ES2360529T3 - Nuevas celulasas alcalinas. - Google Patents
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Abstract
Endoglucanasa que es derivable de una cepa de Humicola insolens, donde dicha endoglucanas comprende 402 residuos de aminoácidos como se relaciona en la Figura 3 y opcionalmente un enlace C-terminal que consiste en 10 aminoácidos como mucho, o una variante de dicha endoglucanasa teniendo una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a dicha secuencia relacionada en la Figura 3 y donde dicha variante tiene uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos sustituidos: N89Q; N89Q+N247Q; H123N; T385N; Q399N; E202A; S37W+P39W; M142E; K217A; K218T; K217A+K218T, R245G; I310D; E150Q; E334K; M198L.
Description
Nuevas celulasas alcalinas.
La presente invención se refiere a una celulasa
capaz de eliminar suciedad de tejido, una composición detergente que
comprende la celulasa, un método de tratamiento de tejido manchado
con la enzima celulolítica, y uso de la celulasa p. ej. en
composiciones detergentes, en suavizantes de tejido, para la
clarificación de color de tejidos textiles (eliminación de pelusas y
bolitas), para evitar la redeposición en el lavado del tejido, para
eliminar la suciedad, para el desentintado de papel usado, y para
reciclar pasta de papel.
El lavado repetido de los tejidos, especialmente
tejidos que contienen celulosa, suelen causar una aspereza en el
tejido usado. El uso de celulasas, es decir enzimas celulolíticas,
para la reducción de la aspereza de los tejidos que contienen
celulosa, p. ej. algodón, fue sugerido y demostrado hace mucho
tiempo.
La explotación práctica de las celulasas ha
sido, hasta cierto punto, atrasada por la naturaleza de las
preparaciones con celulasa conocidas que suelen ser mezclas
complejas de una variedad de componentes individuales de celulasa, y
que pueden tener una actividad específica más bien baja. Es difícil
optimizar la producción de componentes individuales en múltiples
sistemas enzimáticos y así llevar a cabo una producción industrial
de celulasas con buena relación entre coste y eficacia, y su uso
real ha sido impedido por las dificultades que surgen de la
necesidad de emplear cantidades más bien grandes de enzimas para
conseguir el efecto deseado.
Los inconvenientes de las celulasas previamente
sugeridas pueden ser remediados usando enzimas monocomponentes
seleccionadas por una alta actividad específica. Las celulasas
monocomponentes están descritas en, p. ej. WO 91/17243, WO 91/17244
y WO 91/10732.
P. ej. en WO 91/17244 se describe una enzima de
degradación de celulosa (una celulasa) derivable de un hongo
distinto a Trichoderma o Phanerochaete que comprende
un dominio de enlace de carbohidrato homólogo a una región
A-terminal de celulasas de Trichoderma
reesei, el dominio de enlace de carbohidrato siendo capaz de
efectuar el enlace de la enzima a un sustrato celulósico insoluble,
que puede ser empleado para el tratamiento textil, p. ej. para
reducir la aspereza de tejidos que contienen algodón y para eliminar
la suciedad y clarificar el color de tejidos. En el ejemplo 3 y fig.
13 se describe la preparación de una endoglucanasa de la familia C
de Fusarium oxysporum y la secuencia de ADN y secuencia de
aminoácidos derivada, respectivamente. Más tarde se descubrió que la
secuencia de aminoácidos descrita no era correcta; la secuencia
correcta está publicada en Sheppard, P.O., Grant, F.J., Oort, P.J.,
Sprecher, C.A., Foster, D.C., Hagen, F.S., Upshall, A., Mcknight,
G.L. y Ohara, P.J.: Uso de secuencias específicas de familias de
celulasa conservadas para clonar ADNc de homólogos de celulasa de
Fusarium oxysporum. Gen. 150:163-167, 1994.
