CN105861470A - 一种密码子优化的内切葡聚糖酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
Abstract
本发明提供了一种密码子优化的内切葡聚糖酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了密码子优化的内切葡聚糖酶的制备方法和应用。本发明里氏木霉的密码子偏好优化了来源于黑曲霉中的eng1基因，改造后的基因序列与野生型黑曲霉的eng1基因序列（Genebank收录号为AF331518）同源性为95.5%。密码子偏好优化后的eng1表现出较高酶活，本发明核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示密码子优化的内切葡聚糖酶由全基因合成，并连接到里氏木霉纤维二糖水解酶1启动子下。采用原生质体转化法将合成的内切葡聚糖酶基因转化到里氏木霉中，获得重组菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种密码子优化的内切葡聚糖酶（endoglucanase）及其制备方法和应用。
背景技术
传统牛仔布是用靛蓝染料染色的经纱和未染色的纬纱交叉编织而成的。返旧外观是衡量牛仔布品质的一个重要指标。最初人们采用浮石洗涤除去牛仔布表面的靛蓝染料，即在牛仔布洗水中加入浮石，使浮石与牛仔布打磨，洗后牛仔布布面呈现陈旧的感觉。内切葡聚糖酶是纤维素酶的组分之一，可以用在牛仔布生物整理上，内切葡聚糖酶水洗与传统的石洗相比，减少了浮石洗涤设备的磨损，改善了废水的质量，使用过的废水易回收处理，且反应条件温和减少了能耗，用酶水洗后也不需要用大量的水去除牛仔布表面污物。内切葡聚糖酶进行牛仔布生物整理的过程中，内切葡聚糖酶将织物表面暴露的微纤维绒毛进行酶解，再经过机械揉搓后洗去表面突出的微纤维以及吸附的靛蓝染料。里氏木霉具有高效外分泌酶蛋白的优点，常被用来构建基因工程菌表达同源或异源的酶蛋白基因。目前外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶均在里氏木霉中得到有效表达。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种密码子优化的内切葡聚糖酶，其核苷酸序列如基因序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，
一种密码子优化的内切葡聚糖酶的制备方法，其步骤包括，
（1）将里氏木霉基因组重组菌株划线于PDA平板，28℃培养5天；
（2）接种到液体种子培养基中培养48h；
（3）按接种量10%转接至50mL发酵培养基产酶，在28℃条件下发酵120h获得发酵液，将发酵液离心，离心后的上清液为密码子优化的内切葡聚糖酶溶液液。
作为优化，所述里氏木霉基因组重组菌株的制备方法，其步骤包括，
（1）在PDA平板上培养里氏木霉5天，用无菌水收集里氏木霉孢子，接种到YPD液体培养基中，继续培养12小时；
（2）收集孢子，用无菌生理盐水洗涤两次，再用第一缓冲液洗两次，重悬于第二缓冲液中酶解2小时，获得的酶解液；
（3）将步骤（2）获得的酶解液同1 M 山梨醇溶液等体积混合，离心收集菌体，用1 M山梨醇溶液洗涤一次，最后重悬于1 M山梨醇溶液中，获得的悬浮液；
（4）取200μL步骤（3）获得的悬浮液加入5μL的P18PEGH质粒混合，再加入30μL的PEG6000溶液，冰浴15min后加1mL的PEG6000溶液，室温放置半小时；
（5）加入1mL的1 M山梨醇溶液后，涂布潮霉素PDA平板，在30℃条件下进行培养，将培养的里氏木霉基因组重组菌株转接PDA平板，保存重组菌株。
作为优化，所述P18PEGH质粒的制备方法，其步骤包括，
（1）以里氏木霉基因组为模板克隆纤维二糖水解酶I启动子：上游引物：5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3，下游引物：5- CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3，PCR反应条件为95℃ 5 min；95℃ 50 s，70℃ 2 min 5 s，29个循环；72℃ 5 min；
（2）从质粒pDESTR(Genbank：AB218275.1)中扩增潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒：上游引物：5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3，下游引物：5-TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3，PCR反应条件为95℃下5 min；95℃下50s，70℃下2min15s，29个循环；72℃下5min；
（3）P18EG质粒制备：将eng1基因和PUC18载体分别进行KpnI和SacI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的eng1基因或40μL的PUC18载体，第一10×buffer缓冲液5μL，Kpn1和Sac1各1μL，加纯水补至50μL，在温度37℃的条件下酶切25min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2min；
