CN111647582A

CN111647582A - 吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶及其重组表达方法和应用

Info

Publication number: CN111647582A
Application number: CN202010558180.0A
Authority: CN
Inventors: 范光森; 孙宝国; 胡晓晴
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111647582B

Abstract

本发明公开从吡咯伯克霍尔德氏菌B1213克隆的内切葡聚糖酶基因，采用含有可溶性融合标签的pCold TF载体(使用TF)和cspA启动子成功得以表达。通过酶活性，SDS‑PAGE和酶谱分析成功地表达了带有或不带有信号肽的所述酶，其中切除信号肽更好。通过优化培养条件后，酶活性提高至未优化前的11.5倍。同时对该酶的酶学性质研究表明，该酶最适pH为6.0，最适反应温度为45℃；该酶在20‑35℃下保温半小时后残余酶活可达80％以上，且在pH5.5‑11.0环境中保温半小时后残余酶活保持在95％以上，具有极强的耐碱性，该酶具有很好的工业应用潜力。

Description

吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶及其重组表达方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及葡聚糖酶，及其编码基因重组表达方法和在降解纤维质材料中的应用。

背景技术

内切β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(EG)是一种水解酶，可催化纤维素，谷物β-D-葡聚糖和谷物中的β-1、4-D-糖苷键水解。EG由于其潜在的用途多样性而受到了广泛的关注，例如生产低聚葡寡糖，降低糖化液的粘度和提高酿造过程中的麦汁分离效率，提高饲料的消化率，控制植物病原真菌，并生产生物乙醇[Huang JF,Xia T,Li GH,Li XL,Li Y,WangYT,Wang YM,Chen YY,Xie GS,Bai FW,Peng LC,Wang LQ(2019)Overproduction ofnative endo--1,4-glucanases leads to largely enhanced biomasssaccharification and bioethanol production by specific modification ofcellulose features in transgenic rice.Biotechnol Biofuels 12.http://doi.org/10.1186/s13068-018-1351-1]。此外，新一代利用木质纤维素残留物的可再生能源已成为克服环境问题最有可能的战略之一，这些环境问题包括能源消耗增加，化石燃料资源枯竭以及减轻全球变暖的必要性。用酶水解木质纤维素是理想的方法，并有望以环保和高效的方式加以利用。EG可以将糖苷键随机水解成短链，所以它在木质纤维素水解过程中起着重要的作用。EG是由各种细菌，真菌和植物广泛产生的。尽管有较多真菌来源的EG被确定和进行了相关性质分析，但是细菌来源的较少研究，而细菌来源的一般对环境极端条件的稳定性和耐受性较高，因此细菌在EG生产中具有很高的潜力[Maki M,Leung KT,Qin WS(2009)The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion oflignocellulosic biomass.Int J Biol Sci 5:500-516.http://doi.org/doi:10.7150/ijbs.5.500]。

根据氨基酸序列和三维结构，EG分为16个糖基水解酶(GH)家族[Bernardi AV,Yonamine DK,Uyemura SA,Dinamarco TM(2019)A thermostable Aspergillus fumigatusGH7endoglucanase over-expressed in Pichia pastoris stimulates lignocellulosicbiomass hydrolysis.Int J Mol Sci 20.http://doi.org/10.3390/ijms20092261]。其中，GH8酶可以作用于多种底物，包括纤维素，葡聚糖，壳聚糖甚至木聚糖，这使得GH8的EG在各种工业应用中都非常有吸引力。但是，仅有少数报告记录了GH8 EG的存在[NaressiScapin SM,Moreira Souza FH,Zanphorlin LM,de Almeida TS,Sade YB,Cardoso AM,Pinheiro GL,Murakami MT(2017)Structure and function of a novel GH8endoglucanase from the bacterial cellulose synthase complex ofRaoultellaornithinolytica.Plos One 12.http://doi.org/10.1371/journal.pone.0176550]。

发明内容

本发明人所在实验室，从山东省一种芝麻香型白酒制作环境中(从土壤样品中)筛选出一种新的脂肪酶生产菌株吡咯伯克霍尔德氏菌B1213(Burkholderia pyrrocinia)[CN201610880271.X；Li JL,Shen WJ,Fan GS,Li XT(2018)Screening,purification andcharacterization of lipase from Burkholderiapyrrocinia B1213.3Biotech8.http://doi.org/10.1007/s13205-018-1414-9]，该菌株已保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC No.12806)。本发明人分析认为其由于高产脂肪酶，吡咯伯克霍尔德氏菌可能在酯的合成中起重要作用，因为酯是白酒中的重要风味物质，进而有可能用于酿酒中提高风味的作用。基于此，本发明进行了生物信息学分析，发现该属的菌中未报告GH8葡聚糖酶，通过进一步的深入研究而完成本发明。

本发明首先提供一种吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2或4所示，其中前者为含有信号肽的全长氨基酸序列，后者为不包括信号肽的氨基酸序列。

本发明还提供上述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因，优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或3所示，其中前者为编码含有信号肽的全长基因序列，后者为编码不包括信号肽编码序列的核苷酸序列。

进一步地，本发明提供含有如上述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因的重组载体。在优选的实施方式中，出发载体为pCold TF载体，优选地，使用TF和cspA启动子，进一步优选地，不包括信号肽编码序列。

本发明还提供含有上述的重组载体的重组细胞，例如大肠杆菌。

本发明进一步提供一种表达上述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将不包括信号肽的所述编码基因克隆到pCold TF载体，转化获得重组表达细胞，培养所述细胞，诱导表达后收集表达产生的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶。