En el ejemplo 4 y Fig. 14A-E se describe la
preparación de una endoglucanasa I de Humicola insolens (EG
I) y la secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos derivada,
respectivamente. Además, en el ejemplo 4 (página 32, línea 1 a 5) se
describe la construcción del plásmido de expresión de una EG I
truncada (denominada EG I') donde los últimos 13 aminoácidos de la
región de codificación fueron eliminados y se alteró Val a Leu en la
posición 421 (posición 401 en la secuencia de la enzima). El quid de
la invención descrita en WO 91/17244 es proporcionar una celulasa
que, además de la holoenzima, tenga un dominio de enlace de
carbohidrato (CBD) que sea homólogo a la región A de las celulasas
de Trichoderma reesei, puesto que se pensó que la función del
CBD en la molécula de enzima mediaba el enlace a sustratos sólidos
incluyendo celulosa y consecuentemente potenciaba la actividad de
tales enzimas hacia tales sustratos.
El problema subyacente de la presente invención
es obtener endoglucanasas monocomponentes que tengan una actividad
enzimática mejorada en un rango de pH alcalino, mientras ejerza a la
vez una acción celulolítica moderada en el sustrato celulósico. En
otras palabras, la endoglucanasa no debería destruir el sustrato
celulósico como tal. Por ejemplo, cuando el sustrato es un tejido
celulósico, la endoglucanasa usada no debería suponer una pérdida de
fuerza de tracción sustancial del tejido. La actividad alcalina
mejorada de la enzima es también esencial, puesto que la mayoría de
las aplicaciones de endoglucanasas tienen lugar ventajosamente en un
rango de pH alcalino.
Sorprendentemente, se acaba de descubrir que
determinadas celulasas que no comprenden un dominio de enlace de
carbohidrato, es decir, consisten esencialmente en la holoenzima, o
que al menos no comprenden un dominio de enlace de carbohidrato que
sea homólogo a la región A de las celulasas de Trichoderma
reesei, pueden tener una actividad mejorada. Esto puede por
ejemplo suponer una mejor eliminación de suciedad de los
tejidos.
Las celulasas de la invención son endoglucanasas
según se define en las reivindicaciones. Pueden tener el residuo de
aminoácido triptófano (Trp o W) en la posición correspondiente a la
posición 55 del marco de homología estructura en la Figura 5.
Más específicamente, se ha descubierto que las
celulasas seleccionadas del grupo consistente en celulasas
clasificadas en la familia 7 como se describe en Henrissat, B. et
al.: Biochem. J. (1993), 293, p. 781-788, y
variantes de celulasa derivada de una celulasa madre clasificada en
la familia C, comprendiendo un núcleo y opcionalmente un enlace
C-terminal consistente en 10 aminoácidos como mucho,
puede resultar excelente en detergentes con respecto a la
eliminación de suciedad en comparación con las celulasas
conocidas.
En un aspecto, la invención se refiere a
endoglucanasas que pueden ser truncadas, p. ej. genéticamente
truncadas, variantes de endoglucanasas conocidas, y su uso, p. ej.
para lavar, limpiar, desentintar y elaborar pasta de papel.
Las endoglucanasas presentes son útiles p. ej.
para eliminar la suciedad y pueden así ser aplicadas a composiciones
detergentes, aditivos detergentes y/o suavizantes para tejidos.
Otros usos de las presentes endoglucanasas son
la clarificación de color de tejidos textiles (eliminación de
pelusas y bolitas), prevención de la redeposición en el lavado del
tejido, eliminación de suciedad, desentintado de papel usado, y para
reciclar pasta de papel.
En la presente descripción y reivindicaciones,
el término "celulasa" denota una enzima que hidroliza celulosa.
