CN104583394A - 用内切葡聚糖酶处理纺织品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及尤其在生物磨砂和生物抛光工艺中，用于通过将纺织品用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理来制造纺织品的方法。
Description
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发明领域
本发明涉及尤其在生物磨砂和生物抛光工艺中，用于通过将纺织品用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理来制造纺织品的方法。
发明背景
纤维素酶或纤维素分解酶是涉及纤维素水解的酶。已知涉及三种主要类型的纤维素酶，即内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
纤维素酶存在广泛的工业应用。在纺织工业中，在牛仔布精加工中使用纤维素酶以使用生物磨砂工艺在牛仔布上建立流行的石洗外观。还将纤维素酶用于例如使用生物抛光工艺来清洁绒毛和预防球粒在棉布衣表面上的形成。
WO 9629397披露了在工业应用例如洗衣组合物中具备用于以下的性能的酶制品：用于新制造的纺织品的生物抛光，用于对纤维织物或衣服提供磨损的样子，并且用于处理纸浆。WO 9629397中的SEQ ID No:20是粪生粪壳菌纤维素酶的部分序列。
WO 2010/076388披露了在低温下具有实质性性能的真菌内切葡聚糖酶；该内切葡聚糖酶被用于处理纤维素材料，尤其在纺织工业上，例如在生物精加工或生物磨砂中。
WO 2008/151999披露了用于在单浴中处理纺织品的组合的漂白剂清洁、生物抛光和染色的一步工艺，其中这个使用纤维素酶的生物抛光步骤可在与染料相同的浴中进行。
在本领域中对新用于获得具有良好磨损效果和/或在生物抛光工艺中降低的起球形成趋势(尤其在低温下)的纤维素纺织品织物的内切葡聚糖酶和方法存在持续需要。
本发明目标是满足这些需要。
发明概述
本发明涉及一种用于通过将纺织品用选自下组的一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理而处理纺织品的方法，该组由以下各项组成：
(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
(b)一种由在中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；
(c)一种由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(d)一种在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及
(e)一个(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性；
其中该方法是在15℃-65℃的温度范围下进行。
在一个实施例中，该多肽获得自粪壳菌属，优选地获得自粪生粪壳菌。在一个实施例中，该方法在4-8的pH范围下进行。
在一个实施例中，该处理纺织品的方法是生物磨砂工艺。
在一些实施例中，该生物磨砂工艺可进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶以及纤维素酶。
在一些实施例中，该处理纺织品的方法是生物抛光工艺。在一些实施例中，该方法是在一个浴中用一种染料进行的。在一些实施例中，该方法是在一个浴中用过氧化氢酶进行的。
在一些实施例中，该处理纺织品的方法是一种用于制造纺织品的方法。在一些实施例中，该纺织品被从织物制备为衣服。
在一些实施例中，该纺织品是含纤维素的或纤维素的纺织品。
本发明的优点是，该方法可在低温下进行，例如50℃以下，以使得在纺织品制造工艺中节省能源。本发明的方法可进一步显示与染色步骤的良好兼容性。
发明详细说明
如在此使用的，单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如提到“一种过氧化物酶”包括使用一种或多种过氧化酶。一种方法的“一个步骤”意指至少一个步骤，并且它可以是一个、两个、三个、四个、五个或甚至更多个方法步骤。
如在此使用的，相对于对纺织品的多个酶处理的术语“顺序的”意指第二个指定的酶处理是在执行第一个指定的酶处理之后执行的。顺序的处理可由中间的洗涤步骤分开。顺序的酶处理是在“相同的浴或不同的浴中执行。“在相同的浴中”意指实质地相同的液体而没有中间的洗涤。单浴顺序的处理可包括在处理之间的pH调节、温度调节，和/或添加盐、活化剂、介导物等等，但不应包括洗涤或漂洗。
如在此使用的，相对于对纺织品的多个酶处理的术语“同时的”意指第二个指定的酶处理是与第一个指定的酶处理同时执行(即至少部分地与其重叠)。同时的酶处理必定“在相同的浴中”执行而没有中间的洗涤步骤。
定义
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键以及混合的β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或由还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。内切葡聚糖酶活性还可根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的264页的VI部分的程序，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定。
出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定内切葡聚糖酶活性。在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的内切葡聚糖酶活性。
典型地，该内切葡聚糖酶具有至少两个功能结构域、一个碳水化合物结合模块(CBM)和一个催化模块。该催化模块被定义为一种氨基酸序列，其能够酶促裂解纤维素，如具有内切葡聚糖酶活性。该催化模块不被认为是一种碳水化合物-结合模块。一种“接头序列”连接这两个功能模块。
碳水化合物-结合模块：术语“碳水化合物-结合模块”(CBM)被定义为一种可以结合至底物的氨基酸序列。例如，CBM被描述于布莱斯顿(Boraston)等人，生物化学杂志(2004)382，769-781和被描述于多姆等人，约翰N.萨德勒和迈克尔H.彭纳(Eds.)，ACS专题论文集系列第618号，1995。认为结合至底物的CBM增加该酶的催化活性部分的功效。
该术语CBM现在普遍采用；然而，术语“纤维素-结合结构域”(CBD)被用来描述CBM的子集，其特异性地结合至纤维素底物。结合上下文，具有内切葡聚糖酶活性的多肽的CBM或CBD可互换地使用。
家族45或家族GH45或CEL45：术语“家族45”或“家族GH45”或“CEL45”在此意指根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特B.和贝洛赫(Bairoch)A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族45的多肽。碳水化合物结合模块经常与催化模块编码酶(如糖基水解酶)相关联。纪廉(Guillén)D，桑切斯(Sánchez)S，罗德里格斯-萨诺贾(Rodríguez-Sanoja)R.碳水化合物-结合结构域：生物角色的多重性(Carbohydrate-binding domains:multiplicity of biological roles)。应用微生物学&生物技术二月2010:85(5):1241。可得到于：EDS基础索引，伊普斯威奇，MA。
粪生粪壳菌Cel45纤维素酶(缩写为Sf Cel45)及SEQ ID NO:2的成熟肽(SEQ ID NO:2的第22至294位氨基酸)。结合结构域已知可以与纤维素结合和相互作用。认为发现于Sf Cel45中的碳水化物结合结构域在某种程度上负责发现于本发明中的酶在应用中的特殊性能。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸进行表达所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中，该片段具有溶菌酶活性。在一个方面，一个片段包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸数目的至少85％、90％、以及95％。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在本发明的一个方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽的SignalP3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340:783-795)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至294。这进一步由N-末端测序确认，显示成熟肽从ASGSGK开始，其与SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是信号肽的预测一致。