在优选的实施方式中，所述重组菌为大肠杆菌，采用的培养基为LB培养基。

在具体实施方式中，大规模培养前包括菌种活化步骤，即在200rpm摇动下，将阳性转化子在包含氨苄青霉素的LB培养基中于过夜活化，优选为37℃。

在优先的实施方式中，将活化菌种转接到pH为5.6-6.6的LB培养基中180-220rpm、35-39℃震荡培养5-8小时，向培养物中加入IPTG以诱导EG表达10-14小时，优选地，诱导时的培养温度为18-22℃，诱导蛋白质表达12小时；活化菌种的优选接种量为0.8-1.2％。

在更优选的实施方式中，将活化菌种转接到pH为5.9的LB培养基中200rpm、37℃震荡培养6小时，向培养物中加入500μmol/L IPTG以诱导EG表达。诱导温度为20℃，诱导蛋白质表达12小时，接种量为1％。

本发明在吡咯伯克霍尔德氏菌B1213中克隆到不同于已知的内切葡聚糖酶，其具有特别的性质，在重组表达时按常规的表达不能成功，需要特殊处理，其中切除信号肽编码序列进行重组表达更好。同时对该酶的酶学性质研究表明有其特别之处，例如该酶最适pH为6.0，最适反应温度为45℃；该酶在20-35℃下保温半小时后残余酶活可达80％以上，且在pH5.5-11.0环境中保温半小时后残余酶活保持在95％以上，具有极强的耐碱性。此外，通过优化培养条件后，酶活性提高至未优化前的11.5倍。

附图说明

图1BpEG01790的多序列比对和二级结构。比对包括B.stabilis(WP_129514311.1),B.cepacian(WP_048244211.1),B.pyrrocinia(WP_114176742.1)和B.puraquae(WP_085040568.1)的EG。大肠杆菌K12菌株(P37651；PDB：3QXF)的纤维素酶BcsZ的3D晶体结构。与纤维素酶3QXF比对后手动确定了6个糖苷酶loops“发卡”结构和活性位点。α螺旋和β折叠分别标记为α和β。蓝线框表示保守残基。

图2基于邻近法的BpEG01790的系统树。

图3BpEG01790的预测3D模型与信号肽。催化活性中心Glu84和Asp145显示为黄色棒状。

图4表达载体的示意图。在限制酶消化和连接后，将靶基因插入pET-28a(+)(a和b)和pCold TF(c和d)载体中。图中显示了使用的限制位点。

图5在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的BpEG01790的SDS-PAGE和酶谱分析。其中，(a)通过pET28a(+)表达的BpEG01790。M:蛋白质标记物；第1、3、5和7道分别是0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。通道2,4,6和8为由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pET28a(+)的发酵液,总蛋白,无细胞浸出物和细胞沉淀。(b)通过pET28a(+)表达无信号肽DNA片段的BpEG01790。M：蛋白质标记；第1、3、5和7道分别是0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。第2、4、6和8道分别是0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pET28a(+)-r的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。(c)通过pCold TF表达BpEG01790。M：蛋白质标记；第1、3、5和7道分别是0.5mmoL/LIPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pCold TF的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。第2、4、6和8道分别是0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pCold TF的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。(d)通过pCold TF表达没有信号肽DNA片段的BpEG01790。M：蛋白质标记；第1、3、5和7道分别是0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pCold TF的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。第2、4、6和8道分别是0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pCold TF-r的发酵液，总细胞，无细胞提取物和细胞沉淀。(e)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的BpEG01790的酶谱分析。泳道1，由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)的无细胞提取物；第2道，由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pET28a(+)的无细胞提取物；泳道3，由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-r的无细胞提取物；泳道4，由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/pCold TF的无细胞提取物；泳道5，由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pCold TF的无细胞提取物；泳道6，由0.5mmoL/L IPTG诱导的大肠杆菌BL21(DE3)/BpEG01790-pCold TF-r的无细胞提取物。

图6pH对EG酶活和稳定性影响测定结果图。(a)pH对EG酶活的影响。以酶活最高组计为100％，其余以百分比计。(b)pH对EG稳定性的影响。以原酶酶活计为100％，处理后的酶活以相对酶活计。

图7温度对EG酶活和稳定性影响测定结果图。(a)温度对EG酶活的影响。以酶活最高组计为100％，其余以百分比计。(b)温度对EG稳定性的影响。以原酶酶活计为100％，处理后的酶活计为相对酶活。

图8不同pH与温度的相互作用对酶稳定性的影响，以未处理的原酶为100％，其余残余酶活以百分比计。

图9培养基种类对EG活性的影响。

图10IPTG浓度对EG活性的影响。

图11pH对EG活性的影响。

图12诱导时机对EG活性的影响。

图13诱导时间对EG活性的影响。

图14响应面(3D)优化EG活力(U/mL)。其中，(a)pH(A)和诱导时机(h，B)的影响；(b)pH(A)和诱导时间(h，C)的影响；(c)诱导时机(h，B)和诱导时间(h，C)的影响。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式或实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明。

下述实施例中对相关的操作或方法若无特别说明，都是本领域常规操作或方法。对试剂和仪器若无特别说明，则是常规可获得或商业途径可以购买得到的。

一、材料与方法

1、材料

质粒pMD18-T，pET28a(+)和pCold TF，Taq聚合酶，基因组DNA纯化试剂盒，DNA凝胶提取试剂盒，异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，DNA和蛋白质标准分子量Mark购自Takara(Tokyo，日本)。限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶和

高保真DNA聚合酶购自NEBInc.。Plus PCR试剂盒购自Novoprotein Scientific Inc。牛血清白蛋白(BSA)购自Roche，大麦β-葡聚糖购自Sigma-Aldrich。除非另有说明，否则所有其他化学品均为分析纯，可商购。