再以0.9%质量分数的琼脂糖凝胶电泳分别回收eng1基因片段和PUC18载体片段并用连接酶进行连接，连接反应体系：eng1基因片段4μL，PUC18载体片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，16℃下连接8h；
然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态,转化大肠杆菌感受态方法为： 在40 μL大肠杆菌感受态（杭州宝赛生物科技有限公司，大肠杆菌DH5α感受态）中加入6 μL连接产物，轻轻吹匀后冰浴15 min；再在42℃的水浴中热激88 s，然后迅速放在冰浴中5 min；之后，加入1 mL的 LB液体培养基，轻轻吹匀后在37℃下90 rpm的摇床上培养1 h；将反应物8000 r/min离心1 min，弃去850 μl上清液，保留150 μl培养液，重悬离心后的大肠杆菌细胞，涂布抗性LB平板；将LB平板放入37℃培养箱培养15 h，挑取大肠杆菌转化子至5 ml含抗生素的LB液体培养基，于37℃下190 r/min条件振荡培养15 h，提取质粒，该质粒即为P18EG质粒；保存大肠杆菌转化子和P18EG质粒；
（4）P18PEG质粒制备：将纤维二糖水解酶I启动子和P18EG质粒分别进行HindⅢ和KpnI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的纤维二糖水解酶I启动子或40μL的P18EG质粒，第一10×buffer缓冲液5μL，HindⅢ和KpnI各1μL，加纯水补至50μL，在温度37℃的条件下酶切20min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2 min；
以0.9%的琼脂糖凝胶电泳分别回收纤维二糖水解酶I启动子片段和P18EG质粒片段并进行连接，连接反应体系：纤维二糖水解酶I启动子基因4μL，P18EG质粒片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，于16℃下连接8h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，再提取质粒，该质粒即为P18PEG质粒，保存大肠杆菌转化子和P18PEG质粒；
（5）P18PEGH质粒制备：将潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒和P18PEG质粒分别进行SacI和EcoRI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒或40μL的P18PEG质粒，第二10×buffer缓冲液5μL，SacI和EcoRI各1μL，加纯水补至50μL；在温度37℃的条件下酶切20min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2 min；
以0.9%的琼脂糖凝胶电泳分别回收潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒片段和P18PEG质粒片段并进行连接，连接反应体系：潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒片段4μL，P18PEG质粒片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，于16℃下连接8h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，再提取质粒，该质粒即为P18PEGH质粒，保存大肠杆菌转化子和P18PEGH质粒。
作为优化，所述里氏木霉基因组提取方法，其步骤包括，
（1）将里氏木霉在PDA培养基平板上培养5天；
（2）再接入诱导培养基中培养2天，
（3）离心收集菌体，生理盐水洗涤3次后，液氮研磨，
（4）将研磨组织中加入预热CTAB提取液，震荡混匀；
（5）升温至64℃并保温1小时，期间每隔10分钟混匀；
（6）再加入PCI溶液混匀后，离心，
（7）取上层水相加入0.5倍体积预冷异丙醇，混匀，4℃放置25min，离心5 min；
（8）使用70%的乙醇洗沉淀两次，用含RNase 的TE 缓冲液溶解后温水浴30 min，获得里氏木霉基因组。
本发明解决的另一个问题是密码子优化的内切葡聚糖酶的应用，用于牛仔裤的返旧处理。
本发明里氏木霉（Trichoderma reesei）的密码子偏好优化了来源于黑曲霉中的eng1基因，改造后的基因序列与野生型黑曲霉的eng1基因序列（Genebank收录号为AF331518）同源性为95.5%。密码子偏好优化后的eng1表现出较高酶活，本发明核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示密码子优化的内切葡聚糖酶由全基因合成，并连接到里氏木霉纤维二糖水解酶1启动子下。采用原生质体转化法将合成的内切葡聚糖酶基因转化到里氏木霉中，获得重组菌。
作为优化，本发明中，里氏木霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；CICC保藏号为13052,ATCC保藏号为56765；
作为优化，本发明中，PDA培养基配方为：马铃薯去皮，称 200g切碎，加水 800ml 煮沸半个小时，纱布过滤， 再加 20g 葡萄糖和 18g 琼脂，补充水至1000mL，高压蒸121℃灭菌20 分钟；
