CN107988186A

CN107988186A - 一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶及其表达基因和应用

Info

Publication number: CN107988186A
Application number: CN201711273657.5A
Authority: CN
Inventors: 叶建仁; 陈飞飞; 王立超; 郗蓓蓓; 刘婉慧
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2018-05-04

Abstract

本发明公开了一种冷适应性内切β‑1,4‑葡聚糖酶及其表达基因和应用，所述的冷适应性内切β‑1,4‑葡聚糖酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示，其表达基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。本发明采用PCR技术从Burkholderia pyrrocinia JK‑SH007的总DNA中扩增内切葡聚糖酶基因片段，原核表达并纯化得到内切β‑1,4‑葡聚糖酶。通过对内切β‑1,4‑葡聚糖酶酶学分析表明：内切β‑1,4‑葡聚糖酶基因对羧甲基纤维素的最适反应温度为35℃，与报道的同类酶相比最适温度下降了10‑20℃。最适pH为6.0，该酶在30‑45℃和中性环境下较稳定，是一种具有良好工业应用价值的冷适应酶，将该酶运用于生物质能源领域将有利于降低其成本，进而实现同步发酵，且对阐释内切β‑1,4‑葡聚糖酶的相关生物学功能也具有重要意义。

Description

一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶及其表达基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物化工技术领域，涉及一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶及其表达基因和应用。

背景技术

能源短缺和能源消费所引起的环境问题已成为制约我国可持续发展的关键因素之一。我国迫切需要寻找一种清洁的可再生能源来代替化石能源。由于地球上木质纤维原料丰富、环保效益良好，所以利用纤维素酶水解木质纤维素生产乙醇是发展新能源的重要途径，该技术的应用具有巨大的发展潜力。其中发酵酶解技术是降解木质素生产乙醇的关键，纤维素水解生成葡萄糖的过程须依靠内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4)的协同作用才能完成。现有的生物质能源技术很难实现同步发酵，因其中利用内切β-1,4-葡聚糖酶水解纤维素的最适温度为45-55℃，而利用工程酵母菌发酵生产乙醇所需的温度为 25-30℃。因此寻找一种适应低温的内切β-1,4-葡聚糖酶等纤维素酶至关重要，将有利于实现同步发酵，所以对冷适应酶的研究将成为开发生物质能源的热点。

此外，内切β-1,4-葡聚糖酶可以影响植物器官脱落、果实成熟、组织生长等生理功能，且对植物定殖具有一定作用。所以内切β-1,4-葡聚糖酶不仅在纤维素乙醇的生产上具有重要价值，且对研究植物生理功能具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的提供一种冷适应的内切β -1,4-葡聚糖酶，用于制备单糖。本发明的另一目的是提供上述冷适应的内切β -1,4-葡聚糖酶的表达基因。本发明还有一目的是提供上述冷适应的内切β-1,4- 葡聚糖酶的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶，其去信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的去信号肽的表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

含有所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的表达基因的载体或宿主菌。

含有所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的去信号肽的表达基因的载体或宿主菌。

所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶在生产单糖中的应用。

所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的的去信号肽在生产单糖中的应用。

所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶对羧甲基纤维素的最适反应温度为 35℃，最适pH为6.0。

一种利用所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶生产葡萄糖的方法：将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因片段导入到pET-32a质粒载体中，将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中，通过亲和层析色谱分离纯化制得内切β-1,4-葡聚糖酶，然后将内切β-1,4-葡聚糖酶加入以CMC-Na为底物的反应液中，在温度为35℃， pH为6.0的条件下反应24h，得到的葡萄糖溶液。