2、方法

(1)培养方法：对于吡咯伯克霍尔德氏菌(CGMCC，编号：12806)，其在Luria-Bertani(LB，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨和10g/L NaCl)培养基中生长，并在37℃的LBC(LB中含有0.4％大麦β-葡聚糖)上培养24小时后用刚果红溶液鉴定B.pyrrociniaB1213中的EG。B.pyrrocinia B1213参考已报道的培养基进行培养，该培养基含有4％(w/v)的麦麸作为碳源[Li H,Chen J,Li AN,Li D(2007)Purification and partialcharacterization of beta-1,3-glucanase from Chaetomium thermophilum.World JMicrobBiot 23:1297-1303.http://doi.org/10.1007/s11274-007-9366-y]。在37℃下并以180rpm摇动5天。每隔24小时测定每个培养发酵瓶中的pH，蛋白质浓度和EG活性。

大肠杆菌DH5α用于克隆和质粒扩增，而大肠杆菌BL21(DE3)用作表达宿主。大肠杆菌细胞在LB培养基中生长，用于基因克隆和蛋白质过表达。需要时添加氨苄西林或卡那霉素，终浓度为50μg/mL。

2、EG的表达分析：通过在4℃下以10000rpm离心10分钟收集诱导的细胞，将其重悬于50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，并在冰水浴中用2s/4s超声处理10分钟进行超声破碎。在4℃下以10000rpm离心10分钟分别收集细胞碎片和悬浮液，用0.22μm的膜过滤悬浮液。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，EG活性测定和EG酶谱分析，以评估EG在大肠杆菌中的表达。带有BpEG01790-pCold-r质粒的大肠杆菌显示出更多的可溶性蛋白表达，并进一步优化以获得最大的可溶性表达。

3、EG活性测定和蛋白质测定

根据Mandana和Ahmad报道的方法对EG活性进行测定。具体步骤如下：(i)将25μL适当稀释的酶溶液添加到含有225μL 1.0％(w/v)大麦β-葡聚糖的混合物中；(ii)将反应混合物在50℃下(50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.0)反应10分钟；(iii)通过添加250μL的3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂来终止酶反应，并在水浴中煮沸15分钟。游离还原糖的量是通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)方法进行测定，以葡萄糖为标准品确定的[31]。1单位(U)的EG活性定义为在上述测定条件下每分钟从底物释放1μmol葡萄糖的酶的量。蛋白质的浓度通过Lowry法以BSA为标准测定。

4、SDS-PAGE和酶谱分析

按照Laemmli的描述，使用分离凝胶和堆积凝胶进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色使蛋白质可视化[Laemmli UK(1970)Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature 227:680-685.http://doi.org/10.1038/227680a0]。将30μL蛋白质样品添加到7.5μL样品缓冲液中，然后在水浴中煮沸5分钟；冷却至室温后，将样品加载到凝胶上。使用Morag等人的方法进行了Zymograms分析[Morag E,Bayer EA,Lamed R(1990)Relationship of cellulosomal andnoncellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum to cellulose-degradingenzymes.J Bacteriol 172:6098-6105.http://doi.org/10.1128/jb.172.10.6098-6105.1990]。样品通过SDS-PAGE(12.5％分离胶和0.2％(w/v)大麦β-葡聚糖)分析。电泳后将凝胶在4℃下用25％(v/v)异丙醇洗涤4次，每次15分钟，以去除凝胶中的SDS。然后在50mM7.0Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中于4℃洗涤四次，每次15分钟。于新缓冲液中30℃下进一步保温20分钟；最后，将凝胶在室温下用0.5％(w/v)刚果红染色15分钟，用1mol/LNaCl洗涤，直到可以看到清晰的区域为止，将0.5％(v/v)乙酸添加到凝胶中，所得区域变得清晰。

实施例一、BpEG01790基因的分析和BpEG01790的3D模型

通过相似性分析在B.pyrrocinia B1213的基因组序列中鉴定出编码EG前体的一个基因(BpEG01790)。B.pyrrocinia B1213的BpEG01790基因的开放阅读框(ORF)为1218bp(G+C含量为50％)，编码406个氨基酸(AA)残基，为假定内切葡聚糖酶，信号肽为40氨基酸残基，其中编码含有信号肽的全长基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码不包括信号肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。BpEG01790的分子量和理论pI分别为43.0kDa和9.50，9个潜在的N-糖基化位点，无潜在的O-糖基化位点(图1)。与蛋白质数据库的氨基酸序列比较表明，BpEG01790与属于GH 8的酶具有90％以上的相似性。BLAST分析显示，BpEG01790与来自Burkholderia stabilis(B.stabilis)(WP_129514311)的GH 8的纤维素酶的序列同源性最高为98.28％，系统进化树分析表明，BpEG01790与B.stabilis的纤维素酶(WP_129514311.1)也密切相关(图2)。此外，BpEG01790与B.cepacian(WP_048244211)的纤维素酶有97.04％的同源性；与来自B.stabilis的纤维素酶(分别为WP_069745602.1，WP_096470653.1和WP_122166455.1)的相似性分别为93.84％，93.15％和93.10％，与B.pyrrocinia的纤维素酶(WP_114176742.1)具有92.86％的相似度。值得注意的是，上述EG是由完整的基因组序列定义的，而没有克隆，表达和酶功能确认。因此，本发明中描述的BpEG01790是Burkholderia属中尝试克隆和表达的第一个EG。