La celulasa puede ser un componente que ocurre en un sistema de
celulasa producido por un microorganismo dado, dicho sistema de
celulasa comprendiendo principalmente diferentes componentes
enzimáticos de celulasa incluyendo aquellos normalmente
identificados como p. ej. celobiohidrolasas, exocelobiohidrolasas,
endoglucanasas, \beta-glucosidasas. De forma
alternativa, la celulasa puede ser un único componente, es decir un
componente esencialmente libre de otros componentes de celulasa que
ocurren normalmente en un sistema de celulasa producido por un
microorganismo dado, el único componente siendo un componente
recombinante, es decir producido por clonación de una secuencia de
ADN que codifica el único componente y subsiguiente célula
transformada con la secuencia de ADN y expresada en un huésped. El
huésped es preferiblemente un huésped heterólogo, aunque el huésped
puede ser también, bajo ciertas condiciones, el huésped
homólogo.
La celulasa de la invención es una endoglucanasa
como se define en las reivindicaciones.
El término "eliminación de suciedad" o
"eliminación de partículas de suciedad", como se utiliza aquí,
se refiere a una limpieza mejorada de tejidos o prendas que
contienen celulosa, p. ej. algodón, contaminados por partículas de
tierra o de otra materia insoluble atrapada por microfibrillas
extendidas sobre la superficie de la fibra.
En el presente contexto, el término
"homólogo" o "secuencia homóloga" se entiende que indica
una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de la figura 3
en uno o más residuos de aminoácidos. La secuencia homóloga puede
ser una que resulte de la modificación de una secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 3, p. ej. implicando sustitución
de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios diferentes
en la secuencia de aminoácidos, deleción de uno o más residuos de
aminoácidos en cualquiera de los dos extremos de la enzima o en uno
o más sitios en la secuencia de aminoácidos, o inserción de uno o
más residuos de aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de
aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos puede
realizarse de manera adecuada modificando la secuencia de ADN que
codifica la enzima, p. ej. por mutagénesis dirigida o por
mutagénesis aleatoria o una combinación de estas técnicas conforme a
procedimientos bien conocidos. De forma alternativa, la secuencia
homóloga puede ser una de una enzima derivada de otro origen
distinto a las celulasas correspondiente a la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 3. Así, "homólogo" puede p.
ej. indicar un polipéptido codificado por ADN que hibridice a la
misma sonda que el ADN que codifica la celulasa con la secuencia de
aminoácidos en cuestión bajo condiciones específicas determinadas
(tal como lavado previo en 5xSSC y prehibridación durante 1 h a
\sim40ºC en una solución al 20% de formamida, solución
5xDenhard't's, 50 mM de fosfato sódico, pH 6.8, y 50 \mug de ADN
de timo de ternero desnaturalizado por ultrasonidos, seguido de
hibridación en la misma solución completada con 100 \muM ATP
durante 18 H a \sim40ºC). La secuencia homóloga normalmente
muestra algo de homología (en términos de identidad) de al menos
50%, tal como al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso
95% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.
Preferiblemente, el grado de homología está
basado en la homología de la estructura tridimensional de las
celulasas. Por ejemplo, el Solicitante ha preparado el alineamiento
de secuencias mostrado en la Figura 5, donde las secuencias de
aminoácidos de tres endoglucanasas y una celobiohidrolasa estaban
alineadas:
EG1-F: endoglucanasa EG1 de
Fusarium oxysporum
(fus_eg1_nat.pdb, a-cadena)
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EG1-H: endoglucanasa EG1 de
Humicola insolens
(1egl.pdb, a-cadena)
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EG1-T: endoglucanasa EG1 de
Trichoderma reesei
(sin estructura pdb)
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CBH1: celobiohidrolasa de Trichoderma
reesei
(1cel.pdb, a-cadena).
\vskip1.000000\baselineskip
Las referencias entre paréntesis se refieren a
la identificación de la Base de Datos de Brookhaven para las
entradas.
Inicialmente las secuencias fueron alineadas
basándose en la homología de la estructura secundaria, pero la
sobreposición y examen visual de las estructuras de rayos X de
EG1-F, EG1-H y CBH1 necesitó varias
modificaciones del alineamiento de secuencias. El rendimiento final
en la Fi. 5 se basa en el alineamiento estructural
tridimensional.