有益效果：与现有技术相比，本发明采用PCR技术从Burkholderia pyrrociniaJK-SH007的总DNA中扩增内切葡聚糖酶基因片段，原核表达并纯化得到内切β-1,4-葡聚糖酶。通过对内切β-1,4-葡聚糖酶酶学分析表明：内切β-1,4-葡聚糖酶基因对羧甲基纤维素的最适反应温度为35℃，与报道的同类酶相比最适温度下降了10-20℃。最适pH为6.0，该酶在30-45℃和中性环境下较稳定，是一种具有良好工业应用价值的冷适应酶，将该酶运用于生物质能源领域将有利于降低其成本，进而实现同步发酵，且对阐释内切β-1,4-葡聚糖酶的相关生物学功能也具有重要意义。可见，本发明所述的内切β-1,4-葡聚糖酶的最适酶活温度更接近常温，在实际工业化生产中，有利于降低生产耗能，以实现生物质能源的同步化发酵。本发明所述的内切β-1,4-葡聚糖酶在重组菌株中表达量高，纯化过程简单，易于大规模工业化生产。本发明所述的含有信号肽的内切β-1,4-葡聚糖酶重组菌株，具有向细胞外分泌内切β-1,4-葡聚糖酶的能力，有利于直接利用该重组菌株进行生物质能源的同步发酵。

附图说明

图1是B.pyrrocinia JK-SH 007基因组DNA电泳图；图中，M:DL 15000marker，1:基因组DNA；

图2是PCR扩增目的基因电泳图；图中，M:DL 2000marker，1:目的基因；

图3是菌液PCR筛选阳性克隆电泳图，图中，M:DL 2000marker，1-10待检测克隆子；

图4是纯化的融合内切β-1,4-葡聚糖酶图；

图5是内切β-1,4-葡聚糖酶酶切产物的离子色谱分析图；图中，A：寡糖参考标准；B内切β-1,4-葡聚糖酶酶切CMC-Na产生葡萄糖；

图6是内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学特征图；图中，A内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH；B内切β-1,4-葡聚糖酶pH稳定性；C内切β-1,4-葡聚糖酶最适温度；D 内切β-1,4-葡聚糖酶温度稳定性；

图7是大肠杆菌转化子的CMC-Na平板图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、基因组DNA的提取

(1)从超低温冰箱取出25％浓度保存的甘油菌，在LB固体培养基上将分离自杨树的内生细菌Burkholderia pyrrocinia JK-SH007[Jia H R,Jian R Y,Hui L, etal.Isolation and characterization of a new Burkholderia pyrrocinia,strain JK-SH007as a potential biocontrol agent[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2011,27(9):2203-2215.]进行活化，37℃培养16-24h；(2)将单菌落接种于50mL的LB液体培养基中，30℃恒温振荡过夜培养；(3)取1.5mL 培养物，12000rpm离心5min，弃上清；(4)离心收集的沉淀物中加入500μL 的CTAB溶液，振荡混匀，加入20μL溶菌酶(50mg/mL)，依次37℃水浴30min， 65℃水浴10min；(5)加入50μL SDS(10％)、20μL蛋白酶K(20μg/mL)、 10μL RNA酶(l0mg/mL)37℃水浴3h以上或过夜；(6)加入500μL酚:氯仿: 异戊醇(25:24:1)抽提液，12000rpm离心10min，取上清；(7)加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，振荡混匀，冰浴作用5min，4℃、12000rpm离心10min，取上清(如混浊，可重复一次)；(8)加入l/10体积NaAc(3mol/L，pH5.2) 和2倍体积乙醇，混匀，-20℃沉淀DNA；(9)12000rpm，10min离心，弃上清，加lmL75％乙醇洗涤沉淀，离心2min；(10)弃上清，干燥，加入30μLTE 溶解DNA。

经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，及紫外分光光度计检测其OD₂₆₀与OD₂₃₀的比值为1.80，OD₂₆₀与OD₂₈₀的比值为1.86，浓度为682.7ng/μL，完全满足后续实验。于-20℃冰箱中可长期保存。

2、内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆

以步骤1提取的基因组DNA作为模板，采用LA酶扩增内切β-1,4-葡聚糖酶基因基因。PCR反应体系(50μL)：La Taq 0.25μL，2×GC Buffer II 25μL， dNTP Mixture 10μL，引物Primer 1(CGAATTCATGGCGAAGCGACGGGTAAC) 8μL，引物Primer 2(CGAATTCTCAGCGGGC GGCGCACGAA)8μL，模板 DNA(<400ng)ddH₂O补足50μL。PCR反应条件为：94℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。PCR反应结束用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物正确后(图2)，用FavorPrepTM GEL/PCR Purification Mini Kit回收纯化PCR产物并于-20℃保存。