吡咯伯克霍尔德氏菌推导的BpEG01790氨基酸序列与大肠杆菌K12菌株(P37651，GUN_ECOLI)的内切葡聚糖酶BcsZ序列(PDB ID：3QXF)比对分析发现，其含有13个α螺旋，14个β折叠，6个糖苷酶loops“发卡”结构(氨基酸位置分别为80-97,142-160,208-226,248-261,272-281和367-381)，并且第二个“发卡”结构为GH 8中的保守区域(图1)。并且，分析发现氨基酸残基E84和D145为催化中心，分别为质子供体和亲核受体，这与GH8酶催化活性所必需的高度保守的残基一致(图1)。采用迭代线程程序集优化(I-TASSER)服务器处理BpEG01790 AA序列得到C值为0.51的BpEG01790 3D模型(图3)。3D模型在结构上最接近大肠杆菌K12菌株的内切葡聚糖酶BcsZ序列(PDB ID：3QXF)，模型得分(TM得分)为0.81，比对覆盖率为0.83。BpEG01790的3D模型含50.8％的α螺旋，其次是43.8％的无规卷曲，只有～5.4％的β-折叠(图3)。

实施例二、BpEG01790基因的克隆和重组载体的构建

按照生产商的说明，使用细菌基因组DNA纯化试剂盒从B1213中分离基因组DNA。根据B.pyrrocinia B1213中预测的EG基因序列(见SEQ ID NO：1)设计引物(表1)，即BpEG01790-pMD-18T-N和BpEG01790-pMD-18T-C引物，通过PCR扩增了整个BpEG01790基因。使用

高保真DNA聚合酶作为反应条件进行PCR：98℃2min；35个循环，分别为98℃20 s，67.5℃20 s，72℃60 s；并在72℃下延伸5min。将扩增的片段克隆到质粒pMD18-T中，并转化到大肠杆菌DH5α中。经DNA测序确认正确后进行后续实验。

表1实验中使用的引物

BpEG01790-pMD-18T-N和BpEG01790-pMD-18T-C用于扩增整段BpEG01790；BpEG01790-pET28a(+)-F和BpEG01790-pET28a(+)-R用于构建BpEG01790-pET28a(+)质粒；BpEG01790-pET28a(+)-N和BpEG01790-pET28a(+)-C用于构建BpEG01790-pET28a(+)-r质粒；BpEG01790-pCold TF-F和BpEG01790-pCold TF-R用于构建BpEG01790-pCold TF质粒；BpEG01790-pCold TF-N和BpEG01790-pCold TF-C用于构建BpEG01790-pCold TF-r质粒。其中，限制酶位点用下划线标出并以粗体显示。

实施例三、BpEG01790与pET28a(+)的表达

由于含有T7启动子系统，lac操纵子，亲和标签，抗生素抗性基因，限制性酶切位点的灵活选择和操作方便，pET质粒是实验室中常规表达异源蛋白的首选表达载体。因此，根据Plus PCR试剂盒的说明，将该基因在NcoI和EcoRI限制性酶切位点亚克隆到pET28a(+)。用表1中的引物完成，如图4所示，产生BpEG01790-pET28a(+)，首先使用pET28a(+)载体表达BpEG01790。通过下述引物对：

和

从B.pyrrociniausing PCR扩增编码假定的BpEG01790的DNA片段，将PCR产物克隆到表达载体pET28a(+)中，得到表达载体BpEG01790-pET28a(+)。菌株PCR和测序结果表明，BpEG01790已成功连接到pET28a(+)载体，利用常规热击法将构建的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。使用50μg/mL卡那霉素进行阳性菌落的筛选，并通过基因测序确认了阳性转化子。通过在200rpm摇动下，将阳性转化子在包含40μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃进行培养，当培养液在600nm处的吸光度达到0.6-0.8时，向培养物中加入500μmol/L IPTG以诱导EG表达。诱导温度为20℃，接种量为1％，诱导蛋白质表达16小时。

在发酵液(FB)，总细胞(TC)，无细胞提取物(CFE)或细胞沉淀(CP)中未检测到EG活性，并且通过SDS-PAGE和酶谱分析未发现相应的分子量谱带(图5a,e)。针对诱导剂浓度和诱导温度进行了优化，但是，在大麦β-葡聚糖的任何测试条件下均未检测到酶活性(数据未显示)。pET表达质粒的使用通常导致包含重组蛋白的包涵体的产生，但是使用pET载体得到的重组蛋白不表达的情况很少见。考虑到BpEG01790中的信号肽会导致这种现象，通过引物(BpEG01790-pET28a(+)-N and BpEG01790-pET28a(+)-C)构建了没有信号肽的pET28a(+)-BpEG01790，但结果表明目标蛋白仍未表达(图5b,e)。由于含有lacI-lacO系统，pET28a(+)可以防止克隆基因的遗漏表达。BpEG01790未在pET28a(+)表达可能是由于pET28a(+)与BPBG01790的基因之间的相互作用引起的。为了实现可溶性表达，尝试使用了其他表达载体(见后续实施例)。

实施例四、BpEG01790在pCold TF中的表达

与pET28a(+)质粒不同，pCold质粒是冷休克载体，其蛋白表达受cspA启动子控制，pCold载体包含翻译增强元件(TEE)，而Shine-Dalgarno(SD)序列被更改为GAGG，从而导致与pET载体中存在的SD序列AAGG相比，蛋白质过表达增加。因此，本发明人尝试采用pColdTF载体表达BpEG01790。

