JP2015503904A - イソプレン産生時の溶解度が向上されたイソプレン合成酵素変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年10月27日出願の、米国特許仮出願番号第61/552,453号の優先権を主張する。この特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、イソプレン合成酵素変異体を含む方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、宿主細胞におけるイソプレン産生を増加させる、植物のイソプレン合成酵素変異体を提供する。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
本発明は、イソプレン合成酵素活性を有しかつ改良された溶解度を有する変異体ポリペプチド組成物、並びにこのようなポリペプチドの製造方法及び増加した量でイソプレンを産生する方法、を特徴とする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも約5%〜少なくとも約75%増加しているタンパク質溶解度を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、又は少なくとも約75%増加しているタンパク質溶解度を有する。特に、これらの組成物及び方法は、イソプレンの生成速度を増加させ、かつ生成されるイソプレンの総量を増加させる。天然ゴムを用いる代わりに、本開示に記載のイソプレン産生に関する生合成工程を用いることは望ましい。以降に詳細に記載する通り、細胞のイソプレン産生量は、イソプレン合成酵素(IspS)変異体をコードしている異種核酸を細胞に導入することで、非常に増加させることができる。
親イソプレン合成酵素から、イソプレン合成酵素変異体を生成する。親イソプレン合成酵素は、野生型及び非野生型のイソプレン合成酵素などの、本明細書に記載される通りのイソプレン合成酵素である。代表的な親イソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも1種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的な親イソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載されるような任意の生物資源から誘導されるポリペプチド及び核酸の変異体が挙げられる。
本発明のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸は、本発明の範囲内で提供され、企図される。各種実施形態では、核酸は組み換え核酸である。例えば、一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の核酸は、組み換え核酸が、イソプレン合成酵素変異体と、別のポリペプチド(例えば、融合ポリペプチドの精製又は検出を容易にする、His−タグなどといった、ペプチド)の全て又は一部とを含む融合ポリペプチドをコードするよう、他のポリペプチドの全て又は一部をコードしている他の核酸に操作可能に連結させる。一部の実施形態では、組み換え核酸の一部又は全ては化学的に合成される。一部の態様では、核酸は異種核酸である。「異種核酸」とは、その核酸配列が同じホスト細胞内に自然に見出される別の核酸の配列と同一ではない核酸のことを意味する。
上記の通り、DXP経路及び/又はMVA経路の1つ以上のポリペプチドを、本開示に記載のイソプレン合成酵素変異体と組み合わせて使用して、イソプレン産生を増加させることができる。したがって、特定の態様では、MVA経路に関係する1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸は異種核酸である。他の態様では、MVA経路に関係する1つ以上のポリペプチドをコードしている1つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。本開示における任意の態様では、1つ以上のMVA経路に関係するポリペプチドは、(a)2分子のアセチル−CoAを縮合させてアセトアセチル−CoAを生成する酵素、(b)アセトアセチル−CoAをアセチル−CoAと縮合させてHMG−CoAを生成する酵素(例えば、HMGシンターゼ)、(c)HMG−CoAをメバロン酸に変換する酵素、(d)メバロン酸をしてリン酸化してメバロン酸5−リン酸を生成する酵素、(e)メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する酵素、(f)メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、並びに(g)イソペンテニルピロリン酸をジメチルアリルジホスフェートへと変換する酵素、から選択できる。本開示における任意の態様では、1つ以上のMVA経路に関係するポリペプチドは、(a)アセトアセチル−CoAをアセチル−CoAと縮合させてHMG−CoAを生成する酵素(例えば、HMGシンターゼ)、(b)HMG−CoAをメバロン酸へと変換する酵素、(c)メバロン酸リン酸をメバロン酸5−リン酸に変換する酵素、(d)メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する酵素、並びに(e)メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。
MVA経路の上流は、細胞内代謝により産生されるアセチルCo−Aを、(a)(i)チオラーゼ活性又は(ii)アセトアセチル−CoA合成酵素活性、(b)HMG−CoA還元酵素、及び(c)HMG−CoA合成酵素活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。まず始めに、チオラーゼ又はアセトアセチル−CoA合成酵素(アセチル−CoA及びマロニル−CoAを利用する)の作用によりアセチルCo−AをアセトアセチルCoAに変換する。次に、アセトアセチル−CoAは、HMG−CoA合成酵素の酵素作用により、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)へと変換される。このCo−A誘導体をHMG−CoA還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド産生の律速段階となる。