本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。在一个方面，我会使用氨基酸的范围，例如该成熟多肽可以比预测的成熟多肽长或短达7、6、5、4、3、2或1个氨基酸，或可组成具有不同长度但具有基本相同功能的成熟多肽的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的核苷酸75至893，并且SEQ ID NO:1的核苷酸12至74编码信号肽。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的配置，其中控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列的适当位置处，使得控制序列指导编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性通过参数“序列一致性”来说明。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有内切葡聚糖酶活性的一个片段。在一个方面中，子序列包含SEQ ID NO:1的至少749个核苷酸，SEQ ID NO:1的至少793个核苷酸或SEQ ID NO:1的至少837个核苷酸。
变体：术语“变体”意指具有内切葡聚糖酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸置换；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻来添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
纺织品：此处使用术语“纺织品”意在包括纤维、纱线、织物以及衣服。
织物可以由纤维通过机织(weaving)、针织(knitting)或无纺操作(non-woven operation)来构建。纺织和针织需要纱线作为输入(input)，而无纺织物是随机连接纤维的结果(可以把毡认为是无纺的)。在本语境中，术语“织物”也旨在包括纤维和其他类型的加工的织物。
根据本发明，本发明的方法可以应用于本领域中已知的任何纺织品(机织物、针织物、或无纺物)。具体地，本发明的工艺可应用于含有纤维素的纺织品或纤维素纺织品，如棉、粘胶、人造纤维、苎麻、亚麻制品、莱赛尔纤维(lyocell)(例如：考陶尔兹纤维(Courtaulds Fibers)生产的天丝(Tencel))，或其混合物，或这些纤维中任一种与合成纤维(如聚酯、聚酰胺、尼龙)或其他天然纤维(如毛料和丝)的混合物，例如粘胶/棉混纺物(blend)、莱赛尔纤维/棉混纺物，粘胶/毛料混纺物、莱赛尔纤维/毛料混纺物、棉/毛料混纺物；亚麻(flax)(亚麻制品(linen))、苎麻和其他基于纤维素纤维的织物，包括所有的纤维素纤维与其他纤维如毛料、聚酰胺、丙烯酸和聚酯纤维的混纺物，例如粘胶/棉/聚酯混纺物、毛料/棉/聚酯混纺物、亚麻/棉混纺物等。
发明详细说明
具有内切葡聚糖酶活性的多肽
本发明涉及一种用于通过将纺织品用选自下组的一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理来处理纺织品的方法，该组由以下各项组成：
(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
(b)一种由在中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；
(c)一种由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(d)一种在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及
(e)一个(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性；
其中该方法是在15℃-65℃的温度范围下进行。
在本发明中，这种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸的差异。
本发明的多肽优选地包括或其组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另一个方面，多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，该多肽包括SEQ IDNO:2的氨基酸22至294或由其组成。
在一个实施例中，该多肽不是SEQ ID NO:2的少于200个氨基酸的成熟多肽片段。
在另一个实施例中，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽由以下多核苷酸编码：该多核苷酸在中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件下或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆对来自不同属或种的株系的具有内切葡聚糖酶活性的多肽进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与以上描述的探针杂交的并且编码出具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA对由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针所杂交的分子。
在一个方面中，该核酸探针是以下多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽是由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸所编码。
在另一个实施例中，SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入。在一个实施例中，引入进SEQID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如在H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述的。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的内切葡聚糖酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，FEBS快报309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内蛋白技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，EMBO杂志12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能与遗传(Proteins:Structure,Function,andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现的世界(DrugDiscovery World)4:35-48。
本发明的多肽的来源
本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。为了本发明的目标，结合给定来源，如在此使用，术语“获得自”应指由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的多核苷酸编码的多肽。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是粪壳菌属多肽。
在另一个方面，该多肽是一种粪生粪壳菌例如粪生粪壳菌ATCC 52644、人粪壳、大孢粪壳(Sordaria macrospora)例如大孢粪壳ATCC 60255、短颈粪壳(Sordaria brevicollis)或帕派里古洛粪壳(Sordaria papyricola)多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上)。
其他组分
在本发明的一些实施例中，包含具有内切葡聚糖酶活性的多肽的本体溶液进一步包括其他组分，包括而不限于其他酶连同表面活性剂、漂白剂、消泡剂、助洗剂系统等等中的一种或多种，这些组分增强生物抛光和/或生物磨砂工艺和/或提供与例如可染性和/或可湿性相关的优越效果。该水性溶液还可包含染料。
