CN104011214B - C.bescii耐热酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供从Caldicellulosiruptor bescii中分离出来的耐热酶及其片段，用于降解纤维素和/或半纤维素，该耐热酶包括耐热纤维素酶和半纤维素酶。本发明进一步提供编码本发明的耐热酶的核酸。本发明也提供用本发明的耐热酶将纤维素和半纤维素转化成可发酵的糖的方法。本发明还提供含有在此公布的多种酶的酶合剂。该酶可用于释放存在于纤维素或半纤维素中的糖，用于随后的发酵，以生产增值产物。

Description

C.BESCII耐热酶
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年12月21提交的美国临时申请61/425,623和2011年9月7日提交的美国临时申请61/532,060的优先权，其内容在此予以全文引用。
技术领域
本发明涉及用于降解纤维素，半纤维素，及含纤维素和/或半纤维素的材料的组合物和方法。特别地，本公布提供用于降解纤维素的耐热酶，编码该酶的核酸，及其使用方法。本公布也提供用于降解半纤维素的耐热酶，编码该酶的核酸，及其使用方法。本发明进一步提供提高耐热纤维素酶和/或半纤维素酶的活性的耐热酶，编码该酶的核酸，及其使用方法。
在ASCII文本文件上提交的序列表
在此，以全文引用的方式结合ASCII文本文件上提交的内容：计算机可读形式(CRF)序列表(文件名:658012000940SeqListing.txt,记录日期:2011年12月7日,大小:513KB)。
背景技术
目前，用于使糖发酵成生物燃料比如乙醇的微生物不能利用复杂的多糖，比如纤维素和半纤维素。结果，木素纤维材料转化成生物燃料存在重大瓶颈。
纤维素，植物的主要成分和地球上最丰富的有机化合物之一，是由β(1-4)连接的D-葡萄糖分子长链组成的多糖。由于其糖基成分，使得纤维素成为生产生物燃料的富有潜力的原材料。例如，来自纤维素的糖可以发酵成生物燃料，比如乙醇。为了能使纤维素内的糖用于生物燃料或其它化学品的生产，必须将纤维素分解成更小的分子。
可以通过纤维素酶的作用用酶水解纤维素。纤维素酶包括内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的作用在于裂解纤维素的1-4β-D-糖苷键，并且导致β-D-葡萄糖分子的最终释放。在纤维素分解成单个糖分子期间，可形成各种长度的葡萄糖聚合物作为中间分解产物。来自纤维素水解的、长度约2-6分子的葡萄糖聚合物被称为“纤维糊精”或“纤维低聚糖。”
在许多植物如多年生禾草柳枝稷和芒草中，半纤维素构成多糖的第二个最大的成分。半纤维素是具有木糖连接的骨架，带阿拉伯糖、葡糖醛酸基和乙酰基侧链的复杂多糖。半纤维素的结构模型展示了以β-1,4-键连接在一起的木糖骨架残基（图1）。若干功能基团装饰该骨干，包括乙酰（AC）基酯，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸，以及阿魏酯（feroryl）基团的酯。该阿魏酯基团使整个结构连接至木质素。将半纤维素水解为其主要成分糖比如木糖（五碳糖）和阿拉伯糖（五碳糖）的酶合剂会大大增加来自木质纤维素原料的、用于生物燃料生产的可发酵糖。通过半纤维素酶对半纤维素进行酶法移除也会增加纤维素酶进入植物细胞壁的纤维素成分或木质纤维素原料的可达性。因此，半纤维素的降解是利用木质纤维素原料生产生物燃料的关键步骤。
耐热酶对纤维素和半纤维素的高效降解是特别理想的，因为耐热酶比非耐热酶在涉及将木质纤维素材料转化成生物燃料的其它过程中更兼容。例如，处理木质纤维素材料以降低纤维素的结晶度可能需要高温，高温会使非耐热酶失活。
此外，耐热酶对纤维素和/或半纤维素的降解是可取的，因为与其中温相对物相比，耐热酶可能具有更高比活性，并且因为耐热酶可以在降低或排除微生物污染的风险的高温下操作。
因此，需要能降解纤维素和/或半纤维素的耐热酶和酶合剂。
发明内容
本发明提供酶和酶合剂，该酶和酶合剂满足耐热酶能降解纤维素和/或半纤维素的需求。在一些方面，本发明通过具有纤维素酶活性的酶。在一些方面，本发明提供具有纤维素酶活性的去尾酶。在一些方面，本发明提供用于降解含纤维素的材料的改进的酶混合物。在一些方面，本发明通过具有半纤维素酶活性的酶。在一些方面，本发明通过用于降解含半纤维素的材料的改进的酶混合物。本发明进一步提供含一种或多种纤维素酶和一种或多种半纤维素酶的、并且在含纤维素和半纤维素两者的材料上具有改进的活性的酶合剂，其中，纤维素和半纤维素混合物具有协同活性。本发明进一步提供提高这样的酶的活性：具有纤维素酶或半纤维素酶活性和/或其混合物。本发明进一步提供编码在此公开的多肽的核苷酸序列。在此公开的多肽可以单独，结合，或与其它酶一起使用。
在一个实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括选自核苷酸序列SEQID NOs:4,8,14,20,28,34和38的两种或更多种重组核酸。在另一实施例中，提供包括三种重组核酸的宿主细胞，该三种重组核酸选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38。在另一实施例中，提供包括四种重组核酸的宿主细胞，该四种重组核酸选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38。在另一实施例中，提供包括五种重组核酸的宿主细胞，该五种重组核酸选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38。在另一实施例中，提供包括六种重组核酸的宿主细胞，该六种重组核酸选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种的重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptorbesciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ IDNO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。
在另一实施例中，该公开提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptorbesciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ IDNO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸，其中，该宿主细胞进一步包括编码一种或多种纤维素酶的一种或多种重组核酸。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptorbesciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ IDNO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸，其中，该宿主细胞选自：埃希氏菌属（Escherichia spp.）,假单胞菌属（Pseudomonas spp.），变形杆菌属（Proteus spp.）,罗尔斯通菌属（Ralstonia spp.）,链霉菌属（Streptomycesspp.）,葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）,乳球菌属（Lactococcus spp.）,杆菌属（Bacillus spp.）,酿酒酵母属（Saccharomyces cerevisiae）,粟酒裂殖酵母菌属（Schizosaccharomyces pombe）,解脂耶氏酵母属（Yarrowia lipolytica）,汉逊酵母属（Hansenula polymorpha）,乳酸克鲁维酵母属（Kluyveromyces lactis）,巴斯德毕赤酵母属（Pichia pastoris）,曲霉属（Aspergillus spp.）,Chrysosporium lucknowense,或里氏木霉属（Trichoderma reesei）。
在另一实施例中，本发明提供一种用于生产至少两种酶的方法，该酶选自：内切木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡萄糖醛酸酶、β-木糖苷酶、和乙酰木聚糖酯酶，该方法包括：在培养基中培养包括两种或更多种重组核酸的宿主细胞，以在合适的条件下生产内切木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡萄糖醛酸酶、β-木糖苷酶、和乙酰木聚糖酯酶，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ ID NO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞和培养基，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ IDNO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ ID NO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。
在另一实施例中，本发明提供包括两种或更多种重组蛋白质的组合物，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37。
在另一实施例中，本发明提供包括六种重组蛋白质的组合物，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37。
在另一实施例中，本发明提供包括两种或更多种重组蛋白质的组合物，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该组合物进一步包括一种或多种重组纤维素酶。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化为发酵产物的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养该糖溶液。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成发酵产物的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，并且其中，该组合物进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养糖溶液，并且其中，在与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触前对该生物质进行预处理，其中该预处理包括一种或更多种处理，该处理选自：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成发酵产物的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养糖溶液，其中该生物质包括植物材料。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成发酵产物的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养糖溶液，其中该生物质包括选自以下的植物材料：芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybeanstover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（DistillersDried Grains with Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）和能源甘蔗。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的情况下用发酵微生物培养该糖溶液。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，并且该组合物可以进一步包括一种或多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的条件下用发酵微生物培养该糖溶液，并且其中在与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触前对该生物质进行预处理，其中该预处理包括一种或更多种处理，该处理选自：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在另一实施例中，该公布提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的条件下用发酵微生物培养该糖溶液，其中该生物质包括植物材料。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的条件下用发酵微生物培养糖溶液，其中该生物质包括选自以下的植物材料：芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cordgrass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canolastraw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybean stover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（Distillers Dried Grainswith Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）和能源甘蔗。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，并且该组合物可以进一步包括一种或多种重组纤维素酶，并且其中在与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触前对该生物质进行预处理，其中该预处理包括选自以下的一种或更多种处理：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶，其中该生物质包括植物材料。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶，其中该生物质包括选自以下的植物材料：芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephantgrass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybeanstover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（DistillersDried Grains with Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）和能源甘蔗。
在另一实施例中，本发明提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或更多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或更多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述一种或多种官能团选自：阿拉伯糖、葡糖醛酸基、乙酰基。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或更多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述处理在40至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或更多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述处理在60至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述一种或多种官能团选自：阿拉伯糖、葡糖醛酸基、乙酰基。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解半纤维素，其中所述处理在40至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述处理在60至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括选自核苷酸序列SEQID NOs:4,8,14,20,28,34和38的两种或更多种重组核酸，其中该两种或更多种重组核酸中的至少一种选自核苷酸序列SEQ ID NOs:8,14,20,28和34。在另一实施例中，该宿主细胞包括选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38的三种重组核酸，其中该三种重组核酸的至少两种选自核苷酸序列SEQ ID NOs:8,14,20,28和34。在另一实施例中，该宿主细胞包括选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38的四种重组核酸，其中该四种重组核酸的至少三种选自核苷酸序列SEQ ID NOs:8,14,20,28和34。在另一实施例中，该宿主细胞包括选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38的五种重组核酸，其中该五种重组核酸中的至少四种选自核苷酸序列SEQ ID NOs:8,14,20,28和34。在另一实施例中，该宿主细胞包括选自核苷酸序列SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38的六种重组核酸，其中该六种重组核酸的至少五种选自核苷酸序列SEQ ID NOs:8,14,20,28和34。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptorbesciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ IDNO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。其中该两种或更多种重组核酸中的至少一种选自：编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸和编码多肽SEQ IDNO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptorbesciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ IDNO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。其中该两种或更多种重组核酸中的至少一种选自：编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸和编码多肽SEQ IDNO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸，并且其中所述宿主细胞进一步包括编码一种或更多种纤维素酶的一种或更多种重组核酸。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptorbescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptorbesciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ IDNO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。其中该两种或更多种重组核酸中的至少一种选自：编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸和编码多肽SEQ IDNO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸，并且其中所述宿主细胞选自埃希氏菌属（Escherichia spp.）,假单胞菌属（Pseudomonas spp.）,变形杆菌属（Proteus spp.）,罗尔斯通菌属（Ralstonia spp.）,链霉菌属（Streptomyces spp.）,葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）,乳球菌属（Lactococcus spp.）,杆菌属（Bacillusspp.）,酿酒酵母属（Saccharomyces cerevisiae）,粟酒裂殖酵母菌属（Schizosaccharomyces pombe）,解脂耶氏酵母属（Yarrowia lipolytica）,汉逊酵母属（Hansenula polymorpha）,乳酸克鲁维酵母属（Kluyveromyces lactis）,巴斯德毕赤酵母属（Pichia pastoris）,曲霉属（Aspergillus spp.）,Chrysosporium lucknowense,或里氏木霉属（Trichoderma reesei）。
在另一实施例中，本发明提供一种用于生产至少两种酶的方法，该酶选自：内切木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡萄糖醛酸酶、β-木糖苷酶、和乙酰木聚糖酯酶，该方法包括：在培养基中培养包括两种或更多种的重组核酸的宿主细胞，以在合适的条件下生产内切木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡萄糖醛酸酶、β-木糖苷酶、和乙酰木聚糖酯酶，该两种或更多的重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptorbesciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptorbescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ ID NO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。其中该两种或更多种重组核酸中的至少一种选自：编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸和编码多肽SEQ ID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸。
在另一实施例中，本发明提供一种宿主细胞和培养基，该宿主细胞包括两种或更多种重组核酸，该两种或更多种重组核酸选自：a）编码多肽SEQ ID NO:3[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸；b）编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸；c)编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸；d）编码多肽SEQ IDNO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸；e）编码多肽SEQID NO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸；f）编码多肽SEQID NO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸；g）编码多肽SEQ ID NO:37[缺失信号肽的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb193)]的核酸。其中该两种或更多种重组核酸中的至少一种选自：编码多肽SEQ ID NO:7[Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶(Cb195)]的核酸、编码多肽SEQ ID NO:13[Caldicellulosiruptor besciiα-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:19[Caldicellulosiruptor besciiα-葡萄糖醛酸酶(Cb909)]的核酸、编码多肽SEQ IDNO:27[Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶(Cb2487)]的核酸和编码多肽SEQ IDNO:33[Caldicellulosiruptor bescii乙酰木聚糖酯酶(Cb162)]的核酸。
在另一实施例中，本发明提供包括两种或更多种重组蛋白质的组合物，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33。
在另一实施例中，本发明提供包括六种重组蛋白质的组合物，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该六种重组蛋白质中的五种选自多肽序列7,13,19,27和33。
在另一实施例中，本发明提供包括两种或更多种重组蛋白质的组合物，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物进一步包括一种或多种重组纤维素酶。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化为发酵产物的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养该糖溶液。
在另一实施例中，本发明通过一种将生物质转化成发酵产物的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物进一步包括一种或多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养糖溶液，并且其中，在与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触前对该生物质进行预处理，其中该预处理包括一种或更多种处理，该处理选自：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成发酵产物的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养糖溶液，其中该生物质包括植物材料。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成发酵产物的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生发酵产物的条件下用发酵微生物培养糖溶液，其中该生物质包括选自以下的植物材料：芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cordgrass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canolastraw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybean stover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（Distillers Dried Grainswith Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）和能源甘蔗。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的情况下用发酵微生物培养该糖溶液。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且该组合物可以进一步包括一种或多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的条件下用发酵微生物培养该糖溶液，并且其中在与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触前对该生物质进行预处理，其中该预处理包括一种或更多种处理，该处理选自：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的条件下用发酵微生物培养该糖溶液，其中该生物质包括植物材料。
在另一实施例中，本发明提供一种将生物质转化成燃料的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶；以及在足以产生燃料的条件下用发酵微生物培养糖溶液，其中该生物质包括选自以下的植物材料：芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(OatStraw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybean stover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（Distillers Dried Grains with Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）和能源甘蔗。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使该生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且该组合物可以进一步包括一种或多种重组纤维素酶，并且其中在与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触前对该生物质进行预处理，其中该预处理包括选自以下的一种或更多种处理：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶，其中该生物质包括植物材料。
在另一实施例中，本发明提供一种降解生物质的方法，该方法包括使生物质与包括两种或更多种重组蛋白质的组合物接触，以产生糖溶液，该重组蛋白质选自多肽序列SEQID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中该组合物可以进一步包括一种或更多种重组纤维素酶，其中该生物质包括选自以下的植物材料：芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybeanstover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（DistillersDried Grains with Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）和能源甘蔗。
在另一实施例中，本发明提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种重组酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述一种或多种官能团选自：阿拉伯糖、葡糖醛酸基、乙酰基。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该两种或更多种重组蛋白质中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解半纤维素，其中所述处理在40至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用两种或更多种酶处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述处理在60至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，并且其中该两种或更多种酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述一种或多种官能团选自：阿拉伯糖、葡糖醛酸基、乙酰基。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，并且其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述处理在40至80℃之间的温度进行。
在另一实施例中，本公布提供一种降解半纤维素的方法，所述方法包括步骤：a）提供含有半纤维素的植物材料，其中所述半纤维素包括含有β-1,4键的木糖骨架和一个或多个官能团；以及b）用分泌两种或更多种酶的转基因宿主细胞处理该半纤维素，该酶选自多肽SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33和37，其中该两种或更多种酶中的至少一种选自多肽序列7,13,19,27和33，其中所述处理使所述一个或多个官能团从所述木糖骨架裂解以形成裂解的半纤维素，其中所述处理在60至80℃之间的温度进行。
在一方面，在此提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种重组核酸，其中该重组核酸编码一种、两种、三种、四种、五种，或六种多肽，该多肽选自：Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽。
在另一方面，在此提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种重组核酸，其中该重组核酸编码一种、两种、三种、四种、五种，或六种多肽，该多肽选自：Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽，并且其中Cb1952多肽具有选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46的序列，其中Cb1953多肽具有选自SEQ IDNOs:60,61和111的序列，其中Cb1954多肽具有选自74,121和76的序列；其中Cb1946多肽具有选自SEQ ID NOs:86,87和113的序列；其中Cb629多肽具有选自SEQ ID NOs:98,119和100的序列；其中Cb486多肽具有SEQ ID NO:106序列。
在此也提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种重组核酸，其中该重组核酸编码一种、两种、三种、四种、五种，或六种多肽，该多肽选自具有SEQ ID NO:46,111,76,113,100和106序列的多肽。
在此提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种重组核酸，其中该重组核酸编码一种、两种、三种、四种、五种，或六种多肽，该多肽选自：Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽，并且其中编码Cb1952多肽的重组核酸具有选自45,115,125,127,129和47的序列；其中编码Cb1953多肽的重组核酸具有选自SEQ ID NOs:62,63和110的序列；其中编码Cb1954多肽的重组核酸具有选自SEQ ID NOs:116,75和77的序列；并且其中编码Cb1946多肽的重组核酸具有选自SEQ ID NOs:88,89和112的序列；其中编码Cb629多肽的重组核酸具有选自SEQ ID NOs:99,120和101的序列；以及其中编码Cb486多肽的重组核酸具有SEQ ID NO:107序列。
在此提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种重组核酸，其中该重组核酸编码一种、两种、三种、四种、五种，或六种多肽，该多肽选自：Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽，并且其中该重组核酸具有选自47,110,77,112,101和107的序列。
在此提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有六种重组核酸，其中该核酸具有SEQ IDNOs:47,110,77,112,101和107序列。
在此提供的任何宿主细胞也可以含有编码半纤维素酶的一种或多种重组核酸，其中该半纤维素酶具有选自3,7,13,19,27,33和37的序列。在一些方面，编码半纤维素酶的核酸具有选自SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34和38的序列。在一些方面，在此提供的宿主细胞可以含有具有SEQ ID NOs:8,14,20,28,34和38的序列的重组核酸，或具有SEQ ID NOs:8,14,20,28和38的序列的重组核酸。
进一步在此提供一种组合物，该组合物含有一种，两种，三种，四种，五种，六种或更多种重组多肽，其中，该重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽。
在另一发明，在此提供一种组合物，该组合物含有一种，两种，三种，四种，五种，六种或更多种重组多肽，其中，该重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽。并且其中Cb1952多肽具有选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46的序列，其中Cb1953多肽具有选自SEQ ID NOs:60,61和111的序列，其中Cb1954多肽具有选自74,121和76的序列；其中Cb1946多肽具有选自SEQ ID NOs:86,87和113的序列；其中Cb629多肽具有选自SEQ ID NOs:98,119和100的序列；并且其中Cb486多肽具有SEQ ID NO:106序列。
在此也提供一种组合物，该组合物含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种重组多肽，其中该重组多肽具有选自SEQ ID NO:46,111,76,113,100和106的序列。
在此也提供一种组合物，该组合物含有六种多肽，其中该多肽具有SEQ ID NOs:46,111,76,113,100和106的序列。
在此也提供一种组合物，该组合物含有一种或更多种重组多肽，其中所述一种或更多种重组多肽选自多肽：SEQ ID NOs:46,111,76,113,124,126,128和100的多肽。
在此提供的任何组合物也可以含有一种或多种半纤维素酶多肽，其中该半纤维素酶具有选自3,7,13,19,27,33和37的序列。在一些方面，在此提供的组合物含有具有序列SEQ ID NOs:7,13,19,27,33和37的多肽或具有序列SEQ ID NOs:8,14,20,28和38的多肽。
在另一方面，在此提供一种用于生产一种或更多种纤维素酶的方法，该方法包括：a）在足以支持重组核酸表达的条件下，在培养基中培养在此公开的任何宿主细胞，该宿主细胞含有一种或更多种重组核酸，该重组核酸编码一种或多种Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽，并收集来自所述培养基和/或所述宿主细胞的一种或多种纤维素酶。
在另一方面，在此提供一种降解含有纤维素的材料的方法，该方法包括：a）使该含纤维素的材料与在此公开的任何宿主细胞或组合物接触；以及b）在支持纤维素降解的条件下孵化该宿主细胞或组合物和含纤维素的材料。
在与在此公开的组合物或宿主细胞接触前，预处理含纤维素的材料。预处理步骤可以包括一种或更多种以下的处理：氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆破、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、高压处理、高温处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理。
在此也提供一种降低含纤维素的预处理材料的粘性的方法，该方法包括使含纤维素的预处理材料与在此提供的任何宿主细胞或组合物接触。
在此也提供一种将含纤维素的材料转化成发酵产物的方法，该方法包括：a）使含纤维素的材料与在此提供的任何宿主细胞或组合物接触，以产生糖溶液；以及在足以生产发酵产物的条件下，用发酵微生物培养该糖溶液。
在此也提供一种用于降解含纤维素的材料的方法，该方法包括：a）使含纤维素的材料与选自SEQ ID NOs:46,111,76,113,124,126,128和100的一种或更多种多肽接触；以及b）在支持纤维素降解的条件下，孵化该一种或更多种多肽和含纤维素的材料。
在一些方面，在此提供的含纤维素的材料为植物材料。植物材料可以包括，但不限于，芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheatstraw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybean stover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、黑麦壳（rye hull）、大麦壳（wheat hull）、蔗渣、椰子核粉、椰子球（copra pellet）、棕榈仁粉（palm kernel meal）、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（Distillers Dried Grains withSolubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨木（aspen wood）、杨木（poplar wood）、能源甘蔗、废纸、木屑、林业废料、废纸、和作物残茬。
在一些方面，在此提供的任何方法的至少一部分可以在高于50℃的温度进行。在一些方面，在此提供的任何方法的至少一部分可以在40°和80°、50°和80°、60°和80°、70°和80°、45°和55°、50°和60°、55°和65°、60°和70°、65°和75°、75°和85°或80°和90℃之间进行。
在一些方面，在此公开的含有两种或更多种重组核酸的任何宿主细胞可以在连续的多聚脱氧核糖核苷酸链中存在。
在上述任何组合物或方法中，可以在该组合物或方法中提供Cb1581多肽，以及纤维素酶和/或半纤维素酶。在一些方面，Cb1581多肽为含有SEQ ID NO:146序列的多肽。在此也提供进一步含有编码Cb1581多肽的核酸的上述任何宿主细胞。在一些方面，编码Cb1581多肽的核酸为含有SEQ ID NO:147序列的核酸。
附图说明
图1展示了典型的半纤维素比如木聚糖的模型。
图2，图2A展示了Cb193和Cb195的假定域结构。图2B展示了纯化的Cb193和Cb195的SDS-PAGE；该分子标记在标记为M的道中。通过金属亲和层析，随后进行离子交换层析，进而凝胶过滤纯化蛋白质。预测的Cb193和Cb195分子质量分别为77.7kDa和42.0kDa。图2C展示了用TLC分析的Cb193在天然底物上的酶活性。检验了各种底物：可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、燕麦木聚糖（OSX）、桦木木聚糖（BWX）、羧甲基纤维素（CMC）、地衣多糖、葡甘聚糖、1,4β-甘露聚糖和阿拉伯聚糖。就SWAX、OSX和BWX而言，在存在Cb193(+)的情况下，释放短木糖链。在负(-)道中，没加酶，因此没有水解产物释放。X1(木糖单体)、X2(木糖二聚体或二糖)、X3(三糖)、X4(四糖)和五糖(X5)作为标记载入第一道(M)上。结果显示该酶从复合底物(SWAX、OSX和BWX)中释放更短的链或低聚糖。图2D展示了用TLC分析的Cb195在天然底物上的酶活性。检测了各种底物：SWAX、OSX、BWX、CMC、地衣多糖、葡甘聚糖、1,4β-甘露聚糖和阿拉伯聚糖。就SWAX、OSX和BWX而言，在存在Cb195(+)的情况下，释放短木糖链。在负(-)道中，没有加入酶，因此，没有水解产物释放。X1(木糖单体)、X2(木糖二聚体或二糖)、X3(三糖)、X4(四糖)和五糖(X5)作为标记载入第一道(M)上。结果显示该酶从复合底物(SWAX、OSX和BWX)中释放更短的链或低聚糖。图2E展示了来自于还原糖试验的Cb193和Cb195在自然底物上的酶活性。在该实验中，用不同的还原糖试验确定从底物释放的产物。在存在对羟基苯甲酸酰肼（para-hydroxy-benzoic acid hydrazide）的情况下基于已知的葡萄糖浓度及其吸光度（显色）(Cann et al.1999.J.Bacterial.181:1643-1651and other referenceabove-Laver,M.1972.)，制备标准样。酶和底物一起孵化引起产物的释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。
图3，图3A展示了Cb193的耐热性，而图3B展示了Cb195的耐热性。在范围为65～90℃的不同温度下，孵化5nM Cb193和Cb195。对于Cb193，该酶在70℃,75℃,80℃,85℃和90℃下孵化；对于Cb195，该酶在65℃,70℃,75℃和80℃下孵化。在所示的一些时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h、16h和24h)取出该孵化的酶，并立即与小麦阿拉伯木聚糖(终浓度1%,w/v)一起孵化以测量酶活性。计算反应初始速率。通过每个样品的活性除以在零时刻的初始活性计算残余活性。柱状图展示了三个独立实验的标准误差。
图4展示了Cb193水解小麦阿拉伯木聚糖，燕麦木聚糖，和桦木木聚糖的动力学数据。也指出了Km，kcat和kcat/Km。在图4A中，该实验在75℃，50mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行。在图4B中，该实验在85℃，50mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行。木聚糖底物（终浓度2.5-50mg/mL）与Cb193（小麦阿拉伯木聚糖终浓度为5nM，并且燕麦木聚糖和桦木木聚糖终浓度为50nM）。计算反应初始速率。该初始速率与木聚糖底物浓度一起绘制。用Graphpad软件通过非线性拟合计算Km和kcat。柱状图展示了三个独立实验的标准误差。
图5展示了Cb195水解小麦阿拉伯木聚糖，燕麦木聚糖，和桦木木聚糖的动力学数据。也指出了Km，kcat和kcat/Km。在图5A中，该实验在75℃，50mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行。在图4B中，该实验在75℃，50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中进行。木聚糖底物（终浓度2.5-50mg/mL）与Cb195（小麦阿拉伯木聚糖终浓度为5nM，并且燕麦木聚糖和桦木木聚糖终浓度为50nM）。计算反应初始速率。该初始速率与木聚糖底物浓度一起绘制。用Graphpad软件通过非线性拟合计算Km和kcat。柱状图展示了三个独立实验的标准误差。
图6，图6A展示了纯化的Cb1172的SDS-PAGE；图6B展示了来自于还原糖试验的纯化的Cb1172在天然底物上的活性。检验了五种半纤维素底物：阿拉伯聚糖（糖用甜菜）、SWAX、黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、OSX和脱支阿拉伯聚糖（debranched arabinan）。酶和底物一起孵化引起产物的释放，该产物以阿拉伯聚糖当量的浓度量化。阿拉伯聚糖的水解程度比其它天然底物的水解程度更高。图6C展示了用HPLC分析的Cb1172在天然底物上的酶活性。检验了五种半纤维素底物：阿拉伯聚糖（糖用甜菜）、SWAX、黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、OSX和脱支阿拉伯聚糖。对于各种实例而言，在存在Cb1172的情况下，释放阿拉伯糖。在缺乏Cb1172的情况下，对于脱支阿拉伯聚糖，只发现少量的阿拉伯糖；其它天然多糖没有释放水解产物。结果显示该酶从复合底物(阿拉伯聚糖、SWAX、RAX、OSX和脱支阿拉伯聚糖)中释放阿拉伯糖。图6D展示了Cb1172蛋白质的域结构；Cb1172蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族51催化域。图6E展示了Cb1172的耐热性。在70℃、75℃、80℃和85℃分别孵化24小时后，Cb1172具有57%、45%、35%和22%活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃、85℃和90℃）保持50nM Cb1172。在以下时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h、16h和24h)取出样品，并且立即实施酶活性测量。
图7展示了Cb1172水解pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷的动力学数据。也指出了Km，kcat和kcat/Km。在图7A中，该实验在90℃进行。在图7B中，该实验在75℃进行。100μl不同浓度的pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷底物在85℃保持3分钟以进行平衡。加入25μl蛋白质样品（50nM）至底物中并上下颠倒试管若干次，进行混合。通过Cary300紫外可见分光光度计记录400nm的光密度2.5分钟。计算第一分钟中的反应初始速率。该初始速率与pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷浓度一起绘制。用Graphpad软件通过非线性拟合计算Km和kcat。
图8，图8A展示了Cb909的假定域结构。图8B展示了纯化的Cb909的SDS-PAGE。图8C展示了Cb909的活性。该底物是醛糖二糖酸，是用MeGlcA修饰的低聚木糖混合物。与Cb909在75℃孵化了60分钟后，MeGlcA基团被Cb909从醛糖二糖酸裂解从而释放未修饰的木糖，木二糖，木三糖和木四糖作为产物。反应的条件如下：6nM Cb909，50mM磷酸缓冲液pH6.0，150mMNaCl,1mg/ml醛糖二糖酸。图8D展示了PH优化试验结果。在PH5.5检测到最大的活性。该试验如下进行：1mg/ml醛糖二糖酸溶液与6nM Cb909在75℃在每个PH孵化10分钟。从PH5至PH6的范围使用含有150mMNaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液。从PH6至PH7的范围使用含有150mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液。反应后，该温度快速增加至100℃以终止该反应。通过HPLC检测产物量。图8E展示了优化温度试验的结果。在75℃检测到Cb909的最大活性（木二糖和木三糖）。在70℃生产木糖最有效，但在70℃和75℃时产生的木糖量几乎是相同的。该试验如下进行：1mg/ml醛糖二糖酸溶液与6nM Cb909在含有150mM NaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液PH5.5中孵化10分钟。反应后，该温度快速升至100℃以终止该反应。通过HPLC检测产物量。
图9，图9A展示了Cb2487的假定域结构。通过NCBI Conserved Domains Database搜索工具分析Cb2487的假定保守域结构。图9B展示了纯化的Cb2487的SDS-PAGE。图9C展示了确定Cb2487的最优PH的生化试验。对于PH最优试验，对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（para-nitrophenyl-beta-D-xylopyranoside，pNP-X，0.8mM）与Cb2487（浓度10nM）在以下不同的缓冲液中，75℃下孵化：pH4.0-6.0(柠檬酸缓冲液,50mM,150mM NaCl),pH6.0-8.0(磷酸缓冲液,50mM,150mM NaCl),pH8.5-9.0(Tris-HCl,50mM,150mM NaCl)。图9D展示了确定Cb2487的最优温度的生化试验。对于温度最优试验，pNP-X(0.8mM)与Cb2487（10nM）在柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中，在不同温度(40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100℃)下孵化。图9E展示了以pNP-β-D-吡喃木糖苷作为底物的Cb2487的动力学参数。对于图9EA，动力学参数在90℃,pH6.0确定。对于图9EB，动力学参数在75℃，pH6.0确定。对于这些试验，不同浓度的pNP-X(0.08-24mM)与Cb2487(10nM)在柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)，75和90℃中孵化。图9F展示了Cb2487在低聚木糖上的水解活性。Cb2487(0.5μM)与不同的低聚木糖(X2-6)在75℃孵化15hr，然后通过TLC分离产物。图9G展示了Cb2487的耐热性。Cb2487在柠檬酸盐缓冲液，不同的温度（70、75、80、85、90、95℃）下，在不增加底物的情况下，孵化Cb2487，在不同的时刻(0、10min、30min、1h、3h、4,8h、12h、24h)取出该蛋白质，并且以pNP-X作为底物检验残余活性。图9H展示了β-木糖苷酶(Cb2487)和α-葡萄糖醛酸酶(Cb909)的协同作用。醛糖二糖酸与Cb2487(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），75℃中过夜培养，然后用HPLC检验。在醛糖二糖酸中加入切掉了甲基葡糖醛酸修饰物的Cb909以释放木糖和低聚木糖。加入的Cb2487裂解存在的β-1,4-木糖苷键（β-1,4-xylosidic linkage），以释放更多木糖。两种酶的混合导致从Cb909释放低聚木糖转化为Cb2487释放木糖。
图10，图10A展示了Cb162的域结构；该蛋白质具有乙酰木聚糖酯酶的单域。图10B展示了纯化的Cb162的SDS-PAGE。图10C展示了用对硝基苯酚加成酯(pNP-醋酸酯)作为底物的Cb162在pNP-醋酸酯上的pH图谱。用Synergy2微孔板检测仪（Synergy2Microplatereader，BioTek）持续地监测释放的pNP在400nm的吸光度。采用水解初始速率作为酶活性。在50℃，存在50mM柠檬酸盐-NaOH(pH4.0至6.0)或50mM Na2HPO4-HCl(pH6.0至8.0)，以及150mM NaCl的情况下，检测在Cb162上的PH效果。该试验使用了0.1μM纯化的Cb162和2mMpNP-醋酸酯。图10D展示了Cb162在pNP-醋酸酯上的温度图谱。在50mM Na2HPO4-HCl，pH7.0和150mM NaCl，40℃和75℃之间的温度以5℃间隔绘制该温度图谱。该试验使用了0.04μM纯化的Cb162和2mM pNP-醋酸酯。图10E展示了Cb162在pNP--醋酸酯上的耐热性图谱；纯化的0.02μM Cb162在50mM Na2HPO4-HCl,pH7.0和150mM NaCl中，在60℃和80℃之间的温度以5℃间隔孵化0至24小时，并且测量残余活性。图10F展示了Cb162的动力学研究。纯化的0.04μMCb162在50mM Na2HPO4-HCl，pH6.0和150mM NaCl中与各种浓度的pNP--醋酸酯孵化，并且水解的初始速率绘制在图上。利用Graph Pad Prism v5.01(GraphPad软件)通过Michaelis-Menton方程式确定动力学参数。