特定の実施形態では、リステリア・グレイ(L. grayi)、エンテロコッカス・フェシウム(E. faecium)、エンテロコッカス・ガリナラム(E. gallinarum)、エンテロコッカス・カッセリフラバス(E. casseliflavus)及び/又はエンテロコッカス・フェカリス(E. faecalis)由来の様々なmvaE及びmvaS遺伝子を、単独で、あるいはMVA経路上流関連性タンパク質をコードしている1つ以上の他のmvaE及びmvaS遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。リステリア・グレイ(L. grayi)、エンテロコッカス・フェシウム(E. faecium)、エンテロコッカス・ガリナラム(E. gallinarum)、エンテロコッカス・カッセリフラバス(E. casseliflavus)、及びエンテロコッカス・フェカリス(E. faecalis)では、mvaE遺伝子は、チオラーゼ及びHMG−CoA還元酵素の活性のいずれをも保有しているポリペプチドをコードする。実際に、mvaE遺伝子産物は、真正細菌で見られる、IPP生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、HMG−CoA還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた(Hedl,et al.,J Bacteriol.2002 April;184(8):2116〜2122)。それに対しmvaS遺伝子は、HMG−CoA合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸(MVA)経路下流のポリペプチドをコードしている核酸を1つ以上更に含む。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性MVA経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、MVA経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
他の態様では、アセトアセチル−CoA合成酵素の遺伝子(aka nphT7)を使用できる。アセトアセチル−CoA合成酵素遺伝子は、マロニル−CoA及びアセチル−CoAからアセトアセチル−CoAを合成する活性を有し、かつ2分子のアセチル−CoAからアセトアセチル−CoAを合成する活性は最小限である(例えば、非活性である)酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Okamura et al.,PNAS Vol 107,No.25,pp.11265〜11270(2010)を参照されたい。この文献中のnphT7に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。日本国特許公開第2008〜61506(A)号及び米国特許出願公開第2010/0285549号には、放線菌のストレプトミセス(Streptomyces)属CL190株のアセトアセチル−CoA合成酵素遺伝子が記載されている。アセトアセチル−CoA合成酵素も、アセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル−CoA合成酵素(又はアセチルCoA:マロニルCoAアシル基転移酵素)としては、Genbank AB540131.1が挙げられる。
本開示において請求される手法により、各種宿主細胞を用い、イソプレン合成酵素変異体を発現することのできる組み換え宿主細胞を生成し、イソプレンを産生することができる。宿主細胞は、天然にイソプレンを産生する細胞であっても、あるいは天然には産生しない細胞であってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞はDXP経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素、DXP経路ポリペプチド(例えば、DXS)、及び/又はIDI核酸が加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はMVA経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素及び/又はMVA経路に関係する核酸が1つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はDXP経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、MVA経路及びDXP経路の一部又は全体を使用してイソプレンを生成するために、MVA経路に関係した核酸が1つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、DXP及びMVA経路の両方を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、これらの経路の一方又は両方によるイソプレンの生成を促進するために、イソプレンシンターゼ核酸、DXS核酸、IDI核酸、又はMVA経路に関係する核酸が1つ以上加えられる。