其他适合用于本发明中的酶包括而不限于过氧化氢酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和过氧化物酶/氧化酶。
过氧化氢酶
在一个优选实施例中，在本发明中使用过氧化氢酶。术语“过氧化氢酶”此处被定义为一种过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6)，其催化2H2O2向O2+2H2O的转化。出于本发明的目的，根据美国专利号5,646,025确定过氧化氢酶活性。
适合的过氧化氢酶的非限制实例披露于WO 92/17571、CN 1563373、US2003100112、EP 1336659、US 2003074697、US 6201167、US 6022721、EP931831、JP 11046760、WO 9317721、WO 9309219、JP 1086879和/或JP63003788中。优选的可商购过氧化氢酶包括Terminox Ultra，TerminoxSupereme(诺维信A/S)；T 100；Oxy-Gone 400(杰能科国际公司(GenencorInternational Inc.))；Fermcolase 1000，Thermocatalase CTL 200或JH CT 1800(三菱瓦斯化学(Mitsubishi Gas Chemical))。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选是微生物来源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，特别是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。
适用蛋白酶的实例为在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、以及WO 98/34946中描述的变体，特别是具有在一个或多个以下位置处的取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
优选的可商购蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM、和FN3TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)的脂肪酶，例如来自如在EP 258068和EP 305216中描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))；来自腐质霉属的角质酶，例如在WO 96/13580中描述的特异腐质霉(H.insolens)；一种假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；一种芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达托斯(Dartois)等人，1993，生物化学与生物物理学学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131:253-360)、嗜热脂肪芽杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其他实例是脂肪酶变体，例如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/060063、WO2007/087508以及WO 2009/109500中描述的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman TextileEffects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。
淀粉酶
适合的淀粉酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶，优选细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括衍生自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如，在GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株及其变体。
淀粉酶变体的实例描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、以及WO 97/43424中，特别是具有在一个或多个以下位置处的取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、以及444。
可商购的淀粉酶是Stainzyme；Stainzyme Plus；DuramylTM、TermamylTM、Termamyl Ultra；Natalase、FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S(诺维信公司))、RapidaseTM和PurastarTM(来自Genencor International Inc.(杰能科国际公司))。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括完整的纤维素酶或细菌或真菌来源的单组分内切葡聚糖酶。包括化学或遗传修饰的突变体。该纤维素酶例如可以是单组分或单组分内切-1,4-β-葡聚糖酶(常称作内切葡聚糖酶)的混合物。适合的纤维素酶包括一种真菌纤维素酶，来自特异腐质霉(US 4,435,307)或来自木霉属，例如里氏木霉或绿色木霉。纤维素酶的实例在EP 0495257进行了描述。其他适合的纤维素酶来自梭孢壳属，例如如WO 96/29397中所述的土生梭孢壳或如WO91/17244中所述的尖孢镰孢菌或来自芽孢杆菌属，如WO 02/099091和JP2000210081中所述的。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307中描述的那些。可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(GenencorInternational Inc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
过氧化物酶/氧化酶
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO 93/24618、WO95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
纺织品制造工艺
将织物例如纤维素材料的织物加工成衣服制造备用材料涉及几个步骤：将该纤维纺成纱线；从该纱线建造机织(woven)或针织(knit)织物；以及后续的预制工艺、染色/印刷和精加工操作。预制工艺对于去除来自纤维的天然或人工诱导的杂质以及对于在例如染色/印刷和精加工之前改进其美学外观和可加工性是必要的。常用预制工艺包括脱浆(对于机织物品)、煮炼和漂白，其产生适合于染色或精加工的织物。
机织物是通过在织机(loom)上沿纵轴向方向伸展的经纱之间纺织“纬纱(filling)”或“纬线(weft)”而构建的。为了润滑和防止在纺织过程中纬纱高速插入时的磨损，经纱在纺织之前必须上浆。常用的上浆剂是淀粉(或淀粉衍生物以及修饰的淀粉)、聚(乙烯醇)、羧甲基纤维素(即CMC)，其中主要是淀粉。石蜡、丙烯酸粘合剂和多种润滑剂通常被包括在该上浆混合物中。该纬纱可以穿过经纱以“上一个-下一个(over one-under the next)”的方式纺织(平织(plain weave))，或以“上一个-下两个(over one-under two)”(斜纹织(twill))或任何其它无数种变换。通常，服装(dress)、衬衫、裤子、被单类(sheeting’s)、毛巾、带褶布(draperies)等从机织物产生。制成织物之后，在织物上的浆必须被再次去除(即退浆)。
针织是通过将连锁的纱线环连接到一起形成织物。与由两种类型的纱线构建的并且具有许多“末端”的纺织相反，针织物是从单根连续的纱线产生。与纺织一样，有许多不同的方式把纱线环编到一起，并且最终织物的特性依赖于该纱线和针织类型两者。内衣、毛衣(sweater)、袜子、运动衫、绒衣(sweatshirt)等是从针织物得到。
退浆
退浆是从机织物中的纱线降解和/或去除上浆化合物。淀粉通常通过酶退浆程序去除。此外，有时使用氧化退浆和采用酸或碱的化学退浆。
在一些实施例中，该退浆酶是一种淀粉分解酶，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、甘露聚糖酶、葡糖淀粉酶、或其组合。