图11展示了C.bescii半纤维素酶水解可溶性小麦阿拉伯木聚糖(SWAX)的协同作用。SWAX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mMNaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖[图11A]和HPLC[图11B]分析。使用的半纤维素酶包括Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图12展示了C.bescii半纤维素酶水解燕麦木聚糖(OSX)的协同作用。OSX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖[图12A]和HPLC[图12B]分析。使用的半纤维素酶包括Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图13，图13A展示了在不同的温度，用半纤维素酶合剂水解可溶性小麦阿拉伯木聚糖。SWAX(8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)，在65℃、70℃、75℃、80℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖试验。图13B展示了在不同的温度用半纤维素酶合剂水解桦木木聚糖。BWX(8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)，在65℃、70℃、75℃、80℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖试验。图13C展示了在不同的温度用半纤维素酶合剂水解燕麦木聚糖。OSX(8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)，在65℃、70℃、75℃、80℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖试验。
图14，图14A展示了通过在半纤维素酶混合物中添加两种木聚糖酶（Cb195和Cb193）提高SWAX的水解。SWAX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。在水解中使用不同的半纤维素酶混合物：混合物I)Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物II)Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；或混合物III)Cb195(0.25μM)、Cb193(0.25μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。图14B展示了通过在半纤维素酶混合物中添加两种木聚糖酶（Cb195和Cb193）提高BWX的水解。BWX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖分析。在水解中使用不同的半纤维素酶混合物：混合物I)Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物II)Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；或混合物III)Cb195(0.25μM)、Cb193(0.25μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。图14C展示了通过在半纤维素酶混合物中增加两种木聚糖酶（Cb195和Cb193）提高OSX的水解。OSX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖分析。在水解中使用不同的半纤维素酶混合物：混合物I)Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物II)Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；或混合物III)Cb195(0.25μM)、Cb193(0.25μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图15展示了用Caldicellulosiruptor bescii的半纤维素酶合剂水解可溶性小麦阿拉伯木聚糖。不同浓度的SWAX(1.0,2.0,4.0,6.0,8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。图15A展示了对照和水解混合物中的还原糖，而图15B展示了不同底物浓度下，水解混合物中计算出的还原糖与实际的平均还原糖的比较。
图16展示了用Caldicellulosiruptor bescii的半纤维素酶合剂水解桦木木聚糖。不同浓度的BWX(1.0,2.0,4.0,6.0,8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。图16A展示了对照和水解混合物中的还原糖，而图16B展示了不同底物浓度下，水解混合物中计算出的还原糖与实际的平均还原糖的比较。
图17展示了用Caldicellulosiruptor bescii的半纤维素酶合剂水解燕麦木聚糖。不同浓度的OSX(1.0,2.0,4.0,6.0,8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。图17A展示了对照和水解混合物中的还原糖，而图17B展示了不同底物浓度下，水解混合物中计算出的还原糖与实际的平均还原糖的比较。
图18：野生型Cb1952及其去尾突变体的示意结构。填涂矩形中展示了信号肽。GH9:家族9糖苷水解酶结构域；GH5：家族5糖苷水解酶结构域；CBM3c：家族3类型C碳水化合物结合模块；CBM3b：家族3类型B碳水化合物结合模块。
图19：Cb1952及其去尾突变体的SDS-PAGE。道1：蛋白质分子量标记；道2：野生型Cb1952；道3：Cb1952TM1；道4：Cb1952TM2；道5：Cb1952TM3；道6：Cb1952TM4；道7：Cb1952TM5；道8：Cb1952TM6；道9：Cb1952TM7。将2μg每种酶溶解在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上。
图20：来自还原糖试验的Cb1952WT在天然底物上的酶活性。检验了20种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、地衣多糖、甘露聚糖、刺槐豆胶（LBG）、瓜尔豆胶、魔芋葡甘聚糖（KGM）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、桦木木聚糖（BWX）、燕麦木聚糖(OSX)和木葡聚糖。该酶与微晶纤维素、PASC、CMC-Na、地衣多糖、甘露聚糖、LBG、瓜尔豆胶、KGM、WAX和OSX底物一起孵化使产物释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。Cb1952WT主要水解葡萄糖和甘露糖构成的底物，但不水解木糖构成的底物。
图21：来自还原糖试验的Cb1952TM1在天然底物上的酶活性。检验了20种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、地衣多糖、甘露聚糖、刺槐豆胶（LBG）、瓜尔豆胶、魔芋葡甘聚糖（KGM）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、桦木木聚糖（BWX）、燕麦木聚糖(OSX)和木葡聚糖。该酶与微晶纤维素、PASC、CMC-Na、地衣多糖、甘露聚糖、LBG、瓜尔豆胶、KGM、WAX、BWX、OSX和木葡聚糖底物孵化导致产物释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。结果显示Cb1952TM1主要水解葡萄糖构成的底物。Cb1952TM1在甘露糖构成的底物上也有一些活性。Cb1952TM1在木糖构成的底物上具有低活性。
图22：来自还原糖试验的Cb1952TM5在天然底物上的酶活性。检验了20种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、地衣多糖、甘露聚糖、刺槐豆胶（LBG）、瓜尔豆胶、魔芋葡甘聚糖（KGM）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、桦木木聚糖（BWX）、燕麦木聚糖(OSX)和木葡聚糖。该酶与CMC-Na、地衣多糖、甘露聚糖、LBG、瓜尔豆胶和KGM底物一起孵化使产物释放，该产物以甘露糖当量的浓度量化。结果显示Cb1952TM5主要水解甘露糖构成的底物，但在葡萄糖或木糖构成的底物上不具有明显的活性。
图23：Cb1952WT、Cb1952TM1和Cb1952TM5在葡萄糖和纤维低聚糖上的酶活性的薄层层析(TLC)分析。G1、G2、G3、G4、G5和G6分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、和纤维六糖。Cb1952WT和Cb1952TM1将纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、和纤维六糖水解为葡萄糖和纤维二糖，但在纤维二糖上不具有活性。Cb1952TM5在葡萄糖和检验的任何纤维低聚糖不具有活性。没有酶在葡萄糖和纤维低聚糖上具有转糖苷活性。
图24：Cb1952WT、Cb1952TM1和Cb1952TM5在甘露糖和甘露低聚糖上的酶活性的薄层层析(TLC)分析。M1、M2、M3、M4、M5和M6分别指的是甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、和甘露六糖。Cb1952WT和Cb1952TM5将甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、和甘露六糖水解为甘露糖和更小的甘露低聚糖，但对甘露二糖不具有水解活性。Cb1952TM1将甘露五糖和甘露六糖水解为更小的低聚糖，但在甘露二糖、甘露三糖、甘露三糖和甘露四糖上没有水解活性。没有酶在甘露糖和甘露低聚糖上具有转糖苷活性。
图25：Cb1952TM1在纤维素底物上的酶活性的HPLC分析。检验了三种不同的纤维素底物：微晶纤维素、CMC-Na和PASC。对每种实例而言，在存在Cb1952TM1的情况下，释放葡萄糖和纤维二糖。在缺乏Cb1952TM1的情况下，所有的底物既观察不到葡萄糖也观察不到纤维二糖。结果显示，这一部分的酶或多肽（Cb1952）从纤维素底物（微晶纤维素，CMC-Na和PASC）裂解葡萄糖和纤维二糖作为最终产物。
图26：Cb1952TM1水解PASC的时间进程的HPLC分析。100nmole Cb1952TM1与2.5mg/ml PASC在75℃孵化。在不同的时间间隔(0、0.5min、2min、10min、1h、4h和24h)，取出样品并立即煮10分钟以使该酶灭活。离心后，样品上清液适当地用水稀释，并用于HPLC分析。结果显示，Cb1952TM1起初释放葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖和纤维四糖。随着时间增加，反应混合物中仅剩下葡萄糖和纤维二糖。
图27：用PASC作为用于活性测量的底物，测量Cb1952WT的耐热性。分别在70℃、75℃、80℃和85℃孵化24小时后，Cb1952WT具有75%、43%、17%和12%的活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持500nM Cb1952WT。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在PH5.5，85℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且加入8.31μl蛋白质样品至底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.(A new reaction for colorimetricdetermination carbohydrates.Anal.Biochem.1972:47;273-279)方法测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
图28：用PASC作为底物进行活性测量的Cb1952TM1耐热性。分别在70℃、75℃、80℃和85℃孵化24小时后，Cb1952TM1具有94%、76%、18%和13%的活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持500nM Cb1952TM1。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在PH5.5，85℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且加入8.31μl蛋白质样品至底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.(同上)方法测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
图29：野生型(WT)Cb1953、Cb1953TM1和Cb1953TM2的域结构。
图30：纯化的野生型Cb1953、Cb1953TM1和Cb1953TM2蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶。
图31：Cb1953WT、Cb1953TM1、Cb1953TM2在羧甲基纤维素(CMC)上的酶谱。如同标准的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），制备具有CMC底物（终浓度0.1%，w/v）的凝胶。蛋白质电泳分离后，凝胶用蒸馏水洗涤两次，并在25℃，30mL复性缓冲液(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH6.0，2.5%Triton X-100，2mM二硫苏糖醇，2.5mM CaCl2)中孵化1小时，然后在37℃，新鲜的缓冲液中过夜。凝胶用50mM柠檬酸盐缓冲液（pH6）洗涤两次，用0.1%刚果红(Congo red)染色，并且用1M NaCl脱色，可以看到结果。如图31所示，Cb1953WT和Cb1953TM2在其预期大小的位置展示了明显的白色条带，表明纤维素酶活性，但Cb1953TM1蛋白质没有。
图32和33：来自还原糖试验的Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM2在天然底物上的酶活性。检测了七种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素（CMC）、小麦阿拉伯木聚糖、地衣多糖、魔芋葡甘聚糖和甘露聚糖。该酶与底物孵化导致产物的释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。试管在Thermomixer R(Eppendorf)中，75℃，恒速混合，孵化16小时。试管在4℃以10,000rpm离心5分钟。50μL样品上清液转移至干净的1.5mL离心管中用于pHBAH试验。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度并用线性回归使数据拟合成直线。该反应通过薄层层析(TLC)解决，使用由10:5:1(vol/vol/vol)正丁醇：乙酸：水组成移动相和10cmx20cm平板。还原糖试验（图32）和TLC（图33）结果展示了Cb1953WT和Cb1953TM2具有纤维素酶活性，而Cb1953TM1具有甘露聚糖酶活性。
图34：Cb1953TM2在PASC上的酶活性的时间进程的HPLC分析。在水解产物分析中，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析样品。在HPAEC分析中，将每100μL稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTMPA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。在该分析中，葡萄糖和五种不同的纤维低聚糖（纤维二糖、纤维三糖、纤维五糖和纤维六糖）作为标准样使用。在反应中，Cb1953TM2开始释放纤维低聚糖（C2-C4），后来释放葡萄糖。结果显示该酶从PASC主要释放纤维二糖。
图35和36：Cb1953WT(图35)和Cb1953TM2(图36)在PASC上的耐热性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持50nM Cb1953WT和Cb1953TM2。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在85℃，用Cary300UV-Vis分光光度计（Varian）测量酶活性。计算第一分钟的反应初始速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。从结果可知，Cb1953WT(图35)和Cb1953TM2(图36)在70℃和75℃相当稳定，维持热非处理蛋白质（heat non-treatedproteins）75～90%的活性。
图37：Cb1953WT(图37A)和Cb1953TM2(图37B)在PASC上的动力学研究。0.05μM纯化的Cb1953WT或Cb1953TM2在50mM Na2HPO4-HCl,pH6.0和150mM NaCl中与各种浓度的磷酸膨胀纤维素（PASC）孵化，并且绘制水解初始速率和底物浓度的关系。通过将数据拟合至Michaelis-Menten方程(Graph Pad Prism v5.01)确定动力学参数(对于Cb1953WT，Km:7.603mg/mL,kcat:7.513s-1和kcat/Km:0.988s-1mL/mg，而对于Cb1953TM2，Km:3.032mg/mL,kcat:5.411s-1和kcat/Km:1.785s-1mL/mg)。
图38：野生型(WT)Cb1954、Cb1954TM3和Cb1954TM5的域结构。
图39：图39A：纯化的Cb1954TM3蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。图39B：来自还原糖试验的Cb1954TM3在天然底物上的酶活性。检验了三种不同的纤维素：微晶纤维素、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和磷酸膨胀纤维素（PASC）。酶与该底物孵化导致产物释放，该产物以甘露糖当量的浓度量化。PASC的水解程度比其它底物的水解程度高。
图40：Cb1954TM3在纤维素底物上的酶活性的HPLC分析。检验了三种不同的纤维素底物：微晶纤维素、CMC-Na和PASC。对每种实例而言，在存在Cb1954TM3的情况下，释放葡萄糖和纤维二糖。在缺乏Cb1954TM3的情况下，所有的底物既观察不到葡萄糖也观察不到纤维二糖。结果显示，该酶从纤维素底物（CMC-Na和PASC）中释放葡萄糖和纤维二糖以及更长链的低聚糖作为最终产物。
图41：Cb1954TM3的耐热性。分别在70℃、75℃、80℃和85℃孵化24小时后，Cb1954TM3具有75%、87%、64%和7%的活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持500nMCb1954TM3。在PH5.5，95℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且将10μl蛋白质样品加入底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.(同上)方法测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
图42：野生型(WT)Cb1946、Cb1946TM1和Cb1946TM2多肽的域结构。
图43：纯化的野生型Cb1946、Cb1946TM1和Cb1946TM2蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶。
图44：Cb1946WT、Cb1946TM1、Cb1946TM2在羧甲基纤维素(CMC)琼指平板上的酶谱。该琼指平板用CMC底物（终浓度0.25%，w/v）制备。将1μg每种蛋白质在琼指-CMC平板上点样，37℃过夜孵化该平板，然后，用0.1%刚果红染色，并且用1M NaCl脱色，可以看到该凝胶。如图44所示，Cb1946WT和Cb1946TM2在琼脂平板展示了明显的晕轮，表明纤维素酶活性，但Cb1953TM1蛋白质没有。
图45和46：Cb1946WT、Cb1946TM1和Cb1946TM2在磷酸膨胀纤维素（PASC）上的酶活性的薄层层析(TLC)(图45)和高效液相层析（HPLC）（图46）。每种酶（终浓度0.5μM）与终浓度为1%的磷酸膨胀纤维素（PASC）在50mM柠檬酸盐-150mM NaCl，pH6.0，75℃中反应16小时。该反应通过薄层层析（TLC）（图45）解决。使用由10:5:1(vol/vol/vol)正丁醇：乙酸：水组成的移动相和10cmx20cm的平板。在图45中，G1、G2、G3、G4和G5分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。对于水解产物的更多定量分析，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析样品（图46）。对于HPAEC分析，100μL每种稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。对于TLC和HPLC分析，使用葡萄糖和五种不同的纤维低聚糖：纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖作为标准样。基于TLC和HPLC的结果，Cb1953WT和Cb1953TM2显示明显从PASC底物释放产物比如葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，表明Cb1946WT和Cb1953TM2具有纤维素酶活性，但Cb1953TM1没有。
图47：野生型Cb629和Cb629TM1多肽的域结构。
图48：纯化的Cb629TM1蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶。
图49：Cb629TM1在底物上的酶活性，产物通过还原糖试验确定。检验了三种不同的纤维素：微晶纤维素、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和磷酸膨胀纤维素（PASC）。酶与该底物孵化导致产物释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。PASC的水解程度比其它底物的水解程度高。
图50：Cb629TM1在底物上的酶活性的HPLC分析。检验了三种不同的纤维素底物：微晶纤维素、CMC-Na和PASC。对每种实例而言，在存在Cb629TM1的情况下，释放葡萄糖和纤维二糖。在缺乏Cb629TM1的情况下，所有的底物既观察不到葡萄糖也观察不到纤维二糖。结果显示，该酶从纤维素底物（微晶纤维素、CMC-Na和PASC）中释放葡萄糖和纤维二糖作为最终产物。
图51：Cb629TM1在纤维低聚糖上的酶活性的TLC分析。G1、G2、G3、G4、G5和G6分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三塘、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖。
图52：Cb629TM1的耐热性。在60℃、65℃、70℃、75℃和80℃分别孵化24小时后，Cb629TM1具有109%、99%、96%、83%和34%活性。在不同的温度（60℃、65℃、70℃、75℃和80℃）中保持500nM Cb629TM1。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在PH5.5，70℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且加入8.31μl蛋白质样品至底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.方法(同上)测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
图53：图53A：野生型Cb486的域结构。图53B：纯化的野生型Cb486蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶。
图54：Cb486在低聚木糖(X2-X6)上的酶活性的TLC分析。检测了下面的低聚木糖(X2-X6)：木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖。该实验通过低聚木糖过夜水解，接着用TLC溶解产物来完成。对每种实例而言，在存在Cb486的情况下，释放木糖和木二糖。在缺乏Cb486的情况下，对于木二糖，仅观察到少量的木糖；对于其它低聚木糖，没有观察到水解产物。结果显示，该酶从低聚木糖（木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖）中释放木糖和木二糖。X1、X2、X3、X4、X5和X6分别指的是木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖。
图55：Cb486在葡萄糖和纤维低聚糖上的酶活性的TLC分析。该试验使用了葡萄糖和五种不同的纤维低聚糖：C2、C3、C4和C5分别指的是纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。
图56，图56A和56B分别展示了Cb486的活性的PH和温度图谱。对于这些试验，Cb486的酶浓度为10nM。对于PH图谱，反应在两种缓冲液中进行：50mM柠檬酸钠,150mM NaCl(pH4.0-pH6.0)和50mM Na2HPO4-NaH2PO4，150mM NaCl(pH6.5-pH8.0)。该酶与1mM pNP-β-D-吡喃半乳糖苷在每种缓冲液，给定PH，75℃中孵化，并且在30分钟试验中确定活性。为了确定最优温度，10nM Cb486与1mM pNP-β-D-吡喃半乳糖苷在pH5.5，从40℃至95℃以5℃为间隔的不同温度中孵化。通过用Cary300紫外可视分光光度计(Agilent,Santa Clara CA)监测410nM的光密度的增加记录pNP的释放量。
图57：含有由Cb629TM1、Cb486、Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2和Cb1954TM3纤维素酶组成的纤维素酶混合物的纯化蛋白质的域结构和SDS聚丙烯酰胺凝胶（下）。
图58：含有Cb193、Cb195、Cb1172、Cb909、Cb2487和Cb162半纤维素酶的纯化的蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶。
图59和60：用含有Cb629TM1、Cb486、Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2和Cb1954TM3纤维素酶的纤维素酶混合物和/或含有Cb193、Cb195、Cb1172、Cb909和Cb2487半纤维素酶的半纤维素酶混合物处理的微波预处理的芒草样品的TLC（图59）和HPLC（图60）分析。图59展示了用含2%、5%或8%芒草的样品的试验分析，并且图60展示了含有8%芒草的样品的试验分析。在图59中，C1、C2、C3、C4和C5分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。X1、X2、X3、X4和X5分别指的是木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。A1指的是阿拉伯糖。对于图60，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析含8%底物的反应样品。对于HPAEC分析，100μL每种稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System GoldHPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。
图61和62：用含有Cb629TM1、Cb486、Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2和Cb1954TM3纤维素酶的纤维素酶混合物和/或含有Cb193、Cb195、Cb1172、Cb909和Cb2487半纤维素酶的半纤维素酶混合物处理的高压预处理（autoclave-pretreated）芒草样品的TLC（图61）和HPLC（图62）分析。图61展示了含2%、5%或8%芒草的样品的试验分析，而图62展示了含有8%芒草的样品的试验分析。在图61中，C1、C2、C3、C4和C5分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。X1、X2、X3、X4和X5分别指的是木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。对于图62，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析含8%底物的反应样品。对于HPAEC分析，100μL每种稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System GoldHPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。
图63和64：用含有Cb629TM1、Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2和Cb1954TM3纤维素酶的纤维素酶混合物(该混合物缺乏β-葡萄糖苷酶Cb486)和/或含有Cb193、Cb195、Cb1172、Cb909和Cb2487半纤维素酶的半纤维素酶混合物处理的微波预处理的8%芒草样品的TLC（图63）和HPLC（图64）分析。在图63中，C1、C2、C3、C4和C5分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。X1、X2、X3、X4和X5分别指的是木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。对于图64，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析反应样品。对于HPAEC分析，100μL每种稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。
图65和66：用含有Cb629TM1、Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2和Cb1954TM3纤维素酶的纤维素酶混合物(该混合物缺乏β-葡萄糖苷酶Cb486)和/或含有Cb193、Cb195、Cb1172、Cb909和Cb2487半纤维素酶的半纤维素酶混合物处理的高压预处理8%芒草样品的TLC（图65）和HPLC（图66）分析。在图65中，C1、C2、C3、C4和C5分别指的是葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖。X1、X2、X3、X4和X5分别指的是木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。对于图66，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析反应样品。对于HPAEC分析，100μL每种稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。
图67：图67A和67B分别展示了Cb1952TM1的活性的PH和温度图谱。对于PH图谱，反应在两种缓冲液中进行：50mM柠檬酸钠,150mM NaCl(pH4.0-pH6.0)和50mM Na2HPO4-NaH2PO4，150mMNaCl(pH6.5-pH8.0)。Cb1952TM1的酶浓度为0.5μM。该酶与2.5mg/ml PASC在每种缓冲液，给定PH，75℃中孵化，并且在10分钟试验中确定活性。用pHBAH试验测量释放的还原糖。为了确定最优温度，0.5μM Cb1952TM1酶与2.5mg/ml PASC在pH5.5，从40℃至95℃以5℃为间隔的不同温度中孵化。
图68：Cb1953TM2与纤维六糖孵化产生的裂解产物。图68A：反应产物的TLC分析；图68B：反应产物的HPLC分析。数据表明Cb1953TM2随机水解纤维六糖。
图69：图69A和69B分别展示了Cb1954TM3的活性的PH和温度图谱。
图70：图69A和69B分别展示了Cb629TM1的活性的PH和温度图谱。
图71：Cb629TM1在PASC上的酶活性的时间进程的HPLC分析。对水解产物的分析，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析样品。对于HPAEC分析，每100μL稀释样品注入BeckmanCoulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESABiosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。对于该分析，使用葡萄糖，纤维二糖和纤维三糖作为标准样。
图72：Cb486底物特异性分析。在75℃，50nM Cb486分别与每1mM pNP-α-L-阿拉伯吡喃糖苷,pNP-β-D-吡喃岩藻糖苷（pNP-β-D-fucopyranoside），pNP-β-D-吡喃半乳糖苷，pNP-β-D-吡喃葡萄糖苷，pNP-β-D-吡喃木糖苷和pNP-β-D-纤维二糖在其最优缓冲液(50mM柠檬酸钠,150mM NaCl,pH5.5)中孵化30分钟。通过用Cary300紫外可视分光光度计(Agilent,Santa Clara CA)监测410nM的光密度的增加记录pNP的释放量。
图73：用纤维素酶和/或半纤维素酶混合物水解处理过的芒草。图73A：0.5μM酶；2%底物；图73B：0.5μM酶；5%底物；图73C：0.5μM酶；8%底物；图73D：1.0μM酶；10%底物。用两种不同方法(高压或微波)预处理的、不同浓度(2%,5%和8%)的芒草与纤维素酶混合物(含有0.5μMCb1946TM2、0.5μM Cb1952TM1、0.5μM Cb1953TM2、0.5μM Cb1954TM3、0.5μM Cb629TM1和0.5μM Cb486)或半纤维素酶混合物（含有0.5μM Cb193、0.5μM Cb195、0.5μM Cb1172、0.5μMCb2487和0.5μM Cb909）或总体积500μl的两种酶混合物在75℃以颠倒摇匀的方式孵化15小时。此外，两种预处理类型的、浓度增加（10%）的预处理芒草与浓度增加至1.0μM的酶在75℃以颠倒摇匀的方式孵化15小时。用pHBAH方法测量还原性末端。
图74：用缺乏Cb486的酶混合物水解处理过的芒草。对于这些试验，使用含有0.5μM酶和8%底物的反应混合物。用两种不同方法(高压或微波)预处理的(8%)芒草与纤维素酶混合物(含有0.5μMCb1946TM2、0.5μM Cb1952TM1、0.5μM Cb1953TM2、0.5μM Cb1954TM3和0.5μM Cb629TM1，但不含Cb486)或半纤维素酶混合物（含有0.5μM Cb193、0.5μM Cb195、0.5μMCb1172、0.5μM Cb2487和0.5μM Cb909）或总体积500μl的两种酶混合物在75℃以颠倒摇匀的方式孵化15小时。用pHBAH方法测量还原性末端。
图75：图75A：Cb1952TM2、Cb1954TM3、Cb629TM1和Cb486多肽的域结构。图75B：用Cb1952TM2、Cb1954TM3、Cb629TM1和Cb486或含有Cb1952TM2、Cb1954TM3、Cb629TM1和Cb486纤维素酶的混合物处理的预处理芒草样品(AC=高压或MW=微波)的分析。用两种不同的方法(高压或微波)预处理的芒草以终浓度2%与单独的纤维素酶（Cb1952TM2、Cb1954TM3、Cb629TM1或Cb486，每种0.5μM）或含有所有四种纤维素酶，总体积500μl的混合物在75℃以颠倒摇匀的方式孵化15小时。用pHBAH方法测量还原性末端。
图76：Cb1946WT，Cb486或含有Cb1946WT和Cb486纤维素酶混合物的还原糖试验。反应如下进行：用0.5μM Cb1946WT，Cb486或两种酶，在磷酸缓冲液(50mM磷酸钠,150mM NaCl,pH6.5)中，总体积500μl，以颠倒摇匀的方式孵化16小时。
图77：用Cb1946WT，Cb486或含有Cb1946WT和Cb486纤维素酶的混合物处理的PASC(图77A)或微晶纤维素(图77B)样品的分析。反应如下进行：用0.5μM Cb1946WT或0.5μMCb486或两种酶，在磷酸缓冲液(50mM磷酸钠,150mM NaCl,pH6.5)，总体积500μl，75℃以颠倒摇匀的方式孵化16小时。将若干μl的水解产物进行TLC分析。
图78：Cb1952WT(图78A)、TM1(图78B)和TM5(图78C)水解PASC的时间进程。2.5mg/ml PASC与0.5μM Cb1952WT、TM1和TM5在75℃孵化。在不同的时间间隔(0min、2min、10min、60min、4h和24h)取出样品并用于HPAEC-PAD分析。
图79：Cb1952的GH9域和CloceCel9G(Clostridium cellulolyticum Cel9G,GenBank accession number:AAA73868)(26)和ThefuCel9A(Thermobifida fusca Cel9A,GenBank accession number:AAB42155)(34)的氨基酸序列比对。CloceCel9G(非进行性)和ThefuCel9A(进行性)代表家族9主题B1内切葡聚糖酶的两种类型，其酶-纤维低聚糖复合结构已被解决。星号表示在三条序列内，氨基酸残基相同或相似。填涂三角形表示非保守残基。特殊氨基酸残基下的数字表示基于CloceCel9G和ThefuCel9A酶底物复合物结构，与该氨基酸残基相互作用的纤维低聚糖的亚位点。
图80：Cb1952野生型及其去尾突变体与微晶纤维素(图80A)和磷酸膨胀纤维素(PASC)(图80B)的定性结合。30mg的每种蛋白质与40mg/ml微晶纤维素或2.5mg/ml PASC在50mM Tris缓冲液，150mMNaCl(pH7.5)中孵化。该混合物在4℃颠倒摇匀1小时。然后将混合物以16,400rpm离心3分钟，分离绑定或未绑定的蛋白质。纤维素颗粒用1ml缓冲液(50mMTris缓冲液，150mM NaCl，pH7.5)洗涤4次。接着该颗粒加入70μl of1×SDS-PAGE负载缓冲液（loading buffer）并煮5分钟。相应于每份的十分之一体积的蛋白质被加到12%SDS-PAGE中。
图81：Cb1952及其具有纤维素酶活性的去尾突变体的耐热性。图81A：Cb1952TM2；图81B：Cb1952TM3；图81C：Cb1952TM4。该酶在Veriti96孔热循环仪上75℃、80℃和85℃(WT、TM1、TM2和TM3)或在45℃、50℃和55℃(TM4)孵化。在不同的时间点，取出样品并用PASC作为底物测量其残余活性。
图82：Cb1952的CBM3c和来自其它家族9糖苷水解酶的CBM3c的氨基酸序列比对。基于Jindou et al.(2006)和Li et al.(2010)的作品，涉及纤维素配体结合的氨基酸残基用填涂三角形表示。用于比对的酶的来源如下：Cb1952：Caldicellulosiruptor bescii的双功能纤维素酶/甘露聚糖酶(本发明);ADQ45731:Caldicellulosiruptor kronotskyensis假定的纤维素酶;ABP66693:Caldicellulosiruptor saccharolyticus假定的纤维素酶;ADL42950:假定的Caldicellulosiruptor obsidiansis纤维素酶/甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶;AAK06394:Caldicellulosiruptor CelE Tok7B.1(11);AAA73868:Cel9G ofClostridium cellulolyticum(26);AAC38572:EngH of Clostridium cellulovorans(38);CAA39010:Cel9Z of Clostridium stercorarium(18);ABX43720:Cel9ofClostridium phytofermentans(39,48);ABN51860:Cel9Iof Clostridium thermocellumDSM1313(50);CAB38941:Cel9B of Paenibacillus barcinonensis(32);BAB33148:CelQof Clostridium thermocellum F1(2);AAA23086:CenB of Cellulomonas fimi(27);AAW62376:CBP105of Cellulomonas flavigena(28);AAB42155:Cel9A of Thermobifidafusca(16,34)。
图83：纯化的Cb1581的SDS-PAGE。
图84：70℃(图84A)或80℃(图84B)，Cb1581在微波预处理芒草上的酶水解的增强效果。在pH6.0，用0.5μM的每种纤维素酶/半纤维素酶的酶混合物，总体积500μl并以10%芒草作为底物对预处理芒草进行酶水解。混合物中的酶包括Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2、Cb1954TM3、Cb629TM1、Cb486、Cb193、Cb195、Cb2487、Cb1172、Cb909和Cb162，及不同量的重组Cb1581，如所示。在对微波预处理的芒草进行酶水解之后，根据Lever,M.方法确定葡萄糖当量的浓度。在70℃和80℃，在反应混合物中增加Cb1581的量能提高糖的释放量。
具体实施方式
本公布涉及耐热纤维素和半纤维素降解酶，并涉及用这些酶降解纤维素、半纤维素以及含纤维素和半纤维素的材料的方法。本公布也涉及编码在此公开的酶的核酸和含有在此公开的各种酶的酶合剂。
在一方面，本发明提供具有纤维素酶活性的酶。在此提供在野生型纤维素酶蛋白质上提高纤维素酶活性的去尾酶。在此也提供具有与野生型纤维素酶蛋白质相似的酶活性的去尾酶。去尾蛋白质可以比野生型蛋白质有优势，例如，由于成分更低或去尾蛋白质更易于生产。
在另一方面，本公布通过具有半纤维素酶活性的酶。本公布的半纤维素降解酶可以单独或结合使用以降解半纤维素，即，通过裂解存在于半纤维素中成分亚单位之间的键（Bond）或键（linkage）使半纤维素转化成其结构成分。键（Bond）或键（linkage）可以包括在木糖亚单位之间的键，或在木糖和官能团之间的键，或在官能团之间的键。
在另一方面，本发明提供这样的酶和/或其混合物：提高具有纤维素酶或半纤维素酶活性的酶的活性。提高纤维素酶和/或半纤维素酶活性的酶可以单独、与纤维素酶、与半纤维素酶，或纤维素酶和半纤维素酶的混合物一起提供。
用本公布的方法处理的纤维素或半纤维素可以降解至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。除了其他官能团和碳氢化合物外，降解产物可以包括葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精、木糖、阿拉伯糖、纤维、葡糖醛酸基，以及乙酰基。降解产物可以用作生物燃料或其它增值化合物。例如，从纤维素或半纤维素释放的糖可发酵生产乙醇。
本公布的纤维素和半纤维素降解酶是耐热的，并且优选地，在高于50℃的温度能使纤维素和/或半纤维素降解为糖，比如葡萄糖、木糖、或阿拉伯糖。此外，当维持在高于50℃的各种温度时，该酶保持基本活性。
在不希望受限于理论的情况下，在此描述的酶合剂的另一重要特征是：其来源于相同的有机体，确保该酶会共同作用以降解纤维素和/或半纤维素。热解纤维素菌bescii（Caldicellulosiruptor bescii）含有用于降解纤维素和半纤维素比如木聚糖的一整组酶。木聚糖是多年生禾草比如柳枝稷中主要的半纤维素，并且最可能是巨草，芒草（Miscanthus）中的主要半纤维素。
在一方面，本公布提供用于降解半纤维素的耐热酶的核苷酸和氨基酸，包括Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487和Cb162。Cb193和Cb195起内切木聚糖酶作用，Cb1172起α-阿拉伯呋喃糖酶作用，Cb909起葡萄糖醛酸酶作用，Cb2487起β-木糖苷酶作用，Cb162起乙酰木聚糖酯酶作用。本发明也包括保留部分或全部功能活性的酶的变体。在此公布的酶可以用于不同的组合。
在一方面，本发明提供用于降解含纤维素的材料的、改进的酶混合物。用于降解含纤维素的材料的、改进的酶混合物可以含有，例如，纤维素酶和/或去尾纤维素酶的改进的混合物。
在另一方面，本发明提供用于降解含纤维素和半纤维素两者的材料的改进的酶混合物。在此公布的、含纤维素和半纤维素的酶混合物在含有纤维素和半纤维素两者的植物材料上的协同作用具有令人惊讶的结果。例如，如下面的实施例15所示，在此提供的、含有纤维素酶混合物和半纤维素酶混合物的酶合剂在植物材料上的纤维素酶活性比单独的同一纤维素酶混合物更大。此外，含有纤维素酶混合物和半纤维素酶混合物的酶合剂与单独使用的相同半纤维素酶混合物相比，前者对植物材料具有更大的半纤维素酶活性。
酶的联合体，即酶合剂，可以根据特定原料的纤维素和/或半纤维素结构调整以提高降解水平。在此描述的该酶的初步分析表明该成分保质期长—工业酶混合物中的重要特征。
缩写词/定义
以下缩写词用于本公布：TLC（薄层层析）、SWAX（可溶性小麦阿拉伯木聚糖）、OSX（燕麦木聚糖）、桦木木聚糖（BWX）、CMC（羧甲基纤维素）、RAX（黑麦阿拉伯木聚糖）、MeGlcA（4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸基）、pNP-X（对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷）、GH（糖苷水解酶）、CBM（碳水化合物结合模块）、SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）、PASC（磷酸膨胀纤维素）、CMC-Na（羧甲基纤维素钠）、LBG（刺槐豆胶）、KGM（魔芋葡甘聚糖）、WAX（小麦阿拉伯木聚糖）、HPAEC（高效阴离子交换层析）、HPLC（高效液相层析）。
在此使用的“多肽”为连续聚合的氨基酸残基链（例如，至少5个连续聚合的氨基酸残基）。在此使用的术语“多肽”，“蛋白质”和“氨基酸序列”可用交替使用。
在此使用的“纤维素酶”活性指的是使纤维素和/或纤维低聚糖中的葡萄糖分子之间的1-4β-D糖苷键裂解的酶活性。纤维素酶活性包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，和β-葡萄糖苷酶活性。
在此使用的“半纤维素酶”活性指的是使为半纤维素成分的分子中的键裂解的酶活性。纤维素酶活性包括内切木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、葡萄糖醛酸酶、β-木糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶活性。
本发明的多肽
在一些方面，本发明的多肽涉及嗜热细菌—Caldicellulosiruptor bescii（前体为Anaerocellum thermophilum DSMZ6725）的重组多肽，去尾体及其变体。
在一方面，本公布提供涉及纤维素降解的重组多肽。在一些方面，本发明提供具有纤维素酶活性的重组Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽。
在一方面，本公布提供涉及半纤维素降解的重组多肽。在一些方面，本发明提供具有半纤维素酶活性的重组Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487和Cb162多肽。
在一方面，本公布提供在用纤维素酶和/或半纤维素酶处理纤维素和/或半纤维素期间，提高纤维素和/或半纤维素的水解的重组多肽。在一方面，本发明提供重组Cb1581多肽，该重组Cb1581多肽是热休克蛋白，该热休克蛋白在用纤维素酶和/或半纤维素酶处理纤维素和/或半纤维素期间提高纤维素和/或半纤维素水解。
纤维素酶
Cb1952多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb1952多肽。在此使用的“Cb1952多肽”指的是具有纤维素酶活性的SEQ ID NO:44多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb1952多肽”也指的是具有纤维素酶活性的，并且与SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1952多肽”也指的是具有纤维素酶活性的并且具有SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:44多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb1952基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:44的Cb1952多肽为具有糖苷水解酶（GH）家族9催化域（纤维素酶域）、三个家族3碳水化合物结合模块和一个GH5催化域（甘露聚糖酶域）的内切纤维素酶（图18）。
本公布也包括SEQ ID NO:114的Cb1952多肽，SEQ ID NO:114的Cb1952多肽是不含信号肽序列的SEQ ID NO:44的Cb1952多肽。该信号肽作为最初翻译的Cb1952蛋白质的一部分产生，以使从细胞中分泌的蛋白质定靶，并且其可以在分泌过程中从蛋白质裂解。本发明也包括在多肽链起始处具有蛋氨酸残基的SEQ ID NO:114的Cb1952多肽。
本发明进一步包括SEQ ID NO:46的Cb1952多肽(“Cb1952TM1”)，Cb1952TM1为野生型Cb1952的去尾突变体(“TM”)。该Cb1952TM1多肽包括wt Cb1952的CBM和纤维素酶域，但不包括甘露聚糖酶域（图18）。
本发明进一步包括SEQ ID NO:124的Cb1952多肽(“Cb1952TM2”)，Cb1952TM2为野生型Cb1952的去尾突变体，该去尾突变体不包括甘露聚糖酶域或C端CBM（图18）。
本发明进一步包括SEQ ID NO:126的Cb1952多肽(“Cb1952TM3”)，Cb1952TM3为野生型Cb1952的去尾突变体，该去尾突变体不包括甘露聚糖酶域或两个最C端CBM（图18）。
本发明进一步包括SEQ ID NO:128的Cb1952多肽(“Cb1952TM4”)，Cb1952TM4为野生型Cb1952的去尾突变体，该去尾突变体包括GH9纤维素酶域但不含有任何CBM或甘露聚糖酶域（图18）。
本发明的Cb1952多肽是嗜热的并且耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb1952多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度孵化时，本公布的Cb1952多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb1953多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb1953多肽。在此使用的“Cb1953多肽”指的是具有纤维素酶活性的SEQ ID NO:60多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb1953多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NOs:60,61和111中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1953多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NOs:60,61和111中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:60的Cb1953多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb1953基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:60的Cb1953多肽为将纤维素大部分裂解为纤维二糖的内切葡聚糖酶，并且Cb1953多肽具有两个糖苷水解酶（GH）家族5催化域和3个碳水化合物结合模块(CBM)（图29）。
本公布也包括SEQ ID NO:61的Cb1953多肽，SEQ ID NO:61的Cb1953多肽是不含信号肽序列的SEQ ID NO:60的Cb1953多肽。该信号肽作为最初翻译的Cb1953蛋白质的一部分产生，以使从细胞中分泌的蛋白质定靶，并且其可以在分泌过程中从蛋白质裂解。本发明也包括在多肽链起始具有蛋氨酸残基的SEQ ID NO:61的Cb1953多肽。
本发明进一步包括SEQ ID NO:111的Cb1953多肽(“Cb1953TM2”)，Cb1953TM2为野生型Cb1953的去尾突变体(“TM”)。该Cb1953TM2多肽包括wt Cb1953的C端GH5域和3个CBM，但不包括N端GH5域（图29）。
本发明的Cb1953多肽是嗜热的并且耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb1953多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb1953多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb1954多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb1954多肽。在此使用的“Cb1954多肽”指的是具有纤维素酶活性的SEQ ID NO:74多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb1952多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NOs:74,121和76中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1954多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NOs:74,121和76中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:74的Cb1954多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb1954基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:74的Cb1954多肽为具有糖苷水解酶（GH）家族9催化域（纤维素酶域）和3个碳水化合物结合模块(CBM)和一个GH48催化域的内切葡聚糖酶（图38）。
本公布也包括SEQ ID NO:121的Cb1954多肽，SEQ ID NO:121的Cb1954多肽是不含信号肽序列的SEQ ID NO:74的Cb1954多肽。该信号肽作为最初翻译的Cb1954蛋白质的一部分产生，以使从细胞中分泌的蛋白质定靶，并且其可以在分泌过程中从蛋白质裂解。本发明也包括在多肽链起始具有蛋氨酸残基的SEQ ID NO:121的Cb1952多肽。