Los C-terminales son visibles en
varias extensiones en las tres estructuras de cristales. Después del
motivo común de las secuencias IGST (Res#445-449),
tres residuos son visibles en EG1-F, uno en
EG1-H, y cinco en CBH1. Para la comparación de
secuencias en la Tabla 1 a continuación,, residuos de los
N-terminales al motivo C-terminal
NPSG en CBH1 están incluidos (Res#453 en la Fig. 5), es decir 402
residuos desde EG1-F y EG1-H, 373
residuos desde EG1-T y 434 residuos desde CBH1.
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En la Tabla 2 a continuación, se enumeran los
puentes disulfuro encontrados en EG1-F,
EG1-H y CBH1. Basado en la homología estructural las
posiciones equivalentes para EG1-T están
indicadas.
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La deleción alrededor de Res#260 en
EG1-T previene la formación de dos puentes
disulfuro: C215-C234 & C239- C315 (numeración
EG1-H). Es posible que la estructura de
EG1-T se haya movido en relación a
EG1-H y EG1-F para permitir la
formación de un puente disulfuro entre C215 y C315 (C212 & C291
en la numeración de EG1-T). Los 7 puentes disulfuro
restantes encontrados en EG1-F y
EG1-H están también presentes en
EG1-T.
La deleción alrededor de Res#260 en
EG1-T previene la formación de dos puentes
disulfuro: C215-C234 & C239- C315 (numeración de
EG1-H). Es posible que la estructura de
EG1-T se haya movido en relación a
EG1-H y EG1-F para permitir la
formación de un puente disulfuro entre C215 y C315 (C212 & C291
en la numeración de EG1-T). Los 7 puentes disulfuro
restantes encontrados en EG1-F y
EG1-H están también presentes en
EG1-T.
CBH1 contiene los mismos 9 puentes disulfuro que
EG1-F y EG1-H, y un puente disulfuro
adicional en la región N-terminal.
CBH1 contiene la mayoría de inserciones
relativas a las otras, y estas inserciones están predominantemente
localizadas en los bordes del surco de enlace del sustrato,
posiblemente contribuyendo al hecho de que CBH1 es una
celobiohidrolasa.
Cuando se intenta explicar la actividad alcalina
mejorada de EG1-H y EG1-F en
relación a EG1-T, los siguientes bucles pueden ser
los más interesantes, ya que contienen cargas en la proximidad del
sitio activo. Las cargas pueden alterar los valores de pKa de los
residuos catalíticos, e interactúan con la transferencia de
electrones durante la
catálisis.
catálisis.
a) las inserciones de 11 residuos (en relación a
EG1-T) en la Pos. 229 en EG1-H y
EG1-F (Res#254) se localizan sobre los residuos del
sitio activo (E197; D199 & E202) y contienen 2 o 3 residuos
cargados.
b) las inserciones de 5 residuos (en relación a
EG1-T) en la Pos. 320 en EG1-H y
EG1-F (Res#355) se localizan al final del punto de
unión del sustrato y contienen 2 o 3 residuos cargados.
c) las inserciones de 2 residuos (en relación a
EG1-T) en la Pos. 259 en EG1-H y
EG1-F (Res#291) se localizan cerca de la inserción
b) anterior, y contienen un residuo de lisina cargado.
Las composiciones de los aminoácidos de las
cuatro enzimas, es decir EG1-F
EG1-H, EG1-T y CBH1) incluyendo los
residuos usados en la tabla 1 de identidad de secuencias arriba (es
decir, incluyendo Res#453), se muestran en la tabla 3.
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Los puntos isoeléctricos (pl) fueron estimados
para cada una de las cuatro celulasas (mostradas en la tabla 4 más
abajo), utilizando valores de pKa estándares. Se asumió que los
N-terminales están bloqueados, que ningún C-
terminal libre está presente en las enzimas centrales, y que ninguno
de los iones metálicos están enlazados. Las cálculos no consideran
los efectos de desaminaciones.
La diferencia entre los valores de pl real y
calculado se pueden deber a la desaminación, por ejemplo Asn a Asp,
que reduce el pl real.