适合的α和β-淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些，连同化学或遗传修饰的突变体以及这类淀粉酶的变体。适合的α-淀粉酶包括可从芽孢杆菌属物种获得的α-淀粉酶。适合的商业淀粉酶包括但不限于 和(都来自杰能科国际公司)，以及DURAMYLTM、ERMAMYLTM、FUNGAMYLTM TERMAMYLTM、AQUAZYMETM和BANTM(都可从诺维信A/S，巴格斯瓦德(Bagsvaerd)，丹麦获得)。
其他适合的淀粉分解酶包括CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶，EC 2.4.1.19)，例如从芽孢杆菌属、高温厌氧杆菌属或高温厌氧细菌(Thermoanaero-bacterium)获得的那些。
煮炼
煮炼用以从这些纤维中去除杂质，以膨润这些纤维并去除种皮。它是最关键的步骤之一。煮炼的主要目的是a)均匀地清洁该织物，b)软化这些屑和其他废物，c)织物吸收性，d)皂化并溶解脂肪、油、以及蜡，以及e)使得改进不成熟棉最少化。在约沸腾温度进行氢氧化钠煮炼对于100％棉是接受的处理，而氢氧化钙和碳酸钠是不常使用的。合成纤维是在更温和的条件下煮炼的。表面活性剂和螯合剂对于碱煮炼是至关重要的。已引进了酶煮炼，其中纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、脂肪酶、以及蛋白酶都被报道具有煮炼作用。
漂白
漂白是对颜料色和/或有色杂质的破坏以及种皮片段去除。它是最关键的化学处理，因为必须保持洁白程度与不损害纤维之间的平衡。漂白是通过利用氧化或还原化学执行的。氧化剂可进一步细分到采用或产生以下的那些：a)次氯酸盐(OCl-)、b)二氧化氯(ClO2)、以及过氧化氢种类。还原剂典型是二氧化硫、亚硫酸氢盐等。已经报道了使用葡糖氧化酶的酶漂白。传统地，在此工艺中使用过氧化氢。
印刷或染色
通过任何适合的用于将染料结合到纺织品中的纤维的方法，纺织品的印刷或染色是通过将染料(名词“染料(dye以及dyestuff)”可在该上下文中互换使用)施用到该纺织品来进行。纺织品的染色例如是通过以下方式进行：使该织物经过染料的浓溶液，随后储存该湿织物于不漏气的外壳内以在漂洗掉未反应的染料之前允许用于扩散的时间和该染料与该织物底物的反应。可替代地，在漂洗之前，该染料可通过对该纺织品的后续汽蒸来固定。在染色后，未结合到这些纤维的过量的可溶染料必须被去除，以确保这些染色的纺织品的不褪色性并且在消费者洗涤该纺织品的过程中防止不想要的染料转移。WO 99/34054中披露了一种用于用一种漂洗液从染色的织物去除过量的染料的酶促工艺，该漂洗液包括至少一种过氧化物酶、一种氧化酶剂以及至少一种介导物，例如包括一种过氧化物酶、过氧化氢以及一种介导物像1-羟基-苯并三唑的液体。
在用于漂白棉织物的典型的染色工艺中，在一段时间例如10分钟内，首先将染料加入具有适当的pH和温度的浴中，并且然后孵育一段时间像30分钟，接着在20分钟内缓慢加入盐像NaCl或Na2SO4，并且然后再孵育10-20分钟，以实现加速的和均匀的染色；之后将Na2CO3和/或NaOH加入到该浴中并保持在适当的温度下约60min以固定该染料；之后将该染色浴排出并将染色的织物用新鲜水漂洗，用酸中和，并且然后在95℃进行皂洗，10min两次，用热水洗涤，并且然后用冷水洗涤，以完成该染色过程。为了将纤维素酶组合到该染色工艺中，当温度/pH条件合适时该纤维素酶可在该染料之前或同时加入。对于仅用H2O2漂白的织物，可同时将纤维素酶和过氧化氢酶添加到该处理溶液中并且一旦残余的H2O2被清洁掉，就可立即填充染料。
这些染料包括合成的和天然的染料。典型的染料是具有阴离子官能团的那些(例如酸染料、直接染料、媒染染料和反应性染料)、具有阳离子基团的那些(例如碱性染料)、在施用之前需要化学反应的那些(例如瓮染料(vatdye)、硫化染料以及偶氮型染料)、分散染料以及溶剂染料。优选地，适合的用于本发明中的染料包括具有阴离子官能团的染料以及具有阳离子基团的染料，更优选反应性染料。更优选地，这些反应性染料是乙烯砜型染料、单氯三嗪基型染料或双功能的反应性染料，例如反应性黑色5(Reactive Black 5)、反应性红色195、反应性黄色3RF以及反应性红色3BF等。
本发明的方法显示与染色步骤的良好兼容性。例如，与单独使用内切葡聚糖酶时的起球记录相比，当在如在实例7中指定的条件下与盐(例如NaCl或Na2SO4)一起使用时，本发明的内切葡聚糖酶保持相似水平的起球记录。优选地，来自使用与盐组合的内切葡聚糖酶的起球记录不低于单独使用内切葡聚糖酶时的情况。更优选地，当在如在实例7中指定的条件下将本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽与5％黑色5(Black 5)的染料和80g/L Na2SO4一起使用时，该起球记录保持为当使用相同的内切葡聚糖酶而不使用染料和盐时的至少80％、更优选85％。
更优选地，与单独使用内切葡聚糖酶时的起球记录相比，当在如在实例7中指定的条件下与Na2SO4和5％黑色5两者一起使用时，本发明的内切葡聚糖酶保持至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％起球记录。
生物抛光
如此处使用的，术语“生物抛光”、“去球”以及“抗起球”是可互换的。
不应用精加工组件的情况下，大部分棉织物和棉混纺织物具有相当硬和坚硬的手感外观。该织物表面也不光滑，因为小的有绒毛的微纤维从其中突出。另外，在相对短期的穿着之后，起球发生于该织物表面上，从而给予它无吸引力的磨损的样子。
生物抛光是在纤维织物制造过程中通过酶例如纤维素酶对其进行处理的方法，该方法改进了针对“减少起球形成”的织物品质。生物抛光的最重要效果的特征可在于较少起毛和起球，增加的光彩/光泽(gloss/luster)，改进的织物手感，增加的持久柔软性和/或改进的吸水性。通常在生产针织和机织物或衣服的湿润过程中进行生物抛光。湿润处理包括这类步骤如例如脱浆、煮练、漂白、洗涤、染色/印刷和精加工。生物抛光可在这些湿润步骤中的任一个之后作为单独步骤或与这些湿润步骤中的任一个相组合，例如与过氧化氢酶漂白步骤组合和/或与染色步骤组合来执行。
牛仔布织物的制造
一些染色的织物例如牛仔布织物需要在纺织之前将纱线染色。对于牛仔布织物，经纱被用例如靛蓝染料染色并在纺织之前上浆。优选地该牛仔布纱线的染色是环染。本发明的优选实施例是用瓮染料例如靛蓝染料、或一种靛蓝染料相关的染料例如硫靛、或一种硫染料、或一种直接染料、或一种反应性染料、或一种萘酚对纱线进行环染。该纱线还可以被多于一种染料染色，例如首先用一种硫染料并且然后用一种瓮染料，或反之亦然。
优选地，为了实现牛仔布织物的更高品质，在染色之前使这些纱线经历煮练和/或漂白。通常，在被纺织到染色的织物例如牛仔布中之后，该染色的织物或衣服进行到脱浆阶段，优选随后为生物磨砂步骤和/或颜色修饰步骤。
如此处使用的脱浆工艺是与如上在该背景中提到的相同的工艺。
在脱浆之后，如果所希望的是磨损的样子的话，使该染色的织物经历生物磨砂步骤。该生物磨砂步骤可以用酶或轻石或两者执行。如此处使用的，术语“生物磨砂”、“石洗”以及“磨损”是可互换的，其意指将该牛仔布在包含机械磨损剂例如轻石、一种磨损纤维素酶或这些的组合的一种水性介质中进行搅动，以提供“石洗的”样子。在所有情况下，需要机械作用来去除该染料，并且该处理通常是在洗涤机器像鼓式洗涤器、腹式洗涤器(bellywasher)中进行。作为不均匀的染料去除的结果，在染色的区域和已从其中去除染料的区域之间存在反差，这表现为颜色密度的局部变化。用纤维素酶处理可完全取代采用轻石的处理。然而，当所希望的是产生严重磨损成品时，纤维素酶处理还可以与轻石处理组合。
生物磨砂之后通常跟随第三步，即为通常包括洗涤和漂洗步骤的后处理，在其过程中可使用洗涤剂、光学增亮剂、漂白剂或软化剂。
本发明的用于通过用如在本发明中定义的具有内切葡聚糖酶活性的多肽处理纺织品来制造纺织品的方法可应用到生物磨砂工艺中。
在另一个实施例中，本发明提供了一种牛仔布制造工艺，其包括：a)对该牛仔布织物脱浆；b)用本发明的一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽对该牛仔布进行生物磨砂；c)漂洗。
可在常规条件下，在常规用于石磨洗涤的洗衣机如洗涤-脱水机、腹式洗涤器等中进行本发明的工艺。本发明的酶应以有效量添加。
用于纺织品处理的酶组合物
本发明还涉及用于纺织品处理的酶组合物，该组合物包括一种或多种如在本发明中定义的多肽。
该纺织品组合物可适于特定用途，例如生物磨砂或生物抛光，其可提供如下纺织品益处中的至少一个：例如减少起球形成、减少织物重量损失、增加磨损效果、以及低返染水平。
该纺织品组合物可进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和过氧化物酶/氧化酶。
该纺织品组合物典型地包括常规的成分，包括而不限于其他酶连同表面活性剂、稳定剂、湿润剂、分散剂、消泡剂、润滑剂、助洗剂系统等等或其混合物，其提供与例如强度、对起球的耐受性、吸水性、以及可染性相关的优越效果。
该纺织品组合物可处于任何形式，例如固体、液体、膏体、凝胶或其任何组合。
工艺条件