本发明进一步包括SEQ ID NO:76的Cb1954多肽(“Cb1954TM3”)，Cb1954TM3为野生型Cb1954的去尾突变体(“TM”)。该Cb1954TM3多肽包括wt Cb1954的GH9域和最N端的CBM，但不包括中间或C端CBM，或GH48域（图38）。
本公布的Cb1954多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb1954多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb1954多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb1946多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb1946多肽。在此使用的“Cb1946多肽”指的是具有纤维素酶活性的SEQ ID NO:86多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb1946多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NOs:86,87和113中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1946多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且具有86,87和113中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:86的Cb1946多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb1946基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:86的Cb1946多肽为具有在N端区的糖苷水解酶（GH）家族5催化域，C端区的GH家族44催化域和在两个GH催化域之间的2个碳水化合物结合模块(CBM)（图42）的内切葡聚糖酶。
本公布也包括SEQ ID NO:87的Cb1946多肽，SEQ ID NO:87的Cb1946多肽是不含信号肽序列的SEQ ID NO:86的Cb1946多肽。该信号肽作为最初翻译的Cb1946蛋白质的一部分产生，以使从细胞中分泌的蛋白质定靶，并且其可以在分泌过程中从蛋白质裂解。本发明也包括在多肽链起始具有蛋氨酸残基的SEQ ID NO:87的Cb1946多肽。
本发明进一步包括SEQ ID NO:113的Cb1946多肽(“Cb1946TM2”)，Cb1946TM2为野生型Cb1946的去尾突变体(“TM”)。该Cb1946TM2多肽包括wt Cb1946的C端GH44域和2个CBM，但不包括N端GH5域（图42）。
本发明的Cb1946多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb1946多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb1946多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb629多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb629多肽。在此使用的“Cb629多肽”指的是具有纤维素酶活性的SEQ ID NO:98多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb629多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NOs:98,119和100中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1954多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NOs:98,119和100中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:98的Cb629多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb629基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:98的Cb629多肽为最初将葡萄糖，纤维二糖和纤维三糖从纤维素裂解的内切纤维素酶，并且其具有糖苷水解酶（GH）家族5催化域，碳水化合物结合模块(CBM)家族17_28域和可能用于将该酶锚定至细胞表面的3个表层同源(SLH)结构域（图47）。
本公布也包括SEQ ID NO:119的Cb629多肽，SEQ ID NO:119的Cb629多肽是不含信号肽序列的SEQ ID NO:98的Cb629多肽。该信号肽作为最初翻译的Cb629蛋白质的一部分产生，以使从细胞中分泌的蛋白质定靶，并且其可以在分泌过程中从蛋白质中裂解。本发明也包括在多肽链起始具有蛋氨酸残基的SEQ ID NO:119的Cb629多肽。
本发明进一步包括SEQ ID NO:100的Cb629多肽(“Cb629TM2”)，Cb629TM1为野生型Cb629的去尾突变体(“TM”)。该Cb629TM1多肽包括wt Cb629的N端GH5域和CBM17_28域，但不包括C端SLH结构域（图47）。
本发明的Cb629多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb629多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb629多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb486多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb486多肽。
在此使用的“Cb486多肽”指的是具有纤维素酶活性的SEQ ID NO:106多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb486多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NO:106多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb486多肽”也指的是具有纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NO:106多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:106的Cb486多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb486基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:106的Cb486多肽为催化纤维二糖（葡萄糖的二糖）水解为2个单位的葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，并且其具有糖苷水解酶（GH）家族1催化域（图53A）。
本发明的Cb486多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb486多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb486多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
半纤维素酶
本公布也提供耐热半纤维素降解酶Cb193(SEQ ID NO:3)、Cb195(SEQ ID NO:7)、Cb1172(SEQ ID NO:13)、Cb909(SEQ ID NO:19)、Cb2487(SEQ ID NO:27)和Cb162(SEQ IDNO:33)的多肽或其序列。本公布进一步提供一种分离或重组多肽，该分离或重组多肽包括与Cb193、Cb195、Cb1172、Cb2487、Cb909或Cb162具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，或完全(100%)的序列一致性的氨基酸序列。
本公布的半纤维素可以含有一个或更多个糖苷水解酶（GH）域。半纤维素酶也可以含有一个或更多个碳水化合物结合模块(CBM)。该CBM模块可以中断GH域或位于两个GH域之间。半纤维素酶也可以含有乙酰木聚糖酯酶域。在某些实施例中，该GH，CBM和/或乙酰木聚糖酯酶域的序列在多肽变种中是保守的。
Cb193多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb193多肽。在此使用的“Cb193多肽”指的是具有半纤维素酶活性的SEQ ID NO:3多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb193多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NOs:3和/或37中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb193多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NOs:3和/或37中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:3的Cb193多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb193基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:3或37的Cb193多肽是使半纤维素木糖骨架在β-1,4-键随机裂解以产生木糖短链的内切木聚糖酶。这些低聚木糖范围为两个或更多个糖亚单位。Cb193具有信号肽（与SEQ ID NO:3的1-41氨基酸对应），该信号肽可以移除。在SEQ ID NO:37中公布了不含信号肽的Cb193蛋白质的氨基酸序列。该蛋白质具有两个推定的个碳水化合物结合模块(CBM)，碳水化合物结合模块插入糖苷水解酶（GH）家族10催化域内（图2A）。
本公布也包括SEQ ID NO:37的Cb193多肽，SEQ ID NO:37的Cb193多肽是不含信号肽序列的SEQ ID NO:3的Cb193多肽。该信号肽作为最初翻译的Cb193蛋白质的一部分产生，以使从细胞中分泌的蛋白质定靶，并且其可以在分泌过程中从蛋白质中裂解。本发明也包括在多肽链起始具有蛋氨酸残基的SEQ ID NO:37的Cb1952多肽。
本发明的Cb193多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb193多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb193多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb195多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb195多肽。在此使用的“Cb195多肽”指的是具有半纤维素酶活性的SEQ ID NO:7多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb195多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NOs:7多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb193多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NOs:7多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:7的Cb195多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb195基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:7的Cb195多肽是使半纤维素的木糖骨架在β-1,4-键随机裂解以产生更短的木糖链的内切木聚糖酶。这些低聚木糖的范围为两个或更多个糖亚单位。
本发明的Cb195多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb195多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度孵化时，本公布的Cb195多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb1172多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb1172多肽。在此使用的“Cb1172多肽”指的是具有半纤维素酶活性的SEQ ID NO:13多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb1172多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NO:13多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1172多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NO:13多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:13的Cb1172多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb1172基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:13的Cb1172多肽为α-L-阿拉伯呋喃糖酶，α-L-阿拉伯呋喃糖酶使阿拉伯糖基团从半纤维素的木糖骨架或从支链或脱支阿拉伯聚糖裂解从而特定地产生阿拉伯糖。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族51催化域（图6D）。
本发明的Cb1172多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb1172多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度下孵化时，本公布的Cb1172多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb909多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb909多肽。在此使用的“Cb909多肽”指的是具有半纤维素酶活性的SEQ ID NO:19多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb909多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NO:19多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb909多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NO:19多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的的多肽。
SEQ ID NO:19的Cb909多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb909基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:19的Cb909多肽为葡萄糖醛酸酶，葡萄糖醛酸酶在木糖骨架的4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸和β-1,4-木糖苷键（β-1,4-xylosidiclinkage）之间裂解α-1,2-糖苷键。
本发明的Cb909多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb909多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃温度孵化时，本公布的Cb909多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb2487多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb2487多肽。在此使用的“Cb2487多肽”指的是具有半纤维素酶活性的SEQ ID NO:27多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb2487多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NO:27多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb2487多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NO:27多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:27的Cb2487多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb2487基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:27的Cb2487多肽为β-木糖苷酶。
本发明的Cb2487多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb2487多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度孵化时，本公布的Cb2487多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
Cb162多肽
在一些方面，本公布涉及重组Cb162多肽。在此使用的“Cb162多肽”指的是具有半纤维素酶活性的SEQ ID NO:33多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb162多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且与SEQ ID NO:33多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb162多肽”也指的是具有半纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NO:33多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:33的Cb162多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb162基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。SEQ ID NO:33的Cb162多肽为乙酰木聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶裂解半纤维素中的木糖和乙酰基侧链之间的键从而使其它半纤维素酶比如木聚糖酶和β-木糖苷酶更容易进入木聚糖骨架。该蛋白质具有单个乙酰木聚糖酯酶域（图10A）。
本发明的Cb162多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb162多肽具有最大的酶活性速率。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度孵化时，本公布的Cb162多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的酶活性的初始速率。
增强对纤维素和/或半纤维素的酶水解的多肽
在一些方面，本公布提供增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的重组多肽。
在一个方面，增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的重组多肽为重组Cb1581多肽。
在此使用的“Cb1581多肽”指的是具有增强的纤维素和/或半纤维素酶水解活性的SEQ ID NO:146多肽，及其去尾突变体、其同源物、及其同源物的去尾突变体。“Cb1581多肽”也指的是具有增强的纤维素和/或半纤维素酶水解活性的，并且与SEQ ID NO:146多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。在此使用的“Cb1581多肽”也指的是具有增强的纤维素和/或半纤维素酶水解活性的，并且具有SEQ ID NO:146多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸的多肽。
SEQ ID NO:146的Cb1581多肽为Caldicellulosiruptor bescii的Cb1581基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。该Cb1581多肽为小热休克蛋白。
本公布的Cb1581多肽是嗜热的和耐热的。在一些方面，在约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89，或90℃的温度，本公布的Cb1581多肽具有增强的纤维素和/或半纤维素酶水解峰值活性。在一些方面，当在约55,60,65,70,75,80,85,or90℃的温度孵化时，本公布的Cb162多肽在至少24小时的时间段保持至少60%的增强的纤维素和/或半纤维素酶水解活性的初始速率。
带有蛋白质“标签”的多肽
本发明的多肽进一步包括在此公布的、带有蛋白质“标签”的任何重组多肽。多肽标签是可以通过基因克隆连接至感兴趣的蛋白质，并且可以便于纯化，增加溶解度和/或增加“标记的”蛋白质的稳定性的多肽。本领域熟知的蛋白质标签包括，但不限于，聚组氨酸（例如，6个连续的组氨酸残基）、谷胱苷肽S-转移酶(GST)、T7、FLAG、血凝素（HA）、MYC和麦芽糖-结合蛋白(MBP)标签。
多肽的生产
多肽可以在其天然宿主Caldicellulosiruptor bescii中表达并从该天然宿主中纯化。多肽也可以在转基因表达体系中表达并从该转基因表达体系中纯化。转基因表达体系可以是原核的或真核的。转基因宿主细胞可以包括酵母和大肠杆菌（E.coli）。转基因宿主细胞可以将多肽分泌到宿主细胞外。在某些实施例中，分离或重组多肽缺失信号肽。在下文中进一步描述了生产重组多肽的方法。
公布的核酸
本公布进一步提供编码在此公开的任何多肽的重组核酸。在此，编码多肽的核酸也指的是“基因”。确定多肽和编码该多肽的核酸之间的关系的方法对本领域技术人员来说是周知的。相似地，确定多核苷酸序列编码的多肽序列对本领域技术人员来说是周知的。由于密码子简并性，多种不同的核酸序列可以编码相同的多肽序列。
在此使用的术语，“核酸”、“多核苷酸”及其变体属于多聚脱氧核糖核苷酸（含有2-脱氧-D-核糖），属于聚核糖核苷酸（含有D-核糖），属于为嘌呤或嘧啶基的N-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，并且属于含有非核苷酸骨架的其它聚合物，只要该聚合物含有核碱基，核碱基的结构能进行碱基配对和碱基堆积，如在DNA和RNA中发现的。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰物，例如，一种或更多种天然产生的核苷酸的取代物或类似物，及其内部核苷酸修饰物。在此使用的核苷酸和多聚核苷酸的符号是由IUPAC-IUB Commissionof Biochemical Nomenclature推荐的。
在此使用的，多于一个的“核酸”或“多聚核苷酸”可以存在于单条连续的聚脱氧核糖核苷酸链/DNA链中。因此，DNA单链（比如在质粒中）可以含有多于一个“核酸”或“多聚核苷酸”，并且因此，可以含有编码多于一条的、不同的多肽的序列。
核酸可以合成，分离或用标准分子生物技术操纵，比如在Sambrook,J.etal.2000.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版)一文中描述的。该技术可以包括克隆，cDNA文库的表达，和mRNA或基因组DNA的扩增。
本公布的核酸，或其序列，可以包含在克隆载体（cloning vehicle）中，该克隆载体包括表达盒或载体（vector）。该克隆载体可以为病毒载体，质粒，噬体，噬菌粒，粘粒，福斯质粒(fosmid)，噬菌体，或人工染色体。该病毒载体可包括腺病毒载体，逆转录病毒载体，或腺相关病毒载体。该克隆载体可以包括细菌人工染色体（BAC），质粒，噬菌体P1衍生的载体（PAC），酵母人工染色体（YAC），或哺乳动物人工染色体（MAC）。
核酸可操纵地连接至启动子。启动子可以为病毒，细菌，哺乳动物或植物启动子。启动子是组成型启动子，诱导型启动子，组织特异性启动子，或环境调控和发育调控的启动子。
编码纤维素酶的核酸
Cb1952多聚核苷酸
本公布包括编码本公布的Cb1952的重组多聚核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NOs:44,114,124,126,128或46多肽的重组多聚核苷酸。
本发明的多聚核苷酸包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且与SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性。本发明的多聚核苷酸也包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性的、并且具有SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NOs:45,115,125,127,129和47的重组多聚核苷酸。SEQ ID NO:45的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:44的多肽。SEQ ID NO:115的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:45的多肽。SEQ ID NO:47的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:46的多肽。SEQ IDNO:125的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:124的多肽。SEQ ID NO:127的多聚核苷酸编码SEQ IDNO:126的多肽。SEQ ID NO:129的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:128的多肽。
本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：与SEQ ID NOs:45,115,125,127,129和47中的任何序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：具有SEQ ID NOs:45,115,125,127,129和47中的任何序列的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30个连续的核苷酸，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:44,114,124,126,128和46中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。
本发明的多聚核苷酸进一步包括与编码在此公布的Cb1952多肽的多聚核苷酸互补的重组多聚核苷酸。
Cb1953多聚核苷酸
本公布包括编码本公布的Cb1953的重组多聚核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NOs:60,61或111的多肽的重组多聚核苷酸。
本发明的多聚核苷酸包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且与SEQ ID NOs:60,61或111中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。本发明的多聚核苷酸也包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且具有SEQ ID NOs:60,61或111中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NOs:62,63和110的重组多聚核苷酸。SEQ ID NO:62的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:60的多肽。SEQ ID NO:63的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:61的多肽。SEQ ID NO:110的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:111的多肽。
本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：与SEQ ID NOs:62,63和110中的任何序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:60,61和111中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：具有SEQ ID NOs:62,63和110中的任何序列的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30个连续的核苷酸，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:60,61和111中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。
本发明的多聚核苷酸进一步包括与编码在此公布的Cb1953多肽的多聚核苷酸互补的重组多聚核苷酸。
Cb1954多聚核苷酸
本公布包括编码本公布的Cb1954的重组多聚核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NOs:74,121或76的多肽的重组多聚核苷酸。
本发明的多聚核苷酸包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且与SEQ ID NOs:74,121和76中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性。本发明的多聚核苷酸也包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且具有SEQ ID NOs:74,121和76中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NOs:116,75和77的重组多聚核苷酸。SEQ ID NO:116的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:74的多肽。SEQ ID NO:75的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:121的多肽。SEQ ID NO:77的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:76的多肽。
本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：与SEQ ID NOs:116,75和77中的任何序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:74,121和76中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：具有SEQ ID NOs:116,75和77中的任何序列的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30个连续的核苷酸，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:74,121和76中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的多肽。
本发明的多聚核苷酸进一步包括与编码在此公布的Cb1954多肽的多聚核苷酸互补的重组多聚核苷酸。
Cb1946多聚核苷酸
本公布包括编码本公布的Cb1946的重组多聚核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NOs:86,87或113的多肽的重组多聚核苷酸。
本发明的多聚核苷酸包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且与SEQ ID NOs:86,87或113中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性。本发明的多聚核苷酸也包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且具有SEQ ID NOs:86,87或113中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NOs:88,89和112的重组多聚核苷酸。SEQ ID NO:88的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:86的多肽。SEQ ID NO:89的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:87的多肽。SEQ ID NO:112的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:113的多肽。
本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：与SEQ ID NOs:88,89和112中的任何序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:86,87和113中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：具有SEQ ID NOs:88,89和112中的任何序列的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30个连续的核苷酸，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:86,87和113中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。
本发明的多聚核苷酸进一步包括与编码在此公布的Cb1946多肽的多聚核苷酸互补的重组多聚核苷酸。
Cb629多聚核苷酸
本公布包括编码本公布的Cb629的重组多聚核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NOs:98,119或100的多肽的重组多聚核苷酸。
本发明的多聚核苷酸包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且与SEQ ID NOs:98,119和100中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。本发明的多聚核苷酸也包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且具有SEQ ID NOs:98,119和100中的任何多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NOs:99,120和101的重组多聚核苷酸。SEQ IDNO:99的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:98的多肽。SEQ ID NO:120的多聚核苷酸编码SEQ IDNO:119的多肽。SEQ ID NO:101的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:100的多肽。
本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：与SEQ ID NOs:99,120和101中的任何序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:98,119和100中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性的多肽。本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：具有SEQ ID NOs:99,120和101中的任何序列的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30个连续的核苷酸，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NOs:98,119和100中的任何多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的多肽。
本发明的多聚核苷酸进一步包括与编码在此公布的Cb629多肽的多聚核苷酸互补的重组多聚核苷酸。
Cb486多聚核苷酸
本公布包括编码本公布的Cb486的重组多聚核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:106的多肽的重组多聚核苷酸。
本发明的多聚核苷酸包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且与SEQ ID NO:106的多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性。本发明的多聚核苷酸也包括编码这样的多肽的重组多聚核苷酸：具有纤维素酶活性，并且具有SEQ ID NO:106的多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:107的重组多聚核苷酸。SEQ ID NO:107的多聚核苷酸编码SEQ ID NO:106的多肽。
本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：与SEQ ID NO:107序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的一致性，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NO:106多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的多肽。本发明的多聚核苷酸也包括这样的重组多聚核苷酸：具有SEQ IDNO:107序列的至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30个连续的核苷酸，并且编码具有纤维素酶活性和与SEQ ID NO:106多肽序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的多肽。
本发明的多聚核苷酸进一步包括与编码在此公布的Cb486多肽的多聚核苷酸互补的重组多聚核苷酸。
编码半纤维素酶的核酸
本发明提供编码半纤维素降解酶的核苷酸序列Cb193(SEQ ID NO:4),Cb195(SEQID NO:8),Cb1172(SEQ ID NO:14),Cb909(SEQ ID NO:20),Cb2487(SEQ ID NO:28),和Cb162(SEQ ID NO:34)，及其子序列。本发明还提供核苷酸序列，该核苷酸序列与编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的核酸序列具有约至少10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%，或更多，或全部（100%）的序列一致性。
本发明的核苷酸序列可以编码具有一个或多个糖苷水解酶（GH）域的多肽。核苷酸序列还可以编码具有一个或多个碳水化合物结合模块（CBM）的多肽。CBM模块可能中断GH域，位于两个GH域之间。核苷酸序列也可以编码具有乙酰木聚糖酯酶域的多肽。在某些实施例中，GH、CBM和/或乙酰木聚糖酯酶域序列在核苷酸变体中是保守的。
Cb193多核苷酸
本发明包括重组多核苷酸，其编码本发明的Cb193多肽。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NOs:3或37的多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括编码具有半纤维素酶活性的多肽的重组多核苷酸，该多肽与SEQ ID NOs:3和/或37的多肽中任意一个序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括编码多肽的重组多核苷酸，该多肽具有半纤维素酶活性，具有SEQ ID NOs:3和/或37的多肽的任意一种的至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少80，至少100，至少120，至少140，至少160，至少180，或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NOs:4或38的重组多核苷酸。SEQ ID NO:4的多核苷酸编码SEQ ID NO:3的多肽。SEQ ID NO:38的多核苷酸编码SEQ ID NO:37的多肽。
本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸与序列SEQ ID NOs:4和/或38中的任何一个具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NOs:3和/或37的多肽中的任意一个的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NOs:4或38序列中的任意一个的至少10，至少12，至少14，至少16，至少18，至少20，至少22，至少24，至少26，至少28，至少30个连续核苷酸，且该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶的活性，该多肽与SEQ ID NOs:3和/或37的多肽中的任意一个的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码本发明公开的Cb193多肽的多核苷酸互补。
Cb195多核苷酸
本发明包括编码本发明的Cb195多肽的重组多核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:7多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:7的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括编码多肽的多核苷酸，该多肽具有半纤维素酶活性，且具有SEQ ID NO:7的多肽的至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少80，至少100，至少120，至少140，至少160，至少180，或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:8的重组多核苷酸。SEQ ID NO:8的多核苷酸编码SEQ ID NO:7的多肽。
本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸与SEQ ID NO:8的序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性，并编码具有多纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:7的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NO:8序列的至少10，至少12，至少14，至少16，至少18，至少20，至少22，至少24，至少26，至少28，或至少30个连续核苷酸，并编码具有纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:7的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸还包括与编码本发明Cb195多肽的多核苷酸互补的重组多核苷酸。
Cb1172多核苷酸
本发明包括编码本发明Cb1172多肽的重组多核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:13的多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:13的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，且该多肽具有SEQ ID NO:13多肽的至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少80，至少100，至少120，至少140，至少160，至少180，至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:14的重组多核苷酸。SEQ ID NO:14的重组多核苷酸编码SEQ ID NO:13的多肽。
本发明的多核苷酸还包括与SEQ ID NO:14的序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性的重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:13的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NO:14序列的至少10个，至少12个，至少14个，至少16个，至少18个，至少20个，至少22个，至少24个，至少26个，至少28个，或至少30个连续核苷酸，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:13的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸还包括与编码本发明的Cb1172多肽的多核苷酸互补的重组多核苷酸。
Cb909多核苷酸
本发明包括编码本发明Cb909多肽的重组多核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:19多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括编码具有半纤维素酶活性的多肽的重组多核苷酸，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，且该多肽具有SEQ ID NO:19的多肽的至少10个，至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少60个，至少80个，至少100个，至少120个，至少140个，至少160个，或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:20的重组多核苷酸。SEQ ID NO:20的多核苷酸编码SEQ IDNO:19的多肽。
本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸与SEQ ID NO:20序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NO:20序列的至少10个，至少12个，至少14个，至少16个，至少18个，至少20个，至少22个，至少24个，至少26个，至少28个，至少30个连续核苷酸，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸还包括与编码本发明Cb909多肽的多核苷酸互补的重组多核苷酸。
Cb2487多核苷酸
本发明包括编码本发明的Cb2487多肽的重组多核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:27多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:27的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽具有至少10个，至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少60个，至少80个，至少100个，至少120个，至少140个，至少160个，至少180个，或至少200个SEQ ID NO:27的多肽的连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:28的重组多核苷酸。SEQ ID NO:28的多核苷酸编码SEQ ID NO:27的多肽。
本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸与SEQ ID NO:28的序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:27的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NO:28序列的至少10个，至少12个，至少14个，至少16个，至少18个，至少20个，至少22个，至少24个，至少26个，至少28个，至少30个连续核苷酸，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:27的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸还包括与编码本发明Cb2487多肽的多核苷酸互补的重组多核苷酸。
Cb162多核苷酸
本发明包括编码本发明的Cb162多肽的重组多核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:33的多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:33的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽具有SEQ ID NO:33的多肽的至少10个，至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少60个，至少80个，至少100个，至少120个，至少140个，至少160个，至少180个，或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:34的重组多核苷酸。SEQ ID NO:34的多核苷酸编码SEQ ID NO:33的多肽。
本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸与SEQ ID NO:34的序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:33的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NO:34的序列的至少10个，至少12个，至少14个，至少16个，至少18个，至少20个，至少22个，至少24个，至少26个，至少28个，至少30个连续核苷酸，且编码具有半纤维素酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:33的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸还包括与编码本发明Cb162多肽的多核苷酸互补的重组多核苷酸。
编码提高纤维素和/或半纤维素酶水解的多肽的核酸
本发明包括编码本发明的Cb1581多肽的重组多核苷酸。在一些方面，本发明包括编码SEQ ID NO:146的多肽的重组多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码提高纤维素和/或半纤维素酶水解的多肽，该多肽与SEQ ID NO:146的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码提高纤维素和/或半纤维素酶水解的多肽，该多肽具有SEQ ID NO:146的多肽的至少10个，至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少60个，至少80个，至少100个，至少120个，至少140个，至少160个，至少180个，或至少200个连续氨基酸。
在一些方面，本发明包括SEQ ID NO:147的重组多核苷酸。SEQ ID NO:147的多核苷酸编码SEQ ID NO:146的多肽。
本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸与SEQ ID NO:147的序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性，且编码提高纤维素和/或半纤维素酶水解的多肽，该多肽与SEQ ID NO:146多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。本发明的多核苷酸还包括重组多核苷酸，该重组多核苷酸具有SEQ ID NO:147序列的至少10个，至少12个，至少14个，至少16个，至少18个，至少20个，至少22个，至少24个，至少26个，至少28个，至少30个连续核苷酸，且编码提高纤维素和/或半纤维素酶水解的多肽，该多肽与SEQ ID NO:146的多肽的序列具有至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的一致性。
本发明的多核苷酸还包括与编码本发明Cb1581多肽的多核苷酸互补的重组多核苷酸。
编码具有蛋白质“标签”的多肽的重组多核苷酸
本发明还公开了编码具有多肽“标签”的本发明的多肽的重组多核苷酸。编码多肽“标签”的多核苷酸可通过标准分子生物学克隆技术加入编码本发明的多肽的多核苷酸。（见，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,Vol.1-3,Cold
变异，序列一致性和序列相似性
本领域已知用于比较的序列比对的方法。例如，可利用数学算法测定任意两个序列之间的序列一致性百分比。这种数学算法的非限制性的例子是Myers和Miller(1988)CABIOS4:1117算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needlemanand Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443 453的同源性比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:24442448的搜索相似性方法；被Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:58735877所修改的Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法。