A partir de las composiciones de aminoácidos y
los valores de pKa es posible calcular a valores diferentes de pH
las cargas (parciales) en todos los aminoácidos titulables. De esta
manera las cargas netas y la suma de cargas negativas y positivas
fueron calculadas a pH 4, 6, 8 y 10, como se muestra en tabla 5.
Las dos celulasas alcalinas,
EG1-H y EG1-F, comparten la
característica común, de que sobre un intervalo amplio de pH (pH
4-10) contienen al menos 70 residuos cargados. El
EG1-T acídico en cambio contiene menos de 50
residuos cargados dentro de este intervalo de pH. Las superficies
más densamente cargadas de EG1-F y
EG1-H pueden ser responsables del rendimiento
mejorado en detergentes de lavandería en relación a
EG1-T.
Para examinar la región del sitio activo en más
detalle, los aminoácidos localizados dentro de 10 \ring{A} de los
residuos de sitio activo E197; D199 y E202 fueron identificados para
EG1-H y EG1-F. Los siguientes
residuos pertenecen a este subconjunto de 10 \ring{A} en
EG1-H (numeración EG1-H):
108, 124, 129, 131, 133, 135,
138-139, 141-151,
171-177, 193-220,
233-243, 245, 252, 266, 268, 270, 272, 280, 283,
285, 287, 310, 323, 326, 328, 331-336,
338-347, 354, 356-358, 362, 384,
386.
La unidad "\ring{A}" como se utiliza en
este caso se refiere a \ring{A}ngstrom, una unidad de longitud. 1
\ring{A} es igual al 0.1 nanómetro (nm).
El subconjunto de 10 \ring{A} en
EG1-F contiene esencialmente los mismos residuos que
el subconjunto de 10 \ring{A} EG1-H.
EG1-T difiere más significativamente, en particular
con respecto a los segmentos alrededor de 219-221 y
230-240 en EG1-H y
EG1-F, que están ausentes en EG1-T.
Aprox. 80% de identidad de secuencia existe entre
EG1-F y EG1-H en el subconjunto de
10 \ring{A}, mientras que los residuos en el subconjunto
equivalente de 10 \ring{A} para EG1-T son más
diferentes. De interés particular son las diferencias que implican
las cargas.
En el subconjunto de 10 \ring{A} varias
mutaciones en EG1-H & EG1-F, que
tienen como objetivo la catálisis de afectación cambiando la
electrostática, son contempladas basándose en homología secuencial a
EG1-T. Para reducir el pl dentro de esta región
M142E, K217A, K218T (en EG1-H sólo) y R245G es
contemplado, y para aumentar el pl son contemplados E150Q, I310D,
E334K (en EG1-H) y D334K (en
EG1-F).
Los siguientes residuos de aminoácidos están en
contacto cercano con celobiosa (enlazada al EG1-F);
la numeración se refiere a la numeración EG1-F:
a) R106 conservado en las 4 celulasas
b) Y145 conservado en las 4 celulasas
c) S345 conservado en las 4 celulasas.
d) D34 conservado en las 4 celulasas
e) W51 también W51 en EG1-H.
Este W parece ser importante para el enlace de la segunda fracción
de azúcar en celobiosa (relativo al sitio activo).
f) S 104 conservado en las EG1s
g) A143 también A143 en
EG1-H
h) Y171 conservado en las 4 celulasas
i) D173 conservado en las 4 celulasas
j) Q175 conservado en las 4 celulasas
k) Y177 no conservado
l) W347 conservado en las 4 celulasas.
Este W347 parece ser importante para el enlace
de la primera fracción de azúcar en celobiosa (relativo al sitio
activo).
La mayor parte de estos residuos son altamente
conservados. Esto implica que su mutación puede no ser ventajosa,
pero esto ciertamente no significa que el rendimiento de EG1s no se
puede mejorar por sustitución de estos residuos. Estos están todos
localizados en la región del sitio activo, y de hecho esto los hace
muy interesantes, ya que los cambios en las propiedades son
propensos a ser más significantes. Por lo tanto, se contempla que
las sustituciones en estas posiciones son sustituciones
preferidas.