优选地，在本发明中，将纺织品用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理的方法应用于生物磨砂或生物抛光工艺。以下所有工艺条件都可应用于生物磨砂工艺和生物抛光工艺两者。
目前建议有待用于本方法中的适合的液体/纺织品比率可处于从约20:1至约1:1的范围中，优选处于从约15:1至约3:1的范围中，更优选处于从15:1至5:1的范围中(体积/重量，ml/g)。
在常规的“生物磨砂”或“生物抛光”工艺中，反应时间通常处于从约10分钟至约16小时的范围中。优选地，该反应时间处于从约20分钟至约180分钟的范围中，更优选该反应时间处于从约30分钟至约120分钟的范围中。
该反应介质的pH很大程度上取决于所讨论的一种或多种酶。优选地，本发明的工艺是在处于从约pH 4至约pH 8的范围中的，优选处于从约pH 5至约pH 7.5范围中的，或处于从约pH 5.5至约pH 7.0的范围中的pH下进行。
本发明的工艺能够在60℃以下，优选50℃以下，更优选45℃以下，更优选40℃以下，甚至更优选35℃以下，甚至更优选30℃以下，甚至更优选25℃以下的温度运行。
在一些实施例中，本发明的工艺是在15℃-65℃，优选地15℃-45℃，优选地20℃-60℃，优选地20℃-55℃，优选地20℃-45℃，优选地20℃-40℃，更优选地25℃-55℃，更优选地25℃-50℃，更优选地25℃-45℃，更优选地25℃-35℃，并且甚至更优选地30℃-45℃的温度范围进行。
酶剂量很大程度上取决于酶反应时间和酶活性，即相对短的酶反应时间或低酶活性使相对增加的酶剂量成为必需，并且反之亦然。通常，酶剂量可根据可用的反应时间来确定。
根据本发明的方法有待使用的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的量取决于许多因素。根据本发明，本发明的多肽在该水性介质中的浓度可以是从约0.001至约10毫克(mg)酶蛋白质/克(g)织物，优选0.02-5毫克酶蛋白质/克织物，更优选0.03-3毫克酶蛋白质/克织物。
在一些实施例中，用于处理纺织品的方法包括(a)在用H2O2漂白纺织品之后使纺织品接触一种过氧化氢酶；(b)使该纺织品接触本发明的一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽。在一些实施例中，在步骤(a)和(b)之间存在一个洗涤步骤。在一些实施例中，(a)和(b)是在相同的浴中执行而没有中间的洗涤步骤以去除过氧化氢并实现生物抛光作用。在一些实施例中，(a)和(b)是在相同的浴中顺序地或同时地执行的。在一些实施例中，(a)和(b)是在一个单独的浴中顺序地执行的，其中(a)是在(b)之前执行的。在一些实施例中，在步骤b)之后，将一种染料添加到该水性溶液中并将该纺织品孵育足够获得染色的纺织品的时间。
在一些实施例中，用于处理纺织品的方法包括(i)将本发明的一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及一种染料同时或顺序地添加到包含该纺织品的溶液中并将该纺织品孵育足够的时间，并且(ii)用盐例如NaCl和Na2SO4补充该水性溶液。
在一些实施例中，本发明的内切葡聚糖酶是在该染料之前添加的。
在一些实施例中，在添加一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽和染料之后，将该纺织品孵育10分钟至1小时，优选20-50分钟，更优选30–40分钟。
在一些实施例中，在添加盐的步骤(ii)之后，将该纺织品孵育20-50min。
在一些实施例中，该方法包括将Na2CO3和/或NaOH添加到该浴中以固定该染料的步骤(iii)。
在以下编号的段落中进一步描述本方法和组合物。
1.一种用于将纺织品用选自下组的一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理的方法，该组由以下各项组成：
(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
(b)一种由在中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；
(c)一种由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(d)一种在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及
(e)一个(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性；
(f)其中该方法是在15℃-65℃的温度范围下进行。
2.在段落1所述的方法的一些实施例中，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，
3.在段落1所述的方法的一些实施例中，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的10或9或8或7或6或5或4或3或2或1个氨基酸的取代、缺失、和/或插入。
4.在段落1-3中任一项所述的方法的一些实施例中，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽是获得自粪壳菌属，优选获得自粪生粪壳菌。
5.在段落1-4中任一项所述的方法的一些实施例中，其中SEQ ID NO:2的片段不少于200个氨基酸，优选不少于220个氨基酸。
6.在段落1-5中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法是在以下的温度范围下进行的：15℃-65℃，优选15℃-45℃，更优选20℃-40℃，更优选25℃-35℃。
7.在段落1-6中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法是在pH4至约pH 8，优选在从约pH 5至约pH 7.5的范围，或在从约pH 5.5至约pH7.0的范围下进行。
8.在段落1-7中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法应用于生物抛光工艺。
9.在段落1-8中任一项所述的方法的一些实施例中，其中在将该纺织品用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理之前，该方法进一步包括使一种纺织品接触一种过氧化氢酶的步骤。
10.在段落9所述的方法的一些实施例中，其中使纺织品接触一种过氧化氢酶的步骤，并且将纺织品用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理的步骤在相同的浴中顺序地或同时地进行。
11.在段落1-10中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法进一步包括将一种染料添加到包含该纺织品的相同溶液中的步骤。
12.在段落11所述的方法的一些实施例中，其中该染料和这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽被顺序地或同时地添加到相同的包含纺织品的浴中。
13.在段落12所述的方法的一些实施例中，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽是在该染料之前添加的。
14.在段落11-13中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法进一步包括在添加一种染料之后将该纺织品孵育10分钟至1小时、优选20-50分钟、更优选的30-40分钟并且随后用盐补充该溶液的步骤。
15.在段落8-14中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法是在以下的温度范围下进行的：15℃-65℃，优选15℃-45℃，更优选20℃-40℃，更优选25℃-35℃。
16.在段落8-15中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法是在pH 4至约pH 8，优选在从约pH 5至约pH 7.5的范围，或在从约pH 5.5至约pH 7.0的范围下进行。
17.在段落14-16中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该盐时NaCl或Na2SO4。
18.在段落11-17中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该染料是反应性染料。
19.在段落18所述的方法的一些实施例中，其中当在如在实例7中指定的条件下将具有内切葡聚糖酶活性的多肽与5％黑色5的染料和80g/LNa2SO4一起使用时，该起球记录保持为当使用相同的内切葡聚糖酶而不使用染料和盐时的至少80％、更优选85％。
20.在段落1-7中任一项所述的方法的一些实施例中，其中该方法应用于生物磨砂工艺。