这些数学算法的计算机执行过程可用于序列的比对，以确定序列一致性。这种执行过程包括，但不限于，PC/基因程序中的CLUSTAL（由Intelligenetics,Mountain View,Calif获得）；ALIGN程序(2.0版)，和威斯康星州的遗传学分析软件包（Wisconsin GeneticsSoftware Package），版本8中的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,和TFASTA（由GeneticsComputer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得）。可利用默认参数进行使用这些程序的对比。Higgins et al.(1988)Gene73:237244(1988);Higgins et al.(1989)CABIOS5:151153;Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:1088190;Huang etal.(1992)CABIOS8:15565;和Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307331很好的描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序是基于同上Myers和Miller(1988)的算法。当比较氨基酸序列时，PAM120重量残留表，12的空隙长度罚分，和4的空隙罚分可与ALIGN程序共同使用。Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于以上Karlin和Altschul(1990)的算法。BLAST核苷酸搜索可利用BLASTN程序进行，得分=100，字长=12，以获得与编码本发明的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序，得分=50，字长=3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对（gapped alignments），使用如Altschul et al.(1997)NucleicAcids Res.25:3389描述的空位BLAST（BLAST2.0）。或者，可以使用PSI-BLAST(BLAST2.0)进行检测分子间远距离关系的重复搜索。见同上的Altschul et al.(1997)。当使用BLAST,空位BLAST，或PSI-BLAST时，使用相应程序的（例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白质的BLASTX）的默认参数。例如可以从国家生物技术信息中心（NCBI）获得BLAST。也可以手动检查比对。
文中使用的“序列一致性”指的是在被分析序列的相同位置相同的残基的百分比。文中使用的“序列相似性”指的是在被分析序列的相同位置具有相似生物物理/生化特征（例如电荷、大小、疏水性）的残基的百分比。
酶变种的功能活性可利用包括薄层色谱法或还原糖测试的标准生物学技术评价。可利用纤维素、半纤维素或人工底物确定酶活性。
组合物
本发明还包括含有本文公开的一种或多种重组多肽的组合物。在一些方面，本文提供的组合物含有本文公开的两种或多种重组多肽。含有两种或多种重组多肽的组合物可以称为多肽和/或酶的“混合物（cocktail）”。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的一种或多种重组多肽，其中一种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的三种或多种重组多肽，其中该三种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的四种或多种重组多肽，其中该四种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的五种或多种重组多肽，其中该五种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的六种或多种重组多肽，其中该六种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的一种或多种重组多肽，其中该一种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44、114、124、126、128、和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60、61、和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74、121、和76多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86、87、和113的多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98、119、和100的多肽，其中Cb486多肽为SEQ ID NO:106多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44、114、124、126、128、和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60、61、和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74、121、和76多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86、87、和113的多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98、119、和100的多肽，其中Cb486多肽为SEQ ID NO:106多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的三种或多种重组多肽，其中该三种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44、114、124、126、128、和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60、61、和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74、121、和76多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86、87、和113的多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98、119、和100的多肽，其中Cb486多肽为SEQ ID NO:106多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的四种或多种重组多肽，其中该四种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44、114、124、126、128、和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60、61、和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74、121、和76多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86、87、和113的多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98、119、和100的多肽，其中Cb486多肽为SEQ ID NO:106多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的五种或多种重组多肽，其中该五种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44、114、124、126、128、和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60、61、和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74、121、和76多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86、87、和113的多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98、119、和100的多肽，其中Cb486多肽为SEQ ID NO:106多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的六种或多种重组多肽，其中该六种或多种重组多肽选自Cb1952、Cb1953、Cb1954、Cb1946、Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44、114、124、126、128、和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60、61、和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74、121、和76多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86、87、和113的多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98、119、和100的多肽，其中Cb486多肽为SEQ ID NO:106多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46、76、100、106、111、和113的多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的三种或多种重组多肽，其中该三种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46、76、100、106、111、和113的多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的四种或多种重组多肽，其中该四种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46、76、100、106、111、和113的多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的五种或多种重组多肽，其中该五种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46、76、100、106、111、和113的多肽。
在一些方面，本文公开的组合物含有本文公开的六种或多种重组多肽，其中该六种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46、76、100、106、111、和113的多肽。
含有本文公开的一种或多种重组纤维素酶本文公开的任意组合物还含有一种或多种重组半纤维素酶。半纤维素酶包括，但不限于，内切木聚糖酶，外源木聚糖酶，α-阿拉伯糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，β-木糖苷酶，和乙酰木聚糖酯酶。在一些方面，半纤维素酶包括多肽，该多肽含有任意SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33,或37的氨基酸序列。本文公开的、含有本文公开的一种或多种重组纤维素酶的任意组合物还含有酶，该酶增强纤维素和/或半纤维素的酶水解。一方面，增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列。
本发明提供组合物，该组合物包括单独的Cb193的重组氨基酸序列，或者包括与Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487和Cb162的重组氨基酸序列中的一种或多种结合使用的Cb193重组氨基酸序列。本发明还提供组合物，该组合物包括单独的Cb195的重组氨基酸序列，或者包括与Cb193,Cb1172,Cb909,Cb2487和Cb162的重组氨基酸序列中的一种或多种结合使用的Cb195重组氨基酸序列。本发明还提供组合物，该组合物包括单独的Cb1172的重组氨基酸序列，或包括与Cb193,Cb195,Cb909,Cb2487和Cb162的重组氨基酸序列的一种或多种结合使用的Cb1172的重组氨基酸序列。本发明还提供组合物，该组合物包括单独的Cb909的重组氨基酸序列，或者包括与Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487和Cb162的重组氨基酸序列的一种或多种结合使用的Cb909的重组氨基酸序列。本发明还提供组合物，该组合物包括单独的Cb2487的重组氨基酸序列，或者包括与Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909和Cb162的重组氨基酸序列的一种或多种结合使用的Cb2487的重组氨基酸序列。本发明还提供组合物，该组合物包括单独的Cb162的重组氨基酸序列，或者与Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487和Cb909的重组氨基酸序列的一种或多种结合使用的Cb162的重组氨基酸序列。
本发明还提供组合物，该组合物包括两种或多种Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物组合物包括Cb193,Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,Cb1172,和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb909,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195,Cb1172,和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb2487,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb909,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb909,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb1172,和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193,Cb195,和Cb1172的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193和Cb195的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193和Cb1172的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb193和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195和Cb1172的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb195和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172和Cb909的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb1172和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb909和Cb2487的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb909和Cb162的重组氨基酸序列。另一种组合物包括Cb2487和Cb162的重组氨基酸序列。
组合物可以包括转基因宿主细胞，该转基因宿主细胞包括一种或多种编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的氨基酸序列。该一种或多种多肽可以由该转基因宿主细胞分泌出。
本发明提供组合物，该组合物包括单独的编码Cb193的重组氨基酸序列，或者包括与一种或多种编码Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487和Cb162的重组核苷酸序列结合使用的Cb193的重组氨基酸序列。本发明还公开组合物，该组合物包括单独的编码Cb195的重组氨基酸序列，或者包括与一种或多种编码Cb193,Cb1172,Cb909,Cb2487和Cb162的重组核苷酸序列结合使用的Cb195的重组氨基酸序列。本发明还公开组合物，该组合物包括单独的编码Cb1172的重组氨基酸序列，或者包括与一种或多种编码Cb193,Cb195,Cb909,Cb2487和Cb162的重组核苷酸序列结合使用的Cb1172的重组氨基酸序列。本发明还公开组合物，该组合物包括单独的编码Cb909的重组氨基酸序列，或者包括与一种或多种编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487和Cb162的重组核苷酸序列结合使用的Cb909的重组氨基酸序列。本发明还公开组合物，该组合物包括单独的编码Cb2487的重组氨基酸序列，或者包括与一种或多种编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909和Cb162的重组核苷酸序列结合使用的编码Cb2487的重组氨基酸序列。本发明还公开组合物，该组合物包括单独的编码Cb162的重组氨基酸序列，或者包括与一种或多种编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487和Cb909的重组核苷酸序列结合使用的编码Cb162的重组氨基酸序列。
本发明还提供组合物，该组合物包括两种或多种编码Cb162,Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487和Cb909的重组核苷酸序列。组合物可以包括含有编码一种或多种Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的核苷酸序列的载体。
本文公开的、含有本文公开的一种或多种重组半纤维素酶的任何组合物还包括一种或多种重组纤维素酶。在一些方面，纤维素酶包括多肽，该多肽包含任意的SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,46,60,61,111,74,121,76,86,87,113,98,119,100,和106的氨基酸序列。本文共开的、含有本文共开的一种或多种重组半纤维素酶的任何组合物还可以包括酶，该酶增强纤维素和/或半纤维素的酶水解。一方面，增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶包括SEQ ID NO:146的氨基酸序列。
含有本文公开的一种或多种重组多肽的本文公开的组合物可以包括各种形式的蛋白质。在一些方面，多肽为液体溶液。在一些方面，该多肽为冻干的。在一些方面，含有本文公开的一种或多种重组多肽的组合物还包括额外材料，以帮助保持多肽的稳定性。在一些方面，含有本文公开的一种或多种重组多肽的组合物包括额外材料，以帮助保持多肽的稳定性，其中该额外材料为额外的多肽。在一些方面，该组合物至少可以稳定6个月。在一些方面，该组合物至少可以稳定1年。
宿主细胞
本发明还提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码本发明的重组多肽的重组核酸。在一些方面，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码本发明的两种或多种重组多肽的两种或多种重组核酸。
“宿主细胞”和“宿主微生物”在本文中交替的用于表示生物细胞，该生物细胞可通过重组DNA或RNA的嵌入而转化。该重组DNA或RNA可在表达载体中。本文描述的宿主生物体或细胞可以是原核生物体或真核细胞。
只要在核酸序列转化后仍然存活的任何原核或真核宿主细胞都可以用于本发明。优选地，宿主细胞不会受到必要的核酸序列的转导，蛋白质的随后的表达（例如转运蛋白），以及由此产生的中间体的相反地影响。
在一些方面，宿主细胞为原核细胞。任何适合表达重组多肽的原核细胞可用于产生本发明的重组多肽。本发明的原核宿主细胞包括，但不限于，大肠埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、变形杆菌属、青枯雷尔氏菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属、运动发酵单胞菌属、梭状芽孢杆菌属、嗜热厌氧菌属、热解纤维素菌属和克雷伯氏菌属。
在一些方面，宿主细胞为真核细胞。用于重组多肽的表达的任意真核细胞可以用于产生本发明的重组多肽。合适的真核细胞包括，但不限于，真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞。
在某些方面，宿主细胞为真菌菌株。本文中使用的“真菌”包括子囊菌门、接合菌门、壶菌门、担子菌门、卵菌门和所有有丝分裂孢子真菌。
在一些实施例中，真菌宿主为酵母菌株。本文使用的“酵母”指的是通过出牙或分裂无性繁殖的任何单细胞真菌，它包括子囊菌和担子菌。
在一些实施例中，真菌宿主为酵母菌属、裂殖酵母属、白冬孢酵母属、德克/酒香酵母属、接合酵母属、耶氏酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、木糖发酵酵母（毕赤酵母）、脉孢菌属或假丝酵母。
在一些方面，宿主细胞为嗜热性微生物。
本发明的宿主细胞可以在已经引入该宿主细胞中的核酸内被转基因，同样的这种转基因宿主细胞不存在于自然界。合适的宿主细胞是一种能够表达一种或多种核酸构筑物，该核酸构筑物编码用于不同功能的一种或多种蛋白质。
文中使用的“重组核酸”或“异源核酸”或“重组多核苷酸”，“重组核苷酸”或“重组DNA”指的是核酸的聚合物，其中至少以下之一是正确的：（a）核酸序列与给定宿主细胞无关（即不能自然发现）；（b）该序列可在给定宿主细胞内自然发现，但是具有非天然的含量（例如大于预期）；（c）核酸序列包括两种或多种子序列，该子序列在自然界中未发现彼此的相同的关系；（d）将多核苷酸从有机体中分离出，该有机体天然存在该多核苷酸；或者（e）综合制备该多核苷酸。例如，关于例子（c），重组核酸序列将具有来自设置为制备新功能核酸的无关基因的两种或多种序列。具体地，本发明描述了向向宿主细胞引入表达载体，其中表达载体含有用于编码不常在宿主细胞内发现的蛋白质的核酸序列，或者含有编码常在细胞中发现、但是受不同调控序列控制的蛋白质的核酸。参照宿主细胞的染色体组，编码蛋白质的核酸序列为重组的。如本文中所使用的，术语“重组多肽”指的是由上述“重组核酸”或“异源核酸”或“重组多核苷酸”，“重组核苷酸”或“重组DNA”产生的多肽。
在一些方面，宿主细胞自然产生由本发明的多核苷酸编码的蛋白质。编码所需蛋白质的基因可以与宿主细胞异源，或者该基因与宿主细胞具有內源性，但是可操作的连接至异源启动子和/或控制区，其导致在宿主细胞内基因的更高的表达。
宿主细胞成分
在一些方面，本文公开的宿主细胞包含一种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486的一种或多种多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有两种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486的两种或多种多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有三种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486的三种或多种多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有四种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486的四种或多种多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有五种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486的五种或多种多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有六种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486的六种或多种多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有一种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的一种或多种重组多肽，其中该一种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，其中Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，其中Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，其中Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86,87,和113多肽，其中Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98,119,和100多肽，其中Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有两种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946为选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽为SEQ ID NO:106的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有三种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的三种或多种重组多肽，其中该三种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946为选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽为SEQ ID NO:106的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有四种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的四种或多种重组多肽，其中该四种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946为选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽为SEQ ID NO:106的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有五种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的五种或多种重组多肽，其中该五种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946为选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽为SEQ ID NO:106的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有六种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的六种或多种重组多肽，其中该六种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，其中Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946为选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629多肽选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽为SEQ ID NO:106的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞包括编码本文公开的两种或多种重组多肽的两种或多种重组核酸，其中该两种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞包括编码本文公开的三种或多种重组多肽的三种或多种重组核酸，其中该三种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞包括编码本文公开的四种或多种重组多肽的四种或多种重组核酸，其中该四种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞包括编码本文公开的五种或多种重组多肽的五种或多种重组核酸，其中该五种或多种多肽选自SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞包括编码本文公开的六种重组多肽的六种重组核酸，其中该六种多肽为SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有一种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的一种或多种重组多肽，其中该一种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，编码Cb1952多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:45,115,125,127,129,和47的多核苷酸，编码Cb1953多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:62,63,和110的多核苷酸，编码Cb1954多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:116,75,和77的多核苷酸，编码Cb1946多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:88,89,和112的多核苷酸，编码Cb629多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:99,120,和101的多核苷酸，编码Cb486多肽的重组核酸为SEQ ID NO:107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有两种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，编码Cb1952多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:45,115,125,127,129,和47的多核苷酸，编码Cb1953多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:62,63,和110的多核苷酸，编码Cb1954多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:116,75,和77的多核苷酸，编码Cb1946多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:88,89,和112的多核苷酸，编码Cb629多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:99,120,和101的多核苷酸，编码Cb486多肽的重组核酸为SEQ ID NO:107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有三种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的三种或多种重组多肽，其中该三种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，编码Cb1952多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:45,115,125,127,129,和47的多核苷酸，编码Cb1953多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:62,63,和110的多核苷酸，编码Cb1954多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:116,75,和77的多核苷酸，编码Cb1946多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:88,89,和112的多核苷酸，编码Cb629多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:99,120,和101的多核苷酸，编码Cb486多肽的重组核酸为SEQ ID NO:107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有四种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的四种或多种重组多肽，其中该四种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，编码Cb1952多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:45,115,125,127,129,和47的多核苷酸，编码Cb1953多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:62,63,和110的多核苷酸，编码Cb1954多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:116,75,和77的多核苷酸，编码Cb1946多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:88,89,和112的多核苷酸，编码Cb629多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:99,120,和101的多核苷酸，编码Cb486多肽的重组核酸为SEQ ID NO:107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有五种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的五种或多种重组多肽，其中该五种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，编码Cb1952多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:45,115,125,127,129,和47的多核苷酸，编码Cb1953多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:62,63,和110的多核苷酸，编码Cb1954多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:116,75,和77的多核苷酸，编码Cb1946多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:88,89,和112的多核苷酸，编码Cb629多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:99,120,和101的多核苷酸，编码Cb486多肽的重组核酸为SEQ ID NO:107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有六种或多种重组核酸，其中该重组核酸编码本文公开的六种或多种重组多肽，其中该六种或多种重组多肽选自Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629或Cb486多肽，编码Cb1952多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:45,115,125,127,129,和47的多核苷酸，编码Cb1953多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:62,63,和110的多核苷酸，编码Cb1954多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:116,75,和77的多核苷酸，编码Cb1946多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:88,89,和112的多核苷酸，编码Cb629多肽的重组核酸选自SEQ ID NOs:99,120,和101的多核苷酸，编码Cb486多肽的重组核酸为SEQ ID NO:107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有编码本文公开的两种或多种重组多肽的两种或多种重组核酸，其中该两种或多种重组核酸选自SEQ ID NOs:47,110,77,112,101,和107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有编码本文公开的三种或多种重组多肽的三种或多种重组核酸，其中该三种或多种重组核酸选自SEQ ID NOs:47,110,77,112,101,和107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有编码本文公开的四种或多种重组多肽的四种或多种重组核酸，其中该四种或多种重组核酸选自SEQ ID NOs:47,110,77,112,101,和107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有编码本文公开的五种或多种重组多肽的五种或多种重组核酸，其中该五种或多种重组核酸选自SEQ ID NOs:47,110,77,112,101,和107多核苷酸。
在一些方面，本文公开的宿主细胞含有编码本文公开的六种重组多肽的六种重组核酸，其中该六种重组核酸为SEQ ID NOs:47,110,77,112,101,和107多核苷酸。
本文公开的、含有编码本文公开的一种或多种重组纤维素酶的一种或多种重组核酸的任意宿主细胞还包括编码一种或多种重组半纤维素酶的一种或多种重组核酸。在一些方面，编码半纤维素酶的多核苷酸包括含有任意SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34,或38的多核苷酸序列的核酸。本文共开的含有本文公开的一种或多种重组纤维素酶的宿主细胞还可以包括酶，其促进纤维素和/或半纤维素的酶水解。一方面，促进纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶包括SEQ ID NO:146的氨基酸序列。
本发明还提供转化转基因宿主细胞，包括编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的一种或多种核酸。该转化细胞（transformed cell）可以是，但不限于，细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在某些实施例中，该转化细胞是大肠杆菌（E.coli）。在一些实施例中，该转化细胞是嗜热性微生物。
本文公开的含有编码本文公开的一种或多种重组半纤维素酶的一种或多种重组核酸的宿主细胞还包括编码一种或多种纤维素酶的一种或多种重组核酸。在一些方面，编码纤维素酶的多核苷酸包括含有SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,46,60,61,111,74,121,76,86,87,113,98,119,100,和106的任意多核苷酸序列的核酸。本文共开的、含有本文公开的一种或多种重组半纤维素酶的宿主细胞还可以包括酶，其促进纤维素和/或半纤维素的酶水解。一方面，促进纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶包括SEQ ID NO:146的氨基酸序列。
本发明的生产并培养宿主细胞的方法
本发明生产并培养宿主细胞的方法可以包括将含有本发明的重组核酸的表达载体引入或转录（transfer）至宿主细胞。用于将表达载体转录至宿主细胞的该方法是本领域技术人员已知的。例如，用于利用表达载体转化细胞的一种方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀引入表达载体。也可以利用其他盐，例如磷酸钙进行相似的步骤。此外，可使用电穿孔（即使用电流增加细胞对核酸序列的渗透性）转染（transfect）宿主细胞。也可以利用原生质球转录细胞（Schweizer,M,Proc.Natl.Acad.Sci.,78:5086-5090(1981)）。同样，核酸序列的显微注射能提供转染宿主细胞。也可以使用其他方式，例如脂质复合物，脂质体，和树枝状聚合物。本领域技术人员可以利用这些或其他方法，通过理想序列转染宿主细胞。
在一些情况下，在细胞在转化前，将其制备为原生质体或原生质球。例如，可通过酶处理具有细胞壁的细胞，以降解细胞壁，来制备原生质体或原生质球。例如，利用酵母裂解酶或几丁质酶处理真菌细胞。
该载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、染色体外因子、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包括用于确保自我复制的任何工具。或者，该载体可以是当被引入宿主时，其整合至染色体组，并与其整合入的染色体共同复制。进一步地，可以使用单个的载体或质粒，或者共同含有被引入宿主的染色体组中的总的DNA的两个或多个载体或质粒，或者转座子。
该载体优选包括一种或多种选择标记，其允许转化的宿主的简单选择。选择标记是一种基因，其产物提供例如杀菌或耐病毒，耐重金属，营养缺陷型的原养性等。细菌细胞的选择可以基于基因，例如amp,gpt,neo,tet,camR和hyg基因所给予的抗菌剂耐药性。
用于真菌宿主细胞的选择标记包括，但不限于，amdS（乙酰胺酶）、argB（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar（草胺膦乙酰转移酶）、hph（潮霉素磷酸转移酶）、niaD（硝酸还原酶）、pyrG（乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶）、sC（硫酸腺苷酰转移酶）、和trpC（甲酸酯合酶），及等同物。用于酿酒酵母宿主的合适的标记包括，例如ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1,和URA3。
该载体可以包括成分，该成分允许载体整合至宿主的染色体组，或者载体在细胞中独立于染色体组自主复制。
为了整合至宿主染色体组，载体可依赖于基因序列或者通过同源或非同源重组将载体整合至染色体组中的载体的其它成分。或者，该载体可以包括额外的核苷酸序列，用于通过同源重组指导整合至宿主染色体组。该额外的核苷酸序列使载体整合至宿主染色体组中染色体上的准确位置。为了提高在准确位置整合的可能性，整合成分应该包括足够量的核酸，例如100-10,000个碱基对，400-10,000个碱基对，800-10,000个碱基对，其与相应的靶序列高度同源，以增加同源重组的可能性。该整合成分可以是与宿主的染色体组上的靶序列同源的任意序列。此外，该整合成分可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，该载体可通过非同源重组整合至宿主的染色体组。
对于自主复制，该载体还包括复制起点，该复制起点使载体在宿主内自主复制。该复制起点可以是任何调节自主复制的质粒复制因子，其在细胞内起作用。术语“复制起点”或“质粒复制因子”在此处定义为能够使质粒或载体在体内复制的序列。
该载体还包括用于调节重组核酸在载体内表达的启动子。用于调节基因的表达的启动子是本领域已知的，包括组成型启动子，和诱导型启动子。例如Sambrook,etal.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,(2001)中描述了启动子。在一些方面，酵母菌属中使用的载体可以包括TDH1或PGK1启动子，它们是强大的组成型启动子。
可以将一个以上复制的基因插入宿主内，以增加基因产品的产量。基因复制数的增加可通过将至少一个额外的复制基因整合至宿主基因组来获得，或通过在核苷酸序列（其中细胞含有选自标记基因的扩增的复制）中包括一个可扩增的可选择标记基因来实现，从而通过在合适的选择剂存在下培养细胞，选择额外的基因复制。
用于连接上述成分以构建本发明的重组表达载体的方法在本领域是已知的（见例如Sambrook et al.,2001,同上）。
一旦用表达载体转化宿主细胞，该宿主细胞被允许生长。宿主细胞在培养基中的生长可涉及发酵过程。本发明的方法可以包括培养宿主细胞，从而重组核酸在细胞中表达。培养基、温度范围和其它适于生长的条件在本领域是已知的。
本发明重组多肽的表达
本发明还提供本发明的多肽的表达。本发明的多肽可以通过标准分子生物学技术制备，例如文中描述的方法，以及Sambrook,et al.Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001)所描述的方法。重组多肽可以在转基因表达系统中表达并纯化。转基因表达系统可以是原核或真核的。在一些方面，转基因宿主细胞可以在宿主细胞外分泌多肽。在一些方面，转基因宿主细胞可以在宿主细胞内保留表达的多肽。
在一些方面，本发明的重组多肽部分或基本上从宿主细胞分离出，或者来自宿主细胞的生长培养基。在某些方面，利用蛋白质“标签”制备本发明的重组多肽，以便于蛋白质的纯化，例如GST-标签或聚-His标签。在一些方面，利用信号序列制备本发明的重组多肽，以指导多肽导出细胞外。在一些方面，重组多肽可以仅仅被部分纯化（例如，<80%纯度，<70%纯度，<60%纯度，<50%纯度，<40%纯度，<30%纯度，<20%纯度，<10%纯度，<5%纯度）。在一些方面，本发明的重组多肽可纯化至高纯度（例如，>99%纯度，>98%纯度，>95%纯度，>90%纯度，等）。可利用本领域已知的各种技术纯化重组多肽，包括例如离子交换色谱法，尺寸排阻色谱法，和亲和层析法。
一方面，用于生产本发明的任意重组多肽（包括纤维素酶、半纤维素酶，以及增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶）的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件下的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞含有编码本文公开的一种或多种重组多肽的一种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞中收集一种或多种多肽。
一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文公开的一种或多种重组多肽的一种或多种重组核酸，其中该一种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并从培养基和/或宿主细胞中收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文公开的两种或多种重组多肽的两种或多种重组核酸，其中该两种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并从培养基和/或宿主细胞中收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文公开的三种或多种重组多肽的三种或多种重组核酸，其中该三种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并从培养基和/或宿主细胞中收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文公开的四种或多种重组多肽的四种或多种重组核酸，其中该四种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并从培养基和/或宿主细胞中收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文公开的五种或多种重组多肽的五种或多种重组核酸，其中该五种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并从培养基和/或宿主细胞中收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A）在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文公开的六种或多种重组多肽的六种或多种重组核酸，其中该六种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并从培养基和/或宿主细胞中收集该一种或多种多肽。
另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A)在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的一种或多种重组多肽的一种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A)在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的两种或多种重组多肽的两种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A)在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的三种或多种重组多肽的三种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A)在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的四种或多种重组多肽的四种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A)在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的五种或多种重组多肽的五种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞收集该一种或多种多肽。另一方面，用于生产纤维素酶的方法包括步骤：A)在支持重组核酸表达所需的条件的培养基中，培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的六种或多种重组多肽的六种或多种重组核酸，并从培养基和/或宿主细胞收集该一种或多种多肽。
酶的热稳定性
本发明的酶是嗜热和耐热的。文中使用的“嗜热”指的是酶的一种特征，在高温（例如高于50℃）具有活性峰。文中使用的“耐热”指的是酶在高温（例如高于50℃），在显著一段时间保持活性的特征。对于本发明的Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽，“酶的”活性指的是纤维素酶活性（包括β-葡糖苷酶活性）。对于本发明的Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162多肽指的是半纤维素酶活性。对于本发明的Cb1581多肽，“酶的”活性指的是增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的活性。
纤维素酶
在某些方面，本发明的一种或多种Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629和Cb486多肽对纤维素或含纤维素的材料在约55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃的温度具有酶活性的峰率。另一方面，文中提供酶的混合物（enzyme cocktail），其中酶的混合物包括本文公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，其中在温度约为55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃时，该酶的混合物对纤维素或含纤维素的材料具有酶活性的峰率。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，在温度约为55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃时，其对纤维素或含纤维素的材料具有酶活性的峰率。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，其中当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自，Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自，Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自，Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自，Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，其中该两种或多种多肽选自，Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括文中公开的两种或多种重组多肽，该两种或多种重组多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ IDNOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ IDNOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物保持至少75%的初始速率的酶活性至少24小时的期间。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ IDNOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。