作为优化，本发明中，诱导培养基配方为：羧甲基纤维素钠10g/L，乳糖10g/L，酵母粉18g/L；
作为优化，本发明中，CTAB提取液配方为：2%质量分数的CTAB,100m mol/L的Tris-HCl，pH 8.0,20m mol/L的EDTA,1.4mol/L的NaCl；
作为优化，本发明中，PCI溶液配方为：等体积比的苯酚、氯仿和异戊醇混合液；
作为优化，本发明中，含RNase 的TE 缓冲液配方为：10m mol/L的Tris-Hcl，pH 8.0，1mmol/L的EDTA；
作为优化，本发明中，上游引物：5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3和下游引物：5-CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
作为优化，本发明中，质粒pDESTR：Genbank收录号为AB218275.1，购自杭州宝赛生物科技有限公司；
作为优化，本发明中，上游引物：5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3和下游引物：5-TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
作为优化，本发明中，eng1基因购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
作为优化，本发明中，PUC18载体购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
作为优化，本发明中，第一10×buffer缓冲液配方为：100m M的Tris-HCl，pH 8.0，100mM的MgCl2，1M的KCl,1g/L的BSA；
作为优化，本发明中，Kpn1和Sac1购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司；
作为优化，本发明中，T4连接酶即T4 DNA Ligase，购自宝生物工程 (大连) 有限公司；
作为优化，本发明中，buffer缓冲液配方为：660mM的Tris-HCl，pH7.6，66mM的氯化镁，100mM的DTT，1mM的ATP；
作为优化，本发明中，大肠杆菌感受态即大肠杆菌DH5α感受态，购自杭州宝赛生物科技有限公司；
作为优化，本发明中，HindⅢ和KpnI均购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司；
作为优化，本发明中，SacI和EcoRI均购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司；
作为优化，本发明中，第二10×buffer缓冲液配方为：500m M的Tris-HCl，pH 7.5，100mM的MgCl2，1M的NaCl,1g/L的BSA；
作为优化，本发明中，YPD液体培养基配方为：葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L；
作为优化，本发明中，第一缓冲液配方为：10 m M的磷酸钠缓冲液，pH=6，1.0 M的MgSO4；
作为优化，本发明中，第二缓冲液配方为：10 m M的磷酸钠缓冲液, pH=6，含10g/L蜗牛酶；
作为优化，本发明中，PEG6000溶液配方为：20%质量分数的PEG6000，20mM的CaC12，10mM的Tris HCl，pH=7.5；
作为优化，本发明中，潮霉素即潮霉素B（Hygromycin B），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
作为优化，本发明中，潮霉素PDA平板配方为：在PDA培养基上添加1 M的山梨醇，125 μg/mL的潮霉素；
作为优化，本发明中，液体种子培养基配方为：葡萄糖16 g/L，酵母粉 20 g/L，(NH4)2SO4 2.0 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 0.6 g/L，CaC12 1.0 g/L；
作为优化，本发明中，发酵培养基配方为：乳糖16 g/L，微晶纤维素20 g/L酵母粉 20g/L，(NH4)2SO4 4.0 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 0.8 g/L，CaC12 1.0 g/L，FeSO4 0.003 g/L，MnSO4 0.001 g/L，ZnSO4 0.001 g/L，CoCl2 0.002 g/L。
附图说明
图1为本发明实施例3中使用密码子优化的内切葡聚糖酶返旧处理牛仔裤图片。
具体实施方式
实施例1：内切葡聚糖酶基因的获得
采用化学全合成的方法，合成优化后的内切葡聚糖酶eng1基因序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：重组菌株的构建及产酶
里氏木霉基因组提取方法，其步骤包括，
（1）将里氏木霉在PDA培养基平板上培养5天；
（2）再接入诱导培养基中培养2天，
（3）离心收集菌体，生理盐水洗涤3次后，液氮研磨，
（4）将研磨组织中加入预热CTAB提取液，震荡混匀；
（5）升温至64℃并保温1小时，期间每隔10分钟混匀；
（6）再加入PCI溶液混匀后，离心，