21.在段落20所述的方法的一些实施例中，其中该方法进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶和过氧化物酶。
22.在段落20所述的方法的一些实施例中，其中在将该纺织品用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理之前，该方法进一步包括对该织物进行脱浆的步骤。
23.在以上段落中任一项所述的方法的一些实施例中，其中处理纺织品是制造该纺织品。
本发明进一步通过以下实例进行描述，这些实例不应被解释成限制本发明的范围。
实例
材料
用作缓沖液和底物的化学品是至少试剂等级的商品。该染料反应性黑色5和反应性红色195购于阿格斯(Argus)，中国。
介质
COVE-山梨醇板是由182g山梨醇(西格马85529生物超99.5％纯；西格玛-奥德里奇丹麦A/S，哥本哈根，丹麦)、20g琼脂粉、20ml COVE盐溶液以及去离子水至1升组成。该介质通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册，第8版，修订A，1998)。将该介质冷却至60℃并且添加10mM的乙酰胺、15mM的CsCl、(50μl/500ml)。
COVE盐溶液由26g的MgSO4·7H2O、26g的KCl、26g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液以及去离子水至1升组成。
COVE痕量金属溶液由以下组成：0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO2·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO4·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及去离子水至1升。
具有50mM磷酸盐的pH 6.5缓冲液：5.642g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和5.344g二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)溶于1升去离子水中。对于包含盐的缓冲液，将80g硫酸钠(Na2SO4)或80g氯化钠(NaCl)与如上所述的十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠一起溶于1L去离子水中，并检测pH。
具有50mM乙酸盐的pH 5.0缓冲液：2.873g乙酸钠和0.901g乙酸溶于1L去离子水中；
具有50mM磷酸盐的pH 6.0缓冲液：2.20g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和6.84g二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)溶于1L去离子水中。
具有50mM磷酸盐的pH 7.5缓冲液：15.05g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和1.25g二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)溶于1L去离子水中。
酶
Cellusoft(一种单组分土生梭孢壳GH45内切葡聚糖酶产物，可商购自诺维信A/S，描述于WO 96/29397中)
Biotouch XC(一种中性纤维素酶产物，可商购自AB酶，描述为WO 2010/076388中的SEQ ID NO:13毡状地丝霉(Geomyces pannorum)RF6293Cel45A)
织物
双罗纹棉(cotton interlock)：40S，漂白的，HM-A0008，可购自HM棉有限公司，广州，中国。
方法
重量损失确定
将这些小块布样在编号之前置于控制室(65％+/-5％湿度，21℃+/-1℃)中24小时，通过分析天平称重(对于100g以下的样品)记录。在处理之后，将所有样品滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时并在如上提到的控制室中调节24小时。对于每份样品，重量损失定义如下：
起球记录测试
将已经在标准气候(65％湿度，21℃)下预调节至少24小时的织物(包括处理的和未处理的)针对起球记录用Nu-马丁代尔(Martindale)测试仪(詹姆斯(James)H.希尔有限公司(Heal Co.Ltd)，英格兰)进行测试，用相同类型的未处理的织物作为磨损的织物。在2000回转之后进行标准的起球测试(瑞士标准(SN)198525)，通过从具有如下的定义的含义的1-5标记，其中1显示不良的抗起球而5显示优异的抗起球特性。因此马丁代尔起球记录得分越高，该葡聚糖内切酶生物抛光处理越有效。
记录5：无起球
记录4：轻微起球
记录3：中等起球
记录2：明显起球
记录1：严重起球
允许1/2、1/4记录
为了使结果更可靠，对每个样品由不同的人进行3个分开读数，并且这3个读数的平均值被采用作为起球记录的最终结果。
蛋白质含量
产物中的酶蛋白质可用BCATM蛋白质测定试剂盒(产品编号23225，可商购于赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))根据产品手册进行测量。在此针对威娜倍欧(Biotouch)XC300的蛋白质浓度由这种方法测定。
对于纯化的蛋白质样品，这些样品的的蛋白质浓度是使用280nm处的吸光度测量。测量执行如下：以适当的倍数将这些样品用蒸馏水稀释，然后使用分光光度计UV 1700在280nm处针对吸光度进行测量，用蒸馏水作为空白。计算是基于：基于成熟蛋白质的序列，ε＝46170M-1cm-1以及对于纯化的粪生粪壳菌GH45，分子量＝28025g/mol。这些酶样品的浓度是根据朗伯特比尔斯定律Abs＝εx c x l计算。
Abs代表280nm处的吸光度。
c代表酶的浓度。
l代表在标准石英比色杯中光路的长度。
实例1：粪生粪壳菌GH45纤维素酶(Sf Cel45)cDNA的克隆
该Sf cel45的鉴定和克隆描述于专利WO 9629397中。该粪生粪壳菌菌株可购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)ATCC登录号ATCC 52644下。
下列引物集被用作PCR引物用于克隆sf cel45的DNA：
KKSC010F(正向引物)：5′-ACACAACTGGGGATCCACCatgcgttcctccactattttgc-3’(SEQ ID NO:3)
该下划线部分是限制位点BamHI，其被用于促进克隆。这些小写字母是开始于ATG起始密码子的Sf cel45的特异序列。
KKSC010R(反向引物)：5′-AGATCTCGAGAAGCTTAttaggcacactggtgatagtaatc(SEQ ID NO:4)
该序列的下划线部分是HindIII位点，其被用于促进该PCR产物的克隆。这些小写字母是针对Sf cel45的编码区的3’末端的反向互补序列，包括该TAA终止密码子。
亚克隆Sf Cel45的cDNA模板
Sf cel45的cDNA根据文章(真菌酶基因高效表达克隆的新方法(a novelmethod for efficient expression cloning of funal enzyme gene)，分子和普通遗传学(Mol Gen Genet.)(1994)243:253-260)中所描述的方法克隆。克隆的cDNA被直接插入到质粒pYES2.0(英杰公司)的EcoRI-NotI的限制性位点，并且具有插入的质粒DNA被命名为pCIC502。相反的，粪生粪壳菌的cDNA可被用作PCR反应的模板。获得编码酶Sf cel45的DNA的一个额外的方法是从本应用提供的序列(SEQ ID NO:1)创建一个合成基因。合成基因可以从许多服务提供商中任一个，如英杰公司，基因艺术(GeneArt)(www.invitrogen.com)处订购。
将1ng pCIC502质粒DNA用于扩增。
将iProof高保真2X PCR混合液(Master PCR mix)(可商购自伯乐(BioRad)，丹麦)用于扩增。该混合液包括处于2X浓度的聚合酶、dNTP、盐和缓冲液。
将1ul(微升)引物对(KKSC010F和KKSC010R中每种)以100pmol/ul浓度用在PCR反应中，该反应由处于50ul的最终体积的25ul该2X PCR混合液、1ul pCIC502质粒DNA和22ul H2O组成。根据iProof协议执行扩增：在98℃下预变性30秒，并且然后进行30个循环的98℃下变性10秒、53℃下退火20秒、并且72℃下延伸30秒；并且然后最终在72℃下延伸10分钟。然后将该加热块程序化到10℃直至使用样品。
将来自50ul PCR产物的4ul在1X TAE缓冲液中跑1％Tris-乙酸盐(TAE)琼脂糖凝胶电泳。这些结果显示扩增于约880bp(Sf cel45编码区域的预期尺寸)的一个单一条带。将剩余的PCR产物使用一种GFX PCR DNA和胶条带纯化试剂盒(GE医疗(Healthcare)，白金汉郡，UK)纯化。