将内切β-1,4-葡聚糖酶基因的纯化产物与pMDTM19-T载体进行连接，连接体系(10μL)：内切β-1,4-葡聚糖酶基因纯化产物4μL，pMDTM19-T载体1μL， Solution1 5μL，16℃连接过夜。连接产物转化于感受态细胞E.coli JM109中，涂布于含有IPTG(24mg/mL)、X-gal(20mg/mL)和Amp(100mg/mL)的 LB固体培养基上，37℃培养过夜。根据抗性筛选和蓝白斑筛选原理，挑选白色单菌落，并进行菌液PCR(图3)及测序鉴定，获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆质粒，该基因核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所表达的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

3、内切β-1,4-葡聚糖酶基因的表达纯化

通过生物信息学的分析，将步骤2中获得的内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆质粒为模板，设计去除信号肽的特异引物PrimerF (CGGATCCATGGCGGACGCCGGCGCGA)和PrimerR(CGAATTCTCAGCGGGCGGCGCACGAA)进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：La Taq 0.25 μL，2×GC Buffer II 25μL，dNTP Mixture 10μL，引物PrimerF 8μL，引物PrimerR 8μL，模板DNA(<400ng)ddH2O补足50μL。PCR反应条件为： 94℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。获得基因，其核酸序列为SEQ ID NO.4所示。将该基因酶切(BamH I，EcoRI) 纯化后，连入表达载体pET32a，通过42℃热激转化，将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中。将得到的含有重组质粒的大肠杆菌扩大培养，培养至OD₆₀₀为 0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，于16℃下过夜诱导。10000rpm离心，收集菌体。用pH为6.0，50mM PBS缓冲液洗涤菌体两次，超声破碎后，用镍离子亲和层析和超滤纯化出目的蛋白，经SDS-PAGE及westernblot检查，结果如图4所示，条带单一清晰，获得内切β-1,4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。取30μL CMC-Na相应的溶液与10μL适当的酶液，35℃水浴，反应 24h后，样品65℃水浴20min灭酶活，然后通过离子色谱检查，结果显示酶切反应生成大量的葡糖糖，浓度达到540.7mg/L(图5)。

实施例2

1、内切β-1,4-葡聚糖酶最适温度

为获得内切β-1,4-葡聚糖酶的最佳反应温度，本实施例设置不同温度梯度 (10-60℃)进行酶促反应，每隔5℃一个梯度。配制1％羧甲基纤维素钠底物，采用DNS法对酶的活性进行测定，以酶活最高者为100％。

2、内切β-1,4-葡聚糖酶最适反应pH值

为获得内切β-1,4-葡聚糖酶的最佳反应pH，设置不同pH梯度(3-11)进行酶促反应，每隔pH1设置一个梯度，1％羧甲基纤维素钠分别用pH 3.0-9.0的缓冲液配制，在最适温度下，采用DNS法对酶的活性进行测定，以酶活最高者为 100％。

3、内切β-1,4-葡聚糖酶热稳定性

设置不同温度梯度进行酶促反应，测定内切β-1,4-葡聚糖酶对温度的耐受性，将内切β-1,4-葡聚糖酶分别在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃的条件下分别保温15min，30min，45min后，以pH为6.0的1％羧甲基纤维素钠为底物，检测不同温度保温不同时间下内切β-1,4-葡聚糖酶的剩余相对酶活性。

4、内切β-1,4-葡聚糖酶pH稳定性

配置pH为3-11的1％羧甲基纤维素钠溶液，在30℃条件下保温1h，然后在最适条件下检测酶活。检测不同pH条件下内切β-1,4-葡聚糖酶的剩余相对酶活性。

通过对内切葡聚糖酶酶学分析表明：内切葡聚糖酶基因对羧甲基纤维素的最适反应温度为35℃，相较于其他研究(表1)，其最适反应温度相对较低；最适 pH为6.0，该酶在30-45℃及pH5-8的环境下较稳定(图6)。