（7）取上层水相加入0.5倍体积预冷异丙醇，混匀，4℃放置25min，离心5 min；
（8）使用70%的乙醇洗沉淀两次，用含RNase 的TE 缓冲液溶解后温水浴30 min，获得里氏木霉基因组。
一种内切葡聚糖酶eng1基因重组载体P18PEGH质粒的制备方法，其步骤包括，
（1）以里氏木霉基因组为模板克隆纤维二糖水解酶I启动子：上游引物：5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3，下游引物：5- CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3，PCR反应条件为95℃ 5 min；95℃ 50 s，70℃ 2 min 5 s，29个循环；72℃ 5 min；
（2）从质粒pDESTR(Genbank：AB218275.1)中扩增潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒：上游引物：5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3，下游引物：5-TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3，PCR反应条件为95℃下5 min；95℃下50s，70℃下2min15s，29个循环；72℃下5min；
（3）P18EG质粒制备：将eng1基因和PUC18载体分别进行KpnI和SacI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的eng1基因或40μL的PUC18载体，第一10×buffer缓冲液5μL，Kpn1和Sac1各1μL，加纯水补至50μL，在温度37℃的条件下酶切25min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2min；
再以0.9%质量分数的琼脂糖凝胶电泳分别回收eng1基因片段和PUC18载体片段并用连接酶进行连接，连接反应体系：eng1基因片段4μL，PUC18载体片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，16℃下连接8h；
然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态,转化大肠杆菌感受态方法为： 在40 μL大肠杆菌感受态（杭州宝赛生物科技有限公司，大肠杆菌DH5α感受态）中加入6 μL连接产物，轻轻吹匀后冰浴15 min；再在42℃的水浴中热激88 s，然后迅速放在冰浴中5 min；之后，加入1 mL的 LB液体培养基，轻轻吹匀后在37℃下90 rpm的摇床上培养1 h；将反应物8000 r/min离心1 min，弃去850 μl上清液，保留150 μl培养液，重悬离心后的大肠杆菌细胞，涂布抗性LB平板；将LB平板放入37℃培养箱培养15 h，挑取大肠杆菌转化子至5 ml含抗生素的LB液体培养基，于37℃下190 r/min条件振荡培养15 h，提取质粒，该质粒即为P18EG质粒；保存大肠杆菌转化子和P18EG质粒；
（4）P18PEG质粒制备：将纤维二糖水解酶I启动子和P18EG质粒分别进行HindⅢ和KpnI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的纤维二糖水解酶I启动子或40μL的P18EG质粒，第一10×buffer缓冲液5μL，HindⅢ和KpnI各1μL，加纯水补至50μL，在温度37℃的条件下酶切20min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2 min；
以0.9%的琼脂糖凝胶电泳分别回收纤维二糖水解酶I启动子片段和P18EG质粒片段并进行连接，连接反应体系：纤维二糖水解酶I启动子基因4μL，P18EG质粒片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，于16℃下连接8h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，再提取质粒，该质粒即为P18PEG质粒，保存大肠杆菌转化子和P18PEG质粒；
（5）P18PEGH质粒制备：将潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒和P18PEG质粒分别进行SacI和EcoRI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒或40μL的P18PEG质粒，第二10×buffer缓冲液5μL，SacI和EcoRI各1μL，加纯水补至50μL；在温度37℃的条件下酶切20min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2 min；
以0.9%的琼脂糖凝胶电泳分别回收潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒片段和P18PEG质粒片段并进行连接，连接反应体系：潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒片段4μL，P18PEG质粒片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，于16℃下连接8h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，再提取质粒，该质粒即为P18PEGH质粒，保存大肠杆菌转化子和P18PEGH质粒。