La ventaja de EG1-H es su
capacidad para inducir la eliminación de suciedad con daño de tejido
mínimo. Aquello que es característico con respecto a
EG1-H y EG 1-F en comparación con
Carezyme (4egv.pdb) y Thermomonospora fusca EG 1 es un surco
de enlace del sustrato comparativamente profundo, posiblemente que
previene el acceso de fibras de algodón intactas en el sitio
catalítico.
En EG1-F y EG1-H
el surco de enlace del sustrato tiene una profundidad de
18-20 \ring{A} al medir las distancias entre los
átomos C de los residuos del sitio activo (E197; D199 & E202) y
los átomos C de los residuos localizados en el borde superior del
punto de unión del sustrato (G351 & A229 en
EG1-H). El punto es aprox. 19 \ring{A} de amplio,
al medir entre átomos C de los dos residuos del borde.
En contraste, la profundidad del punto de unión
del sustrato en Carezyme® (4egv.pdb), cuando se mide de una manera
similar, sólo es 8-10 \ring{A}, mientras que la
anchura en el borde es aprox. 9 \ring{A}.
En T. fusca EG1 (1tml.pdb) la profundidad
del punto es aprox. 10 \ring{A}, y la anchura aprox. 18
\ring{A}.
La presente invención se refiere a una celulasa
que es seleccionada del grupo consistente en celulasas clasificadas
en la familia 7 como se describe en Henrissat, B. et al.:
Biochem. J. (1993), 293, p. 781-788, y variantes de
celulasa derivada de una celulasa madre clasificada en la familia C,
donde la celulasa comprende un núcleo y opcionalmente una conexión
C-terminal consistente en 10 aminoácidos como mucho,
siempre que la celulasa sea diferente de la endoglucanasa que tiene
la secuencia de aminoácidos relacionada en la figura 1.
La clasificación de Henrissat es un nuevo
sistema de clasificación para glicosil hidrolasas basado en
comparaciones de secuencias y análisis de agrupaciones hidrofóbicas
que han demostrado que los dominios catalíticos de las gicosil
hidrolasas encajan en 45 familias diferentes, de las cuales 11
(originalmente denominadas A-K) contienen enzimas
con actividad celulolítica.
Hasta ahora han sido publicadas estructuras de
los dominios catalíticos de celulasas de cuatro familias:
- Celobiohidrolasa II (CBH II) de Trichoderma reesei (Rouvinen et al. 1990) y endocelulasa E2 de Thermomonospora fusca (Sapezio et al. 1993) de la familia 6(B), Celobiohidrolasa I (CBH I) de T. reesei (Divne et al. 1994) de la familia 7 (C),
- CeIA de Clostridium thermocellum (Juy et al. 1992) de la familia 9(E); y la endoglcucanasa V de H. insolens (Davies et al. 1993) de la familia 45(K).
Las celulasas de la invención pueden ser
obtenibles por o derivadas de una cepa de Humicola, Trichoderma,
Myceliophthora, Penicillium, Irpex, Aspergillus, Scytalidium o
Fusarium, preferiblemente de una cepa de Humicola,
Trichoderma, Myceliophthora, Scytalidium o Fusarium, más
preferiblemente de una cepa de Humicola insolens, Fusarium
oxysporum, Myceliophthora thermophila o Trichoderma
reesei.
La celulasa de la invención puede ventajosamente
tener una o más inserciones de entre 1 y 25, preferiblemente entre 1
y 20 residuos de aminoácidos; preferiblemente la inserción es
relativa a la posición EG1-Tat
230-240 en EG1-H y
EG1-F y parte de la cual está localizada dentro de
10 \ring{A} de los residuos de sitio activo E197, D199 y E202.