将BpEG01790基因在EcoRI限制性酶切位点亚克隆到pCold TF。采用的引物见表1。如图4所示，产生BpEG01790-pCold TF质粒。扩增没有信号肽的DNA片段BpEG01790，插入pCold TF(命名为BpEG01790-pCold TF-r质粒)中。如图4所示，使用表1中的引物，通过利用常规热击法将构建的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。使用50μg/mL卡那霉素进行阳性菌落的筛选，并通过基因测序确认了阳性转化子。通过在200rpm摇动下，将阳性转化子在包含40μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中于37℃进行培养，当培养液在600nm处的吸光度达到0.6-0.8时，向培养物中加入500μmol/L IPTG以诱导EG表达。诱导温度为20℃，接种量为1％，诱导蛋白质表达16小时。

实验结果表明，目标蛋白为可溶性，活性为1.9U/mL。通过对重组细胞的SDS-PAGE分析进一步证实了该结果，在可溶性部分中约有80％的TF-BpEG01790(kDa)(图5c)。酶谱分析还表明，由于存在对应于SDS-PAGE的透明条带，所以酶被成功表达(图5e)。其中无信号肽的BpEG01790片段连接到pCold TF时，诱导后，BpEG01790也可在可溶性位点成功表达，其活性高于以全长形式表达的BpEG01790。因此，其后的研究以BpEG01790中的无信号肽形式进行。

实施例五、pH和温度对EG活性和稳定性的影响

1、最适pH与pH稳定性

最适pH的测定：采用不同pH缓冲液体系(20mmol/L)配制1％的大麦β-葡聚糖作为底物，在40℃条件下用上述标准的3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶活，以最高酶活计为100％，分别计算各pH下的相对酶活。缓冲液体系及其范围分别为:Gly-NaOH 3.0-4.0；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液4.5-6.0；Tris-HCl 6.0-9.0；Gly-NaOH 9.5-11.0，所有试验一式三份。

pH稳定性的测定:用上述缓冲液将酶液稀释合适倍数后置于30℃恒温水浴锅中保温30min，保温结束立即冰浴30min，于45℃和最适pH下测定酶活，以未经处理的原酶作为对照，将处理后酶液的残余酶活表示为原酶液酶活的百分比，所有试验一式三份。

由图6a可以看出，该酶的最适反应pH为6.0，在pH5.0-6.0范围内EG酶活随着pH的升高而增加，在pH 6.0处达到最高，之后随着pH的增加又呈现出急剧下降的趋势。在pH 7.0处已经降为30％左右，显然该酶弱酸环境中能最大程度的发挥作用。而pH稳定性的实验中EG在较宽pH范围内表现出良好的稳定性(结果见6b)，尤其是在碱性环境中保温半小时后残余酶活仍能达到95％左右，并且处于稳定的状态，可以看出EG具有极好的耐碱性，在工业应用中具有很好的应用潜力。

2、最适反应温度与温度稳定性

最适反应温度的测定:用最适pH缓冲液将酶液稀释合适倍数分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下测定酶活，1％的大麦β-葡聚糖底物同样由最适pH缓冲液配制。以最高酶活计为100％，分别计算各温度下的相对酶活，所有试验一式三份。

温度稳定性的测定:用20mmol/L的最适pH缓冲液将酶液稀释合适倍数后，置于不同温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的恒温水浴锅中保温30min，保温结束立即冰水浴30min，在最适温度和最适pH条件下测定残余酶活，以未经处理的原酶为对照，所有试验一式三份。

由图7a可以看出在20-45℃范围内随着温度的升高，酶活力不断增大，在45℃处达到最高。在35-50℃范围内该酶活力能达到80％以上，具有较好的活性。而从该酶的温度稳定性结果(图7b)来看EG在40℃及以下环境中酶活性均保持在95％以上。在40℃环境保温半小时后残余酶活仍保持在90％以上，温度达到50℃时酶活力出现显著的下降。

3、不同pH缓冲液与温度的相互作用对酶稳定性的影响

分别用pH 3.0、pH 6.0、pH 9.0的缓冲液将酶液稀释合适的倍数后置于40℃、45℃、50℃的恒温水浴锅内，温浴时长为0.5-4h，每隔0.5h取样测定残余酶活。温浴结束后冰水浴30分钟，在最适pH与最适温度下利用上述标准的3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定残余酶活，以未经处理的原酶酶活计为100％，其余以相对酶活计算，所有实验一式三份。

图8试验结果表明，EG在pH 6.0环境中处于相对稳定状态，随着保温时间延长酶活有所下降，但保温4h后酶活仍然能保持在88％以上。在pH3.0 50℃环境下EG表现出较差的稳定性，随着保温时间的延长，酶活力急剧下降。保温4h后残余酶活力仅剩45％左右。而在pH9.0 50℃范围内保温4h后酶活力能仍能达60％以上，由此可以看出该酶在弱酸及碱性环境的工业应用中具有较好的应用前景。

实施例六、表达条件的优化

采用单因素优化方法，研究了EG的表达条件，包括培养基类型，IPTG浓度，接种量，初始pH，诱导温度，振荡速度，诱导时机和诱导时间(表2)。根据之前的初步实验，进行了四个变量的Plackett-Burman(PB)设计，包括IPTG浓度(X1)，初始pH(X2)，诱导时机(X3)和诱导时间(X4)。每个变量以高和低两个水平进行，分别由(+1)和(-1)表示(表3)。PB设计和EG活力于表4。通过PB设计获得的回归模型可用于筛选重要变量和构建最陡的上升路径(表3)。沿着最陡峭的上升路径和实践经验进行实验，直到EG活性没有进一步提高为止(表5)。该点将接近最佳点，并且可以用作响应面方法(RSM)的中心点。一旦确定了对响应和中心点具有统计学显著影响的变量，就可以基于Box-Behnken实验设计(BBD,Design-expert 11)，使用RSM优化筛选出的变量，以提高EG的产量。表5中列出的设计包含3个因素：初始pH(A)，诱导时机(B)和诱导时间(C)。每个因素3个水平(包括在中心点重复3次)，用于拟合二阶响应表面。每个实验一式三份进行，EG活性的平均值作为反应。