里氏木霉基因组重组菌株的制备方法，其步骤包括，
（1）在PDA平板上培养里氏木霉5天，用无菌水收集里氏木霉孢子，接种到YPD液体培养基中，继续培养12小时；
（2）收集孢子，用无菌生理盐水洗涤两次，再用第一缓冲液洗两次，重悬于第二缓冲液中酶解2小时，获得的酶解液；
（3）将步骤（2）获得的酶解液同1 M 山梨醇溶液等体积混合，离心收集菌体，用1 M山梨醇溶液洗涤一次，最后重悬于1 M山梨醇溶液中，获得的悬浮液；
（4）取200μL步骤（3）获得的悬浮液加入5μL的P18PEGH质粒混合，再加入30μL的PEG6000溶液，冰浴15min后加1mL的PEG6000溶液，室温放置半小时；
（5）加入1mL的1 M山梨醇溶液后，涂布潮霉素PDA平板，在30℃条件下进行培养，将培养的里氏木霉基因组重组菌株转接PDA平板，保存重组菌株。
一种密码子优化的内切葡聚糖酶的制备方法，其步骤包括，
（1）将里氏木霉基因组重组菌株划线于PDA平板，28℃培养5天；
（2）接种到液体种子培养基中培养48h；
（3）按接种量10%转接至50mL发酵培养基产酶，在28℃条件下发酵120h获得发酵液，将发酵液离心，离心后的上清液为密码子优化的内切葡聚糖酶溶液液。
以羧甲基纤维素钠（sigma 羧甲基纤维素钠C5678）为底物测定内切葡聚糖酶的酶活，一个酶活力单位为每分钟生成1.0μmol葡萄糖而所需的酶量，以IU/mL表示。
实施例3：牛仔布水洗
常规石磨水洗：将靛蓝染色的牛仔布（20cm×15cm）投入到10L水中，将500g浮石在10%的次氯酸钠中浸泡60min后，与牛仔布混合并在60℃温度条件下翻滚水洗60min，加入1%质量分数的次氯酸钠继续水洗30min，用清水冲洗一次后加入50g亚硫酸氢钠，继续水洗10min，再用清水反复冲洗，烘干。
酶水洗：将靛蓝染色的牛仔布（20 cm×15 cm）投入到2 L水中，加入8000IU酶活的内切葡聚糖酶液，在起始温度50℃条件下搅拌水洗40min，再用清水冲洗两次后烘干。
SEQ ID NO: 1
SEQUENCE LISTING
<110> 江西省科学院
<120> 一种密码子优化的内切葡聚糖酶及其制备方法和应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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gtctatgaaa tgcaccagta cctagactcc gacggctccg gcacctcgga gacctgcgtg 720
tcggagacca tcggaaaaga gcgagtcact gaagctacac agtggctgaa ggacaataag 780
aaggtcggct tcataggcga atatgccggg ggttccaatg atgtatgtcg gagtgccgtg 840
tcggggatgc tggagtacat ggcgaataac acggacgttt ggaagggtgc ctcgtggtgg 900
gccgccggcc catggtgggg agactacatt ttcagcctcg agcccccgga tggaactgcg 960
tacaccggca tgctcgacat cctcgaggcc tacctctga 999
SEQ ID NO: 1
SEQUENCE LISTING
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一种密码子优化的内切葡聚糖酶及其制备方法和应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaagtttc agagcaccct gctgctggcc gccgccggcg gcagcgcgtt ggccgtcccc 60
catggtcctg gacataagaa gagggcgtct gtgttcgaat ggttcggatc gaatgagtct 120
ggcgctgagt ttgggaccaa tattcctggg gtctggggaa ccgactacat cttccccgac 180
ccctcggcta tctctacgtt gattgacaag ggcatgaact tcttccgcgt ccagttcatg 240
atggagaggt tgctgcccga ctcaatgact ggctcatatg atgaggagta cctggccaac 300
ttgacgaccg tgataaaagc ggtaaccgac ggaggcgctc atgcccttgt tgaccctcat 360
aactacggca ggtacaacgg cgagatcatc tccagccgtt ctgatttcca gaccttctgg 420
gagaacctgg ccggccagta caaagataac gacctcgtca tgttcgacac caacaacgag 480
tatcacgaca tggatcagga tctcgtgctg aacctcaacc aagcagccat taacggcatc 540