另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约55℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约60℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约65℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约70℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ IDNOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约75℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。另一方面，文中提供酶的混合物，其中该酶的混合物包括SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽，当在约80℃的温度下孵化时，该酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。
半纤维素酶
在某些实施例中，一种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162在温度约为55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃具有酶活性的峰率。在另一些实施例中，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在温度约为55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃对半纤维素或半纤维素衍生物具有酶活性的峰率。在一个实施例中，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在温度约为55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃对半纤维素或半纤维素衍生物具有酶活性的峰率。
本发明的酶在高温下显著时间段内保持显著的酶活性。在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少90%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少75%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少50%的初始速率的酶活性。
在一个实施例中，当在约55℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约60℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约65℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约70℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约75℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。在一个实施例中，当在约80℃的温度下孵化时，含有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物在至少24小时的期间保持至少25%的初始速率的酶活性。
本文公开的、具有此处所公开的嗜热和耐高温特性的任意一种纤维素酶的混合物还可以包括文中公开的任意一种半纤维素酶和/或文中公开的增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶。此外，本文公开的、具有此处所公开的嗜热和耐高温特性的任意一种半纤维素酶的混合物还可以本文公开的任意一种纤维素酶和/或文中公开的增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的酶。
应用
降解含纤维素的材料的方法
一方面，本文中公开的是用于降解含纤维素的材料的方法。
一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文中公开的一种或多种重组多肽的组合物接触，其中该一种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文中公开的两种或多种重组多肽的组合物接触，其中该两种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文中公开的三种或多种重组多肽的组合物接触，其中该三种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文中公开的四种或多种重组多肽的组合物接触，其中该四种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文中公开的五种或多种重组多肽的组合物接触，其中该五种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文中公开的六种或多种重组多肽的组合物接触，其中该六种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。
另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的一种或多种重组多肽的组合物接触，其中该一种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，且Cb1952多肽选自SEQ IDNOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽与含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的两种或多种重组多肽的组合物接触，其中该两种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，且Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629选自SEQ IDNOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽与含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的三种或多种重组多肽的组合物接触，其中该三种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，且Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ IDNOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽与含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的四种或多种重组多肽的组合物接触，其中该四种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，且Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽与含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的五种或多种重组多肽的组合物接触，其中该五种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，且Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946多肽选自SEQ ID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽与含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的六种或多种重组多肽的组合物接触，其中该六种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，且Cb1952多肽选自SEQ ID NOs:44,114,124,126,128,和46的多肽，Cb1953多肽选自SEQ ID NOs:60,61,和111的多肽，Cb1954多肽选自SEQ ID NOs:74,121,和76的多肽，Cb1946多肽选自SEQID NOs:86,87,和113的多肽，Cb629选自SEQ ID NOs:98,119,和100的多肽，Cb486多肽是SEQ ID NO:106的多肽；并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽与含纤维素的材料。
另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有一种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有两种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有三种或多种SEQ IDNOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有四种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有五种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有六种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件下孵化该多肽和含纤维素的材料。
另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的一种或多种重组多肽的一种或多种重组核酸，该一种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的两种或多种重组多肽的两种或多种重组核酸，其中该两种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的三种或多种重组多肽的三种或多种重组核酸，其中三种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽，并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的四种或多种重组多肽的四种或多种重组核酸，其中四种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的五种或多种重组多肽的五种或多种重组核酸，其中五种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的六种或多种重组多肽的六种或多种重组核酸，其中六种或多种多肽选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。
另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码一种或多种SEQID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的一种或多种重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码两种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的两种或多种重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码三种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的三种或多种重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码四种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的四种或多种重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码五种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的五种或多种重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码六种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的六种或多种重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。
另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有本文公开的一种或多种重组多肽的组合物接触，其中该一种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，或Cb629多肽，且该组合物不含有Cb486多肽；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该多肽与含纤维素的材料。另一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，在支持重组核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的一种或多种重组多肽的一种或多种重组核酸，该一种或多种多肽选自：Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，或Cb629多肽，且该宿主细胞不含有编码Cb486多肽的重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该细胞和含纤维素的材料。将含纤维素的材料与本文公开的一种或多种纤维素酶接触，而不与Cb486接触，将导致在含纤维素的材料降解的过程中纤维二糖和/或其他低聚糖的聚集。含有纤维二糖和/或低聚糖的产物可用于有机体的原料或者可用于能有效利用纤维二糖和/或低聚糖以产生例如生物燃料的理想终端产物的工序。
如文中所使用的，“含纤维素的材料”是任何含有纤维素的材料，包括生物质（biomass）。适于与目前公开的方法一起使用的生物质包括任何含纤维素的材料，并且包括芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheatstraw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(Oat Straw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybean stover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、黑麦壳（rye hull）、大麦壳（wheat hull）、蔗渣、椰子核粉、椰肉颗粒（copra pellet）、棕榈仁粉（palm kernel meal）、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨木（aspen wood）、杨木（poplar wood）、能源甘蔗、废纸、木屑、农林业废料、工业废料、废纸、和作物残茬、其他草和其他木材。在一些方面，生物质为木质纤维素材料。
通常，含纤维素的材料还包含半纤维素。例如，未加工或部分加工的材料通常含有半纤维素。在一些方面，本文公开的用于降解含纤维素的材料的任意一种方法还可以包括，将含纤维素的材料与一种或多种半纤维素酶接触。
用于降解含纤维素的材料的方法任意一种，包括将含纤维素的材料与含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种选自Cb1952多肽，Cb1953多肽，Cb1954多肽，Cb1946多肽，Cb629多肽，或Cb486多肽的多肽的组合物接触，还包括将含纤维素的材料与一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、或六种SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37的重组多肽接触。一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽，以及SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37的重组多肽的组合物接触。一方面，本文提供用于降解含生物质的材料的方法，包括将含纤维素的材料与含SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽和SEQ IDNOs:3,7,13,19,27,33,和37的重组多肽的组合物接触，并在支持纤维素降解的条件的下，孵化该多肽和含生物质的材料。
本文公开的用于降解含纤维素的材料的任意一种方法包括，在支持重做核酸表达的条件的培养基中，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞包含编码本文公开的一种、两种、三种、四种、五种、或六种重组多肽的一种、两种、三种、四种、五种、或六种重组核酸，该一种、两种、三种、四种、五种、或六种重组多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽，该方法还包括，将含纤维素的材料与一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、或六种或多种SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37的重组多肽接触。一方面，用于降解含纤维素的材料的方法包括，将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽，以及SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37的重组多肽的重组核酸。一方面，本文提供用于降解含生物质的材料的方法，包括将含纤维素的材料与宿主细胞接触，其中宿主细胞包含编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽和SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37重组多肽的重组核酸；并在支持纤维素降解的条件下，孵化该宿主细胞和含生物质的材料。
一些方面，可以在高温下进行本文中公开的、用于降解含纤维素的材料的任意一种方法。一些方面，可以在约50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃的温度下，进行本文公开的、用于降解含纤维素的材料的任意一种方法。一些方面，可以在至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14,16,18,20,22,或24小时内，约50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃的温度下，进行本文公开的、用于降解含纤维素的材料的任意一种方法。如果在高温下进行本文公开的、用于降解含纤维素的材料的方法，且使用表达本文公开的重组多肽的宿主细胞，那么在一些方面，该宿主细胞为嗜热生物。
用于降低预处理的生物质混合物的粘度方法
本文进一步提供用于降低预处理的生物质的粘度的方法。
用于降解成分糖或低聚糖的生物质可以包括高浓度的木质素，其能够阻止生物质的纤维素成分的水解。通常，对生物质进行例如，高温和/或高压处理，以增加纤维素成分的水解的可能性。其他预处理包括，但不限于，氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆炸、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理，或它们的组合。但是，预处理通常导致高粘度的生物质混合物。预处理的生物质混合物的高粘度可增加处理预处理的生物质的难度，并且它同样影响预处理的生物质的有效的水解。有利地，在进一步降解生物质前，本文公开的重组多肽可用于降低预处理的生物质混合物的粘度。
因此，本发明的某些方面涉及降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，通过将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文公开的一种或多种重组多肽的组合物接触，其中该一种或多种多肽选自一种或多种纤维素酶、半纤维素酶、和能增强纤维素和/或半纤维素的酶水解的多肽；并在足以降低预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。
本发明的某些方面涉及降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文中公开的一种或多种重组多肽的组合物接触，其中该一种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文中公开的两种或多种重组多肽的组合物接触，其中该两种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文中公开的三种或多种重组多肽的组合物接触，其中该三种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文中公开的四种或多种重组多肽的组合物接触，其中该四种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文中公开的五种或多种重组多肽的组合物接触，其中该五种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有本文中公开的六种或多种重组多肽的组合物接触，其中该六种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。
另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有一种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有两种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有三种或多种SEQ IDNOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有四种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有五种或多种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。另一方面，本发明包括降低预处理的生物质混合物的粘度的方法，将具有初始粘度的预处理的生物质混合物与含有六种SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的重组多肽的组合物接触，并在足以降低该预处理的生物质混合物的初始粘度的条件下，孵化该接触的生物质混合物。
一些方面，所述方法可作为预处理过程的一部分进行。该预处理过程可以包括额外的步骤：在预处理生物质的步骤后，将含有本文公开的一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种多肽的组合物添加至预处理的生物质混合物，其中该一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种多肽选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽；并在足以降低该混合物的粘度的条件下，用多肽孵化该预处理的生物质。可以在混合物的温度高的时候，或者当混合物的温度已经降低时，将多肽或组合物加入预处理的生物质混合物中。在一些方面，该方法在进行预处理的同一的容器（container）中进行。在其他方面，该方法可以在与进行预处理的分离开的容器中进行。
在一些方面，该方法在高盐存在下进行，例如含有饱和浓度的盐的溶液，含有氯化钠（NaCl）的溶液，浓度至少为或约为0.1M,0.2M,0.3M,0.4M,0.5M,1M,1.5M,2M,2.5M,3M,3.5M,或4M的氯化钠，或者含有氯化钾（KCl）的溶液，浓度约为0.1M,0.2M,0.3M,0.4M,0.5M,1M,1.5M,2M,2.5M3.0M或3.2M的氯化钾和/或离子液体，例如1,3-二甲基磷酸二甲酯（[DMIM]DMP）或[EMIM]OAc，或者该方法在一种或多种去污剂的存在下进行，例如离子型去污剂（例如SDS,CHAPS），巯基试剂，例如约0至1M之间的饱和硫酸铵或硫酸铵。在一些方面，该方法可以在约50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,或90℃的温度下进行。在一些方面，该方法可以在宽广的温度范围内进行，例如约20-50℃，25-55℃，30-60℃，40-80℃，60-80℃，60-100℃。在一些方面，该方法可以在宽广的pH范围进行，例如，约4.5-8.75的pH，大于7的pH，或8.5pH，或至少为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5的pH。
本文公开的用于降低预处理过的生物质混合物的粘度的任意一种方法包括，将预处理过的生物质混合物与含有选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种多肽的组合物接触，该方法还可以包括将该预处理过的生物质混合物与一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、或六种SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37重组多肽接触。一方面，用于降低预处理过的生物质混合物的粘度的方法包括，将预处理过的生物质混合物与含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113重组多肽以及SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37重组多肽的组合物接触。一方面，文中提供用于降低预处理过的生物质混合物的粘度的方法，包括将预处理的生物质混合物与含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113重组多肽和SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37重组多肽的组合物接触，并孵化该多肽，以降低预处理过的生物质混合物的粘度。
将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法
本文进一步提供用于将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法。一方面，用于将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括步骤：A）将含纤维素的材料与含有选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种多肽的组合物接触；B）在支持纤维素降解的条件下，用含有一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种多肽的组合物孵化该含纤维素的材料，以获得糖；和C）在足以产生发酵产物的条件下，用发酵微生物培养该糖。
另一方面，用于将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括步骤：A）将含纤维素的材料与含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113多肽的组合物接触；B）在支持纤维素降解的条件下，用含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113多肽的组合物孵化该含纤维素的材料，以获得糖；和C）在足以产生发酵产物的条件下，用发酵微生物培养该糖。
本文中公开的用于将含纤维素的材料转化为发酵产物的任意一种方法还可以包括，将预处理的生物质混合物与一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种、或六种SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37重组多肽接触。一方面，用于将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括，将含纤维素的材料与含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113重组多肽和SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37的重组多肽的组合物接触。一方面，文本提供用于将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法，包括步骤：A）将含纤维素的材料与含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113重组多肽以及SEQ ID NOs:7,13,19,27,33,和37重组多肽的组合物接触；B）在支持纤维素降解的条件下，用含有SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,113,7,13,19,27,33,和37的多肽的组合物孵化该含纤维素的材料，以获得糖；和C）在足以产生发酵产物的条件下，用发酵微生物培养该糖。
可从含纤维素的材料的降解获得的糖包括，但不限于，葡萄糖、纤维二糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡糖醛酸和甘露糖。
由从含纤维素的材料的降解获得的糖制备的发酵产物包括，但不限于，乙醇，正丙醇，正丁醇，异丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-戊醇，辛醇。
发酵生物包括，但不限于，酵母菌属。
联合生物加工的方法
本文进一步提供了通过联合生物加工将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法。联合生物加工将酶的产生，生物质的水解，和生物燃料的生产结合至单一步骤中。一方面，通过联合生物加工将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括步骤：A）在足以支持核酸表达的条件下，将含纤维素的材料与具有重组核酸的细胞接触，其中该重组核酸编码选自Cb1952多肽、Cb1953多肽、Cb1954多肽、Cb1946多肽、Cb629多肽、或Cb486多肽的一种、两种、三种、四种、五种、六种或多种多肽，且编码一种或多种多肽的一种或多种重组核酸参与产生生物燃料的生化过程；B）在支持纤维素降解和发酵的条件下，用表达重组核酸的细胞孵化该含纤维素的材料，以产生发酵产物。
另一方面，通过联合生物加工将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括步骤：A）在足以支持核酸的表达的条件下，将含纤维素的材料与具有编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,和113的多肽的重组核酸的细胞接触，且编码一种或多种多肽的一种或多种重组核酸参与用于产生生物燃料的生化过程；B）在支持纤维素降解和发酵的条件下，用表达重组核酸的细胞孵化该含纤维素的材料，以产生发酵产物。
另一方面，通过联合生物加工将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括步骤：A）在足以支持核酸的表达的条件下，将含纤维素的材料与具有编码SEQ ID NOs:46,76,100,106,111,113,7,13,19,27,33,和37的多肽的重组核酸的细胞接触，编码一种或多种多肽的一种或多种重组核酸参与用于产生生物燃料的生化过程；B）在支持纤维素降解和发酵的条件下，用表达重组核酸的细胞孵化该含纤维素的材料，以产生发酵产物。
由从含纤维素的材料的降解获得的糖制备的发酵产物包括，但不限于，乙醇，正丙醇，正丁醇，异丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-戊醇，辛醇。
多肽的浓度
在某些实施例中，本发明的多肽具有底物，每种多肽中底物的浓度至少为0.01nM。在某些实施例中，多肽具有底物，每种多肽的底物浓度至少为0.1nM。在某些实施例中，多肽具有底物，每种多肽的底物浓度至少为1nM。在某些实施例中，多肽具有底物，每种多肽的底物浓度至少为10nM。在某些实施例中，多肽具有底物，每种多肽的底物浓度至少为0.1μM。在某些实施例中，多肽具有底物，每种多肽的底物浓度至少为10μM。在某些实施例中，多肽具有底物，每种多肽的底物浓度至少为100μM。
耐热纤维素酶与耐热半纤维素降解酶的结合
在一些方面，本发明的耐热纤维素降解酶与耐热半纤维素酶一起提供。耐热半纤维素酶可以与本发明的耐热纤维素降解酶一起提供，以提高对含有纤维素和半纤维素的材料的降解，例如来自陆生植物的生物质。
一些方面，当本发明的纤维素酶的混合物与半纤维素酶的混合物结合时，表现出令人惊讶的协同效应。在一些实施例中，当含有多种纤维素酶的混合物与含有多种半纤维素酶的混合物结合成混合物（cocktail）时，与没有与含有多种半纤维素酶结合的纤维素酶的混合物相比，该酶的混合物具有更大的纤维素酶的活性。同样，在一些实施例中，当含有多种半纤维素酶的混合物与含有多种纤维素酶的混合物结合成混合物时，与没有与含有多种纤维素酶的混合物结合的半纤维素酶的混合物的活性相比，其具有更大的半纤维素酶活性。因此，本文中提供的纤维素酶和半纤维素酶混合物可具有令人惊讶的协同效应，其中当每种酶的混合物与另一种酶的混合物结合时，比仅具有一种底物的任意一种酶的混合物具有更大的活性。
耐热半纤维素酶可从能够降解半纤维素的生物获得。一方面，可以从能降解纤维素的生物直接分离出耐热半纤维素酶。另一方面，可通过使用宿主细胞和含有编码耐热半纤维素酶的基因表达载体，重组产生耐热半纤维素酶。耐热半纤维素酶和/或编码耐热半纤维素酶的基因可从能够降解半纤维素的各种生物分离得到，该各种生物例如，但不限于，古细菌，细菌，真菌和原生动物生物。
一些方面，耐热半纤维素酶为涉及C.bescii的耐热半纤维素酶的重组多肽。在一些方面，耐热半纤维素酶包括任意一种SEQ ID NOs:3,7,13,19,27,33,和37的氨基酸序列。在一些方面，编码耐热半纤维素酶的多核苷酸包含任意一种SEQ ID NOs:4,8,14,20,28,34,和38的核酸序列。
半纤维素酶的酶活性的协同作用
在某些实施例中，本发明的酶设置为酶的混合物，其中一起提供两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162，以降解半纤维素或半纤维素衍生底物。在某些实施例中，与单个酶的活性相比，酶的协同功能和两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的结合能更有效地降解半纤维素，及从半纤维素释放单糖。类似地，在某些实施例中，具有三种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有一种或两种酶的混合物对降解半纤维素及从半纤维素释放单糖更有效。在某些实施例中，具有四种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有一种、两种、或三种酶的混合物对降解半纤维素及从半纤维素释放单糖更有效。在某些实施例中，具有五种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有一种、两种、三种、或四种酶的混合物对降解半纤维素和从半纤维素释放单糖更有效。在某些实施例中，具有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有一种、两种、三种、四种、或五种酶的混合物对降解半纤维素和从半纤维素释放单糖更有效。
在其他实施例中，具有两种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有等量的酶单位、但仅具有一种酶的酶的混合物对半纤维素酶的降解以及从半纤维素释放单糖更有效。在其他实施例中，具有三种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有等量的酶单位、但仅具有一种或两种酶的混合物对半纤维素酶的降解以及从半纤维素释放单糖更有效。在其他实施例中，具有四种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有等量的酶单位、但仅具有一种、两种、或三种酶的混合物对半纤维素酶的降解以及从半纤维素释放单糖更有效。在其他实施例中，具有五种或多种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有等量的酶单位、但仅具有一种、两种、三种、或四种酶的混合物对半纤维素酶的降解以及从半纤维素释放单糖更有效。在其他实施例中，具有全部六种酶Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的酶的混合物比具有等量的酶单位、但仅具有一种、两种、三种、四种或五种酶的混合物对半纤维素酶的降解以及从半纤维素释放单糖更有效。
半纤维素和含半纤维素的材料的处理方法
上述半纤维素酶和变体可单独使用或结合使用，以通过从木糖骨架裂解一个或多个官能团，形成裂解的半纤维素，来分解半纤维素。
利用本发明的方法处理的半纤维素可以至少91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%被降解。当酶裂解存在于半纤维素内的亚基之间的键（linkage）时，半纤维素底物被降解。除了其他官能团和烃，降解产物可包括木糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸，乙酰基。
一方面，利用一种或多种上述酶，例如Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162处理含有半纤维素的植物材料或分离出的半纤维素。在一个实施例中，用Cb193结合包括Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162的一种或多种酶处理半纤维素。在一个实施例中，用Cb195结合包括Cb193,Cb1172,Cb909,Cb2487,和Cb162的一种或多种酶处理半纤维素。
不希望被理论束缚，申请人相信本发明的方法通过以下机理降解半纤维素。用内切木聚糖酶Cb193,Cb195或变体处理半纤维素，裂解木糖骨架中的β-1,4-木糖键，以在β-1,4-键内产生短键木糖。用α-L-阿拉伯呋喃糖酶Cb1172或变体处理半纤维素，从纤维素的木糖骨架或从支链或脱支阿拉伯多糖裂解阿拉伯糖基团，从而只产生阿拉伯糖。用α-葡萄糖醛酸酶Cb909或变体处理半纤维素，裂解4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸和木糖骨架的β-1,4-木糖苷键（β-1,4-xylosidic linkage）之间的α-1,2-糖苷键。用β-木糖苷酶Cb2487或变体处理半纤维素，裂解木糖骨架内的β-1,4-木糖苷键。用Cb162或变体处理半纤维素，裂解半纤维素内的乙酰基侧链与木糖之间的键，以使其他半纤维素酶比如木聚糖酶和β-木糖苷酶更容易进入木聚糖骨架。相信使用两种或多种酶的结合可提供协同效果的半纤维素降解活性。
在某些实施例中，可利用一种或多种分离或重组多肽处理含有半纤维素的植物材料或分离的半纤维素，该一种或多种分离或重组多肽包括与Cb193,Cb195,Cb1172,Cb2487,Cb909,和Cb162具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或更多，或完全（100%）的序列一致性/序列相似性的氨基酸序列。
可以单独或作为组合物直接施加该多肽。
在本发明的其他方法中，通过与分泌包含Cb193、Cb195、Cb1172、Cb2487、Cb909、和Cb162的一种或多种多肽的转基因宿主细胞接触来降解半纤维素。在一些实施例中，该转基因宿主细胞可以是大肠埃希氏菌属（Escherichia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、变形杆菌属（Proteus）、青枯雷尔氏菌属（Ralstonia）、链霉菌属（Streptomyces）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳球菌属、杆菌属、酿酒酵母属（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母菌属（Schizosaccharomyces pombe）、解脂耶氏酵母属（Yarrowia lipolytica）、汉逊酵母属（Hansenula polymorpha）、乳酸克鲁维酵母属（Kluyveromyces lactis）、巴斯德毕赤酵母属（Pichia pastoris）、曲霉属（Aspergillus）、金孢子菌属（Chrysosporiumlucknowense）、或里氏木霉属（Trichoderma reesei）。在一些实施例中，该转基因宿主细胞可以是嗜热微生物。在一个实施例中，该嗜热宿主细胞为Caldicellulosiruptor bescii。
该转基因宿主细胞可以包括编码Cb193,Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487,Cb162或其变体的载体。在一些实施例中，仅利用Cb193或其变体，或一种或多种Cb195,Cb1172,Cb909,Cb2487,Cb162的结合或其变体处理来降解半纤维素。在一些实施例中，仅利用Cb195或其变体，或一种或多种Cb193,Cb1172,Cb909,Cb2487,Cb162的结合或其变体处理来降解半纤维素。
可使用任何含有半纤维素的植物材料实施本发明的方法。适用于本发明的方法的植物材料包括芒草（Miscanthus）、柳枝稷（switchgrass）、大米草（cord grass）、黑麦草（rye grass）、草芦（reed canary grass）、象草（elephant grass）、芦苇（common reed）、小麦秸秆（wheat straw）、大麦秸秆（barley straw）、油菜秸秆（canola straw）、燕麦杆(OatStraw)、玉米秸秆（corn stover）、大豆秸秆（soybean stover）、燕麦壳（oat hull）、高粱、稻壳、黑麦壳（rye hull）、小麦壳、蔗渣、玉米纤维、干酒糟及其可溶物（Distillers DriedGrains with Solubles，DDGS）、蓝茎（Blue Stem）、玉米芯、松木、桦木、柳木、山杨（aspen）、杨木（poplar wood）、和能源甘蔗。该方法也可以对分离的纤维素进行。
在某些实施例中，本发明的嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为0.01nM。在某些实施例中，嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为0.1nM。在某些实施例中，嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为1nM。在某些实施例中，嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为10nM。在某些实施例中，嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为0.1μM。在某些实施例中，嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为10μM。在某些实施例中，嗜热酶具有底物，每种酶中底物的浓度至少为100μM。
本发明的方法可以在任意pH和纤维素可以降解的温度下进行，但是，在某些实施例中，本发明的方法在约5-7的pH，在约60-80℃的温度下进行。
耐热半纤维素降解酶与耐热纤维素酶的结合
在一些实施例中，本发明的耐热半纤维素降解酶与耐热纤维素酶一起提供。纤维素酶为可以降解纤维素的酶，它们包括，但不限于，外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、和β-葡糖糖苷酶。在一些方面，耐热纤维素酶在高于55℃的温度下具有最佳酶活性。耐热纤维素酶可以与本发明的耐热半纤维素降解酶一起提供，以增加含纤维素和半纤维素材料的降解，例如来自陆生植物的生物质。例如，但不限于，一方面，可以提供表达本发明的半纤维素降解酶和耐热纤维素酶的微生物。一方面，含有本发明的半纤维素降解酶的组合物也可以含有耐热纤维素酶。在其他方面，提供降解生物质、将生物质转化为发酵产物、和将生物质转化为燃料的方法，其中，生物质与本发明的半纤维素降解酶以及耐热纤维素酶接触。
耐热纤维素酶可以从能够降解纤维素的生物获得。一方面，耐热纤维素酶直接从能够降解纤维素的生物获得。另一方面，通过使用宿主细胞和含有编码耐热纤维素酶的基因的表达载体，重组制得耐热纤维素酶。耐热纤维素酶和/或编码耐热纤维素酶的基因可以从能够降解纤维素的各种生物中分离出，各种生物为例如，但不限于，古细菌，细菌，真菌和原生动物生物。
能够降解半纤维素的生物包括，例如，但不限于产液菌属、杆菌属、红嗜热盐菌属（Rhodothermus）、嗜热裂孢菌属、热袍菌（Thermotoga）、厌氧纤维素菌属（Anaerocellum）、硫化叶菌属（Sulfolobus）、火球菌属（Pyrococcus）和热解纤维素菌属（Caldicellulosiruptor）。在大肠杆菌中产生的风产液菌的重组耐热内切葡聚糖酶在80℃，pH7.0时表现出最大的活性，在100℃的半衰期为2h(Kim JS,Lee YY,Torget,RW.(2001).Cellulose hydrolysis under extremely low sulfuric acid and high-temperature conditions.Appl.Biochem.Biotechnol.91-93.331-340))。由厌氧纤维素菌thermophilum和Caldicellulosiruptor saccharolyticus产生的内切葡聚糖酶由两种催化区构成的多域的酶，该两个催化区连接至脯氨酸-苏氨酸丰富区的碳水化合物结合域（Zverlov V,Mahr S,Riedel K,Bronnenmeier K(1998a),“Properties and genestructure of a bifunctional cellulolytic enzyme(CelA)from the extremethermophile′Anaerocellum thermophilum′with separate glycosyl hydrolasefamily9and48catalytic domains,”Microbiology144(Pt2):457-465;Te′o VS,Saul DJ,Bergquist PL(1995),“celA,another gene coding for a multidomain cellulase fromthe extreme thermophile Caldocellum saccharolyticum,”Appl MicrobiolBiotechnol43:291-296;Saul et al.1990）。红嗜热盐菌属marinus的重组内切葡聚糖酶具有的最佳pH为6.0-7.0，最佳温度为100℃（Halldórsdóttir S,Thórólfsdóttir ET,Spilliaert R,Johansson M,Thorbjarnardóttir SH,Palsdottir A,Hreggvidsson GO,Kristjánsson JK,Holst O,Eggertsson G.(1998),“Cloning,sequencing andoverexpression of a Rhodothermus marinus gene encoding a thermostablecellulase of glycosyl hydrolase family12,”Appl Microbiol Biotechnol49:277-284）。高温好氧菌Thermus caldophilus也产生内切葡聚糖酶，其与纤维二糖和纤维三糖产物在CMC表现高活性（Kim D,Park BH,Jung B-W,Kim M-K,Hong SI,Lee,DS(2006)Identification and molecular modeling of a family5endocellulase from Thermuscaldophilus GK24,a cellulolytic strain of Thermus thermophilus.Int J MolSci7:571-589）。耐热纤维素酶也来自于枯草芽孢杆菌属（Mawadza,C,Hatti-Kaul,R.,Zvauya,R.and Mattiasson,B.,2000.Purification and characterization ofcellulases produced by two Bacillus strains.J.Biotechnol.83,pp.177-187），来自激烈火球菌（Kengen,S.,Luesink,E.,Stams,A.and Zehnder,A.,1993.Purification andcharacterization of an extremely thermostable β-glucosidase from thehyperthermophilic archaeon Pyrococccus furiosus.Eur.J.Biochem.213,pp.305-312），来自掘越氏热球菌（Pyrococcus horikoshi）（Ando,S.,Ishida,H.,Kosugi,Y.andIshikawa,K.,2002.Hyperthermostable endoglucanase from Pyrococcushorikoshi.Appl.Environ.Microbiol.68,pp.430-433），来自红嗜热盐菌属marinus（Hreggvidsson,GO.,Kaiste,E.,Hoist,O.,Eggertsson,G.,Palsdottir,A.andKristjansson,J.K.,1996.An extremely thermostable cellulase from thethermophilic eubacterium Rhodothermus marinus.Appl.Environ.Microbiol.62,pp.3047-3049.），来自热袍菌maritema（Bronnenmeier,K.,Kern,A.,Libel,W.andStaudenbauer,W.,1995.Purification of Thermatoga maritema enzymes for thedegradation of cellulose materials.Appl.Environ.Microbiol.61,pp.1399-1407.），来自热袍菌neapolitana(Bok,J.,Goers,S.and Eveleigh,D.,1994.Cellulase andxylanase systems of Thermatoga neapolitana.ACS Symp.Ser.566,pp.54-65;Bok,J.,Dienesh,A.,Yernool,D.and Eveleigh,D.,1998.Purification,characterization andmolecular analysis of thermostable cellulases CeIA and CeIB from Thermatoganeapolitana.Appl.Environ.Microbiol.64,pp.4774-4781.)。
在一些方面，该耐热纤维素酶为任意的Cb1952,Cb1953,Cb1954,Cb1946,Cb629,或Cb486多肽。
在一些方面，本文提供的半纤维素酶的混合物或半纤维素酶与纤维素酶的混合物还可以有Cb1581多肽。
额外的应用
本文描述的方法可以与用于将木质纤维素材料转化为生物燃料的其他方法结合使用。
例如，植物材料可经受预处理，包括氨纤维膨胀（AFEX）、蒸汽爆炸、用碱性水溶液处理、用酸性溶液处理、用有机溶剂处理、用离子液体（IL）处理、用电解水处理、以及用磷酸处理，或它们的组合。从该植物材料去除木质素的预处理可以增加从半纤维素释放的糖的总量。
在某些实施例中，其中纤维素酶混合物用于从植物细胞壁中释放葡萄糖，本发明的半纤维素酶酶的混合物可用于水解该植物材料中的半纤维素成分，并增加纤维素酶的混合物进入植物材料的纤维素成分的可能性。
通常，本发明的组合物和方法用于产生生物燃料或特定的化学品。一方面，本发明的该组合物和方法用于将半纤维素降解为可发酵的糖。然后该可发酵的糖转化为生物燃料成分，例如乙醇、丙醇和丁醇，或者特定的化学品，例如酮和醛。该可发酵的糖可以通过微生物，例如酵母，或者通过分离的酶进行转化。
本文中描述的半纤维素相关的方法可以结合纤维素实施。提供额外的方法，用于作为饲料添加剂的多肽和组合物，该饲料添加剂用于包括猪和家禽生产的单位动物农业。
实施例
以下实施例仅用于解释，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：内切木聚糖酶Cb193（SEQ ID NOs:3和4）
内切木聚糖酶Cb193被确定在Caldicellulosiruptor bescii中。该酶是Cb193的基因产物，其中Cb代表C.bescii。该内切木聚糖酶任意地裂解半纤维素的木糖骨架，以在β-1,4-键上产生木糖的短键。这些低聚木糖可以包括两个或多个糖亚基。Cb193蛋白质为671个氨基酸长，具有77.7kDa的分子量（His-标签+截短Cb193蛋白质）。该蛋白质具有两个假定的碳水化合物结合模块（CBM），该碳水化合物结合模块插入糖苷水解酶（GH）族10催化域内（见图2A）。
Cb193的克隆
利用iProof HF DNA聚合酶（BIO-RAD），从Caldicellulosiruptor bescii染色体组DNA，PCR扩增用于Cb193的基因。利用以下引物对扩增Cb193：
Cb193正向
5’-GACGACGACAAGATGAACTTTGAAGGAAGAGAC-3’(SEQ ID NO:134)
Cb193反向
5’-GAGGAGAAGCCCGGTTATTTT TTAGCCTTTAC-3’(SEQ ID NO:135)
聚合酶链反应混合物包含：
PCR反应
为了扩增来自染色体组DNA的基因，使用以下PCR循环：
PCR程序
在上述PCR扩增之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳确认Cb193基因的扩增。然后向纯化的PCR产物中加入T4DNA聚合酶（Novagen），以产生兼容的突出（overhangs）。
在在反应之后，用pET46 Ek/LIC载体来进行以下退火反应。
在孵化之后，将EDTA加入反应中。
通过电穿孔将Cb193-pET46 Ek/LIC的退火混合物引入E.coli JM109，并将细胞涂在LB氨卡青霉素平板上。在37℃下孵化过夜之后，选择三种菌落，用于接种10mL的LB氨卡青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并对细胞培养液进行小量提取。然后在1%的琼脂糖凝胶上对质粒进行电泳，以确定质粒/插入DNA的尺寸。接着，通过核苷酸测序确定基因的完整性。
为了基因的表达，通过热休克法将一个质粒转化至E.coli BL21密码子和DE3RIL，并将其涂在LB板上，在37℃下孵化过夜，其中LB板添加了100μg/ml氯霉素和50μg/ml氨苄青霉素。将五至六个菌落接种至3mL的LB培养基中，该LB培养基添加了两种相同浓度的抗生素，并培养4小时。将1mL的该培养液加入500mL的LB培养基中，该LB培养基添加了两种相同浓度的抗生素，并在37℃下培养，直至在600nm处的吸光率达到～0.25。随后将加入诱导剂IPTG，使其最终浓度0.5mM，并在16℃下继续培养过夜。
蛋白质的纯化