表1内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学特征

注：ND:未测定。

实施例3

CMC-Na刚果红平板试验：将含有信号肽的转化子(实例1中获得)和不含有信号肽的转化子(将实例1中获得克隆质粒，酶切(EcoR I和Hind III)后连接连入表达载体pET32a，通过42℃热激转化，将重组质粒导入E.coli BL21(DE3) 中获得，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1)分别接种在含有1％CMC-Na的LA 平板上，37℃恒温箱倒置培养过夜。待长出菌落后，用1mM IPTG诱导后继续培养10h。倒入0.1％刚果红溶液使其完全浸满平板表面，室温水平静置20min，倒掉刚果红溶液后，用6.6％NaCl溶液洗脱，重复洗涤三次，静置浸泡直至脱色清晰后观察是否有水解圈。

结果显示(图7)含有信号肽的转化子产生了水解圈，不含有信号肽的转化子没有产生水解圈，表明含有信号的内切β-1,4-葡聚糖酶的转化子能够向细胞外分泌内切β-1,4-葡聚糖酶。其最适酶活温度(35℃)与该菌的最适生长温度(℃) 吻合。有利于实现活体生物质能源的同步化发酵。

注：表1中涉及的参考文献，具体信息如下：

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序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶及其表达基因和应用

<130> 100

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 405

<212> PRT

<213> Burkholderia pyrrocinia

<400> 1

Met Ala Lys Arg Arg Val Thr Arg Pro Ala Arg Arg Val Gly Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Ala Val Ala Met Ala Cys Ala Ala Gly Gly Met Ala Ala

20 25 30

Arg Ala Gln Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Asp Ala Ala Ala Ala Gly

35 40 45

Cys Gly Ala Pro Trp Pro Arg Trp Asp Ala Phe Lys Arg Asp Phe Ile

50 55 60

Ser Ala Asp Gly Arg Val Ile Asp Val Gly Ser Ala Asp Ser Arg Thr

65 70 75 80

Val Ser Glu Gly Gln Ala Tyr Gly Leu Phe Phe Ala Leu Val Ala Asn

85 90 95

Asp Arg Arg Met Phe Asp Thr Ile Leu Ala Trp Thr Glu Asn Asn Leu

100 105 110

Ala Gln Gly Asp Leu Ser Ala His Leu Pro Ala Trp Leu Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Pro Asp Gly Ala Trp Arg Val Leu Asp Ala Asn Ala Ala Ser Asp

130 135 140

Ala Asp Leu Trp Ile Ala Tyr Ala Leu Val Glu Ala Gly Arg Leu Trp

145 150 155 160

His Glu Arg Ser Tyr Thr Ala Arg Gly Ala Leu Leu Ala Lys Arg Val

165 170 175

Leu Asp Glu Glu Thr Ala Thr Val Pro Gly Leu Gly Val Thr Leu Leu

180 185 190

Pro Gly Pro Thr Gly Phe Lys Leu Pro Asn Gly Gln Trp Arg Val Asn

195 200 205

Pro Ser Tyr Ser Pro Pro Gln Val Ile Arg Ala Leu Gly Ala Arg Leu

210 215 220

Pro Asp Asp Arg Arg Trp Ala Ala Leu Ala Ser Ser Thr Gly Arg Val

225 230 235 240

Leu Leu Asp Thr Ala Pro Lys Gly Phe Ser Pro Asp Trp Ala Leu Tyr

245 250 255

Arg Ala Gly Thr Gly Phe Gly Pro Asp Pro Gln Thr His Ala Glu Ser

260 265 270

Ala Tyr Asn Ala Ile Arg Val Tyr Leu Trp Ala Gly Met Leu Asp Arg

275 280 285

Ala Asp Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ala Arg Phe Ala Pro Phe Ala