cgcgccgcag gtgcgaccag ccagtacatc ttcgtcgaag gcaactcctg gaccggcgcc 600
tggacgtggg tcgacgtcaa cgacaacatg aagaacttga ccgaccccga agacaagatc 660
gtctatgaaa tgcaccagta cctagactcc gacggctccg gcacctcgga gacctgcgtg 720
tcggagacca tcggaaaaga gcgagtcact gaagctacac agtggctgaa ggacaataag 780
aaggtcggct tcataggcga atatgccggg ggttccaatg atgtatgtcg gagtgccgtg 840
tcggggatgc tggagtacat ggcgaataac acggacgttt ggaagggtgc ctcgtggtgg 900
gccgccggcc catggtgggg agactacatt ttcagcctcg agcccccgga tggaactgcg 960
tacaccggca tgctcgacat cctcgaggcc tacctctga 999
Claims (10)
1.一种密码子优化的内切葡聚糖酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的密码子优化的内切葡聚糖酶的制备方法，其步骤包括，
（1）将里氏木霉基因组重组菌株划线于PDA平板，28℃培养5天；
（2）接种到液体种子培养基中培养48h；
（3）按接种量10%转接至50mL发酵培养基产酶，在28℃条件下发酵120h获得发酵液，将发酵液离心，离心后的上清液为密码子优化的内切葡聚糖酶溶液液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述液体种子培养基配方为：葡萄糖16 g/L，酵母粉 20 g/L，(NH4)2SO4 2.0 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 0.6 g/L，CaC121.0 g/L。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述发酵培养基配方为：乳糖16 g/L，微晶纤维素20 g/L酵母粉 20 g/L，(NH4)2SO4 4.0 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 0.8g/L，CaC12 1.0 g/L，FeSO4 0.003 g/L，MnSO4 0.001 g/L，ZnSO4 0.001 g/L，CoCl2 0.002g/L。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述里氏木霉基因组重组菌株的制备方法，其步骤包括，
（1）在PDA平板上培养里氏木霉5天，用无菌水收集里氏木霉孢子，接种到YPD液体培养基中，继续培养12小时；
（2）收集孢子，用无菌生理盐水洗涤两次，再用第一缓冲液洗两次，重悬于第二缓冲液中酶解2小时，获得的酶解液；
（3）将步骤（2）获得的酶解液同1 M 山梨醇溶液等体积混合，离心收集菌体，用1 M山梨醇溶液洗涤一次，最后重悬于1 M山梨醇溶液中，获得的悬浮液；
（4）取200μL步骤（3）获得的悬浮液加入5μL的P18PEGH质粒混合，再加入30μL的PEG6000溶液，冰浴15min后加1mL的PEG6000溶液，室温放置半小时；
（5）加入1mL的1 M山梨醇溶液后，涂布潮霉素PDA平板，在30℃条件下进行培养，将培养的里氏木霉基因组重组菌株转接PDA平板，保存重组菌株。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中PEG6000溶液配方为：20%质量分数的PEG6000，20mM的CaC12，10mM的Tris HCl，pH=7.5。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述P18PEGH质粒的制备方法，其步骤包括，
（1）以里氏木霉基因组为模板克隆纤维二糖水解酶I启动子：上游引物：5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3，下游引物：5- CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3，PCR反应条件为95℃ 5 min；95℃ 50 s，70℃ 2 min 5 s，29个循环；72℃ 5 min；
（2）从质粒pDESTR(Genbank：AB218275.1)中扩增潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒：上游引物：5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3，下游引物：5-TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3，PCR反应条件为95℃下5 min；95℃下50s，70℃下2min15s，29个循环；72℃下5min；