表2单因素试验设计的因素和水平

表3 PB设计中的变量级别和统计分析

“*”,显著性达5％水平(P<0.05)；“**”,显著性达1％水平(P<0.01)

表4用于评估影响EG活动的因素的PB矩阵设计

表5最陡爬坡试验设计方案和结果

为了提高可溶性活性BpEG01790的产量，通过单因素设计，PB设计，最陡的上升设计和RSM优化了表达条件。

1、通过单因素设计优化表达条件

比较了使用9种常用培养基LB，TB，MX，SOB，LBBM，LBMMG，LBMBM，LBBSMG和TBGN的表达[Golotin VA,Balabanova LA,Noskova YA,Slepchenko LV,Bakunina IY,VorobievaNS,Terenteva NA,Rasskazov VA(2016)Optimization of cold-adapted alpha-galactosidase expression in Escherichia coli.Protein ExpresPurif 123:14-18.http://doi.org/10.1016/j.pep.2016.03.006]。如图9所示，BpEG01790在LB培养基中显示最大表达。如图10所示，在七个不同浓度下评估了IPTG的作用。结果表明，在不同IPTG浓度下表达水平之间存在差异，以0.10mmoL/L IPTG达到的BpEG01790表达水平优于其他浓度。

当诱导温度在16℃到24℃之间时，目标融合蛋白的表达水平要优于诱导温度高于24℃的表达水平，这与带有冷休克启动子cspA的pCold载体的特征一致(数据未显示)。此外，在七个不同的接种量下评估蛋白质的过表达。BpEG01790的最高活性是在0.8％的接种量下实现的(数据未显示)。BpEG01790的产生受到初始pH的强烈影响。低(pH 3-4)或高(pH8)的初始pH值会降低细胞的生长速率和产量，导致重组BpEG01790的生产水平降低(图11)。当初始pH为5.0时，获得了最高的BpEG01790表达水平(图11)。研究了不同摇动速度对BpEG01790表达的影响，并以160rpm的转速达到了最高表达水平(数据未显示)。IPTG添加到培养物中的时间点可能会影响蛋白质的过表达水平和蛋白质活性。接种后6h加入IPTG观察到BpEG01790的最高活性(图12)。诱导8小时后未观察到重组BpEG01790的活性增加。因此，选择8小时的诱导时长以实现最佳的BpEG01790过表达(图13)。

2、通过PB设计优化表达条件

根据先前描述的单因素实验，BpEG01790的产生受到IPTG浓度，初始pH，诱导时机和诱导时间的积极影响。因此，选择了这四个因素并通过PB设计对其进行了优化评估。在测试条件下，EG活性在3.7-12.7U/mL范围内变化很大(表4)，这表明这些变量强烈影响了EG的产生。测试了模型的充分性，并通过Fisher的ANOVA检验确定了具有统计学显著效果的参数。发现所有变量，即初始pH(X2)，诱导时机(X3)，诱导时间(X4)和IPTG浓度(X1)，在显著性水平为5％时均显著影响EG活性(表3)。初始pH(X2)和诱导时间(X4)具有正系数，而其他两个变量具有负系数。这四个变量的最佳条件需要进一步测量。

3、通过最陡爬坡试验设计优化表达条件

最陡的上升路径的方向由回归结果确定(表3)。从该效果可以预测，增加初始pH(X2)和诱导时间(X4)，同时减小诱导时机(X3)和降低IPTG(X1)的浓度会增强重组BpEG01790的过表达。表5说明了最陡的上升路径实验的实验设计和响应。最陡峭上升路径的结果清楚地表明，运行2的最大产量曲线值为18.7U/mL(表5)。因此，选择此组合用于进一步优化。

4、通过RSM优化表达条件

RSM是解决多种问题并优化各种实验中的几种响应的一种流行且有效的方法。基于使用PB设计和最陡峭上升设计识别出的变量，选择了基于RSM的三因子，三级BBD来分析三个变量的影响：初始pH(A)，诱导时机(B)和诱导时间(C)。结果示于表6中，得出的变量响应方程为：

EG活动(Y)＝-184.34+83.85×A-6.77×B-3.91×C+1.01×AB+0.46×AC+0.06×BC-8.45×A²+0.19×B²+0.13×C² (1)

其中，Y是响应(以U/mL为单位的EG活性)。

表7以ANOVA形式显示了二阶响应面模型的结果。具有非常低的概率值[(Pmodel>F)<0.05]表明该模型非常显著。该模型的适用性通过确定系数(R²＝0.9903)进行了检验，该系数表明样本变量的变异大于99％是归因于变量的，而模型中只有不到1％的总方差无法解释。调整后的确定系数(Adj R²＝0.9727)和预测确定系数(Pre R²＝0.8601)也令人满意地证实了模型的显著性。变异系数值低(CV＝9.43％)表示所进行实验的可靠性更高。因此，该模型足以在所使用的变量范围内进行预测。

表6 Box-Behnken试验设计和因变量的响应

表7 BBD结果的回归系数及其各因素对EG生产的影响显著性

“**”,显著性达1％水平(P<0.01)。

每个系数的显著性由F检验和P值确定(表7)。较大的F检验值和较小的P值表明相应的系数更为显著。这三个变量均对响应有很强的线性效应(P<0.01)，pH值显示正效应，而其他两个变量则显示负效应。pH值的显著正效应表明EG活性随pH值的增加而增加。pH和诱导时机之间的相互作用是显著的，而其他的则不显著，而pH和诱导时机对EG的活性表现出明显的正二次效应。