イソプレン合成酵素、DXS、IDI、及び/又はMVA経路の核酸又はこれらの核酸を収容しているベクターは、これらの核酸にコードされているイソプレン合成酵素、DXS、IDI、及び/又はMVA経路関連性ポリペプチドを発現させる際、標準的な発現法を用い、宿主細胞(例えば、細菌細胞)に挿入することができる。宿主細胞へのDNAコンストラクト又はベクターの導入は、形質転換、電気穿孔法、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入(例えば、リポフェクションを利用した又はDEAE−デキストリンを利用した形質移入、あるいは組み換えファージウイルスを用いた形質移入)、リン酸カルシウムDNA沈殿法を用いるインキュベーション、DNAコートした微粒子銃による高速導入、及びプロトプラストの融合などの手法により実施できる。一般的な形質転換法は、当該技術分野において既知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds)Chapter 9,1987;Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor,2001;並びにCampbell et al.,Curr Genet,16:53〜56,1989を参照されたい。これらの開示は、それぞれ参照によりその全体が組み込まれ、特に形質転換法に関して組み込まれる)。導入された核酸は、染色体DNAに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は生物により代謝することのできる、1つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。
一部の実施形態では、イソプレン産生条件下で細胞を培養培地で培養する。一部の実施形態では、培養時に細胞が産生するイソプレン量は、1時間につき、細胞の湿潤重量1g当たり、約1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、又は5,000ナノモル(nmol/gwcm/時)以上である。一部の実施形態では、イソプレンの量は、約2〜約5,000nmol/gwcm/時、例えば、約2〜約100nmol/gwcm/時、約100〜約500nmol/gwcm/時、約150〜約500nmol/gwcm/時、約500〜約1,000nmol/gwcm/時、約1,000〜約2,000nmol/gwcm/時、又は約2,000〜約5,000nmol/gwcm/時である。nmol/gwcm/時単位のイソプレンの量は、米国特許第5,849,970号に開示の通りに測定できる。例えば、ヘッドスペース2mLに含まれるイソプレン(例えば、密閉したバイアル瓶で、32℃、200rpmで振盪させながら約3時間培養した2mL培養物などの培養物から、ヘッドスペースに放出されたイソプレン)は、n−オクタン/porasil Cカラム(Alltech Associates、Inc.(Deerfield、IL))を取り付け、RGD2酸化水銀還元ガス検出器(Trace Analytical(Menlo Park、CA))に連結させた等温操作系(85℃)などの、一般的なガスクロマトグラフィー系を用い測定する(例えば、Greenberg et al,Atmos.Environ.27A:2689〜2692,1993;Silver et al.,Plant Physiol.97:1588〜1591,1991を参照されたい)。標準イソプレン濃度をもとにした検量線により、ガスクロマトグラフィーの面積単位をイソプレン量(nmol)に変換する。一部の実施形態では、細胞の湿潤重量(g)当たりの値は、細胞培養物サンプルのA600値を得、次に、A600値が既知である細胞培養物の湿潤重量に関する検量線をもとにA600値を細胞重量(g)に変換することで算出する。一部の実施形態では、細胞重量(g)は、ブロス1L(細胞培地及び細胞を含む)のA600値が1である場合、湿潤細胞が1g含まれているものと仮定し、概算する。この値を、培養物をインキュベートした時間数(例えば3時間)で除算する。
炭素収率(%)=(産生されたイソプレンに含まれる炭素のmol数)/(炭素源に含まれる炭素のmol数)*100
この計算式では、酵母エキスには50重量%の炭素が含有されるものと仮定することができる。
炭素収率(%)=(39.1gイソプレン*1/68.1mol/g*5C/mol)/[(181221gグルコース*1/180mol/g*6C/mol)+(17780g酵母エキス*0.5*1/12mol/g)]*100=0.042%
式3
1gイソプレン/Lブロス/時=14.7mmolイソプレン/Lブロス/時(合計容積流量)
1nmolイソプレン/gwcm/時=1nmolイソプレン/Lブロス/時/OD600(この変換式では、OD600の値が1のブロス1Lには、1gの湿潤細胞が含まれているものと仮定する)。
1nmolイソプレン/gwcm/時=68.1ngイソプレン/gwcm/時(イソプレンの分子量)
1nmolイソプレン/ガス中O2(L)/時=90nmolイソプレン/Lブロス/時(培養ブロス1L当たりのO2流速90L/時)
1μgイソプレン/放出ガス中イソプレン(L)=60μgイソプレン/Lブロス/時(流速60Lガス/Lブロス)(1vvm)
式8
1nmolイソプレン/1mg細胞タンパク質=150nmolイソプレン/Lブロス/OD600(この変換式では、OD600値が1のブロス1Lに含まれる合計タンパク質量は約150mgであると仮定する)(比産生性)
1gイソプレン/Lブロス=14.7mmolイソプレン/Lブロス(合計力価)
細胞乾燥重量=(細胞湿潤重量)/3.3
一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンを回収する工程を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い産生させたイソプレンを、ガス・ストリッピング、分画、吸着/脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱又は減圧脱着、又は固相に不動化又は吸収させたイソプレンの溶媒による抽出などの標準法を用い回収することができる(例えば、米国特許第4,703,007号及び同第4,570,029号を参照されたい)。一部の実施形態では、イソプレンの回収には、液体イソプレン(イソプレンの未希釈溶液又はイソプレンの溶媒希釈液など)の単離を包含する。ガス・ストリッピングには、連続的な様式で、発酵による放出気流からイソプレン蒸気を除去することを包含する。このような除去は、いくつかの異なる方法で達成することができ、これには、固相への吸着、液相への分割、又は直接凝縮が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を上回る温度での希釈イソプレン蒸気ストリームの膜濃縮により、液体イソプレンの凝縮がもたらされる。一部の実施形態では、回収は、米国仮出願特許第61/288,142号(2009年12月18日出願)に記載の通りに実施する。
MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)の活性部位付近に局在する変異をプールし、DMAPPをイソプレンに変換することができかつ宿主発現株に向上した生育を付与するものを選別した。
NNK/MNNオリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、完全なMEAウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS酵素(544残基)の各位置に、QuikChange(Stratagene)PCRにより変異を導入した。MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)のコード配列の各位置(可能性のある32コドン)にNNKにより置換を行うことで、変異プールにおいて全20の可能性のあるアミノ酸を表現することができる。変異させるコドンの上流10塩基及び下流20塩基を有するようNNKプライマーを体系的に作成した。プライマー対間で23塩基がオーバーラップするよう、正確に同じ方法で相補的なMNNプライマーを体系的に作製した。製造元の推奨するプロトコルに従って、Quikchange PCR反応を実施した。PCR産物の形質転換後、組換え変異体を精製した。
5回選別を繰り返し、MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS(表1を参照されたい)の活性部位付近の51の位置におけるそれぞれの変異のプールを濃縮した後、優性な変異としてS288Cを同定した。表2は、5回の濃縮の後、ランダムに単離し、配列決定した16の変異体のうち13が、S288C変異を保有していたことを示す。初期の3又は4回の濃縮後には、単離された8の変異体のいずれにもS288Cは存在せず、6回濃縮した後には単離されたもののうち(16のうち)2つの変異体にのみ存在していた。表2は、6回の濃縮後、主要な変異はR435R(CGTからCGGへの変異)のサイレント変異であったことも示し、このサイレント変異により、宿主株において単純なIspS発現の増加が生じた可能性がある。この濃縮手順では、単純に発現の向上した変異体を増産させるより前に、IspSに対し有効な特性を示す変異を特定するために限られた候補が示されることを意味する。
MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)の活性部位付近に局在する変異をプールし、DMAPPをイソプレンに変換することができかつ宿主発現株に向上した生育を付与するものを選別した。複数回濃縮工程を行った後、S288Cが主要変異であり(実施例1に記載)、かつ細胞内IspS活性に明らかな有効性をもたらしたことから、さらなる解析のため、変異を保有している各株を単離した。
野生型と比較してMEAウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS S288C変異体の可溶性を評価するため、野生型IspSをコードしているプラスミドpCL201を含有しているDW425株と、S288C変異体をコードしているプラスミドpDW218を含有しているDW526株と(図2)をLB培地に接種し、増殖させ、標準的な分子生物学的手法に従いIPTGにより発現誘導した(表5及び表6を参照されたい)。上記のQuikChangeの手順を用い、表4に示すプライマーを使用し、イソプレン合成酵素のG491S変異体を含むpCHL243(図3)にS288C変異を導入した。QuikChange(Stratagene)による変異導入を行い(PCRのサイクルパラメーターについては下記を参照されたい)、野生型イソプレン合成酵素をコードしているpDW34(pDW34作製については下記を参照されたい)にG491S変異を導入し、pCHL243を作製した。
濃縮プールからDW526株を直接単離し、発現誘導を行い、画分を行い、S288Cが可溶性に対し示す効果を野生型と比較して決定した。図5は、対照分子と比較して、MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS S288C変異体が、不溶性画分に存在していないことを示す(クマシー染色ゲルのレーン2をレーン4と比較)。図5は、対照IspS酵素は可溶性及び不溶性画分に約1:1比で存在するのに対し、S288Cが可溶性画分のみに検出されたことも示す。図6は、大規模発酵試験における、IspSの可溶性に対するS288C変異の効果を示す。この試験では、親IspS酵素は、それまでに、細胞活性に対して正の効果を有するものの可溶性に対しては効果を有さないことが示されていた、G491S変異を保有していた。親酵素と比較して、IspS G491S S288C酵素は、発酵株において著しく向上した可溶性を示した。図6は、G491S分子単独の場合ではIspSの総量の78%だけが可溶性であったのに対し、S288C G491S分子では可溶性が90%に向上していたことを示す。
サリックス・アルバ(Salix alba)及びシダレヤナギ(Salix babylonica)由来のIspSの可溶性に対するS288C変異の効果を調査した。
プラスミドpEWL792(pTrc S.alba IspS)の構築