离心培养液，以收集细胞沉淀。该沉淀随后悬浮在裂解液中（50mM Tris-HCL pH7.5, 300mM of NaCl）。随后通过弗氏细胞压碎器释放细胞中的蛋白质。在离心分离以沉淀细胞碎片后，将上清液施加至带电钴树脂（TALON,Clontech），并清洗多次，以去除未结合的蛋白质。随后用洗脱缓冲液将结合蛋白质（6个组氨酸标记的Cb193）从树脂中洗脱出来，该洗脱缓冲液由添加了150mM咪唑的裂解液组成。
Cb193的基因产物表达为截短形式。移除代表信号肽的前41个氨基酸。在天然生物C.bescii中，该信号肽便于Cb193运输出细胞，从而在培养基中，它不能作为目标底物（木聚糖或植物蛋白壁）。通常在运输出细胞之后，该信号肽切断（切割）该蛋白质。信号肽通常在重组蛋白的生产的过程中成为一个问题。为了避免这个潜在的问题，即防止蛋白质分泌至周质中，PCR引物设计为去除该信号肽。该信号肽不会影响催化活性。PCR引物的设计同样确保蛋白质融入在质粒中编码的6个组氨酸。该六个组氨酸将结合至带电镍树脂或带电钴树脂。可使用含有咪唑的缓冲液从树脂中去除结合蛋白质。该方法便于快速纯化感兴趣的蛋白质。
Cb193（氨基酸序列）
SEQ ID NO:3公开了Cb193[内切-1,4-β-木聚糖酶前体(EC3.2.1.8)]氨基酸序列。去除与SEQ ID NO:3的1-41号氨基酸对应的信号蛋白，以创建Cb193蛋白质表达载体。因此，表达的Cb193蛋白质不包含SEQ ID NO:3的1-41号氨基酸。SEQ ID NO:37中公开了不具有信号肽的Cb193蛋白质的氨基酸序列。
Cb193（核苷酸序列）
SEQ ID NO:4中公开了Cb193核苷酸序列。SEQ ID NO:4的1-123号核苷酸与Cb193的信号肽对应，并且没有存在于用于克隆制造Cb193的基因中。SEQ ID NO:38中公开了不具有前123个核苷酸的Cb193基因，其编码SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
用于Cb193的基因克隆至质粒pET46Ek/LIC的程序导致基因融合入短核苷酸序列中，该核苷酸序列编码含有六个组氨酸的肽。该短肽包括SEQ ID NO:6的前15个氨基酸。编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
Cb193表达在E.coli细胞中，且该蛋白通过三步来纯化（TALON亲和层析、离子交换色谱法、及凝胶过滤）。图2B展示了纯化的Cb193的SDS-PAGE。分子标记为道标记M。
酶的活性
根据Morag,E.,Bayer,E.A.,和Lamed,R的方法测定Cb193的酶活性（Relationshipof cellulosomal and non-cellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum tocellulose degrading enzymes.J.Bacteriol.1990:172;6098-6105）。将1μL的样品上清液（与酶反应的底物）在TLC板上点样。通过结合每种0.2μL的1%的木糖/木二糖/木三糖/木四糖/木五糖制备标记混合物。从Megazyme处购买所有的糖。干燥样点，并且将TLC在展开罐内展开1小时。将该板在室内干燥30分钟。用显色剂喷射板并在75℃孵化5至10分钟以显示结果。
图2C展示了使用TLC分析的Cb193在天然底物上的酶活性。测试各种底物：可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、燕麦木聚糖（OSX）、桦木木聚糖（BWX）、羧甲基纤维素（CMC）、地衣多糖、葡甘聚糖、1,4β-甘露聚糖和阿拉伯聚糖。就SWAX、OSX和BWX而言，在存在Cb193(+)的情况下，释放短木糖链。在负(-)道中，没加酶，因此没有水解产物释放。X1(木糖单体)、X2(木糖二聚体或二糖)、X3(三糖)、X4(四糖)和五糖(X5)作为标记载入第一道(M)上，作为标记。结果显示该酶从复合底物(SWAX、OSX和BWX)中释放更短的链或低聚糖。
在SWAX和OSX酶水解之后，根据Lever,M的方法（A new reaction forcolorimetric determination carbohydrates.Anal.Biochem.1972:47;273-279）确定葡萄糖当量的浓度。将1.5mL的微量离心管在离心天平上“归零”。接下来，向每个管中加入5±0.1mg SWAX或OSX，测量并记录质量。根据该质量，计算需要加入每个管中的体积。以反应缓冲液为开始，向每个管中加入磷酸钠反应缓冲液和酶。该管在旋转式管混合器中，在37℃下，恒速混合孵化15小时。该管在10,000rpm下、4℃下离心5分钟。将100μL的样品上清液转移至干净的1.5mL的离心管中，用于pHBAH分析，加入150μL的柠檬酸钠反应缓冲液，最终体积为250μL。用柠檬酸缓冲液制备浓度为20mM的1mL的葡萄糖原液，然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释至以下浓度（20mM,10mM,5mM,2.5mM,1.25mM,0.625mM,0.3125mM）。50mg的pHBAH溶解于50mL的冰浴柠檬酸/氢氧化钠溶液，最终浓度为0.1%（w/v），且该溶液保持在冰中。将112.5μL的pHBAH溶液加入至37.5μL的样品和葡萄糖标准溶液中，并在100℃下孵化该管10分钟。在室温下孵化该管5分钟。检测标准和样品在410nm的波长。绘制A410nm和葡萄糖浓度和用线性回归使数据拟合成线。相关系数（R2）值为0.98-1.0。来自标准曲线的等式用于根据吸光度，计算样品还原末端的浓度。
图2E展示了还原糖测定中Cb193在天然底物上的酶活性。在该实验中，使用了不同的还原糖测定来确定从底物中释放的产物。基于已知的葡萄糖浓度和它们在对羟基苯甲酸酰肼（para-hydroxy-benzoic acid hydrazide）存在下的吸光度（显色）来制定标准(Cannet al.1999.J.Bacterial.181:1643-1651and other reference above-Laver,M.1972.)。酶与底物的培养导致产物的释放，这些产物可量化成葡萄糖当量的浓度。
图3A展示了Cb193的热稳定性。最终的5nM Cb193在70-90℃的温度范围内培养。Cb193酶在70℃,75℃,80℃,85℃,90℃的温度下培养。该培养酶在一定的时间点(0h,0.5h,1h,2h,4h,7h,11h,16h,和24h)上取出，并立即用小麦阿拉伯木聚糖（最终1%,w/v）来培养，以测定酶活性。计算出反应的最初速率。通过将每个样品的活性除以在零时间的最初活性来计算出剩余活性(%)。三个独立实验，条状以标准误差来展示。
图4展示了Cb193在小麦阿拉伯木聚糖，燕麦木聚糖和桦木木聚糖水解的动力学数据。同样指示了Km,kcat,和kcat/Km。在(A)部分，该实验是在75℃下用50mM的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)来进行的。在（B）部分中，该实验在85℃下用50mM的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)来进行的。用CB193来培养木聚糖底物（小麦阿拉伯木聚糖的最终5nM，燕麦木聚糖和桦木木聚糖的最终50nM）。计算反应的最初速率。随后对照木聚糖底物来绘制最初速率。使用Graphpad软件，通过非线性拟合来计算出Km和kcat。对于三个独立的实验，条状以标准误差来展示。
实施例2：木聚糖内切酶Cb195(SEQ ID NOs:7和8)
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种木聚糖内切酶Cb195。这种酶是Cb195的基因产物，其中的Cb代表C.bescii。该木聚糖内切酶任意地断开半纤维素的木糖主链，来在β-1,4-连接上产生更短的链。这些低聚木糖的范围可来自包含两个或更多的糖单元。该Cb195蛋白为351个氨基酸长，并具有41.9kDa(组氨酸标签+Cb195蛋白)的分子量（图2）。
Cb195的克隆
使用iProof高频DNA聚合酶，通过PCR来从Caldicellulosiruptor bescii基因组DNA处扩增Cb195基因(BIO-RAD)。
聚合酶链反应混合物包含以下物质：
PCR反应
为了从基因组DNA处扩增基因，使用以下PCR循环。
PCR协议
在上述的PCR扩增之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认Cb195基因的扩增。随后将T4DNA聚合酶（载体）加入纯化的PCR产物中，以产生相容的突出。
在反应之后，用pET46Ek/LIC载体来进行以下的退火反应。
在孵化之后，将EDTA加入反应中。
将Cb195-pET46Ek/LIC的退火混合物通过电穿孔引入E.coli JM109，并该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃下培养过夜后，选择三个菌落接种至10mL的LB-氨氨苄青霉素培养液中。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从细胞培养液中小量制备质粒。随后在1%的琼脂糖胶中经过电泳来确定质粒/插入DNA的尺寸，通过核苷酸测序来确定基因的整体性。
对于基因表达，将一种质粒通过热休克法转化到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂在用100μg/ml的氯霉素和50μg/ml的氨氨苄青霉素补充的LB平板上，并在37℃下培养过夜。将5到6个群落接种到3ml的LB培养液中，该LB培养液用两种相同浓度的抗生素来补充，并培养4小时。将1mL的培养物加入500mL的LB培养液中，该LB培养液用两种相同浓度的抗生素来补充，并在37℃下培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.25。随后加入诱导物IPTG，使其最终浓度为0.5mM，并在16℃下连续培养过夜。
蛋白纯化
将培养液离心，来收集细胞颗粒。该颗粒随后悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCLpH7.5,300mM的NaCl)中。细胞中的蛋白通过弗氏压碎器来释放。离心制成细胞碎片之后，将上层清液应用于钴的带电树脂上（TALON,Clontech），并清洗数遍来移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质随后用洗脱液从树脂中洗脱，该洗脱液由裂解缓冲液组成，该裂解缓冲液用150mM的咪唑来补充。蛋白质通过三个步骤来纯化（TALON亲和层析，离子交换层析和凝胶过滤）。图2B展示了纯化的Cb195的SDS-PAGE。分子量标记在标记为M的道上。
SEQ ID NO:7公布了Cb195[内切-1,4-β木聚糖酶前体(EC3.2.1.8)]氨基酸序列。SEQ ID NO:8公布编码Cb195的核苷酸序列。
在蛋白质表达中，Cb195克隆到质粒pET46Ek/LIC中。SEQ ID NO:10是Cb195-pET46Ek/LIC的氨基酸序列。SEQ ID NO:10的1-15号氨基酸来自于pET46Ek/LIC质粒，并包括6个组氨酸序列以利于蛋白质纯化。SEQ ID NO:9公布了编码SEQ ID NO:10的核苷酸序列。SEQ ID NO:9的1-45号核苷酸来自pET46Ek/LIC质粒。
酶活性
根据Morag,E.,Bayer,E.A.,and Lamed,R.的方法(Relationship ofcellulosomal and non-cellulosomal xylanases of Clostridium thermocellum tocellulose degrading enzymes.J.Bacteriol.1990:172;6098-6105)测量Cb195的酶活性。将1μL上清液（底物与酶反应）在TLC平板上点样。结合各0.2μL的1%木糖/木二糖/木三糖/木四糖/木五糖制备标记混合物。所有的糖从Megazyme购买。干燥样点，并且将TLC在展开罐内展开1小时。平板在室内干燥30分钟。用显色剂喷射平板并在75℃孵化5至10分钟以显示结果。
图2D展示了用TLC分析的Cb195在天然底物上的酶活性。检测了各种底物：可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、燕麦木聚糖（OSX）、桦木木聚糖（BWX）、羧甲基纤维素（CMC）、地衣多糖、葡甘聚糖、1,4β-甘露聚糖和阿拉伯聚糖。就SWAX、OSX和BWX而言，在存在Cb195(+)的情况下，释放短木糖链。在负(-)道中，没有加入酶，因此，没有水解产物释放出来。X1(木糖单体)、X2(木糖二聚体或二糖)、X3(三糖)、X4(四糖)和五糖(X5)作为标记载入第一道(M)上。结果显示该酶从复合底物(SWAX、OSX和BWX)中释放更短的链或低聚糖。
在可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、燕麦木聚糖（OSX）酶水解后，根据Lever,M.方法(A new reaction for colorimetric determinationcarbohydrates.Anal.Biochem.1972:47;273-279)确定葡萄糖当量的浓度。将1.5ml微量离心管在分析天平上“归零”。接着，将5±0.1mg SWAX或OSX加入每个试管中，并且测量并记录质量。基于该质量计算需要加入每个试管中的体积。以反应缓冲液为开始，在每个试管中加入磷酸钠反应缓冲液和酶。该试管在Rotisserie-style试管混合器，37℃以恒速混合孵化15h。试管以4℃，10,000rpm离心5分钟。100μL样品上清液转移到干净的1.5mL离心管中用于pHBAH分析，加入150μL柠檬酸钠反应缓冲液使终体积为250μL。1mL葡萄糖储备液用柠檬酸钠缓冲液制备成浓度为20mM。然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释成以下浓度(20mM,10mM,5mM,2.5mM,1.25mM,0.625mM,0.3125mM)。50mg pHBAH溶解在50mL冰浴柠檬酸/NaOH溶液中，终浓度为0.1%(w/v)，并且溶液保持在冰上。112.5μL pHBAH溶液加入37.5μL样品和葡萄糖标准溶液中，并且在100℃孵化试管10分钟。该试管在室温下孵化5分钟。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度，并且用线性回归将数据拟合成直线。相关系数(R2)值在0.98和1.0之间。标准曲线方程用于基于样品的吸光度计算样品的还原性端的浓度。
图2E展示了来自于还原糖试验的Cb195在自然底物上的酶活性。在该实验中，用不同的还原糖试验确定从底物释放的产物。在存在对羟基苯甲酸酰肼的情况下，基于已知的葡萄糖浓度及其吸光度（显色）(Cann et al.1999.J.Bacterial.181:1643-1651and otherreference above-Laver,M.1972.)，制备标准样。酶和底物一起孵化引起产物的释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。
图3B展示了Cb195的耐热性。在范围为65～90℃的不同温度下，孵化终浓度为5nM的Cb195。在65℃,70℃,75℃和80℃孵化Cb195酶。在一些时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h、16h和24h)取出孵化的酶，并立即与小麦阿拉伯木聚糖(终浓度1%,w/v)一起孵化以测量酶活性。计算反应初始速率。通过每个样品的活性除以在零时刻的初始活性计算残余活性。柱状图展示了三个独立实验的标准误差。
图5展示了Cb195水解小麦阿拉伯木聚糖，燕麦木聚糖，和桦木木聚糖的动力学数据。也指出了Km，kcat和kcat/Km。在图5A中，该实验在75℃，50mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行。在图5B中，该实验在75℃，50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中进行。木聚糖底物（终浓度2.5-50mg/mL）与Cb195（小麦阿拉伯木聚糖终浓度为5nM，并且燕麦木聚糖和桦木木聚糖终浓度为50nM）。计算反应初始速率。该初始速率与木聚糖底物浓度对应绘制。用Graphpad软件通过非线性拟合计算Km和kcat。柱状图展示了三个独立实验的标准误差。
实施例3：
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种α-L-阿拉伯呋喃糖酶。该酶是Cb1172的基因产物。α-L-阿拉伯呋喃糖酶从木糖骨架或从支链或脱支裂解阿拉伯糖基团。该Cb1172蛋白质长度为505个氨基酸，并且分子量为59.6kDa(His标签+Cb1172蛋白质)。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族51催化域（图6D）。
克隆Cb1172
使用iProofTM High-Fidelity DNA聚合酶(BIO-RAD)通过PCR从Caldicellulosiruptor bescii DSM6725T基因组DNA中，扩增Cb1172基因。用下面的引物组扩增Cb1172基因。
Cb1172正向引物
5’-GAC GAC GAC AAG ATG AAA AAA GCA AAA GTC ATC TAC-3’(SEQ ID NO:136)
Cb1172反向引物
5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT TCT TTC TTC TTT AAC CTG-3’(SEQ ID NO:137)
聚合酶链反应混合物包含以下物质：
PCR反应
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环。
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb195基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将DNA从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于将插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μL l25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5min。
将Cb1172-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过电穿孔导入E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mLLB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液进行质粒小量提取(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小，对质粒插入片段（基因）进行测序以确定其一致性。
在基因表达中，一种正确的质粒通过热休克法转化到E.coli BL21codon plusDE3RIL中，并涂在添加了氯霉素(100μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板上，并在37℃下培养过夜。将5到6个群落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的3ml LB培养液中，并培养4小时。将1mL的培养物加入添加了两种相同浓度的抗生素的500mL LB培养液中，并在37℃下培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.25。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.01mM，并在16℃连续培养过夜。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团（cell pellet）。随后该团悬浮于裂解缓冲液(25mMTris-HCL pH7.8,750mM NaCl,5%甘油,20mM咪唑,1.25%Tween-20)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的Cb1172)随后用洗脱液(50mM Tris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。
Cb1172的基因产物以其全长的形式表达。PCR引物的设计确保该蛋白质融合至在质粒中编码的6个组氨酸。该6个组氨酸会结合到带电镍或带电钴树脂上。该绑定蛋白质可以用含有咪唑的缓冲液从树脂中取代出来。该方法便于蛋白质的快速纯化。
SEQ ID NO:13公布了Cb1172[α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)]氨基酸序列。SEQ ID NO:14公布编码Cb1172的核苷酸序列。
在蛋白质表达中，Cb1172克隆到质粒pET46Ek/LIC中。SEQ ID NO:16是Cb195-pET46Ek/LIC的氨基酸序列。SEQ ID NO:16的1-15号氨基酸来自于pET46Ek/LIC质粒，并包括6个组氨酸序列以利于蛋白质纯化。SEQ ID NO:15公布了编码SEQ ID NO:16的核苷酸序列。SEQ ID NO:15的1-45号核苷酸来自pET46Ek/LIC质粒。
Cb1172在E.coli细胞中表达，并且通过二个步骤来纯化该蛋白质，该步骤包括利用质粒编码的6个组氨酸的talon树脂纯化（固定化金属亲和层析）步骤和使用Hitrap Q柱的离子交换步骤。图6A展示了纯化的Cb1172的SDS-PAGE。
酶活性
图6B展示了来自于还原糖试验的Cb1172在天然底物上的活性。检验了五种半纤维素底物：阿拉伯聚糖（糖用甜菜）、可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、燕麦木聚糖（OSX）和脱支阿拉伯聚糖（debranched arabinan）。酶和底物一起孵化引起产物的释放，该产物以阿拉伯聚糖当量的浓度量化。阿拉伯聚糖的水解程度比其它天然底物的水解程度更高。
在对阿拉伯聚糖（糖用甜菜）、可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、燕麦木聚糖（OSX）和脱支阿拉伯聚糖（debranched arabinan）进行酶水解后，根据Lever,M.方法(A new reaction for colorimetric determinationcarbohydrates.Anal.Biochem.1972:47;273-279)确定葡萄糖当量的浓度。将1.5ml微量离心管在分析天平上“归零”。接着，将2±0.1mg阿拉伯聚糖（糖用甜菜）、SWAX、RAX、OSX和脱支阿拉伯聚糖加入每个试管中，并且测量并记录质量。基于该质量计算需要加入每个试管中的体积。以反应缓冲液为开始，在每个试管中加入柠檬酸钠反应缓冲液和酶。该试管在Thermomixer R(Eppendorf)，75℃以恒速混合孵化16h。试管以4℃，10,000rpm离心5分钟。50μL样品上清液转移到干净的1.5mL离心管中用于pHBAH分析。1mL阿拉伯糖储备液制备成在柠檬酸钠缓冲液中浓度为100mM。然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释成以下浓度(50mM,25mM,12.5mM和6.25mM)。50mg pHBAH溶解在50mL冰浴柠檬酸/NaOH溶液中，终浓度为0.1%(w/v)，并且溶液保持在冰上。150μL pHBAH溶液加入50μL样品和阿拉伯糖标准溶液中，并且试管在100℃孵化10分钟。该试管在室温下孵化5分钟。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和阿拉伯糖浓度，并且用线性回归将数据拟合成直线。相关系数(R2)值在0.98和1.0之间。标准曲线方程用于基于样品的吸光度计算样品中还原性端的浓度。
图6C展示了用HPLC分析的Cb1172在天然底物上的酶活性。检验了五种半纤维素底物：阿拉伯聚糖（糖用甜菜）、可溶性小麦阿拉伯木聚糖（SWAX）、黑麦阿拉伯木聚糖（RAX）、OSX和脱支阿拉伯聚糖。对于各种实例而言，在存在Cb1172的情况下，释放阿拉伯糖。在缺乏Cb1172的情况下，对于脱支阿拉伯聚糖，只发现少量的阿拉伯糖；其它天然多糖没有释放水解产物。结果显示该酶从复合底物(阿拉伯聚糖、SWAX、RAX、OSX和脱支阿拉伯聚糖)中释放阿拉伯糖。
图6E展示了Cb1172的耐热性。在70℃、75℃、80℃和85℃分别孵化24小时后，Cb1172具有57%、45%、35%和22%活性。50nM Cb1172保持在不同的温度（70℃、75℃、80℃、85℃和90℃）。在以下时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h、16h和24h)取出样品，并且立即实施酶活性测量。在85℃，用Cary300UV-Vis分光光度计（Varian）测量酶活性。100μl，1.25mM的pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷底物在85℃保持3分钟以进行平衡。然后将25μl蛋白质样品加入底物中并上下颠倒试管若干次，进行混合。通过分光光度计记录400nm的光密度2.5分钟。计算第一分钟的反应初始速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
图7展示了Cb1172水解pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷的动力学数据。也指出了Km，kcat和kcat/Km。在图7A中，该实验在90℃进行。在图7B中，该实验在75℃进行。100μl不同浓度的pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷底物在85℃保持3分钟以进行平衡。加入25μl蛋白质样品（50nM）至底物中并上下颠倒试管若干次，进行混合。通过Cary300紫外可见分光光度计记录400nm的光密度2.5分钟。计算第一分钟中的反应初始速率。该初始速率与pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷浓度一起绘制。用Graphpad软件通过非线性拟合计算Km和kcat。
实施例4：α-葡萄糖醛酸酶Cb909(SEQ ID NOs:19and20)
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种α-葡萄糖醛酸酶。该酶是Cb909的基因产物。该α-葡萄糖醛酸酶在木糖骨架的4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸和β-1,4-木糖苷键（β-1,4-xylosidic linkage）之间裂解α-1,2-糖苷键。
使用iProofTM High-Fidelity DNA聚合酶(BIO-RAD)通过PCR扩增Cb909基因，并用Ek/LIC Cloning Kits(Novagen)将其亚克隆至pET46Ek/LIC载体。正向(For)和反向(Rev)引物序列如下。
Cb909正向引物
5′-GAC GAC GAC AAG ATG ATT TTA TCA AGG AGC AGT AAC-3′(SEQ ID NO:138)
CB909反向引物
5′-GAG GAG AAG CCC GGT TAC GGA TAT ATT AGT CTT C-3′(SEQ ID NO:139)
PCR混合物和扩增过程如下：
PCR混合物
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb909基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将DNA从胶中提取出来。随后将T4DNA聚合酶（Novagen）加入纯化的PCR产物中，以产生兼容的突出。
在反应之后，用pET46Ek/LIC载体来进行以下的退火反应。
在孵化养之后，加入EDTA以终止退火反应。
将Cb909-pET-46Ek/LIC的退火混合物通过电穿孔导入E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择三个菌落，分别用于接种10mLLB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并对每个细胞培养液进行质粒小量提取。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒/插入片段DNA的大小。接着通过核苷酸测序确定该基因的完整性。
SEQ ID NO:19公布了Cb909(α-葡萄糖醛酸酶)氨基酸序列。SEQ ID NO:20公布编码Cb909的核苷酸序列。
在蛋白质表达中，Cb909克隆到质粒pET46Ek/LIC中。SEQ ID NO:24是Cb909-pET46Ek/LIC的氨基酸序列。SEQ ID NO:24的1-15号氨基酸来自于pET46Ek/LIC质粒，并包括6个组氨酸序列以利于蛋白质纯化。SEQ ID NO:23公布了编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列。SEQ ID NO:23的1-45号核苷酸来自pET46Ek/LIC质粒。
图8A展示了Cb909的假定域结构。图8B展示了纯化的Cb909的SDS-PAGE。
图8C展示了Cb909的活性。底物为醛糖二糖酸，是用4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸基（MeGlcA）修饰的低聚木糖混合物。与Cb909在75℃孵化了60分钟后，MeGlcA基团被Cb909从醛糖二糖酸裂解从而释放未修饰的木糖，木二糖，木三糖和木四糖作为产物。反应的条件如下：6nM Cb909，50mM磷酸缓冲液pH6.0，150mM NaCl,1mg/ml醛糖二糖酸。
图8D展示了Cb909的PH优化试验结果。在PH5.5检测到最大的活性。该试验如下进行：1mg/ml醛糖二糖酸溶液与6nM Cb909在75℃在每个PH孵化10分钟。从PH5至PH6的范围使用含有150mMNaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液。从PH6至PH7的范围使用含有150mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液。反应后，该温度快速增加至100℃以终止该反应。通过HPLC检测产物量。
图8E展示了优化温度试验的结果。在75℃检测到Cb909的最大活性（木二糖和木三糖）。在70℃生产木糖最有效，但在70℃和75℃时产生的木糖量几乎是相同的。该试验如下进行：1mg/ml醛糖二糖酸溶液与6nM Cb909在含有150mM NaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液PH5.5中孵化10分钟。反应后，该温度快速升至100℃以终止该反应。通过HPLC检测产物量。
实施例5：β-木糖苷酶Cb2487(SEQ ID NOs:27和28)
酶合剂中的另一种酶是β-木糖苷酶，从Caldicellulosiruptor bescii,Cb2487扩增出该酶。
使用iProofTM High-Fidelity DNA聚合酶(BIO-RAD)通过PCR扩增Cb2487基因，并用Ek/LIC Cloning Kits(Novagen)亚克隆至pET46Ek/LIC载体中。正向(For)和反向(Rev)引物序列如下：
Cb2487For
5’-GACGACGACAAGATGTCAATTGAAAAAAGGGTAAAC-3’(SEQ ID NO:140)
CB2487Rev
5’-GAGGAGAAGCCCGGTTATTCACACCATGCA-3’(SEQ ID NO:141)
PCR混合物和扩增过程如下：
PCR混合物
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb2487基因。随后将T4DNA聚合酶（Novagen）加入纯化的PCR产物中，以产生兼容的突出。
在反应之后，用pET46Ek/LIC载体来进行以下的退火反应。
在孵化养之后，加入EDTA以终止退火反应。
将Cb2487-pET46Ek/LIC的退火混合物通过电穿孔导入E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择三个菌落，分别用于接种10mLLB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并对每个细胞培养液进行质粒小量提取。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒/插入片段DNA的大小。接着通过核苷酸测序确定该基因的完整性。
SEQ ID NO:27公布了Cb2487(β-木糖苷酶)氨基酸序列。SEQ ID NO:28公布编码Cb2487的核苷酸序列。
在蛋白质表达中，Cb2487克隆到质粒pET46Ek/LIC中。SEQ ID NO:30是Cb2487-pET46Ek/LIC的氨基酸序列。SEQ ID NO:30的1-15号氨基酸来自于pET46Ek/LIC质粒，并包括6个组氨酸序列以利于蛋白质纯化。SEQ ID NO:29公布了编码SEQ ID NO:30的核苷酸序列。SEQ ID NO:29的1-45号核苷酸来自pET46Ek/LIC质粒。
图9A展示了Cb2487的假定域结构。图9B展示了纯化的Cb2487的SDS-PAGE。图9C展示了确定Cb2487的最优PH的生化试验。图9D展示了确定Cb2487的最优温度的生化试验。图9E展示了以pNP-β-D-吡喃木糖苷作为底物的Cb2487的动力学参数。图9F展示了通过薄层层析(TLC)分析的低聚木糖水解产物。图9G展示了Cb2487的耐热性试验。图9H展示了β-木糖苷酶(Cb2487)和α-葡萄糖醛酸酶(Cb909)的协同作用。
图9A展示了Cb2487的假定域结构。通过NCBI Conserved Domains Database搜索工具分析Cb2487的假定保守域结构。
图9B展示了纯化的Cb2487的SDS-PAGE。靠近MW的道展示了蛋白质分子量标记。道Cb2487展示了纯化的蛋白质。
纯化Cb2487
在Cb2487的纯化中，细胞团重悬浮于结合缓冲液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,pH7.5)中，然后通过EmulsiFlex C-3细胞均质机裂解细胞。裂解液在4℃，20,000×g离心20分钟以除去细胞碎片。上清液在75℃孵化30分钟并在4℃，20,000×g离心15分钟以除去热不稳定的蛋白质。通过用结合缓冲液预平衡并且在4℃孵化1h的Talon金属亲和树脂纯化加热后的上清液。用50倍柱体积的结合缓冲液洗树脂，然后用10倍柱体积的洗脱液(50mMTris-HCl,300mM NaCl,250mM咪唑,pH7.5)洗脱。聚集并用Amicon Ultra-15centrifugalfilter units(50,000MMCO)浓缩洗脱馏分，并通过3次连续浓缩和稀释循环交换至Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.5)中，然后用Hitrap Q HP柱纯化。聚集并用Amicon Ultra-15centrifugal filter units(50,000MMCO)浓缩洗脱馏分，并通过3次连续浓缩和稀释循环交换至Tris-HCl缓冲液(50mM,pH7.5,300mM NaCl)中。然后该蛋白质通过SuperdexTM200HiloadTM16/60size排斥柱用装备有UV探测器的AKTAxpress系统纯化。
图9C展示了确定Cb2487的最优PH的生化试验。对于PH最优试验，对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（para-nitrophenyl-beta-D-xylopyranoside，pNP-X，0.8mM）与Cb2487（10nM）在以下不同的缓冲液中，75℃下孵化：pH4.0-6.0(柠檬酸缓冲液,50mM,150mM NaCl),pH6.0-8.0(磷酸缓冲液,50mM,150mM NaCl),pH8.5-9.0(Tris-HCl,50mM,150mM NaCl)。
图9D展示了确定Cb2487的最优温度的生化试验。对于温度最优试验，pNP-X(0.8mM)与Cb2487（10nM）在柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中，在不同温度(40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100℃)下孵化。
图9E展示了以pNP-β-D-吡喃木糖苷作为底物的Cb2487的动力学参数。对于图9EA，动力学参数在90℃,pH6.0确定。对于图9EB，动力学参数在75℃，pH6.0确定。对于这些试验，不同浓度的pNP-X(0.08-24mM)与Cb2487(10nM)在柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mMNaCl)中，分别在75和90℃下孵化。
图9F展示了Cb2487在低聚木糖上的水解活性。Cb2487(0.5μM)与不同的低聚木糖(X2-6)在75℃孵化15hr，然后通过TLC分离产物。
图9G展示了Cb2487的耐热性试验。Cb2487在柠檬酸盐缓冲液(pH6.0,50mM)中，不同的温度（70、75、80、85、90、95℃）下，不增加底物的情况下，孵化Cb2487，在不同的时刻(0、10min、30min、1h、3h、4,8h、12h、24h)取出该蛋白质，并且以pNP-X作为底物检验残余活性。
图9H展示了β-木糖苷酶(Cb2487)和α-葡萄糖醛酸酶(Cb909)的协同作用。醛糖二糖酸与Cb2487(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在柠檬酸盐缓冲液(PH6.0），75℃中过夜培养，然后用HPLC检验。在醛糖二糖酸中加入切掉了甲基葡糖醛酸修饰物的Cb909以释放木糖和低聚木糖。加入的Cb2487裂解存在的β-1,4-木糖苷键（β-1,4-xylosidic linkage），以释放更多木糖。两种酶的混合导致从Cb909释放低聚木糖转化为Cb2487释放木糖。
实施例6：乙酰木聚糖酯酶Cb162(SEQ ID NOs:33和34)
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种乙酰木聚糖酯酶Cb162。该酶为Cb162的基因产物，其中Cb代表C.bescii。该乙酰木聚糖酯酶裂解半纤维素中的木糖和乙酰基侧链之间的键从而使其它半纤维素酶比如木聚糖酶和β-木糖苷酶更容易进入木聚糖骨架。Cb162蛋白长度为321个氨基酸并且预测分子量为38.7kDa(组氨酸标签+Cb162蛋白质)。该蛋白质具有单个乙酰木聚糖酯酶域（图10A）。
Cb162克隆
使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptorbescii基因组DNA中扩增Cb162基因。用下面的引物组扩增Cb162基因。
Cb162-Fw
5’-GACGACGACAAGATGGTTTTTGAAATGCCACTTGAAAAG-3’(SEQ ID NO:142)
Cb162-Rv
5’-GAGGAGAAGCCCGGTTATTTTATCATCTCCATAAGATACATAAATATCTTGTC-3’(SEQ IDNO:143)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
使用Ek/LIC cloning kit(Novagen)。在存在dATP的情况下，以T4DNA聚合酶的3′至5′外切酶活性消化扩增的基因片段的两端。合成的片段通过退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
Cb162-pET46的连接混合物通过热休克法导入到E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨苄青霉素平板上，并在37℃下培养过夜。选定4个菌落接种并在10ml LB-氨苄青霉素分别孵化。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从细胞培养液提取小量质粒。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在基因表达中，将一个质粒通过热休克法转移到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂于添加了100μg/ml的氯霉素和50μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃过夜孵化。将5到6个菌落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的3ml LB培养液中，并培养4小时。将1mL的培养物加入到添加了两种相同浓度的抗生素的500mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm的吸光度达到～0.25。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃下连续过夜培养。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团（cell pellet）。随后该团悬浮于裂解缓冲液(50mMTris-HCL pH7.5,20mM咪唑,300mM of NaCl)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电镍树脂上（GE Healthcare），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的Cb162)随后用添加了250mM咪唑的裂解缓冲液组成的洗脱液从树脂中洗脱。在50mMNa2HPO4-HCl pH6.5和100mM NaCl缓冲液的条件下，通过Hiload16/20凝凝胶过滤预装柱(GE Healthcare)进一步纯化洗脱的蛋白质。
SEQ ID NO:33公布了Cb162（乙酰木聚糖酯酶）氨基酸序列。SEQ ID NO:34公布编码Cb162的核苷酸序列。
在蛋白质表达中，Cb162克隆到质粒pET46Ek/LIC中。SEQ ID NO:36是Cb162-pET46Ek/LIC的氨基酸序列。SEQ ID NO:36的1-15号氨基酸来自于pET46Ek/LIC质粒，并包括6个组氨酸序列以利于蛋白质纯化。SEQ ID NO:35公布了编码SEQ ID NO:36的核苷酸序列。SEQ ID NO:35的1-45号核苷酸来自pET46Ek/LIC质粒。
图10A展示了Cb162的域结构；该蛋白质具有乙酰木聚糖酯酶的单域。
Cb162在E.coli细胞中表达，并且利用质粒编码的6个组氨酸，通过二个步骤来纯化该蛋白质。图10B展示了纯化的Cb162的SDS-PAGE。分子标记在靠近纯化的Cb162的道上。
图10C展示了用对硝基苯酚加成酯(pNP-醋酸酯)作为底物，Cb162在不同pH的酶活性。用Synergy2微孔板检测仪（Synergy2Microplate reader，BioTek）持续地监测释放的pNP在400nm的吸光度。采用水解初始速率作为酶活性。该图展示了Cb162在pNP-醋酸酯上的pH图谱。在存在50mM柠檬酸盐-NaOH(pH4.0至6.0)或50mM Na2HPO4-HCl(pH6.0至8.0)，以及150mM NaCl的情况下，在50℃，分别检测在Cb162上的PH效果。该试验使用了0.1μM纯化的Cb162和2mM pNP-醋酸酯。
图10D展示了Cb162在pNP-醋酸酯上的温度图谱。在50mM Na2HPO4-HCl，pH7.0和150mM NaCl，40℃和75℃之间的温度以5℃间隔绘制该温度图谱。该试验使用了0.04μM纯化的Cb162和2mMpNP-醋酸酯。
图10E展示了Cb162在pNP--醋酸酯上的耐热性图谱；纯化的0.02μM Cb162在50mMNa2HPO4-HCl,pH7.0和150mM NaCl中，在60℃和80℃之间的温度以5℃间隔孵化0至24小时，并且测量残余活性。
图10F展示了Cb162的动力学研究。纯化的0.04μM Cb162在50mM Na2HPO4-HCl，pH6.0和150mM NaCl中与各种浓度的pNP--醋酸酯孵化，并且水解的初始速率绘制在图上。利用Graph Pad Prismv5.01(GraphPad软件)通过Michaelis-Menton方程式确定动力学参数。
实施例7：用含有单一类型的木聚糖内切酶的Caldicellulosiruptor bescii半纤维素酶的酶合剂水解多糖
内切木聚糖酶(Cb193)，α-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)，β-木糖苷酶(Cb2487)，α-葡萄糖醛酸酶(Cb909)，和乙酰木聚糖酯酶(Cb162)中的一种或多种酶的混合物与多糖可溶性小麦阿拉伯木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖一起孵化。对于每种底物，底物与含有内切木聚糖酶(Cb193)，α-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)，β-木糖苷酶(Cb2487)，α-葡萄糖醛酸酶(Cb909)，和乙酰木聚糖酯酶(Cb162)中的所有酶的合剂一起孵化会比底物与含有比所有的酶更少的合剂一起孵化从木聚糖中释放更多的单糖。
图11展示了C.bescii半纤维素酶水解可溶性小麦阿拉伯木聚糖(SWAX)的协同作用。SWAX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mMNaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖[图11A]和HPLC[图11B]分析。使用的半纤维素酶包括Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图12展示了C.bescii半纤维素酶水解燕麦木聚糖(OSX)的协同作用。OSX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖[图12A]和HPLC[图12B]分析。使用的半纤维素酶包括Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图13A展示了在不同的温度，用半纤维素酶合剂水解可溶性小麦阿拉伯木聚糖。SWAX(8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)，在65℃、70℃、75℃、80℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖试验。
图13B展示了在不同的温度用半纤维素酶合剂水解桦木木聚糖。BWX(8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)，在65℃、70℃、75℃、80℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖试验。
图13C展示了在不同的温度用半纤维素酶合剂水解燕麦木聚糖。OSX(8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)，在65℃、70℃、75℃、80℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中混合孵化15hr，并进行还原糖试验。
实施例8：用含有两种类型的内切木聚糖酶的Caldicellulosiruptor bescii半纤维素酶的酶合剂水解多糖
含有α-阿拉伯呋喃糖酶(Cb1172)，β-木糖苷酶(Cb2487)，α-葡萄糖醛酸酶(Cb909)，乙酰木聚糖酯酶(Cb162)和内切木聚糖酶(Cb193和Cb195)中的一种或两种的混合物与多糖可溶性小麦阿拉伯木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖一起孵化。对于每种底物，底物与含有两种内切木聚糖酶(Cb193和Cb195)的合剂一起孵化会比底物与仅含有一种内切木聚糖酶的酶合剂一起孵化从木聚糖中释放更多的单糖。
图14A展示了通过在半纤维素酶混合物中添加两种木聚糖酶（Cb195和Cb193）提高SWAX的水解。SWAX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中75℃，孵化15hr，并进行还原糖试验。在水解中使用不同的半纤维素酶混合物：混合物I)Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物II)Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物III)Cb195(0.25μM)、Cb193(0.25μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图14B展示了通过在半纤维素酶混合物中添加两种木聚糖酶（Cb195和Cb193）提高BWX的水解。BWX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中75℃，孵化15hr，并进行还原糖分析。在水解中使用不同的半纤维素酶混合物：混合物I)Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物II)Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物III)Cb195(0.25μM)、Cb193(0.25μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图14C展示了通过在半纤维素酶混合物中增加两种木聚糖酶（Cb195和Cb193）提高OSX的水解。OSX(8.0%,w/v)与不同的半纤维素酶混合物在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖分析。在水解中使用不同的半纤维素酶混合物：混合物I)Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物II)Cb193(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)；混合物III)Cb195(0.25μM)、Cb193(0.25μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb909(0.5μM)和Cb162(0.5μM)。
图15展示了用Caldicellulosiruptor bescii的半纤维素酶合剂水解可溶性小麦阿拉伯木聚糖。不同浓度的SWAX(1.0,2.0,4.0,6.0,8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。图15A展示了对照和水解混合物中的还原糖，而图15B展示了不同底物浓度下，水解混合物中计算出的还原糖与实际的平均还原糖的比较。
图16展示了用Caldicellulosiruptor bescii的半纤维素酶合剂水解桦木木聚糖。不同浓度的BWX(1.0,2.0,4.0,6.0,8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。图16A展示了对照和水解混合物中的还原糖，而图16B展示了不同底物浓度下，水解混合物中计算出的还原糖与实际的平均还原糖的比较。_
图17展示了用Caldicellulosiruptor bescii的半纤维素酶合剂水解燕麦木聚糖。不同浓度的OSX(1.0,2.0,4.0,6.0,8.0%,w/v)与Cb193(0.5μM)、Cb195(0.5μM)、Cb1172(0.5μM)、Cb2487(4μM)、Cb162(0.5μM)和Cb909(0.5μM)在75℃，柠檬酸盐缓冲液(50mM,pH6.0,150mM NaCl)中孵化15hr，并进行还原糖试验。图17A展示了对照和水解混合物中的还原糖，而图17B展示了不同底物浓度下，水解混合物中计算出的还原糖与实际的平均还原糖的比较。
实施例9：内切纤维素酶/甘露聚糖酶Cb1952
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种内切纤维素酶/甘露聚糖酶Cb1952。该酶为Cb1952的基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族9催化域（纤维素酶域）、三个家族3碳水化合物结合模块(CBM)(一个CBM3c和两个CBM3b模块)和一个GH5催化域（甘露聚糖酶域）（图18）。
系统构建缺失信号肽的野生型Cb1952蛋白质和若干去尾突变体(TM1,TM2,TM3,TM4,TM5,TM6和TM7)用于功能分析（图18）。
如图18所示，TM1含有GH9模块和三个CBM，TM2含有GH9模块和2个CBM，TM3含有GH9模块和1个CBM(CBM3c)，而TM4仅由GH9模块构成。去尾突变体TM5有连接至GH9模块的3个CBM组成，而TM6和TM7分别由CBM3c和CBM3b组成。图19中的SDS-PAGE结果显示所有的蛋白质构造都成功地表达为可溶蛋白并高度纯化。
克隆Cb1952野生型
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增Cb1952基因。用下面的引物组扩增Cb1952野生型基因：
Cb1952野生型正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCA ACA ACC TTT AACTATGGT GAA GCT C-3’(SEQ ID NO:39)
Cb1952野生型反向引物：5’-GA GGA GAA GCC CGG TTA TTC AGC ACC AAT CGCATT AGT TTT ATA CC-3’(SEQ ID NO:40)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1952TM1
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增Cb1952TM1基因。用下面的引物组扩增Cb1952TM1基因：
Cb1952TM1正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCA ACA ACC TTT AAC TAT GGTGAA GCT C-3’(SEQ ID NO:41)
Cb1952TM1反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAG CTA GTA TCT ATC TTC ACTATT CCA CTG-3’(SEQ ID NO:42)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1952TM5
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增Cb1952TM5基因。用下面的引物组扩增Cb1952TM5基因：
Cb1952TM5正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG A AT TTC AAA GCT ATC GAA AAGCCA AC -3’(SEQ ID NO:43)