响应面图为预测不同测试变量值的EG活性提供了一种方法。图14显示了EG活性变化的3D响应面曲线。响应面图提供了一种易于理解的方法来了解两个变量之间的相互作用，并找到其最佳值。图14中的结果表明，3D响应表面曲线本质上是凸形的，这表明对于pH和诱导时机以及pH和诱导时间，存在明确的最佳状态。尽管实际情况可能比所报道的更为复杂，但是RSM一直在尝试优化蛋白质生产和活性的条件。

5、实验设计验证

从使用RSM获得的数据中计算出变量的最佳值。最佳pH为5.9，最佳预诱导时机为10小时，最佳诱导时间12h。该模型预测，使用上述变量的优化值，EG的产量可达到39.9U/mL。通过优化条件进行验证实验，得出EG活性值为38.3U/mL，与预测值相符。在未优化培养基中的EG酶活为3.1U/mL，增加了11.5倍。因此，该结果证实了预测值和模型的有效性，表明优化EG表达条件非常重要。

可见，本发明克隆了一种新的源于吡咯伯克霍尔德氏菌的GH8 BpEG01790这一内切β-1,4-葡聚糖酶，并探索了在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，以及优化培养条件以最大化蛋白质产量的方法。其中研究发现使用pCold TF载体时，实现了BpEG01790的可溶性表达。该酶的最适温度为45℃，具有较宽的pH范围的适应性。通过研究表明，在优化条件下，BpEG01790的表达水平提高了11倍以上。本研究中用于改善蛋白质表达和酶活性的方案代表了一种生产活性可溶性形式重组蛋白的有用方法。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶及其重组表达方法和应用