（3）P18EG质粒制备：将eng1基因和PUC18载体分别进行KpnI和SacI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的eng1基因或40μL的PUC18载体，第一10×buffer缓冲液5μL，Kpn1和Sac1各1μL，加纯水补至50μL，在温度37℃的条件下酶切25min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2min；
再以0.9%质量分数的琼脂糖凝胶电泳分别回收eng1基因片段和PUC18载体片段并用连接酶进行连接，连接反应体系：eng1基因片段4μL，PUC18载体片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，16℃下连接8h；
然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态,转化大肠杆菌感受态方法为： 在40 μL大肠杆菌感受态（杭州宝赛生物科技有限公司，大肠杆菌DH5α感受态）中加入6 μL连接产物，轻轻吹匀后冰浴15 min；再在42℃的水浴中热激88 s，然后迅速放在冰浴中5 min；之后，加入1 mL的 LB液体培养基，轻轻吹匀后在37℃下90 rpm的摇床上培养1 h；将反应物8000 r/min离心1 min，弃去850 μl上清液，保留150 μl培养液，重悬离心后的大肠杆菌细胞，涂布抗性LB平板；将LB平板放入37℃培养箱培养15 h，挑取大肠杆菌转化子至5 ml含抗生素的LB液体培养基，于37℃下190 r/min条件振荡培养15 h，提取质粒，该质粒即为P18EG质粒；保存大肠杆菌转化子和P18EG质粒；
（4）P18PEG质粒制备：将纤维二糖水解酶I启动子和P18EG质粒分别进行HindⅢ和KpnI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的纤维二糖水解酶I启动子或40μL的P18EG质粒，第一10×buffer缓冲液5μL，HindⅢ和KpnI各1μL，加纯水补至50μL，在温度37℃的条件下酶切20min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2 min；
以0.9%的琼脂糖凝胶电泳分别回收纤维二糖水解酶I启动子片段和P18EG质粒片段并进行连接，连接反应体系：纤维二糖水解酶I启动子基因4μL，P18EG质粒片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，于16℃下连接8h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，再提取质粒，该质粒即为P18PEG质粒，保存大肠杆菌转化子和P18PEG质粒；
（5）P18PEGH质粒制备：将潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒和P18PEG质粒分别进行SacI和EcoRI双酶切，酶切体系为：分别选取40μL的潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒或40μL的P18PEG质粒，第二10×buffer缓冲液5μL，SacI和EcoRI各1μL，加纯水补至50μL；在温度37℃的条件下酶切20min，将酶切产物移到85℃水浴中灭活2 min；
以0.9%的琼脂糖凝胶电泳分别回收潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒片段和P18PEG质粒片段并进行连接，连接反应体系：潮霉素磷酸转移酶的基因表达盒片段4μL，P18PEG质粒片段2μL，T4连接酶0.5μL，buffer缓冲液2μL，加纯水补至20μL，于16℃下连接8h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，再提取质粒，该质粒即为P18PEGH质粒，保存大肠杆菌转化子和P18PEGH质粒。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述里氏木霉基因组提取方法，其步骤包括，
（1）将里氏木霉在PDA培养基平板上培养5天；
（2）再接入诱导培养基中培养2天，
（3）离心收集菌体，生理盐水洗涤3次后，液氮研磨，
（4）将研磨组织中加入预热CTAB提取液，震荡混匀；
（5）升温至64℃并保温1小时，期间每隔10分钟混匀；
（6）再加入PCI溶液混匀后，离心，
（7）取上层水相加入0.5倍体积预冷异丙醇，混匀，4℃放置25min，离心5 min；
（8）使用70%的乙醇洗沉淀两次，用含RNase 的TE 缓冲液溶解后温水浴30 min，获得里氏木霉基因组。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述诱导培养基配方为：羧甲基纤维素钠10g/L，乳糖10g/L，酵母粉18g/L。
10.如权利要求1所述密码子优化的内切葡聚糖酶的应用，其特征在于，用于牛仔裤的返旧处理。
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|---|---|---|---|
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| CN (1) | CN105861470A (zh) |
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