大腸菌(E. coli)の発現に特異的なコドン最適化法を利用し、Gene Oracle Inc.(Mountain View,CA)により、サリックス・アルバ(Salix alba)イソプレン合成酵素(S. alba IspS)をコードしている合成遺伝子の作製を行った。NcoI制限部位を5’末端に及びPstI制限部位を3’末端にもつよう遺伝子操作し、プラスミドpGOv4に合成遺伝子をクローニングした。ウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS及びサリックス・アルバ(S. alba)IspS間のClustal W配列アラインメントにより、同一性は91.73%であるとして示された(図7)。
製造元のプロトコルに従って、テンプレートとしてプラスミドMCM376、プライマーMCM165及びMCM177、並びにPfu Ultra II FusionDNAポリメラーゼ(Agilent)を用いてPCR反応を実施し、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)MVK遺伝子を増幅させた。PCR条件は次のとおりにした:95℃で2分間(最初のサイクルのみ)、95℃で25秒間、55℃で25秒間、72℃で18秒間を29サイクル、最後の伸長を72℃で2分間。QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いメタノサルシナ・マゼイ(M. mazei)MVKのPCR産物を精製した。
CMP451株の細胞をLB中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で3回洗った。50μLの懸濁液を1μLのpEWL795プラスミドと混合した。Gene Pulser Xcell Electroporatorを用い、2mmキュベット中で細胞懸濁液混合物を2.5ボルト及び25μFdで電気穿孔した。1mLのLBに細胞を回収し、振盪しながら30℃で2時間インキュベートした。LA+50μg/μLのカルベニシリン+5mMのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、37℃で一晩インキュベートした。1つのコロニーを採取し、EWL804株と命名した(表9)。
EWL804株の細胞をLB中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で3回洗った。50μLの細胞懸濁液を1μLのプラスミドMCM82(pCL Ptrc Upper MVA)と混合した。Gene Pulser Xcell Electroporatorを用い、2mmキュベット中で細胞懸濁液混合物を2.5ボルト及び25μFdで電気穿孔した。1mLのLBに細胞を回収し、振盪しながら30℃で2時間インキュベートした。LA+50μg/μLのカルベニシリン+50μg/μLのスペクチノマイシンを添加したプレート上で形質転換体を選別し、37℃で一晩インキュベートした。1つのコロニーを採取し、EWL810株と命名した(表9)。
大腸菌(E. coli)の発現に特異的なコドン最適化法を利用し、Gene Oracle Inc.(Mountain View,CA)により、シダレヤナギ(Salix babylonica)イソプレン合成酵素(S.babylonica IspS)をコードしている合成遺伝子の作製を行った。NcoI制限部位を5’末端に及びPstI制限部位を3’末端にもつよう遺伝子操作し、プラスミドpGOv4に合成遺伝子をクローニングした。ウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS及びシダレヤナギ(S. babylonica)IspS間のClustal W配列アラインメントにより、同一性は92.28%であるとして示された(図10)。
製造元のプロトコルに従って、テンプレートとしてプラスミドMCM376、プライマーMCM165及びMCM177、並びにPfu Ultra II FusionDNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いてPCR反応を実施し、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)MVK遺伝子を増幅させた。PCR条件は次のとおりにした:95℃で2分間(最初のサイクルのみ)、95℃で25秒間、55℃で25秒間、72℃で18秒間を29サイクル、最後の伸長を72℃で2分間。QIAquick PCR精製キットを用いメタノサルシナ・マゼイ(M. mazei)MVKのPCR産物を精製した。
CMP451株の細胞をLB中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で3回洗った。50μLの懸濁液を1μLのpEWL851プラスミドと混合した。Gene Pulser Xcell Electroporatorを用い、2mmキュベット中で細胞懸濁液混合物を2.5ボルト及び25μFdで電気穿孔した。1mLのLBに細胞を回収し、振盪しながら30℃で2時間インキュベートした。LA+50μg/μLのカルベニシリン+5mMのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、37℃で一晩インキュベートした。1つのコロニーを採取し、EWL887株と命名した(表9)。
EWL887株の細胞をLB中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で3回洗った。50μLの懸濁液を1μLのMCM82プラスミドと混合した。Gene Pulser Xcell Electroporatorを用い、2mmキュベット中で細胞懸濁液混合物を2.5ボルト及び25μFdで電気穿孔した。1mLのLBに細胞を回収し、振盪しながら30℃で2時間インキュベートした。LA+50μg/μLのカルベニシリン+50μg/μLのスペクチノマイシンを添加したプレート上で形質転換体を選別し、37℃で一晩インキュベートした。1つのコロニーを採取し、EWL893株と命名した(表9)。
