所述的一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如权利要求7-8任一项所述的转化子；

2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

11.一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

I)按照权利要求10的步骤1)生产赖氨酸脱羧酶；

12.一种mRNA，其特征在于，所述mRNA的序列包括与权利要求1所述的核糖体结合位点对应的序列。