290 295 300

Asp His Ile Ala Ala His Gly Ala Pro Pro Glu Lys Val Asp Thr Thr

305 310 315 320

Thr Gly Val Ala Gly Pro Asn Asp Gly Asn Gly Gly Phe Ser Ala Ala

325 330 335

Ala Val Pro Phe Leu Asp Ala Arg Gly Gln Arg Ala Leu Ala Asp Ala

340 345 350

Gln Ala Ala Arg Val Glu Ser Leu Ala Arg Gln Ser Ala Pro Gly Tyr

355 360 365

Tyr Thr Ser Val Leu Thr Leu Phe Gly Leu Gly Trp Arg Asp Gly Arg

370 375 380

Tyr Arg Phe Gly Ala Asp Gly Thr Leu Asp Ala Arg Trp Gly Gly Pro

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<400> 2

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Pro Trp Pro Arg Trp Asp Ala Phe Lys Arg Asp Phe Ile Ser Ala Asp

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Arg Arg Trp Ala Ala Leu Ala Ser Ser Thr Gly Arg Val Leu Leu Asp

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Thr Ala Pro Lys Gly Phe Ser Pro Asp Trp Ala Leu Tyr Arg Ala Gly

210 215 220

Thr Gly Phe Gly Pro Asp Pro Gln Thr His Ala Glu Ser Ala Tyr Asn

225 230 235 240

Ala Ile Arg Val Tyr Leu Trp Ala Gly Met Leu Asp Arg Ala Asp Pro

245 250 255

Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ala Arg Phe Ala Pro Phe Ala Asp His Ile

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Ala Ala His Gly Ala Pro Pro Glu Lys Val Asp Thr Thr Thr Gly Val

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Ala Gly Pro Asn Asp Gly Asn Gly Gly Phe Ser Ala Ala Ala Val Pro

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Arg Val Glu Ser Leu Ala Arg Gln Ser Ala Pro Gly Tyr Tyr Thr Ser

325 330 335

Val Leu Thr Leu Phe Gly Leu Gly Trp Arg Asp Gly Arg Tyr Arg Phe

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<212> DNA

<213> Burkholderia pyrrocinia

<400> 3

atggcgaagc gacgggtaac gcggccggcg cggcgcgtcg gcgcggcact cgcgctggcg 60

gttgcgatgg cgtgtgcggc gggcggcatg gccgctcgcg cgcaggccgc gggcgccggc 120

gcgaccgatg cggccgccgc cggatgcggc gcgccgtggc cgcgctggga cgcgttcaag 180

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ttcgacacga tcctcgcatg gaccgagaac aacctcgcgc agggcgacct gagcgcgcac 360