MCM531株の細胞をLB中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で3回洗った。50μLの細胞懸濁液を1μLのプラスミドpEWL792(pTrc S.alba IspS)又はpEWL834(pTrc S.babylonica IspS)と混合した。Gene Pulser Xcell Electroporatorを用い、2mmキュベット中で細胞懸濁液混合物を2.5ボルト及び25μFdで電気穿孔した。1mLのLBに細胞を回収し、振盪しながら30℃で2時間インキュベートした。LA+50μg/μLのカルベニシリン+5mMのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、37℃で一晩インキュベートした。プラスミドpEWL792を保有している形質転換体に関しては1つのコロニーを選択し、EWL900株と命名した(表9)。プラスミドpEWL834を保有している形質転換体に関しては1つのコロニーを選択し、EWL903株と命名した(表9)。
pTrc P.alba IspS(DW194)、pTrc S.alba IspS(EWL900)及びpTrc S.babylonica IspS(EWL903)を発現している株をLB培地で生育させ、OD600が約0.5の時点で200μMのIPTGにより発現誘導を開始し、4時間にわたって発現誘導を行った。遠心分離により細胞沈殿を回収し、−80℃にて保存した。フレンチ・プレスにより細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによりタンパク質の可溶性について解析した。結果として、S.alba IspS及びS.babylonica IspSはP.alba IspSよりも可溶性が高いことが示された(図13及び図14)。
プライマーを消化し、S288C変異をサリックス・アルバ(S. alba)IspS(プライマーEL1288及びEL1289,表7を参照されたい)及びサリックス・バビロニア(S. babylonica)IspS(プライマーEL1290及びEL1291,表7を参照されたい)。Pfu Ultra II Fusion DNAポリメラーゼによるPCRの開始テンプレートとしてプラスミドpEWL792(pTrc S.alba IspS)及びpEWL834(pTrc S.babylonica IspS)を使用した。PCR条件は次のとおりにした:95℃で2分間(最初のサイクルのみ)、95℃で30秒間、55℃で1分間、68℃で6分間を16サイクル繰り返した。各PCR反応に際し、2μLのDpnI制限酵素(Roche)を添加し、37℃にて2時間インキュベートし、親テンプレートを消化した。MCM531株の細胞をLB中で対数増殖期中期まで増殖させた後、氷冷した滅菌水で3回洗った。50μLの細胞懸濁液を2μLの各PCR反応物と混合した。Gene Pulser Xcell Electroporatorを用い、2mmキュベット中で細胞懸濁液混合物を2.5ボルト及び25μFdで電気穿孔した。1mLのLBに細胞を回収し、振盪しながら30℃で2時間インキュベートした。LA+50μg/μLのカルベニシリン+5mMのメバロン酸を添加したプレート上で形質転換体を選別し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、それぞれから複数の形質転換体を回収し、5mL LB+50μg/μLカルベニシリンを入れたチューブにおいて30℃にて一晩生育させた。QIAquick Spin Miniprepキット(Qiagen)を用い、一晩培養することでプラスミド調製を実施した複数の形質転換体から得られたプラスミドをSequetechに用い、配列決定を行った。pTrc S.alba IspS S288Cの配列決定には、プライマーEL1005、EL1006、EL1270、EL1271、及びEL1272を使用した(表7を参照されたい)。pTrc S.babylonica IspS S288Cの配列決定には、プライマーEL1005、EL1006、EL1285、EL1286、及びEL1287を使用した(表7を参照されたい)。
P.alba IspS(DW194)、S.alba IspS(EWL900)、S.alba IspS S288C(EWL913)、S.babylonica IspS(EWL903)、又はS.babylonica IspS S288C(EWL916)を発現している株をLB+50μg/μLカルベニシリンにて生育させた。OD600が約0.5に達した時点で200μM IPTGにより細胞に発現誘導を行い、34℃にて4時間生育させた。遠心分離により細胞沈殿を回収し、−80℃にて保存した。細胞をフレンチ・プレスにより溶解させ、10% NuPageゲル(Invitrogen)のクマシー染色(図17)並びにウェスタンブロット(図18)によりタンパク質の可溶性について分析した。結果として、S288C変異によりS.alba IspS及びS.babylonica IspSのいずれもの可溶性が向上していたことが示された。
表10に掲載するプライマーを使用し、QuikChange(Stratagene)変異導入により、S288C変異をMD09−163ベクター(これまでに記載)に導入した。製造元の推奨するプロトコルに従って、変異導入を実施した。PCR産物により、ケミカルコンピテントなTop10大腸菌(E. coli)(Invitrogen)細胞を形質転換させ、プラスミドを単離するため陽性の形質転換体を選択し、完全に配列決定した。単一のプラスミド、pDW196(表11、図23)を検証し、更なる変異導入に使用した。上記の同様の手順によりA3T変異をpDW196ベクターに導入した。製造元の推奨するプロトコルに従って、完全に検証したプラスミド、pDW204(表11、図24)によりケミカルコンピテントなBL21 DE3 pLysS細胞(Invitrogen)を形質転換させた。構造解析のため、このDW614株を、MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)IspS A3T S288C変異体の精製及びそれに続く結晶化に使用した。
6×Hisタグ付加MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)A3T S288Cの発現