将输注中干燥(In-Fusion Dry-Down)PCR克隆试剂盒(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景城(Mountain View)，CA，USA)用于将Sf cel45的纯化PCR片段插入到大肠杆菌/曲霉属穿梭载体pDau109(描述于WO 2005/042735中)中。该载体是通过用酶BamHI和HindIII进行限制并且使用GFX PCR DNA和胶条带纯化试剂盒胶纯化该限制的载体来制备。随后根据制造商的说明进行输注反应，以10ul的总体积使用2ul的Sfcel45的PCR片段(大约50ug)和2ul的质粒载体pDau109(大约50ug)，用去离子水将剩余的体积调节到10ul。也根据制造商的说明将该反应转化到融合蓝大肠杆菌感受态细胞(克罗泰克实验室公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景城(Mountain View)，CA，USA)中。将推荐选择下生长的菌落(具有50mg/l氨苄青霉素的LB琼脂，37℃过夜)进行鉴定并且选择16个菌落进行菌落PCR。
菌落PCR
将这些菌落使用黄色的接种针(能肯(Nunc)A/S，丹麦)转移到具有50mg/升氨苄青霉素的新鲜LB琼脂并且之后直接投到200ul PCR管中，其由以下组成：6ul的2x HiFI reddy PCR混合液(AB基因；富酶泰斯(Fermentas)GmbH-赛默飞世尔科技部，Opelstraβe 968789St.Leon-Rot，德国)、0.5ul的用于pDau109的引物对(引物8653和引物8654中每种)(以10pmol/ul浓度)和5ul的去离子H2O(终体积为12ul)。如下执行扩增：在94℃下预变性60秒，然后进行30个循环的94℃下变性30秒、55℃下退火30秒、并且68℃下延伸60秒；最终在68℃下延伸10分钟。然后将该加热块程序化到10℃直至使用。
引物8653(正向引物)：5’-GCAAGGGATGCCATGCTTGG-3’(SEQ ID NO:5)
引物8654(反向引物)：5’-CATATAACCAATTGCCCTC-3’(SEQ ID NO:6)
将4ul的以上PCR产物直接加载到1％TAE琼脂糖凝胶上。根据旋转微量制备试剂盒(Spin miniprep kit)(凯杰，德国)的制造商说明，对这些显示具有预期尺寸的PCR条带的大肠杆菌Sf cel45转化体针对质粒DNA小量制备进行选择。根据制造商的说明，将所选择的具有Sf Cel45插入片段的质粒在ABI 3700测序仪(应用生物系统公司，USA)上用被用于菌落PCR反应的正向和反向载体引物进行测序。将无PCR错误的质粒指定为名称P2CF-10并且针对进一步的工作进行选择。质粒DNA是用凯杰质粒小试剂盒(midiKit)由P2CF-10制备。将该质粒洗脱于100ul TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA pH 8.0)中。
粪生粪壳菌GH45纤维素酶(sf cel45)cDNA的cDNA和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。该编码序列是核苷酸12-896(包括终止密码子TAA)。编码的预测蛋白质是294个氨基酸。使用SignalP程序(尼尔森等人，1997，蛋白质工程10:1-6)，预测了21个残基的信号肽，其进一步通过显示始于ASGSGK的成熟肽的N-末端测序确定。该编码的蛋白质包含具有氨基酸22到237的纤维素酶催化结构域和氨基酸258至294的纤维素结合结构域的294个氨基酸。
实例2：米曲霉中粪生粪壳菌GH45纤维素酶cDNA的表达
将米曲霉菌株MT3568用于所有实验。米曲霉MT3568是JaL355的AMDS(乙酰胺酶)破坏的衍生物(WO 2002/40694)，其中在敲除米曲霉乙酰胺酶(AMDS)基因的过程中修复pyrG营养缺陷型。根据欧洲专利EP 0238023，第14-15页中的方法制备MT3568原生质体，将其通过引用结合在此。制备MT3568的新鲜原生质体并将其用于转化质粒P2CF-10。
将制备于实例1中的2.5ug的质粒DNA P2CF-10用于转化。将DNA轻柔地加入到100ul MT3568原生质体中并且然后加入250ul的60％PEG。将该管轻柔地混合，并且在37°下孵育30分钟。将该混合液添加到具有10mM乙酰胺的6ml的顶层琼脂中并且将其铺在具有10mM乙酰胺的科夫(Cove)-山梨糖醇上。
将这些板在37℃下孵育3天或更多天并且然后将其移至26℃持续两天。通过首先将白色的10μl接种针(可购自能肯A/S，丹麦)浸渍80溶液，接触选择板上形成孢子的菌落，并且用该针在新鲜的选择培养基(具有10mM乙酰胺的科夫-山梨糖醇)上再划痕来从8个单独的菌落中挑取孢子。在26℃下5天后，使用再划痕的菌落接种96孔深碟形板。在Nu-Page 10％Bis-Tris SDS-PAGE(英杰，卡尔斯巴德，CA，USA)上通过考马斯亮蓝染色确认表达。选择一个转化体用于进一步的工作并且将其指定为EXP03724。
实例3：来自表达菌株EXP03724的重组粪生粪壳菌GH45纤维素酶的纯化
将重组米曲霉EXP03724的培养液通过0.2μm(微米)PES瓶盖过滤器过滤。将该培养液的pH通过使用乙酸调整到8.0。将微晶纤维素柱通过将50g艾维素(Avicel)PH-101(西格玛奥德里奇)重悬浮于大约300mL MilliQ水中来填满。将该浆体静置并将较细的粒子通过倾析法去除，并添加300mLMilliQ水。将此步骤重复至少三次。将该浆体倾倒至一个柱中并以24cm/h的线性流速填充该浆体。使用平衡缓冲液将该艾维素(Avicel)柱平衡至少两个柱体积，该平衡缓冲液由25mM Tris-HCl，pH 7.5组成。以24cm/h的线性流速加载粗蛋白质。使用该平衡缓冲液洗涤掉未结合的蛋白质直至实现稳定的UV(280nm)基线。使用1％三乙胺溶液洗脱结合的蛋白质并收集洗脱的蛋白质。将收集的蛋白质的pH立即调整至7.6。使用SDS-PAGE(NuPAGE，英杰)评价纯度，并合并显示预期表观分子量的条带的级分。
将从前述步骤收集的蛋白质进一步使用疏水作用层析进行纯化。将固体硫酸铵轻柔地添加到该合并物中以实现1.2M的最终浓度。将该蛋白质加载在苯基-琼脂糖凝胶(Sepharose)HP柱(GE医疗)上并使用由20mM Tris-HCl，pH 8.0组成的补充以1.2M(NH4)2SO4的平衡缓冲液平衡。使用至少2个柱体积的平衡缓冲液洗涤掉未结合的蛋白质。将结合的蛋白质通过由20mMTris-HCl，pH 7.5组成的洗脱缓冲液产生的线性下降梯度的硫酸铵(1.2至0.0M)进行洗脱。将该洗脱步骤进行12个柱体积。在该梯度末端，将剩余的蛋白质通过4个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。在洗脱程序过程中收集10mL级分。将在该洗脱程序中收集的蛋白质峰在SDS-PAGE上进行分析并合并纯的级分。将该缓冲液通过使用G-25凝胶过滤柱(GE医疗)交换到20mMTris-HCl，pH 7.5。通过以下方式确定脱盐的样品的浓度：测量280nm处的吸光度并使用45580M-1cm-1的消光系数以及28005Da的分子量，这是使用软件GPMAW 7.1(灯塔(Lighthouse)数据，欧登塞(Odense)，丹麦)从成熟的基本序列计算的。在探索者(Explorer)(GE医疗，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)上以+4℃进行纯化。
实例4：内切葡聚糖酶活性测定
将0.2％AZCL-HE-纤维素(麦格酶(Megazyme)，I-AZCEL)通过轻柔搅拌悬浮于添加了0.01％Triton X-100的具有pH 6.0的20mM Bis-Tris缓冲液中，其被用作一种底物。然后将120微升底物和根据实例3制备的1mg/ml的30微升酶样品在微量滴定板中混合并在反应前置于冰上。通过将该微量滴定板转移至设定为50℃的测定温度的埃普多夫恒温混匀仪(Eppendorfthermomixer)来启动测定。将该板在埃普多夫恒温混匀仪上在其针对微量滴定板的振摇速率700rpm下孵育20分钟。通过将该板转移回冰浴而停止孵育。然后将该板在冰冷的离心机中离心5分钟并将100微升上清液转移至微量滴定板。读取OD595作为内切葡聚糖酶活性的量度。一式三份进行所有反应并且该测定包括一种不添加任何酶的空白缓冲液(buffer blind)。
如果该酶样品的OD595值减该空白的OD595值超过0，则该酶就被定义为具有内切葡聚糖酶活性的酶。
在此实例中测试的粪生粪壳菌GH45纤维素酶样品的OD595值减该空白的OD595值超过0，这显示本发明中的粪生粪壳菌GH45纤维素酶(Sf cel45)具有内切葡聚糖酶活性。