Cb1952TM5反向引物：5’-GA GGA GAA GCC CGG TTA TTC AGC ACC AAT CGC ATTAGT TTT ATA CC-3’(SEQ ID NO:40)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb1952野生型、Cb1952TM1和Cb1952TM5基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen GelExtraction kit将DNA从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于使插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μL25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5分钟。
将Cb1952野生型、Cb1952TM1-或Cb1952TM5-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过化学转化方法导入E.coli NovaBlue感受态细胞中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mL LB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液中提取小量质粒(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确定该基因已经插入质粒中后，对基因进行测序以确定其一致性。选择具有正确的插入序列的质粒用于生产重组蛋白。
通过与上述步骤相似的步骤，制备Cb1952TM2,Cb1952TM3,Cb1952TM4,Cb1952TM6,和Cb1952TM7，其中具有适当的不同步骤(例如，引物序列)。
在每种酶的基因表达中，含有野生型、TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6或TM7的质粒通过热休克法转化到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂在添加了氯霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，并在37℃孵化过夜。将5到6个群落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的10mlLB培养液中，并培养6小时。将10mL培养物加入添加了两种相同浓度的抗生素的1000mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.3。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃连续培养过夜。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团（cell pellet）。对于Cb1952野生型，随后该团悬浮于裂解缓冲液(25mMTris-HCL pH7.8,750mM NaCl,5%甘油,20mM咪唑,1.25%Tween-20)中。对于Cb1952TM1，随后该团悬浮于裂解缓冲液(25mM Tris-HCL pH7.8,100mM of NaCl,10%甘油,10mM咪唑,1.25%Tween-20)中。对于其它Cb1952突变体，随后该团悬浮于不含咪唑的裂解缓冲液(50mM Tris-HCL pH7.5,300mMNaCl)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质随后用洗脱液(50mM Tris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。
PCR引物的设计确保该蛋白质融合至在质粒中编码的6个组氨酸（N端标签）。该6个组氨酸会结合到带电镍或带电钴树脂上。绑定的蛋白质可以用含有咪唑的缓冲液从树脂中替换出来。该方法便于快速纯化感兴趣的蛋白质。所有的重组蛋白用talon树脂(Clontech,Mountain View,CA)根据制造商的使用说明通过固定化金属亲和层析(IMAC)纯化。对于Cb1952野生型，洗脱的蛋白质用蛋白质储备缓冲液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)渗析。该蛋白质在75℃加热10min，并在16,400rpm离心20min以使任何共洗脱的热不稳定宿主蛋白质。该重组蛋白质过配备Hiload16/60Superdex200柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)的TWIN快速蛋白液体层析(FPLC)系统进一步通纯化。对于Cb1952TM1，洗脱的蛋白质用蛋白质储备缓冲液渗析。然后该蛋白质在75℃加热10min，并在16,400rpm离心20min。上清液通过上述凝胶过滤进一步纯化。对于其它突变体，从Talon树脂洗脱的重组蛋白质直接用于凝胶过滤以纯化成同质的。图19展示了纯化的Cb1952蛋白质的SDS-PAGE。
Cb1952WT、Cb1952TM1和Cb1952TM5的基因和蛋白质序列
Cb1952全长氨基酸序列
SEQ ID NO:44公布了全长Cb1952内切纤维素酶/甘露聚糖酶(EC3.2.1.4/EC3.2.1.78)的氨基酸序列。在所有PCR扩增期间，移除与SEQ ID NO:44第1-28号的氨基酸对应的Cb1952的信号肽。因此，表达的野生型Cb1952蛋白质不含SEQ ID NO:44的第1-28号的氨基酸。SEQ ID NO:114公布了不含信号肽的野生型Cb1952的氨基酸序列。
将野生型Cb1952（不含信号肽）的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:51公布了带该短肽的野生型Cb1952氨基酸序列（不含信号肽）。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:51第1-14个氨基酸。
Cb1952核苷酸全长序列
SEQ ID NO:45公布了Cb1952核苷酸全长序列。在所有PCR扩增期间，移除与SEQ IDNO:44第1-84号的核苷酸对应的Cb1952的信号肽。因此，表达野生型Cb1952蛋白质的核苷酸不含SEQ ID NO:45的第1-84号的核苷酸。SEQ ID NO:115公布了编码不含信号肽的野生型Cb1952蛋白质的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的野生型Cb1952核苷酸序列（不含信号肽）。编码该短肽的核苷酸为SEQ ID NO:51第1-42个核苷酸。
Cb1952TM1氨基酸序列
SEQ ID NO:46公布了Cb1952TM1内切纤维素酶(EC3.2.1.4)的氨基酸序列。将Cb1952TM1的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:53公布了带该短肽的Cb1952TM1氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:53第1-14个氨基酸。
Cb1952TM1核苷酸序列
SEQ ID NO:47公布了Cb1952TM1核苷酸序列。SEQ ID NO:52公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1952TM1核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:52第1-42个核苷酸。
Cb1952TM5氨基酸序列
SEQ ID NO:8公布了Cb1952TM5的氨基酸序列。将Cb1952TM5的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ IDNO:55公布了带该短肽的Cb1952TM5氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:55第1-14个氨基酸。
Cb1952TM5核苷酸序列
SEQ ID NO:49公布了Cb1952TM5核苷酸序列。SEQ ID NO:54公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1952TM1核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:54第1-42个核苷酸。
酶活性
最优PH、最优温度和耐热性的确定
以PASC作为底物的Cb1952WT,TM1,TM2和TM3的最优PH在pH5.0-5.5的范围内，并且每种蛋白质的最优温度为85℃。就TM4来说，与PASC反应的最优PH和温度分别为6.5和55℃。在野生型和具有纤维素酶活性的去尾突变体上进行耐热性试验。在80℃和85℃，在孵化24h后，除了TM3保持61.8%的活性外，WT、TM1和TM2的残余活性低于20%。在75℃，在孵化24h后，WT、TM1、TM2和TM3的残余活性分别保持43.1%,75.7%,53.6%和101.7%。CBM3c的缺失显著地降低酶的耐热性。在45℃和50℃，去尾突变体TM4保持稳定，在高于55℃，该酶快速失去其活性（图81C）。也确定水解甘露聚糖的最优PH和温度。对于野生型酶，水解甘露聚糖的最优PH和温度分别为5.5-6.5和90℃，而对于TM5，该值分别为6.5和90℃（数据没有展示出来）。
通过Cb1952及其突变体水解磷酸膨胀纤维素、纤维低聚糖和甘露低聚糖
在水解PASC的时间进程方法中调查野生型Cb1952及其TM1和TM5突变体的能力，其中野生型Cb1952及其TM1和TM5突变体代表含有GH9模块和3CBM以及与3个CBM一起的GH5模块（图18）的突变体。如图78色谱所示，观察到，含有GH9模块的野生型（图78A）和TM1（图78B）释放的产物，主要为纤维二糖和葡萄糖。从TM5(C)（以GH5构建）中检测到非常少的甚至没有PASC被水解。通过进一步测试纤维低聚糖的水解，确定β-1,4-葡萄糖裂解活性存在于GH9域（图23）。在甘露低聚糖水解上，野生型和TM5展示了聚合度(DP)为3或更高的低聚糖的裂解活性（图24）。有趣的是，TM1也展示了在DP为5或更高的底物上的活性，虽然该活性比野生型酶和TM5突变体的低（图24）.没有发现野生型、TM1和TM5在葡萄糖，纤维低聚糖，甘露糖和甘露低聚糖上具有转糖苷活性。
Cb1952及其突变体在纤维素底物上的活性和动力学参数
以微晶纤维素、典型的结晶纤维素和滤纸作为底物，确定野生型蛋白质及每种突变体的特异活性。在微晶纤维素上，单独的CBM缺失导致突变体(TM1,TM2和TM3)的特异活性下降（表1）。相比WT酶，带有2个或1个CBM3b的去尾突变体(分别无TM1和TM2)仅展示了特异活性的微小下降。相反，缺失2个CBM3b导致蛋白质的特异活性低于WT蛋白质在微晶纤维素上的特异活性的一半。对于特异活性，尽管活性的下降小于所声称的（表1），但在滤纸作为底物上观察到相似的趋势。在两种底物上，单独由GH9催化域组成的构建仅具有WT蛋白质在微晶纤维素和滤纸上分别观察到的活性的3.8%和16.2%。
表1Cb1952野生型、其去尾突变体和TM3突变体在纤维素底物上的活性和动力学参数
a:除了TM4在45℃进行外，该反应在75℃进行。
b:PASC:磷酸膨胀纤维素。
用来源于微晶纤维素的磷酸膨胀纤维素检测WT蛋白质及其突变体的动力学参数（表1）。预计的WT的kcat(2.58s-1)及其去尾突变体的kcat(2.12-3.09s-1)是非常适度的。有趣的是，TM1展现的催化效率比野生型的高两倍，表明GH9和GH5模块的催化活性是功能性相关的。在单条多肽内，不同的催化模块的相似的功能性相关用于另一个植物细胞壁降解酶Prevotella ruminicola Xyn10D-Fae1A(9)，来自于深海蛤Calyptogena kaikoi(40)的2个域的精氨酸激酶和来自于Chaetopterus variopedatus(13)的鞭毛肌酸激酶。TM4的动力学参数，仅有GH9催化模块的该蛋白质远远比不上连接至CBM的蛋白质，暗示着这些辅助模块对Cb1952的功能的重要性。
Cb1952及其突变体在甘露糖聚类底物上的活性和动力学参数
调查Cb1952及其突变体在甘露糖聚类底物上的酶活性。检测的底物为刺槐豆胶、瓜尔豆胶和魔芋葡甘聚糖。野生型酶在所有检测的甘露糖基底物上展现了非常高的kcat。在刺槐豆胶、魔芋葡甘聚糖和瓜尔豆胶上，kcat值分别为1420s-1,1068s-1和696s-1（表2）。基于表2中的数据，降解甘露聚糖和甘露糖构成的底物的催化活性是位于GH5模块。注意，对刺槐豆胶、瓜尔豆胶和魔芋葡甘聚糖来说，从多肽中裂解GH9模块以产生TM5突变体使该突变体的kcat分别比野生型增加2.4-,2.8-,1.6倍。注意，对瓜尔豆胶来说，kcat的标准误差相当高。在每种甘露糖构成的底物上，TM5的Km的相应增加导致催化效率比野生型蛋白质确定的催化效率更低（表2）。除了3个CBM（TM1）或仅有CBM3c(TM3)之外，还含有GH9催化模块的去尾突变体在刺槐豆胶和瓜尔豆胶两者上几乎没有活性。但是，这些突变体在魔芋葡甘聚糖上展现了非常高的活性。
表2：Cb1952野生型、其去尾突变体及TM3突变体在甘露糖聚底物和魔芋葡甘聚糖上的动力学参数
a:魔芋葡甘聚糖为葡萄糖和甘露糖混合连接的多糖。
定点诱变
GH9模块的结构多样性分配成4中不同的组，被称为主题A、B、C和D(19)。在Cb1952中，GH9催化模块连接至C端配件CBM3c，并且该CBM3c为主题B1的成员的结构。在主题B1中，具有进行性内切葡聚糖酶(7,12,34)和非进行性内切葡聚糖酶(2,10)。纤维素酶水解的滤纸的可溶和不可溶馏分的还原性末端的分布通常用于估计纤维素酶(17)的持续合成能力。基于这样的实验，我们的结果确定由于去尾突变体的最终产物含有40%-50%不可溶的还原性末端，Cb1952及其去尾突变体(TM1、TM2、TM3和TM4)不含有进行性GH9催化模块(表3)。
表3：Cb1952野生型，其去尾突变体及TM3a突变体水解的滤纸的可溶和不可溶馏分中的还原性末端的分布
a对除了TM4之外的所有酶，该反应在75℃进行16h，TM4在45℃进行。
b:Sol./Insol.:可溶的比不可溶的。
c:酶浓度为0.5μM。
d:酶浓度为10μM。
检查Cb1952的GH9域与Clostridium cellulolyticum Cel9G(非进行性内切葡聚糖酶)和Thermobifida fusca Cel9A(进行性内切葡聚糖酶)的氨基酸序列比对。C.cellulolyticum和T.fusca蛋白质代表解决的两种类型的家族9主题B1内切葡聚糖酶与酶-纤维低聚糖共结晶结构(26,34)。氨基酸序列比对展示了涉及纤维素底物结合的大部分残基在Cb1952的GH9模块中是非常保守的（图79）。但是，对亚位点-3的疏水性堆叠负责的两个芳香族残基(T.fusca中的Trp-209和C.cellulolyticum中的Phe-308)都不存在于Cb1952中（图79）。由于涉及疏水性堆叠的芳香族残基与底物相互反应，在结晶底物水解期间有助于酶的持续合成能力，我们通过将Gly-208变成Trp-208或Gly-208之前插入色氨酸以分别获得TM3G208W和TM3G208WG突变体，使Cb1952TM3中相应的氨基酸残基突变成芳香族残基。这些突变体摹拟T.fusca酶。此外，T-298也变成Phe-298以获得TM3T298F突变体，TM3T298F突变体摹拟C.cellulolyticum酶。
如圆二色谱(CD)扫描所示，与Cb1952TM3相比，该三个突变体的二级结构没有展示显著的不同（表4），表明与Cb1952TM3相比，该突变不在该蛋白质的二级结构成分中造成显著的不同。与亲本蛋白质(TM3)相比，该三种突变体在微晶纤维素和滤纸上的活性没有不同（表1）。该突变也不帮助我们将TM3修饰为进行性内切葡聚糖酶，比如可溶的还原性末端比不可溶的还原性末端的比率保持不变（表3）。以PASC作为底物，突变体的kcat值增加约2倍。但是，Km值也增加，导致催化效率(kcat/Km)与Cb1952TM3的相似（表1）。
表4：CbCelB/Man5ATM3及其突变体的CD光谱分析
意外地，以刺槐豆胶和瓜尔豆胶作为底物，与TM3确定的值相比，TM3G208WG的kcat值增加15和100倍（表2）。产物，该突变体对刺槐豆胶和瓜尔豆胶的催化效率也分别增加34倍和10倍（表2）。TM3去尾突变体的定点诱变也使其在魔芋葡甘聚糖上的kcat增加2倍或更高（表2）。
Cb1952与不溶性纤维素底物的结合
含有3个CBM（1个CBM3c和2个CBM3b）的Cb1952野生型、TM1和TM5紧密绑定至微晶纤维素（图80A）和PASC（图80B）。含有CBM3c和1个CBM3b的去尾突变体TM2也紧密绑定至这两种纤维素底物。由GH9模块和CBM3c组成的TM3与不溶性纤维素的结合比野生型、TM1和TM5与不溶性纤维素的结合更弱（图80A，80B）。用消耗结合等温线（Depletion binding isotherms）评估TM3与微晶纤维素的解离常数和最大结合能力分别为0.52±0.20M-1和423.9±50.7nmol蛋白质/g微晶纤维素。注意，TM3的两个部件，即GH9模块和CBM3c微弱地结合至不溶性纤维素（图80A，80B）。CbCel9AMan5B(TM6)的CBM3c与不溶性纤维素的结合是意外的，因为通过该方法(7,10,12,16)不能从具有CBM3c特征的其它物质中观察到该结合。注意，但是，该结合是弱的，并且因此阻碍我们获得GH9和CBM3c模块与微晶纤维素的结合常数。CBM3b(TM7)也绑定至微晶纤维素和PASC（图80A，80B），尽管在该例子中也不能确定结合常数。
用于Cb1952多肽的方法
上述Cb1952实验只不过使用的方法包括如下：
最优PH和温度饿确定;Cb1952的PH图谱使用2中缓冲液：50mM柠檬酸钠,150mMNaCl(pH4.0-pH6.0)和50mM Na2HPO4-NaH2PO4,150mM NaCl(pH6.5-pH8.0)。为了测量该酶在纤维素底物上的最优PH，0.5μM Cb1952野生型或其去尾突变体中的一种与2.5mg/ml PASC在各种缓冲液中以给定的PH，在75℃孵化，并在确定在10min试验中的活性。用pHBAH试验确定释放的还原糖。为了确定最优温度，0.5μM的各种酶与2.5mg/ml PASC在pH5.5，在40℃至95℃的范围以5℃为间隔的不同温度下孵化。除了用甘露聚糖替代PASC作为底物并将酶的浓度改为12.5nM外，如上文所述确定甘露聚糖酶的最优PH和温度。
酶试验：在75℃，该酶的最优缓冲液中确定Cb1952野生型及其突变体在微晶纤维素和滤纸上的特异活性。除了TM4(5μM)，酶浓度为每种蛋白质0.3μM。在90min试验中，在不同时间间隔取出样品并以反应混合物中存在的还原性末端的量确定释放的产物。在该范围中确定的还原糖比时间的关系是线性的。
在30分钟试验中确定Cb1952野生型及其突变体在PASC、刺槐豆胶、瓜尔豆胶和魔芋葡甘聚糖上的动力学。不同浓度的酶与一定浓度范围的底物在75℃孵化。确定还原性末端的释放速率，并用GraphPad Prism5.01(GraphPad,San Diego,CA)软件，相对底物的浓度绘制还原性末端的释放速率从而估计动力学参数。
磷酸膨胀纤维素(PASC)的水解的时间进程：2.5mg/ml PASC与0.5μM Cb1952WT,TM1,和TM5在75℃孵化。在不同的时间间隔(0min,2min,10min,60min,4h和24h)取出样品并如早前所述，进行HPAEC-PAD分析。
低聚糖水解和转糖苷活性分析：葡萄糖，纤维低聚糖（纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、和纤维六糖）和甘露低聚糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、和甘露六糖），每种以终浓度1mg/ml与0.1μM Cb1952野生型、Cb1952TM1和Cb1952TM5在柠檬酸缓冲液(10mM柠檬酸钠,150mMNaCl,pH5.5)中，以75℃孵化14h。总反应浓度为40μl。该反应产物用SpeedVac浓缩器(Thermo Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)干燥并溶解于3.5μlH2O中，并且通过薄层层析(TLC)用250μm厚的Whatman silica gel60A(Maidstone,England)分析1μl产物。该TLC方法如我们早前报道（29）所述的一样。
耐热性试验：在Veriti96孔热循环仪(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)上，通过使酶在75℃、80℃和85℃(WT、TM1、TM2和TM3)或在45℃、50℃和55℃(TM4)孵化确定Cb1952及其含有纤维素酶活性的去尾突变体的耐热性。在不同的时间点，从反应混合物中取出进样量并以PASC作为底物确定酶的残余活性。
定点诱变和圆二色谱：对于定点诱变，根据制造商的使用说明使用QuikChangeMulti Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA)。在PCR扩增中，使用100纳克编码Cb1952TM3的质粒作为模板。反应混合物含有100ng诱变引物，1μl dNTP混合物，0.75μl QuikSolution和1μl QuikChange多酶混合物。用于诱变的诱变引物的核苷酸序列如补充表1中所示。PCR扩增步骤如下进行：95℃初始变性1min，随后在95℃1min，55℃1min，65℃15min中进行30个循环，PCR扩增产物用DpnI(New England Biolabs)在37℃消化4小时以降解亲本质粒DNA。使用Gene Pulser Xcell电穿孔系统(BioRAD,Hercules,CA)将来自DpnI消化的产物电转化到JM109感受态细胞中。E.coli细胞涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃培养过夜。将单克隆接种到添加了100μg/ml氨苄青霉素的7mlLB培养液中并培养10h。从重组E.coli细胞中提取质粒并对插入片段进行测序(W.M.KeckCenter for Comparative and Functional Genomics,UIUC)以确定存在想要的突变。如我们之前的报道所述(37)，对突变的蛋白质进行圆二色谱扫描。
水解滤纸的可溶和不可溶部分中的还原糖的测量：如Irwin等(17)所述，确定水解滤纸的可溶和不可溶部分中的还原糖。Cb1952野生型及其突变体（除了TM4为10μM外，每种蛋白质为0.5μM）与5平板的Whatman No.1滤纸（直径0.6cm）在柠檬酸缓冲液(pH5.5)中以200μl，75℃(对于TM4，该温度为45℃，为该构建具有更低的耐热性)。该混合物颠倒摇匀16h。离心反应产物，并且分析上清液（可溶馏分）中的还原糖的量。对于不可溶馏分中还原糖的确定，首先将滤纸洗4次，每次用1ml柠檬酸缓冲液。接着，将200微升的柠檬酸缓冲液加入不溶性馏分（沉淀的滤纸）中，随后通过pHBAH方法分析还原性末端。
Cb1952及其去尾突变体与纤维素的结合：对于单独的多肽结合至纤维素的能力的定性测量，30微克的Cb1952野生型及其突变体与40mg/ml微晶纤维素或2.5mg/ml PASC在50mM Tris-HCl,150mM NaCl(pH7.5)中孵化。4℃颠倒摇匀1h。接着通过在16,400rpm将混合物离心3min，分离绑定和未绑定蛋白质。将纤维素团用1ml缓冲液(50mM Tris缓冲液,150mMNaCl,pH7.5)洗涤4次。将70微升1×SDS-PAGE负载缓冲液加入该团中并煮5min以释放绑定的蛋白质。用12%SDS-PAGE检测存在于十分之一体积的上清液（未绑定的蛋白质）和纤维素团（绑定的蛋白质）中的蛋白质。
对于定性结合试验，不同浓度的蛋白质与2mg/ml微晶纤维素在50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5缓冲液中，在2ml试管中混合。作为对照，在没有微晶纤维素的情况下，在试管中孵化相同浓度的蛋白质。在4℃颠倒摇匀1.5h后，以16,400rpm将混合物离心3min。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质分析试剂盒(Protein Assay Reagent Kit，Thermo Scientific,Rockford,IL)确定上清液中的蛋白质浓度。不含纤维素的试管中的蛋白质浓度视为总蛋白质，从总蛋白质浓度减去具有纤维素的样品中的蛋白质浓度得到绑定的蛋白质的浓度。对于结合参数的确定，使用我们之前的报告(46)中所述的Michaelis/Langmuir方程(qad/q=Kp×qmax/(1+Kp×q))。方程中的qad代表绑定的蛋白质的量（nmol蛋白质/g微晶纤维素），q为游离蛋白质(μM)，qmax为绑定至微晶纤维素的蛋白质的最大量。用GraphPad Prism5.01进行结合参数的计算。
氨基酸序列比对：从Carbohydrate Active enZYme数据库和Genbank数据库检索到Clostridium cellulolyticum Cel9G(GenBank accession number AAA73868)与Thermobifida fusca Cel9A(GenBank accession number:AAB42155)(34)的家族9糖苷水解酶催化模块(26)的氨基酸序列，并通过ClustalX与Cb1952的GH9序列进行比对。相似地，对来自于公共文库中的、不同细菌来源的具有特征的纤维素酶的CBM3c的氨基酸序列进行比对。这包括：ADQ45731：Caldicellulosiruptor kronotskyensis的假定纤维素酶；ABP66693：Caldicellulosiruptor saccharolyticus的假定纤维素酶；ADL42950：假定的Caldicellulosiruptor obsidiansis纤维素酶/甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶；AAK06394:CelE of Caldicellulosiruptor sp.Tok7B.1(11);AAA73868:Cel9G ofClostridium cellulolyticum(26);AAC38572:EngH of Clostridium cellulovorans(38);CAA39010:Cel9Z of Clostridium stercorarium(18);ABX43720:Cel9ofClostridium phytofermentans(39,48);ABN51860:Cel9I of Clostridium thermocellumDSM1313(50);CAB38941:Cel9B of Paenibacillus barcinonensis(32);BAB33148:CelQof Clostridium thermocellum F1(2);AAA23086:CenB of Cellulomonas fimi(27);AAW62376:CBP105of Cellulomonas flavigena(28);AAB42155:Cel9A of Thermobifidafusca(16,34)。用BOXSHADE3.21分析比对序列，其中序列参数部分的缺省值设置为0.5
另外的试验
图20展示了来自还原糖试验的Cb1952野生型在天然底物上的酶活性。检验了20种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、地衣多糖、甘露聚糖、刺槐豆胶（LBG）、瓜尔豆胶、魔芋葡甘聚糖（KGM）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、桦木木聚糖（BWX）、燕麦木聚糖(OSX)和木葡聚糖。该酶与微晶纤维素、PASC、CMC-Na、地衣多糖、甘露聚糖、LBG、瓜尔豆胶、KGM、WAX和OSX底物一起孵化使产物释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。Cb1952野生型主要水解葡萄糖和甘露糖构成的底物，但不水解木糖构成的底物。
图21展示了来自还原糖试验的Cb1952TM1在天然底物上的酶活性。检验了20种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、地衣多糖、甘露聚糖、刺槐豆胶（LBG）、瓜尔豆胶、魔芋葡甘聚糖（KGM）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、桦木木聚糖（BWX）、燕麦木聚糖(OSX)和木葡聚糖。该酶与微晶纤维素、PASC、CMC-Na、地衣多糖、甘露聚糖、LBG、瓜尔豆胶、KGM、WAX、BWX、OSX和木葡聚糖底物孵化导致产物释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。结果显示Cb1952TM1主要水解葡萄糖构成的底物。Cb1952TM1在甘露糖构成的底物上也有一些活性。Cb1952TM1在木糖构成的底物上的活性是低的。
图22展示了来自还原糖试验的Cb1952TM5在天然底物上的酶活性。检验了20种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、地衣多糖、甘露聚糖、刺槐豆胶（LBG）、瓜尔豆胶、魔芋葡甘聚糖（KGM）、小麦阿拉伯木聚糖（WAX）、桦木木聚糖（BWX）、燕麦木聚糖(OSX)和木葡聚糖。该酶与CMC-Na、地衣多糖、甘露聚糖、LBG、瓜尔豆胶和KGM底物一起孵化使产物释放，该产物以甘露糖当量的浓度量化。结果显示Cb1952TM5主要水解甘露糖构成的底物，但在葡萄糖或木糖构成的底物上不具有明显的活性。
图23展示了来自于薄层层析(TLC)分析的Cb1952野生型、Cb1952TM1和Cb1952TM5在葡萄糖和纤维低聚糖上的酶活性。使用了葡萄糖和五种不同的纤维低聚糖：纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、和纤维六糖。Cb1952野生型和Cb1952TM1将纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、和纤维六糖水解为葡萄糖和纤维二糖，但在纤维二糖上不具有活性。Cb1952TM5在葡萄糖和检验的任何纤维低聚糖不具有活性。没有酶在葡萄糖和纤维低聚糖上具有转糖苷活性。
图24展示了来自于薄层层析(TLC)分析的Cb1952野生型、Cb1952TM1和Cb1952TM5在甘露糖和甘露低聚糖上的酶活性。使用了甘露糖和五种不同的甘露低聚糖：甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、和甘露六糖。Cb1952野生型和Cb1952TM5将甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、和甘露六糖水解为甘露糖和更小的甘露低聚糖，但对甘露二糖不具有水解活性。Cb1952TM1将甘露五糖和甘露六糖水解为更小的低聚糖，但在甘露二糖、甘露三糖、甘露三糖和甘露四糖上没有水解活性。没有酶在甘露糖和甘露低聚糖上具有转糖苷活性。
在天然多糖酶水解后，根据Lever,M.方法(A new reaction for colorimetricdetermination carbohydrates.Anal.Biochem.1972:47;273-279)确定葡萄糖或甘露糖当量的浓度。将1.5ml微量离心管在分析天平上“归零”。接着，将2±0.1mg微晶纤维素或甘露聚糖加入每个试管中，并且测量并记录质量。基于该质量计算需要加入每个试管中的体积。对于CMC-Na和PASC，使用CMC-Na(2%)和PASC(6.11mg/ml)的底物储备液。对于LBG和瓜尔豆胶，使用0.5%的储备液。以反应缓冲液为开始，在每个试管中加入柠檬酸钠反应缓冲液和酶。该试管在Thermomixer R(Eppendorf)，75℃以恒速混合孵化16h。试管以4℃，10,000rpm离心5分钟。50μL样品上清液转移到干净的1.5mL离心管中用于pHBAH分析。1mL葡萄糖储备液用柠檬酸钠缓冲液制备成浓度为100mM。然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释成以下浓度(20mM,10mM和5mM)。50mg pHBAH溶解在50mL冰浴柠檬酸/NaOH溶液中，终浓度为0.1%(w/v)，并且溶液保持在冰上。150μL pHBAH溶液加入50μL样品和葡萄糖标准溶液中，并且在100℃孵化试管10分钟。该试管在室温下孵化5分钟。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度，并且用线性回归将数据拟合成直线。相关系数(R2)值在0.98和1.0之间。标准曲线方程用于基于样品的吸光度计算样品的还原性端的浓度。
图25展示了用HPLC分析的Cb1952TM1在纤维素底物上的酶活性。检验了三种不同的纤维素底物：微晶纤维素、CMC-Na和PASC。对每种实例而言，在存在Cb1952TM1的情况下，释放葡萄糖和纤维二糖。在缺乏Cb1952TM1的情况下，所有的底物既观察不到葡萄糖也观察不到纤维二糖。结果显示，这一部分的酶或多肽（Cb1952）从纤维素底物（微晶纤维素，CMC-Na和PASC）裂解葡萄糖和纤维二糖作为最终产物。
图26展示了Cb1952TM1水解PASC的时间进程。100nmole Cb1952TM1与2.5mg/mlPASC在75℃孵化。在不同的时间间隔(0、0.5min、2min、10min、1h、4h和24h)，取出样品并立即煮10分钟以使该酶灭活。离心后，样品上清液适当地用水稀释，并用于HPLC分析。结果显示，Cb1952TM1起初释放葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖和纤维四糖。随着时间增加，反应混合物中仅剩下葡萄糖和纤维二糖。
图27展示了用PASC作为底物进行活性测量的Cb1952野生型耐热性。分别在70℃、75℃、80℃和85℃孵化24小时后，Cb1952野生型具有75%、43%、17%和12%的活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持500nM Cb1952野生型。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在PH5.5，85℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且加入8.31μl蛋白质样品至底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.方法(同上)测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
图28展示了用PASC作为底物进行活性测量的Cb1952TM1耐热性。分别在70℃、75℃、80℃和85℃孵化24小时后，Cb1952TM1具有94%、76%、18%和13%的活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持500nM Cb1952TM1。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在PH5.5，85℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且加入8.31μl蛋白质样品至底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.方法(同上)测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
Cb1952多肽结果讨论
Cb1952为第一个GH9纤维素酶，其特征在于连接至GH9-CBM3c于的2个串联的CBM3b模块。CBM3b模块(TM7)结合至不溶性纤维素（图80A和80B）。从TM1中缺失CBM3b(TM2)不会明显影响与这些底物的结合（图80A和80B）。相应地，对于纤维素底物来说，TM1和TM2的特异活性和动力学参数是相似（表1）。另一个CBM3b(TM3)的进一步缺失减少与不溶性底物的结合和对微晶纤维素和滤纸的特异活性（表1）.因此，CBM3b模块利于Cb1952使结晶纤维素解构。
Cb1952及其去尾突变体，特别是TM3，在75℃孵化24h之后，保持相当大的活性。对于其它超嗜热内切葡聚糖酶，Thermoanaerobacter tengcongensis的Cel5A在60℃孵化24h(24)后，具有高于80%的残余活性。Clostridium stercorarium的微晶纤维素酶在80℃孵化12h(6)后，具有高于60%的残余活性。在将其用于从纤维素底物中释放发酵糖期间，多功能性酶的耐热性能可以利于循环。酶引入纤维素乙醇生产的循环步骤可以大大降低增值产物的生产成本。
C.bescii Cb1954(CelA)(ORF1954,GenBank accession number ACM60955)为从该细菌(49)中描述的第一种纤维素酶。当C.bescii在微晶纤维素培养基(25)上生长时，该酶为最高度分泌纤维素酶。与Cb1952相似但不相同，Cb1954由坐落于N端的GH9模块，坐落于C端的GH48模块和在该2个催化域之间的3个CBM3模块组成。Cb1952在微晶纤维素(10.15μmol糖/min/μmol酶)上的特异活性比全长Cb1954/CelA在微晶纤维素(55.0μmol糖/min/μmol酶)上的特异活性低很多。但仅比其含有GH9催化域和CBM的去尾突变体CelA′(18.0μmol糖/min/μmol酶)稍微低点(49)。与其它超耐热内切葡聚糖酶相比，Cb1952的特异活性比Thermoanaerobacter tengcongensis的Cel5A(60.0μmol糖/min/μmol酶)(24)和Clostridium stercorarium的微晶纤维素酶(30.2μmol糖/min/μmol酶)(6)的特异活性更低，与Pyrococcus horikoshii的EGPh的特异活性(12.7μmol糖/min/μmol酶)(1)相当，当比C.saccharolyticus CelB的特异活性(0.4μmol糖/min/μmol酶)(41)高很多。Cb1952在滤纸上的特异活性与Thermotoga neapolitana的CelB(20.8μmol糖/min/μmol酶)(5)、Thermoanaerobacter tengcongensis的Cel5A(18.5μmol糖/min/μmol酶)(24)和Pyrococcus furious的EglA(18.7μmol糖/min/μmol酶)(3)在滤纸上的特异活性相当，但比Thermotoga neapolitana的CelA(3.2μmol糖/min/μmol酶)(5)和C.saccharolyticus的CelB(1.8μmol糖/min/μmol酶)(41)在滤纸上的特异活性高很多。注意，在上述酶中，这些特异活性的试验条件（反应温度，缓冲液，反应周期，测量还原糖的方法和实验室设备）可以不同。然而，Cb1952是用于在高温下从纤维素底物中释放可发酵的糖的有效的酶。
有趣的是，Cb1952编码基因所坐落的基因簇中9种基因中的7种也含有与Cb1952的CBM3b相同或高度相似的CBM3b模块。该基因簇中的多肽中的6中具有2个或3个串联的CBM3b复件。有理由假定这些CBM3b模块有助于植物细胞壁的水解。
Cb1952的甘露聚糖酶活性主要坐落于GH5模块；但是，含有作为催化模块的GH9域的构建物也观察到有限的甘露聚糖酶活性。在大部分情况下，家族9糖苷水解酶描述为内切葡聚糖酶(10,16)、纤维素水解酶(36)、1,4-β-D-葡聚糖葡萄糖水解酶(1,4-β-D-glucanglucohydrolase)(33)，β-葡萄糖苷酶(30)，和外切-β-氨基葡萄糖苷酶(42)；但是，其在甘露糖构建的底物上的动力学数据和水解方式是未知的。与TM5突变体相比，Cb1952的TM1突变体展示了不同的水解方式，其中GH9需要的最小链长度为5并且释放甘露二糖作为最短的最终产物，而GH5需要的最小链长度为3并且释放甘露糖作为最短的最终产物。Cb1952的GH9模块水解甘露糖构建的底物的能力表明该催化模块能接纳葡萄糖的C-2平伏羟基（equatorial C-2hydroxyl）并且也能容忍甘露糖的C-2直立羟基（axial C-2hydroxyl）。
缺失用于-3亚位点疏水反应的色氨酸将动摇无效结合，这可能损害GH9纤维素酶(31)的持续合成能力。G208和T298突变成芳香族残基(TM3G208WG,TM3G208W,和TM3T298F)，但是，并不改变TM3的持续合成能力，如可溶性的对不溶性的还原性末端的不变的比率所反应的。该突变体在结晶纤维素（微晶纤维素和滤纸）上的特异活性与亲本TM3在在结晶纤维素上的特异活性是相当的。但是，对于非结晶PASC，但催化效率保持不变时，突变体的所有转换数大约增加2倍。结晶和非结晶纤维素的不同结果可能影响这些酶的性能。一种突变体TM3G208WG，其对刺槐豆胶的底物特异性增加35倍(TM3:[kcat/Km]LBG/[kcat/Km]PASC=7.4×10-3,TM3G208WG:[kcat/Km]LBG/[kcat/Km]PASC=0.26)，表明，用于亚位点-3反应的残基可能参与底物的选择。
CBM3c被认为松散地结合至纤维素配体，并将纤维素链填充到GH9催化模块（34）。但是对于该结合，没有提供生化数据。在与纤维低聚糖复合的家族9纤维素酶的共结晶结构中，目前还没观察到纤维低聚糖结合到CBM3c（26,34）。我们的结果表明CBM3c确实可以结合至不溶性纤维素，尽管该结合显得很弱。Cb1952与其同源体的序列比对表明在Cb1952CBM3c及其同源体之间，与配体(19,22,23)反应的氨基酸残基中存在很大的不同。被认为与配体反应的ThefuCel9A中保守的Q553、R557、E559和R563残基相应地分别被Cb1952的CBM3c中的E545、K549、Q561和K565取代（图82）。该观察所得可能类似于在Caldanaerobiuspolysaccharolyticus家族16CBM中显示的微调，其中，Caldanaerobiuspolysaccharolyticus家族16CBM通过在涉及氢与配体（37）的结合中使一个极性残基（Q121突变为E121）突变。E545、K549、Q561和K565残基也可以在来自相关生物C.kronotskyensis,C.saccharolyticus,C.obsidiansis,和Caldicellulosiruptor sp.Tok7B.1的4个CBM3模块中发现（图82）。依然没有与配体复合的CBM3c的三维结构，这阻碍了对配体结合很重要的残基的精确指定。由于CBM3c模块（19）的多变性，可以假定可能存在这样的其它CBM3c变体：该变体能足够紧密地保持纤维低聚糖以在结晶中抓住该复合体。
实施例10：内切葡聚糖酶/甘露聚糖酶Cb1953
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种推定的内切葡聚糖酶Cb1953WT，该酶为Cb1953的基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。该内切葡聚糖酶主要从纤维素裂解纤维二糖。该Cb1953WT蛋白质长度为1391个氨基酸并且分子量为153.6kDa(组氨酸标签+Cb1953蛋白质)。该Cb1953WT具有2个糖苷水解酶（GH）家族5催化域和3碳水化合物结合模块（图29）。制备了2个去尾突变体，如图29所示，以确定每个GH5模块的活性。对于去尾突变体，Cb1953TM1(961个氨基酸,103.9kDa)具有N端GH5催化域和3个碳水化合物结合模块，而Cb1953TM2(1108个氨基酸,121.7kDa)具有C端GH5催化域和3个碳水化合物结合模块，如图29中所示那样。
PCT扩增Cb1953WT
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增该基因。用下面的各引物组扩增Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM2编码序列：
Cb1953WT正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GATGGA GTAGTG AAG-3’(SEQ ID NO:56)
Cb1953WT反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT TGC GGC TGG AAC TGGCGC TGG TTC-3’(SEQ ID NO:57)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1953TM1
Cb1953TM1正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GATGGA GTAGTG AAG-3’(SEQ ID NO:56)
Cb1953TM1反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAT GGC ATT GGT ATT ACT GTCTGC ACC GG-3’(SEQ ID NO:58)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1953TM2
Cb1953TM2正向引物：
5’-GAC GAC GAC AAG ATG GGTGCCTCTTCAGTACCTACTTCAACACC-3’(SEQ ID NO:59)
Cb1953TM2反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT TGC GGC TGG AAC TGGCGC TGG TTC-3’(SEQ ID NO:57)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM5产物。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将DNA从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理每种纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20min使该酶灭活。
以下方案用于使插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μL25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5分钟。
将Cb1953-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过电穿孔方法导入E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mL LB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液中提取小量质粒(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确定该基因插入质粒中后，对插入片段进行测序以确定其序列的完整性。
在基因表达中，将一种质粒通过热休克法转移到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂于添加了氯霉素(100μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板上，并在37℃过夜孵化。将5到6个菌落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的3ml LB培养液中，并培养4小时。将1mL该培养物加入到添加了两种相同浓度的抗生素的500mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm的吸光度达到～0.25。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃下连续过夜培养。
Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM2的基因和蛋白质序列
野生型Cb1953氨基酸序列
SEQ ID NO:60公布了野生型Cb1953的氨基酸序列。在所有PCR扩增期间，移除与SEQ ID NO:60第1-38号的氨基酸对应的Cb1953的信号肽。因此，表达的野生型Cb1952蛋白质不含SEQ ID NO:60的第1-38号的氨基酸。SEQ ID NO:61公布了不含信号肽的野生型Cb1953的氨基酸序列。
将野生型Cb1953（不含信号肽）的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:65公布了带该短肽的野生型Cb1953氨基酸序列（不含信号肽）。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:65第1-14个氨基酸。
野生型Cb1953核苷酸序列
SEQ ID NO:62公布了Cb1953核苷酸序列。在所有PCR扩增期间，移除与SEQ ID NO:62第1-114号的核苷酸对应的Cb1953的信号肽。因此，用于表达野生型Cb1953蛋白质的核苷酸不含SEQ ID NO:62的第1-114号的核苷酸。SEQ ID NO:63公布了编码不含信号肽的野生型Cb1953蛋白质的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的野生型Cb1953核苷酸序列（不含信号肽）。编码该短肽的核苷酸为SEQ ID NO:64第1-42个核苷酸。
Cb1953TM1氨基酸序列
SEQ ID NO:122公布了Cb1953TM1的氨基酸序列。将Cb1953TM1的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ IDNO:67公布了带来自pET-46Ek/LIC的短肽的Cb1953TM1氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQID NO:67第1-14个氨基酸。
Cb1953TM1核苷酸序列
SEQ ID NO:123公布了Cb1953TM1核苷酸序列。SEQ ID NO:66公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1953TM1核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:66第1-42个核苷酸。
Cb1953TM2氨基酸序列
SEQ ID NO:111公布了Cb1953TM2的氨基酸序列。将Cb1953TM2的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ IDNO:69公布了带该短肽的Cb1953TM2氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:69第1-14个氨基酸。
Cb1953TM2核苷酸序列
SEQ ID NO:110公布了Cb1953TM2核苷酸序列。SEQ ID NO:68公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1953TM2核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:68第1-42个核苷酸。
Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM2蛋白质的纯化
在E.coli BL-21CodonPlus(DE3)RIL感受态细胞中通过热休克表达Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM2。重组细胞在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上37℃过夜生长。8小时后，起始培养液稀释到添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的新鲜的LB中，37℃，通风培养直到在600nm的吸光度达到0.5。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在低至16℃的温度培养，诱导基因表达。16小时后，离心该细胞以收集细胞团。随后该团悬浮于裂解缓冲液(25mMTris-HCL pH7.8,750mM ofNaCl,5%甘油,20mM咪唑,1.25%Tween-20)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的蛋白质)随后用洗脱液(50mM Tris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。接着洗脱馏分在65℃热处理30分钟，然后离心以移除沉淀的蛋白质。接着用Tris-HCl洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)通过凝胶过滤层析(HiLoad16/20Superdex200,GE Healthcare)纯化该蛋白质。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析部分洗脱馏分，并且通过考马斯亮蓝G-250（Coomassiebrilliant blue G-250）染色，可观察到蛋白质条带(图30)。
酶活性
图31展示了Cb1953WT、Cb1953TM1、Cb1953TM2在羧甲基纤维素(CMC)上的酶谱。如同标准的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），制备具有CMC底物（终浓度0.1%，w/v）的凝胶。蛋白质电泳分离后，凝胶用蒸馏水洗涤两次，并在25℃，30mL复性缓冲液(20mM柠檬酸盐缓冲液，pH6.0，2.5%Triton X-100，2mM二硫苏糖醇，2.5mM CaCl2)中孵化1小时，然后在37℃，新鲜缓冲液中过夜。凝胶用50mM柠檬酸盐缓冲液（pH6）洗涤两次，用0.1%刚果红(Congo red)染色，并且用1M NaCl脱色，可以看到结果。如图31所示，Cb1953WT和Cb1953TM2在其预期大小的位置展示了明显的白色条带，表明纤维素酶活性，但Cb1953TM1蛋白质没有。
图32和33展示了来自还原糖试验的Cb1953WT、Cb1953TM1和Cb1953TM2在天然底物上的酶活性。检测了七种不同的底物：微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素（PASC）、羧甲基纤维素（CMC）、小麦阿拉伯木聚糖(WAX)、地衣多糖、魔芋葡甘聚糖和甘露聚糖。该酶与底物孵化导致产物的释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。试管在Thermomixer R(Eppendorf)中，75℃，恒速混合，孵化16小时。试管在4℃以10,000rpm离心5分钟。50μL样品上清液转移至干净的1.5mL离心管中用于pHBAH试验。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度，并用线性回归使数据拟合成直线。该反应通过薄层层析(TLC)解决，使用由10:5:1(vol/vol/vol)正丁醇：乙酸：水组成移动相和10cmx20cm平板。还原糖试验（图32）和TLC（图33）结果展示了Cb1953WT和Cb1953TM2具有纤维素酶活性，而Cb1953TM1具有甘露聚糖酶活性。通过
图34展示了用HPLC分析的Cb1953TM2在PASC上的酶活性的时间进程。在水解产物分析中，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析样品。在HPAEC分析中，将每100μL稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTMPA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的CoulochemIII电化学检测器。在TLC和HPLC分析中，葡萄糖和五种不同的纤维低聚糖（纤维二糖、纤维三糖、纤维三糖、纤维五糖和纤维六糖）作为标准样使用。在反应中，Cb1953TM2开始释放纤维低聚糖（C2-C4），后来释放葡萄糖。结果显示该酶从PASC主要释放纤维二糖。