N末端6×Hisタグ付加MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)A3T S288Cを発現させ、株DW614から精製した。増殖法は、BL21(λDE3)pLysS細胞で発現させたヒスチジンタグ付加酵素に好適なものである。予定していた各1Lの増殖用に、10mLの一晩培養物を調製した。25mLフラスコを用い、10mL LB培地に適切な抗生物質(50mg/mLカナマイシン、50mg/mLクロラムフェニコール)を加え、新しい細胞プレートから1コロニーを接種し、あるいは凍結させたグリセロールストックを直接接種した。約220rpmで振盪させながら、培養物を30℃で一晩増殖させた。一日培養物は、各培養時に適切な抗生物質を添加した1L LB培地で調製した。各1Lの一日培養物に10mLの一晩培養物を接種し、OD600が約0.4〜0.6に到達するまで、約220rpmで振盪しながら30〜37℃で増殖させた。次に、400μMのIPTGにより1日培養物に発現誘導を行い、220rpmで振盪しながら30℃にて5〜6時間増殖させた。次に、4℃にて10,000×gで10分間遠心沈降し、細胞を回収した。回収後、細胞は次工程に直接用いるか、あるいは使用までの間−80℃で保存した。
ヒスチジンタグ付加した酵素をBL21(λDE3)pLysS細胞から精製するにあたって、細胞を新鮮な溶解緩衝液(溶解緩衝液(pH 8.0):Ni洗浄緩衝液+0.5mM PMST、0.01% Tween−20、1mg/mLリゾチーム、0.2mg/mL DNaseI、Ni洗浄緩衝液:50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール)に穏やかに再懸濁した。細胞沈殿に対し、培養培地1Lにつき約40〜50mL溶解緩衝液を使用した。次に細胞を氷上で約30分インキュベートした。次に、可溶化液が透明になり始めるまで、フレンチプレスセルを2〜3回通過させて(8274kPa/High setting(1200psi/High setting)に設定して大型フレンチプレスセルを使用)、細胞懸濁液を完全に可溶化させた。活性解析及びゲル解析(約100μL)のため可溶化液を保存した。次に、Sorvall Discovery 90SE超遠心機により、4℃にて30,000xgで30分遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。上清を回収し、維持した。「清澄化させた可溶化液」試料を、活性解析及びゲル解析のため保存した(約100μL)。
DW614株については上記のとおりである。Eton Bioscience Inc.のTurboTEVプロテアーゼにより消化を実施した。10μgの精製タンパク質当たり1ユニットのTurboTEVを使用した。消化は4℃で一晩行った。試料をNi緩衝液で平衡化させた他のNiカラムに素通りさせ、未切断の酵素、タグ、TurboTEVプロテアーゼ(同様にタグ付加されている)、及び不純物を除去した。Niカラムを素通りさせ、洗浄液をSDS−PAGEゲル(NUPAGE、Invitrogen)を用い解析し、及びDMAPP活性を解析した。高純度の酵素を含油している試料をプールし、1mM DTTを含有している50mM NaCl(pH 7.4)緩衝液で脱塩し、−80℃で保存した。
コンストラクトDW614を記載の通りに生成し、次に、可能性のある結晶化条件を検討するためにタンパク質濃縮液を調製した。コンストラクトを精製し、以下に記載の通りに別個に結晶化条件を検討した。最小限に、市販のスクリーニングキット:Hampton Research社(Aliso Viejo、CA)のCrystal Screen及びQiagen社(Valencia、CA)のJCSG+Suiteを用い、コンストラクトを調査した。
アミノ酸は、MEAウラジロハコヤナギ(P. alba)及びヤナギ(Salix spp.)間で異なる。IspS酵素は表12に掲載する。各アミノ酸置換に関する電荷変化、並びにMEAウラジロハコヤナギ(P. alba)の結晶構造における各残基の表面接近性(%)を表12に示す。表面接近性は、Chemical Computing Group,Inc.により作成及び支援されるプログラムMOEを使用し算出した。特定の半径を有するプローブを使用し、各残基に関し、水が接近可能な表面積を推定した。次に、推定データをペプチドライブラリと比較し、これらのデータ間の比を表面接近性(%)として記録した。ウラジロハコヤナギ(P. alba)の配列と異なっているサリックス・アルバ(S. alba)の配列部位を図25に示す。ウラジロハコヤナギ(P. alba)の配列と異なっているサリックス・ベイロニカ(S. baylonica)の配列部位を図26に示す。
合成酵素酵素ウラジロハコヤナギ(P. alba)MEA結晶構造における各位置の
電荷変化及び表面接近性を示す。
Claims (32)
- イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドであって、該ポリペプチド変異体が、配列番号1の対応する残基X288に置換を含み、かつ前記ポリペプチドが、残基X288に置換を含まない親ポリペプチドと比較してタンパク質溶解度が増加している、単離ポリペプチド。
- 前記置換が残基S288のものである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記置換が残基S288Cのものである、請求項2に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記親ポリペプチドと比較してタンパク質の溶解度が少なくとも約5%〜少なくとも約75%増加している、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、植物から単離された親ポリペプチドに由来するものである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記親ポリペプチドが、ポプラ(poplar)(ハコヤナギ(Populus sp.))、クズ(kudzu)(プエラリア(Pueraria sp.))、ヨーロッパナラ(English oak)(カシ(Quercus sp.))又はヤナギ(willow)(サリクス(Salix sp.))から選択される植物種から単離される、請求項5に記載のポリペプチド。