<160> 16

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 1221

<212> DNA

<213> Burkholderiapyrrocinia B1213

<220>

<223>

<400> 1

atggcgcggg ttatggcgaa gcgacgggca acgcagccgg cgcgacgcgt cggcgcggcg 60

ttcgcgctga cggtcgcggt ggcgtgcgcg gcggccggca tggccgctcg cgcgcaggcc 120

gcgggggccg atgcggccgc tgcgggatgc agcgcggcgt ggccgcgctg ggacgcgttc 180

aagcgcgatt tcatctcggc cgacggccgc gtgatcgacg tcggctcggc cgattcacgc 240

acggtgtcgg aggggcaggc gtatggactt ttcttcgcgc tggtcgcgaa cgaccggcgc 300

atgttcgaca cgatcctcgc atggaccgag aacaacctcg cgcagggcga cctgagcgcg 360

cacctgccgg cgtggctgtg gggccgtgcg cccgacggcg cgtggcgcgt gctcgacgcg 420

aacgccgcgt ccgacgccga cctgtggatc gcatatgcgc tcgtcgaggc cgggcggctg 480

tggcacgagc gcagctacac cgcgcgcggc acgctgctcg cgaagcgtgt gctcgacgag 540

gaaacggcca ccgtgccggg cctcggcgtc acgctgctgc cggggccgac ggggttcaag 600

ctggccaatg gtcagtggcg cgtgaatccg agctattcgc cgccgcaggt gatccgcgcg 660

ctcggcgcgc gcctgcccga cgaccggcgc tgggccgcgc tggcttccag caccgggcgc 720

gtgatgctcg acacggcgcc gaagggtttt tcacccgact gggcgctgta tcgcgcgggc 780

accggcttcg ggcccgatcc ggagacgcat gcggagagcg cgtacaacgc gatccgcgtg 840

tacctgtggg ccggcatgct cgaccgcgcc gatccgcttg ccgcgccgtt gctcgcgcgt 900

ttcgcgccgt ttgcggacgc catcgccacg cgtggcgcgc caccggagaa ggtcgatacg 960

acgaccggcg tcgcggggcc gaacgacggc aacgcagggt tctcggcggc ggccgtgccg 1020

tttctcgacg cgcgcggcca acgctcgctc gcggatgtgc aggcggcccg cgtcgagtcg 1080

ctgcgcgcgc cagtcgcgcc cggctactac acgagcgtgc tgacgctgtt cgggctcggc 1140

tggcgcgacg ggcgctaccg gttcggcgcg gacggcacgc tcgatgcccg ctggggaggc 1200

cgttcgtgcg ccgcccgctg a 1221

<210>2

<211> 406

<212> PRT

<213> Burkholderiapyrrocinia B1213

<220>

<223>

<400>2

MARVMAKRRA TQPARRVGAA FALTVAVACA AAGMAARAQA AGADAAAAGC SAAWPRWDAF 60

KRDFISADGR VIDVGSADSR TVSEGQAYGL FFALVANDRR MFDTILAWTE NNLAQGDLSA 120

HLPAWLWGRA PDGAWRVLDA NAASDADLWI AYALVEAGRL WHERSYTARG TLLAKRVLDE 180

ETATVPGLGV TLLPGPTGFK LANGQWRVNP SYSPPQVIRA LGARLPDDRR WAALASSTGR 240

VMLDTAPKGF SPDWALYRAG TGFGPDPETH AESAYNAIRV YLWAGMLDRA DPLAAPLLAR 300

FAPFADAIAT RGAPPEKVDT TTGVAGPNDG NAGFSAAAVP FLDARGQRSL ADVQAARVES 360

LRAPVAPGYY TSVLTLFGLG WRDGRYRFGA DGTLDARWGG RSCAAR 406

<210>3

<211> 1101

<212> DNA

<213> Burkholderiapyrrocinia B1213

<220>

<223>

<400>3

gcgggggccg atgcggccgc tgcgggatgc agcgcggcgt ggccgcgctg ggacgcgttc 60

aagcgcgatt tcatctcggc cgacggccgc gtgatcgacg tcggctcggc cgattcacgc 120

acggtgtcgg aggggcaggc gtatggactt ttcttcgcgc tggtcgcgaa cgaccggcgc 180

atgttcgaca cgatcctcgc atggaccgag aacaacctcg cgcagggcga cctgagcgcg 240

cacctgccgg cgtggctgtg gggccgtgcg cccgacggcg cgtggcgcgt gctcgacgcg 300

aacgccgcgt ccgacgccga cctgtggatc gcatatgcgc tcgtcgaggc cgggcggctg 360

tggcacgagc gcagctacac cgcgcgcggc acgctgctcg cgaagcgtgt gctcgacgag 420

gaaacggcca ccgtgccggg cctcggcgtc acgctgctgc cggggccgac ggggttcaag 480

ctggccaatg gtcagtggcg cgtgaatccg agctattcgc cgccgcaggt gatccgcgcg 540

ctcggcgcgc gcctgcccga cgaccggcgc tgggccgcgc tggcttccag caccgggcgc 600

gtgatgctcg acacggcgcc gaagggtttt tcacccgact gggcgctgta tcgcgcgggc 660

accggcttcg ggcccgatcc ggagacgcat gcggagagcg cgtacaacgc gatccgcgtg 720

tacctgtggg ccggcatgct cgaccgcgcc gatccgcttg ccgcgccgtt gctcgcgcgt 780

ttcgcgccgt ttgcggacgc catcgccacg cgtggcgcgc caccggagaa ggtcgatacg 840

acgaccggcg tcgcggggcc gaacgacggc aacgcagggt tctcggcggc ggccgtgccg 900

tttctcgacg cgcgcggcca acgctcgctc gcggatgtgc aggcggcccg cgtcgagtcg 960

ctgcgcgcgc cagtcgcgcc cggctactac acgagcgtgc tgacgctgtt cgggctcggc 1020

tggcgcgacg ggcgctaccg gttcggcgcg gacggcacgc tcgatgcccg ctggggaggc 1080

cgttcgtgcg ccgcccgctg a 1101

<210> 4

<211> 366

<212> PRT

<213> Burkholderiapyrrocinia B1213

<220>

<223>

<400> 4

AGADAAAAGC SAAWPRWDAF KRDFISADGR VIDVGSADSR TVSEGQAYGL FFALVANDRR 60

MFDTILAWTE NNLAQGDLSA HLPAWLWGRA PDGAWRVLDA NAASDADLWI AYALVEAGRL 120

WHERSYTARG TLLAKRVLDE ETATVPGLGV TLLPGPTGFK LANGQWRVNP SYSPPQVIRA 180

LGARLPDDRR WAALASSTGR VMLDTAPKGF SPDWALYRAG TGFGPDPETH AESAYNAIRV 240

YLWAGMLDRA DPLAAPLLAR FAPFADAIAT RGAPPEKVDT TTGVAGPNDG NAGFSAAAVP 300

FLDARGQRSL ADVQAARVES LRAPVAPGYY TSVLTLFGLG WRDGRYRFGA DGTLDARWGG 360

RSCAAR 366

<210>5

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

atggcgcggg ttatggcgaa g 21

<210>6

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tcagcgggcg gcgcacgaac g 21

<210>7

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

catgccatgg atggcgcggg ttatggc 27

<210>8

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ccggaattct cagcgggcgg cgcacgaacg gc 32

<210>9

<211>27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

catgccatgg gcgggggccg atgcggc 27

<210>10

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

ccggaattct cagcgggcgg cgcacgaacg gc 32

<210>11

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

cgcggatccg aattcgcgcg ggttatggcg 30

<210>12

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

gacaagcttg aattctcagc gggcggcgca 30

<210>13

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

cgcggatccg aattcgcggg ggccgatgcg 30

<210>14

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

gacaagcttg aattctcagc gggcggcgca 30

<210>15

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

catgccatgg atggcgcggg ttatggc 27

<210>16

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

ccggaattct cagcgggcgg cgcacgaacg gc 32

Claims

1.一种吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示核苷酸所编码。

2.如权利要求1所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因，优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或3。

3.含有如权利要求2所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，出发载体为pCold TF载体，优选地，使用TF和cspA启动子，进一步优选地，不包括信号肽编码序列。

5.含有如权利要求3或4所述的重组载体的重组细胞。

6.一种表达如权利要求2所述的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶的编码基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将不包括信号肽的所述编码基因克隆到pCold TF载体，转化获得重组表达细胞，培养所述细胞，诱导表达后收集表达产生的吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组表达细胞为大肠杆菌。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，培养前包括菌种活化步骤，即在200rpm摇动下，将阳性转化子在包含氨苄青霉素的LB培养基中于过夜活化。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将活化菌种转接到pH为5.6-6.6的LB培养基中180-220rpm、35-39℃震荡培养5-8小时，向培养物中加入IPTG以诱导EG表达10-14小时，优选地，诱导时的培养温度为18-22℃，诱导蛋白质表达12小时；活化菌种的优选接种量为0.8-1.2％。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将活化菌种转接到pH为5.9的LB培养基中200rpm、37℃震荡培养6小时，向培养物中加入500μmol/L IPTG以诱导EG表达。诱导温度为20℃，诱导蛋白质表达12小时，接种量为1％。