图35和36展示了Cb1953WT(图35)和Cb1953TM2(图36)在PASC上的耐热性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持50nM Cb1953WT和Cb1953TM2。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在85℃，用Cary300UV-Vis分光光度计（Varian）测量酶活性。计算第一分钟的反应初始速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。从结果可知，Cb1953WT(图35)和Cb1953TM2(图36)在70℃和75℃相当稳定，维持热非处理蛋白质（heatnon-treated proteins）75～90%的活性。
图37展示了Cb1953WT和Cb1953TM2在PASC上的动力学研究。0.05μM纯化的Cb1953WT或Cb1953TM2在50mM Na2HPO4-HCl,pH6.0和150mM NaCl中与各种浓度的磷酸膨胀纤维素（PASC）孵化，并且相对底物浓度绘制水解初始速率。通过将数据拟合至Michaelis-Menten方程(Graph Pad Prism v5.01)确定动力学参数(对于Cb1953WT，Km:7.603mg/mL,kcat:7.513s-1和kcat/Km:0.988s-1mL/mg，而对于Cb1953TM2，Km:3.032mg/mL,kcat:5.411s-1和kcat/Km:1.785s-1mL/mg)。
实施例11：内切纤维素酶Cb1952
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种推定的内切葡聚糖酶Cb1954，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族9催化域（推定的纤维素酶域），3个家族3碳水化合物结合模块(CBM)和一个GH48催化域（图38）。Cb1954野生型长度为1746个氨基酸并且预测分子量为193.6kDa(组氨酸标签+Cb1954野生型蛋白质)。酶Cb1954TM3和Cb1954TM5为Cb1954的基因产物的去尾突变体，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。该内切纤维素酶产品从纤维素中连接葡萄糖和纤维二糖作为最终产物。Cb1954TM3蛋白质长度为709个氨基酸并且分子量为78.57kDa(组氨酸标签+Cb1954TM3蛋白质)。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族9催化域和1个家族3碳水化合物结合模块(CBM)。Cb1954TM5蛋白质长度为1294个氨基酸并且分子量为142.82kDa(组氨酸标签+Cb1954TM5蛋白质)。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族48催化域和3个家族3碳水化合物结合模块(CBM)。
克隆Cb1954野生型
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增Cb1954基因。用下面的引物组扩增Cb1954野生型基因：
Cb1954野生型正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG CAA GAG GTT AGG GCT GGTTCG TTT AAC-3’(SEQ ID NO:70)
Cb1954野生型反向引物：5’-GA GGA GAA GCC CGG TTA TTG ATT GCC AAA CAGTAT TTC ATA TG-3’(SEQ ID NO:71)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1954TM3
使用PfuDNA聚合酶通过PCR从Caldicellulosiruptor bescii DSM6725T基因组DNA中扩增Cb1954基因。用下面的引物组扩增Cb1954TM3基因：
Cb1954TM1正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG CAA GAG GTT AGG GCTGGT TCGTTT AAC-3’(SEQ ID NO:70)
Cb1954TM1反向引物：5’-GA GGA GAA GCC CGG TTA TAC CTT TAT CTG TCC ACCTGC TAC-3’(SEQ ID NO:72)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1952TM5
使用PfuDNA聚合酶通过PCR从Caldicellulosiruptor bescii DSM6725T基因组DNA中扩增Cb1954基因。用下面的引物组扩增Cb1954TM3基因：
Cb1954TM5正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG TTC AAA GCT ATT GAA ACT CCAACA AAC-3’(SEQ ID NO:73)
Cb1954TM5反向引物：5’-GA GGA GAA GCC CGG TTA TTG ATT GCC AAA CAG TATTTC ATA TG-3’(SEQ ID NO:71)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb1954野生型、Cb1954TM3和Cb1954TM5基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen GelExtraction kit将扩增片段从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于使插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μl25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5分钟。
将Cb1954野生型、Cb1954TM3-或Cb1954TM5-pET-46Ek/LIC的各连接混合物通过化学转化方法导入E.coli NovaBlue感受态细胞中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mL LB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液中提取小量质粒(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确定该基因已经插入质粒中后，对基因进行测序以确定其一致性。
对于所有的Cb1954的构建，仅Cb1954TM3可以克隆。因此，在该蛋白质的表达中，一种重组质粒通过热休克法转化到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂在添加了氯霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，并在37℃孵化过夜。将5到6个群落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的3ml LB培养液中，并培养4小时。将1mL培养物加入添加了两种相同浓度的抗生素的500mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.25。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃连续培养过夜。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团（cell pellet）。随后该团悬浮于裂解缓冲液(50mMTris-HCL pH7.5,300mMNaCl)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的Cb1954TM3)随后用洗脱液(50mM Tris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。
PCR引物的设计确保该蛋白质融合至在质粒中编码的6个组氨酸。该6个组氨酸会结合到带电镍或带电钴树脂上。该绑定蛋白质可以用含有咪唑的缓冲液从树脂中取代出来。该方法便于蛋白质的快速纯化。
在E.coli细胞中表达Cb1954TM3基因，并且通过三个步骤来纯化该蛋白质，该步骤包括利用质粒编码的6个组氨酸的talon树脂纯化步骤，使用Hitrap Q柱的离子交换步骤和使用Hiload16/60Superdex200柱的凝胶过滤步骤。图39A展示了纯化的Cb1954TM3的SDS-PAGE。
Cb1954WT、Cb1954TM3和Cb1954TM5的基因和蛋白质序列
野生型Cb1954的氨基酸序列
SEQ ID NO:74公布了野生型Cb1954内切纤维素酶(EC3.2.1.4)的氨基酸序列。Cb1954的信号肽与SEQ ID NO:74第1-27号的氨基酸对应。因此，表达的野生型Cb1952蛋白质不含SEQ ID NO:44的第1-28号的氨基酸。SEQ ID NO:121公布了不含信号肽的野生型Cb1954的氨基酸序列。
Cb1953TM1核苷酸序列
SEQ ID NO:116公布了野生型Cb1954核苷酸序列。Cb1954的信号肽与SEQ ID NO:116第1-81号的核苷酸对应。SEQ ID NO:75公布了编码不含信号肽的野生型Cb1954蛋白质的核苷酸序列。
Cb1954TM3的氨基酸序列
SEQ ID NO:76公布了Cb1954TM3的氨基酸序列。将野生型Cb1954TM3基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQID NO:81公布了带来自pET-46Ek/LIC的短肽的Cb1954TM3氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:81第1-14个氨基酸。
Cb1954TM3的核苷酸序列
SEQ ID NO:77公布了Cb1954TM3核苷酸序列。SEQ ID NO:80公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1954TM3d的核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:80第1-42个核苷酸。
Cb1954TM5的氨基酸序列
SEQ ID NO:78公布了Cb1954TM5的氨基酸序列。
Cb1954TM5的核苷酸序列
SEQ ID NO:79公布了Cb1954TM5的核苷酸序列。
酶活性
图39B展示了来自还原糖试验的Cb1954TM3在天然底物上的酶活性。检验了三种不同的纤维素：微晶纤维素、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和磷酸膨胀纤维素（PASC）。酶与该底物孵化导致产物释放，该产物以甘露糖当量的浓度量化。PASC的水解程度比其它底物的水解程度高。
在对微晶纤维素、CMC-Na和PASC进行酶水解后，根据Lever,M.方法(同上)确定葡萄糖当量的浓度。将1.5ml微量离心管在分析天平上“归零”。接着，将2±0.1mg微晶纤维素加入每个试管中，并且测量并记录质量。对于CMC-Na和PASC，使用CMC-Na(2%)和PASC(6.11mg/ml)的底物储备液。以反应缓冲液为开始，在每个试管中加入柠檬酸钠反应缓冲液和酶。该试管在Thermomixer R(Eppendorf)，75℃以恒速混合，孵化16h。试管以4℃，10,000rpm离心5分钟。50μL样品上清液转移到干净的1.5mL离心管中用于pHBAH分析以确定该酶释放的还原性末端。1mL葡萄糖储备液用柠檬酸钠缓冲液制备成浓度为100mM。然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释成以下浓度(20mM,10mM和5mM)。50mg pHBAH溶解在50mL冰浴柠檬酸/NaOH溶液中，终浓度为0.1%(w/v)，并且溶液保持在冰上。150μL pHBAH溶液加入50μL样品和葡萄糖标准溶液中，并且在100℃孵化试管10分钟。该试管在室温下孵化5分钟。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度，并且用线性回归将数据拟合成直线。相关系数(R2)值在0.98和1.0之间。标准曲线方程用于基于样品的吸光度计算样品的还原性端的浓度。
图40展示了用HPLC分析的Cb1954TM3在纤维素底物上的酶活性。检验了三种不同的纤维素底物：微晶纤维素、CMC-Na和PASC。对每种实例而言，在存在Cb1954TM3的情况下，释放葡萄糖和纤维二糖。在缺乏Cb1954TM3的情况下，所有的底物既观察不到葡萄糖也观察不到纤维二糖。结果显示，该酶从纤维素底物（CMC-Na和PASC）中释放葡萄糖和纤维二糖以及更长链的低聚糖作为最终产物。
图41展示了Cb1954TM3的耐热性。分别在70℃、75℃、80℃和85℃孵化24小时后，Cb1954TM3具有75%、87%、64%和7%的活性。在不同的温度（70℃、75℃、80℃和85℃）中保持500nM Cb1954TM3。在PH5.5，95℃，恒温混匀器上测量该酶的活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且将10μl蛋白质样品加入底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.方法(同上)测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
实施例12：内切葡聚糖酶Cb1946
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种推定的内切葡聚糖酶Cb1946WT，该酶为Cb1946WT的基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。Cb1946WT蛋白质长度为1271个氨基酸并且分子量为139.8kDa(组氨酸标签+Cb1946蛋白质)。Cb1946WT具有具有在N端区的糖苷水解酶（GH）家族5催化域，C端区的GH家族44催化域和在两个GH催化域之间的2个碳水化合物结合模块(CBM)（图42）。对于去尾突变体，Cb1946TM1(653个氨基酸,71.3kDa)具有N端GH5催化域和2个碳水化合物结合模块，而Cb1946TM2(1015个氨基酸,111.0kDa)具有C端GH44催化域和2个碳水化合物结合模块,如图42所示。
克隆Cb1946WT
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增该野生型基因及其两个去尾突变体（图42）。用下面的引物组和步骤扩增编码Cb1946WT、Cb1946TM1和Cb1946TM2的核苷酸序列：
Cb1946WT正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GAT GGA GTAGTG AAG-3’(SEQ ID NO:82)
Cb1946WT反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT AGT TTG TAC TGA GGTTGA ATA TAA AAC GAT ATG G-3’(SEQ ID NO:83)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1946TM1
Cb1946TM1正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GCT ACA TCT AAT GAT GGA GTAGTG AAG-3’(SEQ ID NO:82)
Cb1946TM1反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAG TTA AAC CTT ATC TGT ATCTCC CCT GTG TC-3’(SEQ ID NO:84)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
克隆Cb1946TM2
Cb1946TM2正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG GTA GGG TAC TTG GAC ATG GTAAAC AAT TGG GA-3’(SEQ ID NO:85)
Cb1946TM2反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAA TTT AGT TTG TAC TGA GGTTGA ATA TAA AAC GAT ATG G-3’(SEQ ID NO:83)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb1946基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将扩增片段从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于使插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μL25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5分钟。
将Cb1946-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过电穿孔方法导入E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，并用于接种6mLLB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液中提取小量质粒(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确定该基因插入质粒中后，对基因或编码序列进行测序以确定其一致性或完整性。
在基因表达中，将一种质粒通过热休克法转移到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂于添加了氯霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，并在37℃过夜孵化。将5到6个菌落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的3ml LB培养液中，并培养4小时。将1mL该培养物加入到添加了两种相同浓度的抗生素的500mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm的吸光度达到～0.25。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃下连续过夜培养。
Cb1946WT、Cb1946TM1和Cb1946TM2的基因和蛋白质序列
野生型Cb1946氨基酸序列
SEQ ID NO:86公布了野生型Cb1946的氨基酸序列。在所有PCR扩增期间，移除与SEQ ID NO:Cb1946第1-38号的氨基酸对应的Cb1946的信号肽。因此，表达的野生型Cb1946蛋白质不含SEQ ID NO:86的第1-38号的氨基酸。SEQ ID NO:87公布了不含信号肽的野生型Cb1946蛋白质的氨基酸序列。
将野生型Cb1946（不含信号肽）的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:91公布了带该短肽的野生型Cb1946氨基酸序列（不含信号肽）。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:91第1-14个氨基酸。
野生型Cb1946核苷酸序列
SEQ ID NO:88公布了野生型Cb1946核苷酸序列。在所有PCR扩增期间，移除与SEQID NO:88第1-114号的核苷酸对应的Cb1946的信号肽。因此，用于表达野生型Cb1946蛋白质的核苷酸不含SEQ ID NO:88的第1-114号的核苷酸。SEQ ID NO:89公布了编码不含信号肽的野生型Cb1946蛋白质的核苷酸序列。
SEQ ID NO:90公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的野生型Cb1946核苷酸序列（不含信号肽）。编码该短肽的核苷酸为SEQ ID NO:90第1-42个核苷酸。
Cb1946TM1氨基酸序列
SEQ ID NO:117公布了Cb1946TM1的氨基酸序列。将Cb1946TM1的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ IDNO:93公布了带该短肽的Cb1946TM1氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:93第1-14个氨基酸。
Cb1946TM1核苷酸序列
SEQ ID NO:118公布了Cb1946TM1核苷酸序列。SEQ ID NO:92公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1946TM1核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:92第1-42个核苷酸。
Cb1946TM2氨基酸序列
SEQ ID NO:113公布了Cb1946TM2的氨基酸序列。将Cb1946TM2的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ IDNO:95公布了带该短肽的Cb1946TM2氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:95第1-14个氨基酸。
Cb1946TM2核苷酸序列
SEQ ID NO:112公布了Cb1946TM2核苷酸序列。SEQ ID NO:94公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb1946TM2核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:94第1-42个核苷酸。
Cb1946WT、Cb1946TM1和Cb1946TM2蛋白质的纯化
在E.coli BL-21CodonPlus(DE3)RIL感受态细胞中通过热休克表达Cb1946WT及其去尾突变体Cb1946TM1和Cb1946TM2。重组细胞在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上37℃过夜生长。8小时后，起始培养液稀释到添加了氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的新鲜的LB中，37℃，通风培养直到在600nm的吸光度达到0.5。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在低至16℃的温度培养，诱导基因表达。16小时后，离心该细胞以收集细胞团。随后该团悬浮于裂解缓冲液(25mM Tris-HCLpH7.8,750mM of NaCl,5%甘油,20mM咪唑,1.25%Tween-20)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的蛋白质)随后用洗脱液(50mMTris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。接着洗脱馏分在65℃热处理30分钟，然后离心以移除沉淀的蛋白质。接着用Tris-HCl洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)通过凝胶过滤层析(HiLoad16/20Superdex200,GE Healthcare)纯化该蛋白质。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析部分洗脱馏分，并且通过考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染色，可观察到蛋白质条带(图43)。
酶活性
图44展示Cb1946WT、Cb1946TM1、Cb1946TM2在羧甲基纤维素(CMC)琼指平板上的酶谱。该琼指平板用CMC底物（终浓度0.25%，w/v）制备。将1μg每种蛋白质在琼指-CMC平板上点样，37℃过夜孵化该平板，然后，用0.1%刚果红染色，并且用1M NaCl脱色，可以看到该凝胶。如图44所示，Cb1946WT和Cb1946TM2在琼脂平板展示了明显的晕轮，表明纤维素酶活性，但Cb1953TM1蛋白质没有。
图45展示了Cb1946WT、Cb1946TM1和Cb1946TM2在磷酸膨胀纤维素（PASC）上的酶活性。每种酶（终浓度0.5μM）与终浓度为1%的磷酸膨胀纤维素（PASC）在50mM柠檬酸盐-150mMNaCl，pH6.0，75℃中反应16小时。该反应通过薄层层析（TLC）解决。使用由10:5:1(vol/vol/vol)正丁醇：乙酸：水组成的移动相和10cm x20cm的平板。对于水解产物的更多定量分析，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析样品（图46）。对于HPAEC分析，每100μL稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTMPA1guard(4x50mm)和来自Dionex Corporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。对于TLC和HPLC分析，使用葡萄糖和五种不同的纤维低聚糖：纤维二糖、纤维三糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和纤维六糖作为标准样。基于TLC和HPLC的结果，Cb1953WT和Cb1953TM2显示明显从PASC底物释放产物比如葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，表明Cb1946WT和Cb1953TM2具有纤维素酶活性，但Cb1953TM1没有。
实施例13：内切纤维素酶Cb629
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种推定的内切纤维素酶Cb629，该酶Cb629TM1为Cb629的基因产物的去尾突变体，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。内切纤维素酶起初从纤维素裂解葡萄糖，纤维二糖和纤维三糖。Cb629TM1蛋白质长度为562个氨基酸并且分子量为63.7kDa(组氨酸标签+Cb629TM1蛋白质)。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族5催化域和碳水化合物结合模块(CBM)家族17_28域。此外，用于分泌的N端信号肽（SP）和3个表层同源(SLH)结构域用于将该酶锚定至细胞表面。由于该SP和SLH是非催化的，通过下文所述的PCR扩增将其从多肽裂解，并且该基因产物命名为Cb629TM1。
克隆Cb629TM1
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增Cb629TM1基因。用下面的引物组扩增Cb629TM1基因：
Cb629TM1正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG CAG AGC ATA CTG TAT GAA AAGG-3’(SEQ ID NO:96)
Cb629TM1反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAC TCA AAA AGG ATA TTG GTAAAT C-3’(SEQ ID NO:97)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb629TM1。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将扩增片段从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于使插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μL25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5分钟。
将Cb629TM1-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过化学转化方法导入E.coliNovaBlue感受态细胞中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mL LB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液中提取小量质粒(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确定该基因已经插入质粒中后，对基因进行测序以确定编码序列的一致性。
在基因表达中，将一种质粒通过热休克法转移到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂在添加了氯霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，并在37℃孵化过夜。将5到6个群落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的10ml LB培养液中，并培养6小时。将10mL培养物加入添加了两种相同浓度的抗生素的1000mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.3。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃连续培养过夜。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团。随后该团悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCL pH7.5,300mM NaCl)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的Cb629TM1)随后用洗脱液(50mM Tris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。
PCR引物的设计确保该蛋白质融合至在质粒中编码的6个组氨酸。该6个组氨酸会结合到带电镍或带电钴树脂上。该绑定蛋白质可以用含有咪唑的缓冲液从树脂中取代出来。该方法便于蛋白质的快速纯化。
Cb629WT和Cb629TM1的基因和蛋白质序列
野生型Cb629的氨基酸序列
SEQ ID NO:98公布了野生型Cb629内切纤维素酶(EC3.2.1.4)的氨基酸序列。Cb629的信号肽与SEQ ID NO:98第1-29号的氨基酸对应。SEQ ID NO:119公布了不含信号肽的野生型Cb629的氨基酸序列。
野生型Cb629的核苷酸序列
SEQ ID NO:99公布了野生型Cb629核苷酸序列。Cb629的信号肽与SEQ ID NO:99第1-87号的核苷酸对应。SEQ ID NO:120公布了编码不含信号肽的野生型Cb629蛋白质的核苷酸序列。
Cb629TM1的氨基酸序列
SEQ ID NO:100公布了Cb629TM1内切纤维素酶(EC3.2.1.4)的氨基酸序列。将Cb629TM1基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:103公布了带该短肽的Cb629TM1氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:103第1-14个氨基酸。
Cb629TM1核苷酸序列
SEQ ID NO:101公布了Cb629TM1核苷酸序列。SEQ ID NO:102公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的Cb629TM1的核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ IDNO:102第1-42个核苷酸。
Cb629TM1编码序列在E.coli细胞中表达，并且通过一个步骤即，利用质粒编码的6个组氨酸的talon树脂纯化步骤纯化该蛋白质。图48展示了纯化的Cb629TM1的SDS-PAGE。
酶活性
图49展示了Cb629TM1在底物上的酶活性，产物通过还原糖试验确定。检验了三种不同的纤维素：微晶纤维素、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和磷酸膨胀纤维素（PASC）。酶与该底物孵化导致产物释放，该产物以葡萄糖当量的浓度量化。PASC的水解程度比其它底物的水解程度高。
在对微晶纤维素、CMC-Na和PASC进行酶水解后，根据Lever,M.方法(同上)确定葡萄糖当量的浓度。将1.5ml微量离心管在分析天平上“归零”。接着，将2±0.1mg微晶纤维素或甘露聚糖加入每个试管中，并且测量并记录质量。基于该质量计算需要加入每个试管中的体积。对于CMC-Na和PASC，使用CMC-Na(2%)和PASC(6.11mg/ml)的底物储备液。以反应缓冲液为开始，在每个试管中加入柠檬酸钠反应缓冲液和酶。该试管在Thermomixer R(Eppendorf)，75℃以恒速混合孵化16h。试管以4℃，10,000rpm离心5分钟。50μL样品上清液转移到干净的1.5mL离心管中用于pHBAH分析。1mL葡萄糖储备液用柠檬酸钠缓冲液制备成浓度为100mM。然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释成以下浓度(20mM,10mM和5mM)。50mgpHBAH溶解在50mL冰浴柠檬酸/NaOH溶液中，终浓度为0.1%(w/v)，并且溶液保持在冰上。150μLpHBAH溶液加入50μL样品和葡萄糖标准溶液中，并且在100℃孵化试管10分钟。该试管在室温下孵化5分钟。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度，并且用线性回归将数据拟合成直线。相关系数(R2)值在0.98和1.0之间。标准曲线方程用于基于样品的吸光度计算样品的还原性端的浓度。
图50展示了用HPLC分析的Cb629TM1在底物上的酶活性。检验了三种不同的纤维素底物：微晶纤维素、CMC-Na和PASC。对每种实例而言，在存在Cb629TM1的情况下，释放葡萄糖和纤维二糖。在缺乏Cb629TM1的情况下，所有的底物既观察不到葡萄糖也观察不到纤维二糖。结果显示，该酶从纤维素底物（微晶纤维素、CMC-Na和PASC）中释放葡萄糖和纤维二糖作为最终产物。
图50展示了该酶也能从纤维低聚糖释放大部分的二糖（纤维二糖）和葡萄糖。该酶不能水解纤维二糖（在图中为G2）。
图52展示了Cb629TM1的耐热性。在60℃、65℃、70℃、75℃和80℃分别孵化24小时后，Cb629TM1具有109%、99%、96%、83%和34%活性。在不同的温度（60℃、65℃、70℃、75℃和80℃）中保持500nM Cb629TM1。在不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h)取出样品，并立即用于酶活性测量。在PH5.5，70℃，恒温混匀器上测量酶活性。用于测量的PASC终浓度为2.5mg/ml，并且加入8.31μl蛋白质样品至底物中并上下颠倒试管若干次进行混合。总体积是100μl。根据Lever,M.方法(同上)测量与葡萄糖当量对应的还原性末端。计算10分钟中的反应速率。0时刻反应速率设定为100；接着分别用0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h时刻的反应速率除以0时刻的反应速率，然后与100相乘，计算出0.5h、1h、2h、4h、7h、11h和24h的残余活性（百分比）。
实施例14：β-葡萄糖苷酶Cb486
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种推定的β-葡萄糖苷酶Cb486，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。β-葡萄糖苷酶催化纤维二糖（葡萄糖的二糖）水解为2个单位的葡萄糖。Cb486蛋白质长度为466个氨基酸并且预测分子量为54.9kDa(组氨酸标签+Cb486蛋白质)。该蛋白质具有糖苷水解酶（GH）家族1催化域（图53A）。
克隆Cb486
使用iProofTM High-Fidelity DNA 聚合酶 (BIO-RAD)通过PCR从Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725T基因组DNA中，扩增Cb486基因。用下面的引物组扩增Cb486基因。
Cb486正向引物：5’-GAC GAC GAC AAG ATG AGT TTA CCA AAA GGA TTT CTG TGGGGT GC-3’(SEQ ID NO: 104)
Cb486反向引物：5’-GAG GAG AAG CCC GGT TAT GAG TTT TCC TTT ATA TAC TGCTG-3’ (SEQ ID NO: 105)
聚合酶链反应混合物包含以下物质：
PCR反应
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环。
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb486基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将DNA从胶中提取出来。
用Novagen pET-46 Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46 Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于将插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μL l25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5min。
将Cb486-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过电穿孔导入E.coli JM109中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mL LB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液进行质粒小量提取(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确认该基因已经插入该质粒中后，对插入片段进行测序以确定其序列的一致性和完整性。
在基因表达中，一种正确的质粒通过热休克法转化到E.coli BL21codon plusDE3RIL中，并涂在添加了氯霉素(100μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板上，并在37℃下培养过夜。将5到6个群落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的3ml LB培养液中，并培养4小时。将1mL的培养物加入添加了两种相同浓度的抗生素的500mL LB培养液中，并在37℃下培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.25。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃连续培养过夜。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团。随后该团悬浮于裂解缓冲液(25mM Tris-HCL pH7.8,750mM NaCl,5%甘油,20mM咪唑,1.25%Tween-20)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。离心使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的Cb486)随后用洗脱液(50mM Tris-HCL,pH7.5,250mM咪唑)从树脂中洗脱。
Cb486的基因产物以其全长的形式表达。PCR引物的设计确保该蛋白质融合至在质粒中编码的6个组氨酸。该6个组氨酸会结合到带电镍或带电钴树脂上。该绑定蛋白质可以用含有咪唑的缓冲液从树脂中替换出来。该方法便于感兴趣的蛋白质的快速纯化。
Cb486WT的基因和蛋白质序列
野生型Cb486氨基酸序列
SEQ ID NO:106公布了野生型Cb486β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)的氨基酸序列。将野生型Cb486的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:109公布了带该短肽的野生型Cb486氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ ID NO:109第1-14个氨基酸。
野生型Cb486核苷酸序列
SEQ ID NO:107公布了野生型Cb486核苷酸序列。SEQ ID NO:108公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的野生型Cb486核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQID NO:108第1-42个核苷酸。
在E.coli细胞中表达Cb486基因，并且通过一个步骤—利用质粒编码的6个组氨酸的talon树脂纯化步骤来纯化该蛋白质。图53B展示了纯化的Cb486的SDS-PAGE。
酶活性
图54展示了通过薄层层析（TLC）分析的Cb486在低聚木糖(X2-X6)上的酶活性。检测了下面的低聚木糖(X2-X6)：木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖。该实验通过低聚木糖过夜水解，接着用TLC溶解产物来完成。对每种实例而言，在存在Cb486的情况下，释放木糖和木二糖。在缺乏Cb486的情况下，对于木二糖，仅观察到少量的木糖；对于其它低聚木糖，没有观察到水解产物。结果显示，该酶从低聚木糖（木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖）中释放木糖和木二糖。
图55展示了该酶也能将从纤维二糖（通过β1,4键连接的2个葡萄糖单位）至纤维六糖（通过β1,4键连接在一起的6个葡萄糖单位）的纤维低聚糖裂解成葡萄糖。因此，当加上释放葡萄糖短链的内切葡聚糖酶时，该酶能将该短链转化成单糖葡萄糖。多功能活性（不同键的裂解）使该酶成为用于水解复杂多糖的酶混合物中的重要的酶。
图56A和56B分别展示了Cb486的活性的PH和温度图谱。
实施例15：用于水解芒草（Miscanthus）的、来自Caldicellulosiruptor bescii的纤维素酶混合物
基于上述分析。重新构建含有Cb629TM1、Cb486、Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2和Cb1954TM3的纤维素酶混合物以代表Caldicellulosiruptor bescii纤维素(图57)。也制备之前重新构建的Caldicellulosiruptor bescii半纤维素酶(图58)以检验与纤维素酶混合物的协同效果。所有的酶混合物（每种0.5μM）与2%、5%和8%预处理(高压芒草&1%NaOH处理的+微波芒草)样品在50mM柠檬酸-150mMNaCl缓冲液(pH6.5)反应，75℃摇动过夜。
该反应通过薄层层析(TLC)解决，使用由10:5:1(vol/vol/vol)正丁醇：乙酸：水组成移动相和10cmx20cm平板（图59、61、63和65）。
在进一步分析水解产物中，通过高效阴离子交换层析(HPAEC)分析8%底物反应样品(图60、62、64和66；即图60为来自图59的样品的HPAEC数据，图62为来自图61的样品的HPAEC数据等等)。在HPAEC分析中，将每100μL稀释样品注入Beckman Coulter(Fullerton,CA)的System Gold HPLC仪器中，该仪器配有CarboPacTM PA1guard(4x50mm)和来自DionexCorporation(Sunnyvale,CA)的分析柱(4x250mm)以及来自ESA Biosciences(Chelmsford,MA)的Coulochem III电化学检测器。
对于TLC（图59、61、63和65）和HPLC分析（图60、62、64和66），使用葡萄糖(C1)和五种不同的纤维低聚糖：纤维二糖(C2)、纤维三糖(C3)、纤维四糖(C4)、纤维五糖(C5)和纤维六糖(C6)作为标准样。为了分离木聚糖和葡萄糖，使用Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm,BioRad)和LC-20AT HPLC(SHIMADZU)，其中5mM硫酸作为移动相并且65℃时流速为0.6mL/mL
基于图59-62的TLC和HPLC数据，在存在纤维素酶和半纤维素酶两者的情况下，该纤维素酶和半纤维素酶在预处理的芒草样品上协同地释放的葡萄糖和木糖比相同的单独的纤维素酶混合物释放的葡萄糖量或相同的单独的半纤维素酶混合物释放的木糖量更多。例如，如图60所示，当存在半纤维素酶混合物时，纤维素酶混合物从微波预处理芒草释放的葡萄糖（道4，C1峰；～11mM）比当该纤维素酶混合物单独作用于芒草时(道2,C1峰;～7mM)更多。同样，如图60所示，当存在于纤维素酶混合物时，半纤维素酶混合物从预处理芒草释放的木糖(道4,X1峰;～6mM)比半纤维素酶混合物单独作用于芒草(道2,X1峰;～3mM)时更多。如图61和62所示，纤维素酶和半纤维素酶之间的协同作用也用高压预处理芒草获得。因此，在此提供的结果展示了惊人的结果，含有在此公开的纤维素酶混合物和在此公开的半纤维素酶的酶合剂在纤维素和半纤维素混合物之间展示了协同活性。
图59-62的结果也表明从微波预处理芒草（图59和60）中释放的产物比从高压预处理芒草（图61和62）中释放的产物更多。
在图63-66中，在两种预处理样品上检验了不含Cb486(β-葡萄糖苷酶)的酶混合物。结果表明不含β-葡萄糖苷酶(Cb486)的酶混合物主要释放纤维二糖。图63的道4和64的结果表明不含β-葡萄糖苷酶的半纤维素酶和纤维素酶混合物将从微波样品中主要释放木糖和纤维二糖。以高压芒草作为底物的相同的试验获得的数据相同（图65和66）。
实施例16：热休克蛋白质Cb1581
在Caldicellulosiruptor bescii中鉴定出一种小热休克蛋白质Cb1581，该蛋白质为Cb1981的基因产物，其中Cb代表Caldicellulosiruptor bescii。该蛋白质长度为162个氨基酸并且分子量为19.68kDa(组氨酸标签+Cb1581蛋白质)。
克隆Cb1581
使用PrimeSTAR DNA聚合酶(TaKaRa)通过PCR从Caldicellulosiruptor besciiDSM6725T基因组DNA中扩增Cb1581基因。用下面的引物组扩增Cb1581基因：
Cb1581正向引物：5’-GACGACGACAAGATGCTCAGAGACATAGTTCCATTTGGC-3’(SEQ IDNO:144)
Cb1581反向引物：5’-GAGGAGAAGCCCGGTTATTCTATATCAATTGTTCTTACATC-3’(SEQ IDNO:145)
聚合酶链反应混合物包括以下物质：
PCR混合物
为了从基因组DNA扩增该基因，使用以下PCR循环：
PCR方案
在上述的PCR反应之后，通过1%的琼脂糖凝胶电泳来确认扩增的Cb1581基因。在胶上切出与预期条带对应的DNA，并且用Qiagen Gel Extraction kit将该DNA从胶中提取出来。
用Novagen pET-46Ek/LIC kit处理纯化的DNA并将该DNA连接至pET-46Ek/LIC载体。对纯化的DNA的处理如下：
反应后，在75℃孵化20分钟使该酶失活。
以下方案用于使插入片段退火连接至pET-46Ek/LIC载体。
然后加入0.5μl25mM EDTA。搅拌管子末端，进行混合。在22℃孵化5分钟。
将Cb1581-pET-46Ek/LIC的连接混合物通过电穿孔方法导入E.coli XL10-Gold中，并且该细胞涂在LB-氨氨苄青霉素平板上。在37℃过夜培养后，选择四个菌落，分别用于接种6mL LB-氨氨苄青霉素培养液。该培养液在37℃，充分通风的环境下生长16小时，并从该细胞培养液中提取小量质粒(QIAGEN).。随后质粒在1%琼脂糖胶中进行电泳来确定质粒DNA的大小。在确定该基因已经插入质粒中后，对基因进行测序以确定其一致性。
在基因表达中，将一种质粒通过热休克法转移到E.coli BL21codon plus DE3RIL中，并涂在添加了氯霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，并在37℃孵化过夜。将5到6个群落接种到添加了两种相同浓度的抗生素的10ml LB培养液中，并培养6小时。将10mL培养物加入添加了两种相同浓度的抗生素的1000mL LB培养液中，并在37℃培养，直到在600nm下的吸光度达到～0.3。随后加入诱导剂IPTG，使其最终浓度为0.1mM，并在16℃连续培养过夜。
蛋白质纯化
将培养液离心，收集细胞团。随后该团悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCL,300mMNaCl,pH7.5)中。通过弗氏压碎器释放细胞中的蛋白质。10000rpm离心30分钟使细胞碎片成团后，将上清液应用于带电钴树脂上（TALON,Clontech），并洗3遍以移除未绑定的蛋白质。绑定的蛋白质(6个组氨酸标记的Cb1581)随后用洗脱液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,250mM咪唑,pH7.5)从树脂中洗脱。
PCR引物的设计确保该蛋白质融合至在质粒中编码的6个组氨酸。该6个组氨酸会结合到带电镍或带电钴树脂上。该绑定蛋白质可以用含有咪唑的缓冲液从树脂中取代出来。该方法便于感兴趣的蛋白质的快速纯化。
Cb Cb1581的基因和蛋白质序列
野生型Cb1581氨基酸序列
SEQ ID NO:146公布了野生型Cb1581的氨基酸序列。将野生型Cb1581的基因克隆到质粒pET-46Ek/LIC的步骤使该基因融合至编码含有6个组氨酸的多肽的短核苷酸序列。SEQ ID NO:149公布了带该短肽的野生型Cb1581氨基酸序列。该短肽的氨基酸为SEQ IDNO:149第1-14个氨基酸。
野生型Cb1581的核苷酸序列
SEQ ID NO:147公布了野生型Cb1581的核苷酸序列。SEQ ID NO:148公布了带来自质粒pET-46Ek/LIC的短肽编码序列的野生型Cb1581核苷酸序列。编码该短肽的核苷酸为SEQ ID NO:148第1-42个核苷酸。
在E.coli细胞中表达Cb1581基因，并且通过一个步骤即，利用质粒编码的6个组氨酸的talon树脂纯化步骤纯化该蛋白质。图83展示了纯化的Cb1581的SDS-PAGE。
微波预处理的芒草的增强的酶水解作用
图84展示了70℃(图84A)或80℃(图84B)，Cb1581在微波预处理芒草上的酶水解的增强效果。在pH6.0，用每种0.5μM的纤维素酶/半纤维素酶的酶混合物，总体积500μl并以10%芒草作为底物进行酶水解。混合物中的酶包括Cb1946TM2、Cb1952TM1、Cb1953TM2、Cb1954TM3、Cb629TM1、Cb486、Cb193、Cb195、Cb2487、Cb1172、Cb909和Cb162。将2ml微量离心管在分析天平上“归零”。接着，将50±0.2mg微波预处理的芒草加入每个试管中。该试管在EchoThermTMRT11变速旋转混合器（EchoThermTMRT11Variable Speed Rotating Mixers，Torrey Pines Scientific）中，以恒速旋转，70℃或80℃孵化24小时。
在对微波预处理芒草进行酶水解后，根据Lever,M.方法(A new reaction forcolorimetric determination carbohydrates.Anal.Biochem.1972:47;273-279)确定葡萄糖当量的浓度。反应后试管以4℃，10,000rpm离心5分钟。45μL的水和5μL样品上清液转移到干净的1.5mL离心管中用于pHBAH分析。1mL葡萄糖储备液用柠檬酸钠缓冲液制备成浓度为100mM。然后用柠檬酸钠缓冲液连续稀释成以下浓度(20mM,10mM和5mM)。50mg pHBAH溶解在50mL冰浴柠檬酸/NaOH溶液中，终浓度为0.1%(w/v)，并且溶液保持在冰上。150μL pHBAH溶液加入50μL样品和葡萄糖标准溶液中，并且在100℃孵化试管10分钟。该试管在室温下孵化5分钟。测量标准样和样品在410nm的波长。互相对应绘制A410nm和葡萄糖浓度，并且用线性回归将数据拟合成直线。相关系数(R2)值在0.98和1.0之间。标准曲线方程用于基于样品的吸光度计算样品的还原性端的浓度。在70℃和80℃，糖的释放量随反应混合物中的Cb1581的增加量而提高。
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Claims (3)

1.一种生产Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶和Caldicellulosiruptorbesciiβ-木糖苷酶的方法，所述方法包括：
a)在足以支持重组核酸的表达的条件下，在培养基中培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码SEQ ID NO:3的Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶的重组核酸，和编码SEQID NO:27Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶的重组核酸；
b)从所述培养基和/或所述宿主细胞中收集Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶和Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶；
其中，所述内切木聚糖酶中木聚糖在温度为85℃，pH为6.0下的Km为1.33mg/mL至13.97mg/mL，木聚糖在温度85℃，pH为6.0下的Kcat为93.95s-1至7865s-1，木聚糖在温度为85℃，pH为6.0下的Kcat/Km为33.92ml/mg·s-1至562ml/mg·s-1,
其中，β-木糖苷酶具有90℃的最佳温度，低聚木糖在温度为90℃，pH为6.0下的Km为8.21mM，低聚木糖在温度为90℃，pH为6.0下的Kcat为619.1s-1，低聚木糖在温度为90℃，pH为6.0下的Kcat/Km为75.4ml/mg·s-1，
其中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
其中所述Caldicellulosiruptor bescii内切木聚糖酶Cb629多肽的序列为SEQ IDNOs:98；并且
其中所述Caldicellulosiruptor besciiβ-木糖苷酶Cb486多肽的序列为SEQ ID NO:106。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞进一步包括编码Caldicellulosiruptor bescii热休克蛋白质Cb1581多肽的重组核酸，其中Caldicellulosiruptor bescii热休克蛋白质Cb1581多肽的序列为SEQ ID NOs:146。
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