- 前記親種が、ハコヤナギ(Populus sp)である、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記親ペプチドがウラジロハコヤナギ(P. alba)、ヤマナラシ(P. tremuloides)、コットンウッド(P. trichocharpa)、セイヨウハコヤナギ(P. nigra)のものである、請求項7に記載のポリペプチド。
- 前記親種が、プエラリア(Pueraria sp.)である、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記親種が、タイワンクズ(Pueraria montana)である、請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記親種が、カシ(Quercus sp.)である、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記親種が、ヨーロッパナラ(Quercus rubur)である、請求項11に記載のポリペプチド。
- 前記親種が、サリックス(Salix sp.)である、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記親種がサリックス・アルバ(S. alba)又はサリックス・バビロニア(S. baylonica)である、請求項13に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組み換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、ラン藻細胞、又はクロストリジウムからなる群から選択される、請求項15の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞、又はグラム陰性細菌細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記細菌細胞が、大腸菌(E. coli)、ラクトバチルス・アシドフィルス(L. acidophilus)、シュードアルテロモナス・シトレア(P. citrea)、バチルス・サブチリス(B. subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(B. licheniformis)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス(B. brevis)、バチルス・ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B. alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バチルス・クラウシィ(B. clausii)、バチルス・ハロドュランス(B. halodurans)、バチルス・メガテリウム(B. megaterium)、バチルス・コアギュランス(B. coagulans)、バチルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス・ロータス(B. lautus)、バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、ストレプトマイシス・アルブス(S. albus)、ストレプトマイシス・リビダンス(S. lividans)、ストレプトマイシス・セリカラー(S. coelicolor)、ストレプトマイシス・グリセウス(S. griseus)、シュードモナス(Pseudomonas sp.)、シュードモナス・アルカリゲネス(P. alcaligenes)、コリネバクテリウム・グルタミクム(C. glutamicum)細胞からなる群から選択される、請求項18に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が藻類細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項20に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記真菌細胞が糸状菌である、請求項22に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス(Saccharomyces sp)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces sp.)、ピキア属(Pichia sp.)、又はカンジダ属(Candida sp.)からなる群から選択される、請求項24に記載の宿主細胞。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項25に記載の宿主細胞。
- 配列番号2(DW614)のアミノ酸残基を含むポリペプチドの結晶形態。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項28に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項29に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
- イソプレン産生法であって、(a)イソプレン産生に好適な条件下で請求項15に記載の組み換え細胞を培養すること、並びに(b)イソプレンを産生させること、を含む、方法。
- イソプレン産生法であって、(a)イソプレン産生に好適な条件下で請求項30に記載の組み換え細胞を培養すること、並びに(b)イソプレンを産生させること、を含む、方法。
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