ctgccggcgt ggctgtgggg ccgcgcgccg gacggcgcgt ggcgcgtgct cgacgcgaac 420

gcggcgtcgg acgccgacct gtggatcgcg tacgcgctcg tcgaggccgg gcggctgtgg 480

cacgagcgca gctacaccgc gcgcggcgcg ctgctcgcga agcgcgtgct cgacgaggaa 540

accgcgaccg tgccgggcct cggcgtcacg ctgctgcccg ggccgaccgg cttcaagctg 600

cccaacggcc agtggcgcgt gaacccgagc tattcgccgc cgcaggtgat ccgcgcgctc 660

ggcgcgcgcc tgcccgacga ccggcgctgg gccgcgctgg catccagcac cgggcgcgtg 720

ctgctcgaca cggcgccgaa gggtttttcg cccgactggg cgctgtatcg cgcgggcacg 780

ggcttcgggc ccgatccgca gacgcatgcg gagagcgcgt acaacgcgat ccgcgtgtac 840

ctgtgggccg gcatgctcga ccgcgccgat ccgctcgccg cgccgttgct cgcgcgtttc 900

gcgccgttcg ccgaccatat cgccgcgcat ggcgcgccgc cggagaaggt cgatacgacg 960

acgggcgtcg cggggccgaa cgacggcaac ggcggatttt ccgcggcggc cgtgccgttt 1020

ctcgacgcgc gcggccagcg cgcgctcgcc gatgcgcagg cggcccgcgt cgagtcgctc 1080

gcgcgccagt cggcgcccgg ctattacacg agcgtgctga cgctgttcgg cctcggctgg 1140

cgcgacggac gctacaggtt cggcgcggac ggcacgctcg acgcccgctg gggaggccct 1200

tcgtgcgccg cccgctga 1218

<210> 4

<211> 1113

<212> DNA

<213> Burkholderia pyrrocinia

<400> 4

atggcggacg ccggcgcgac cgatgcggcc gccgccggat gcggcgcgcc gtggccgcgc 60

tgggacgcgt tcaagcgcga tttcatctcg gccgacggcc gcgtgatcga cgtcggctcg 120

gccgattcac gcacggtgtc ggaggggcag gcgtatggac ttttcttcgc gctggtcgcg 180

aacgaccggc gcatgttcga cacgatcctc gcatggaccg agaacaacct cgcgcagggc 240

gacctgagcg cgcacctgcc ggcgtggctg tggggccgcg cgccggacgg cgcgtggcgc 300

gtgctcgacg cgaacgcggc gtcggacgcc gacctgtgga tcgcgtacgc gctcgtcgag 360

gccgggcggc tgtggcacga gcgcagctac accgcgcgcg gcgcgctgct cgcgaagcgc 420

gtgctcgacg aggaaaccgc gaccgtgccg ggcctcggcg tcacgctgct gcccgggccg 480

accggcttca agctgcccaa cggccagtgg cgcgtgaacc cgagctattc gccgccgcag 540

gtgatccgcg cgctcggcgc gcgcctgccc gacgaccggc gctgggccgc gctggcatcc 600

agcaccgggc gcgtgctgct cgacacggcg ccgaagggtt tttcgcccga ctgggcgctg 660

tatcgcgcgg gcacgggctt cgggcccgat ccgcagacgc atgcggagag cgcgtacaac 720

gcgatccgcg tgtacctgtg ggccggcatg ctcgaccgcg ccgatccgct cgccgcgccg 780

ttgctcgcgc gtttcgcgcc gttcgccgac catatcgccg cgcatggcgc gccgccggag 840

aaggtcgata cgacgacggg cgtcgcgggg ccgaacgacg gcaacggcgg attttccgcg 900

gcggccgtgc cgtttctcga cgcgcgcggc cagcgcgcgc tcgccgatgc gcaggcggcc 960

cgcgtcgagt cgctcgcgcg ccagtcggcg cccggctatt acacgagcgt gctgacgctg 1020

ttcggcctcg gctggcgcga cggacgctac aggttcggcg cggacggcac gctcgacgcc 1080

cgctggggag gcccttcgtg cgccgcccgc tga 1113

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物Primer 1(Artificial)

<400> 5

cgaattcatg gcgaagcgac gggtaac 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物 Primer 2(Artificial)

<400> 6

cgaattctca gcgggcggcg cacgaa 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 特异引物PrimerF(Artificial)

<400> 7

cggatccatg gcggacgccg gcgcga 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 特异引物PrimerR(Artificial)

<400> 8

cgaattctca gcgggcggcg cacgaa 26

Claims

1.一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶，其去信号肽氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的表达基因，核苷酸序列如 SEQ IDNO.3所示。

4.权利要求2所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的去信号肽的表达基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。

5.含有权利要求3所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的表达基因的载体或宿主菌。

6.含有权利要求4所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的去信号肽的表达基因的载体或宿主菌。

7.权利要求1所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶在生产单糖中的应用。

8.权利要求1所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶的的去信号肽在生产单糖中的应用。

9.权利要求1所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶对羧甲基纤维素的最适反应温度为35℃，最适pH为6.0。

10.一种利用权利要求1所述的冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶生产葡萄糖的方法，其特征在于：将核苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示的基因片段导入到pET-32a质粒载体中，将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中，通过亲和层析色谱分离纯化制得内切β-1,4-葡聚糖酶，然后将内切β-1,4-葡聚糖酶加入以CMC-Na为底物的反应液中，在温度为35℃，pH为 6.0 的条件下反应24h，得到的葡萄糖溶液。