实例5：粪生粪壳菌GH45在洗衣指数计(Launder-O-Meter)中在不同温度的生物抛光
将从实例3纯化的粪生粪壳菌GH45纤维素酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)在本实例中在不同温度下针对生物抛光进行测试，以获得其温度曲线并评估其在生物抛光中的适应性。该可商购的低温度纤维素酶产品威娜倍欧(Biotouch)XC300也被包括作为基准。
将棉织物小块布样切成约16cm*16cm(每块约5克)。将这些小块布样在编号之前置于控制室(65％相对湿度，21℃)中24小时，通过分析天平称重并记录。在洗衣指数计(LOM，SDL-阿特拉斯(Atlas)LP2)中进行该生物抛光。将两个经调节的小块布样和20个大的钢球(220克的总重量)置于每个烧杯中，来提供机械辅助。将该烧杯用酶和如在介质部分中所述制备的具有50mM磷酸盐的pH 6.5缓冲液填充，其中表1中示出具有100ml左右的总体积的最终酶浓度，其可得到约10:1(v/w ml/g)的液体与织物比率。
在选取如下的所需的程序之后启动该洗衣指数计(LOM)机器，并且当该温度达到预设的温度例如25℃、35℃、45℃、55℃或65℃时将保持。在每个温度下在相同试验中对两种酶进行测试。每个烧杯装配一种内衬有2个neoprin垫片的盖子并且用金属夹紧装置紧密闭合。将这些烧杯加载到预热的LOM中。在垂直位，在这4个鼓位中的每个中，使用金属架来接纳并固定5个烧杯。在每个预设温度处理1小时之后，将这些小块布样从这些烧杯中去除并转移到具有2g/L的碳酸钠的钝化溶液中并保持在85℃持续10min。然后将这些小块布样在热水中漂洗2次并在冷水中漂洗2次。并且将它们滚动干燥(AEG，LAVATHERM 37700，德国)1小时，在重量损失和起球记录评价之前在65％相对湿度、21℃调节24小时。
如在表1中总结的，在从25℃至55℃的宽范围的温度中，粪生粪壳菌Cel45纤维素酶(Sf Cel45)展现了良好的生物抛光性能，这是由明显的重量损失和显著的起球记录改进指示的。这种酶在35℃-45℃显示最好的性能并且在55℃和25℃在生物抛光中保持其大部分性能。Sf Cel45是针对低温度生物抛光的一种良好的酶。
在此实例中使用的威娜倍欧XC 300的酶蛋白浓度是该Sf Cel45的情况的五倍。威娜倍欧XC 300在高酶蛋白下在起球记录方面获得显著改进，而更低剂量的Sf Cel45可满足工业需要。威娜倍欧XC 300以其在45℃的最高性能和在35℃和55℃下大幅降低的性能以及在25℃下非常弱的性能显示更陡的温度曲线。
表1：用Sf Cel45在pH 6.5、25℃-65℃进行LOM生物抛光
实例6：粪生粪壳菌GH45在洗衣指数计中在35℃、不同pH下的生物抛光
将从实例3纯化的粪生粪壳菌GH45纤维素酶(SEQ ID NO:2的成熟肽)在本实例中在不同pH下针对生物抛光进行测试，以研究其pH曲线并评估其在生物抛光中的适应性。
该织物制品和试验操作类似于实例5中的那些，除了该试验是在35℃以不同pH进行的，如在介质部分中所述制备的。
如在表2中总结的，在35℃的试验中，Sf Cel45在从5至7.5的宽范围的pH下展现了良好的生物抛光性能，如由明显的重量损失和起球记录改进指示的。在宽范围的pH下，该酶将起球记录增加1.5-2.3，这是如与空白样品(无酶)相比的显著改进。该酶在pH 6-6.5显示最好性能并且可在从5至7.5的宽的pH范围下作用。
表2：用Sf Cel45在pH 5-7.5、35℃进行LOM生物抛光
实例7：用或不用盐/染料的情况下粪生粪壳菌GH45和Cellusoft CR在洗衣指数计中的生物抛光
在用反应性染料的经典染色工艺中，以高剂量加载盐如Na2SO4或NaCl以辅助染色。如此有待施用到该染色浴中的纤维素酶产物应可与盐和染料相容以使该酶潜力最大化。此处，在本实例中将从实例3纯化的Sf Cel45(SEQ ID NO:2的成熟肽)针对生物抛光进行测试。产物Cellusoft CR被包括作为基准。
该织物制品和试验操作类似于实例5，除了在该实例中，该烧杯是用酶和/或染料溶液填充，并且根据表3在一些选择的烧杯中包括盐，并且该试验是在pH 6.5、35℃下进行，其中35℃的温度适合于Cellusoft CR和Sf Cel45两者。
该产物Cellusoft CR是以按织物重量的1.4％给予，因为与0.096mg粪生粪壳菌GH45/g织物得到的分别为1.10和3.8的重量损失水平和起球记录相比，此种剂量达到了相似的重量损失水平和起球记录，分别为1.37％和4.1。
如在表3中总结的，Sf Cel45在生物抛光中在pH 6.5、35℃、在高浓度的盐和染料的存在下高效发挥作用。盐的存在甚至将Sf Cel45的生物抛光促进到一定程度。因此Sf Cel45是在染色步骤中与盐和染料具有良好相容性的一种纤维素酶。
表3：用Sf Cel45和Cellusoft CR在pH 6.5、35℃进行LOM生物抛光
在此描述并且要求的本发明不应限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
Claims (15)
1.一种用于将纺织品用选自下组的一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理的方法，该组由以下各项组成：
(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；
(b)一种由在中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；
(c)一种由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(d)一种在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及
(e)一个(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性；
(f)其中该方法是在15℃-65℃的温度范围下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
3.如权利要求1所述的方法，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的10或9或8或7或6或5或4或3或2或1个氨基酸的取代、缺失、和/或插入。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽是获得自粪壳菌属，优选地获得自粪生粪壳菌。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该方法是在以下的温度范围进行的：15℃-65℃，优选20℃-60℃，更优选25℃-55℃，更优选25℃-50℃，并且甚至更优选30℃-45℃。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该方法是在pH 4至约pH 8，优选在从约pH 5至约pH 7.5的范围，或在从约pH 5.5至约pH 7.0的范围内进行。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该方法应用于生物抛光工艺。
8.如权利要求7所述的方法，其中该方法进一步包括使一种纺织品接触一种过氧化氢酶的步骤，并且将纺织品用一种过氧化氢酶和用一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理的步骤是在相同的浴中顺序地或同时地进行。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使该纺织品接触一种染料的步骤，其中该染料和这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽被顺序地或同时地添加到相同的包含纺织品的浴中。
10.如权利要求9所述的方法，其中这种具有内切葡聚糖酶活性的多肽是在该染料之前添加的。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在添加一种染料之后将该纺织品孵育10分钟至1小时、优选20-50分钟、更优选30-40分钟并且随后用盐补充该溶液的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中该盐是NaCl或Na2SO4。
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中该染料是反应性染料。
14.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该方法应用于生物磨砂工艺。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中处理纺织品是制造该纺织品。
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