En otro aspecto, la celulasa de la invención
tiene un surco de enlace del sustrato con una profundidad de al
menos 12 \ring{A}, preferiblemente 15 \ring{A}, si se mide entre
los átomos C\alpha de los residuos de sitio activo localizados en
el fondo del surco y los átomos C\alpha de los residuos
localizados en el borde del surco de enlace del sustrato
inmediatamente arriba de los residuos del sitio activo.
Según la invención las celulasas, que
esencialmente consisten en el núcleo y opcionalmente en un enlace
C-terminal teniendo 10 aminoácidos como mucho,
pueden resultar excelentes para la eliminación de partículas de
suciedad cuando se usa para el lavado o suavizado del tejido. En la
figura 1 se describe la secuencia de aminoácidos de una
endoglucanasa genéticamente truncada de Humicola insolens de
402 residuos de aminoácidos que está descrita en WO 91/17244 como se
ha mencionado anteriormente (denominada EG I'). En la figura 3 se
describe la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa
genéticamente truncada de Humicola insolens de 402 residuos
de aminoácidos, esta endoglucanasa particular de ahora en adelante
siendo denominada EG I*. En la figura 4 se describe la secuencia de
aminoácidos de una endoglucanasa genéticamente truncada de
Fusarium oxysporum, esta endoglucanasa particular de ahora en
adelante siendo denominada EGI-Fus. En la figura 6
se describe la secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de
Myceliophthora thermophila. Sin estar limitados a la teoría
se cree que puede obtenerse una actividad enzimática mejorada
suministrando celulasas, especialmente endoglucanasas, que
esencialmente consisten en un núcleo. La celulasa puede además
comprender un enlace C-terminal, una "cola",
que es relativamente corta, el enlace C-terminal
corto no contribuyendo negativamente a la actividad enzimática. Así
se cree que las celulasas de la invención pueden ser derivadas de
celulasas conocidas p. ej. "truncando" el
C-terminal completa o parcialmente de la proteína
enzimática en cuestión. La mencionada EG I* es así derivada de la
endoglucanasa conocida EG I (véase WO 91/17244,
Fig.14A-E) eliminando los últimos 13 aminoácidos de
la región de codificación. Además, los residuos de aminoácidos en
las posiciones 162, 203, 211 y 401, respectivamente, son sustituidos
(162: Ser a Pro; 203: Val a Ala; 211: Val a Ala; 401: Val a
Leu).
Se contempla que las celulasas que tienen una
secuencia de aminoácidos que es al menos un 60% homóloga a las
secuencias de aminoácidos relacionadas en la figura 1, 3 y 4,
respectivamente, también tienen una actividad mejorada produciendo
una mejor eliminación de suciedad de los tejidos.
En la figura 2 se relaciona una alineación de la
secuencia de aminoácidos de tres endoglucanasas conocidas de
Humicola insolens (denominada EGIHUM y teniendo 415
aminoácidos), Fusarium oxysporum (denominada Cendofus y
teniendo 409 aminoácidos) y Trichoderma reesei (denominada
Egltrite y teniendo 435 aminoácidos), respectiva-
mente.
mente.
En consecuencia, la invención se refiere además
a una celulasa que es derivable de una cepa de Humicola
insolens y comprende los residuos de aminoácidos
1-397 relacionados en la figura 3 y opcionalmente un
enlace C-terminal consistente en 10 aminoácidos
como mucho, o una variante de dicha celulasa con una secuencia de
aminoácidos que es al menos un 95% homóloga a dicha secuencia
relacionada en la Figura 3 y donde dicha variante tiene uno o más de
los siguientes aminoácidos son sustituidos: N89Q, N89Q+N247Q, H123N,
T385N, Q399N, E202A, S37W+P39W, M142E, K217A, K217A+K218T, R245G,
I310D, E150Q, E334K, M198L.
Aún otra variante de celulasa útil es aquella en
la que uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes dentro de
5 \ring{A} de celobiosa enlazada son sustituidos: R106x, Y145x,
S345x, D34x, W51x, S104x, A143x, Y171x, D173x, Q175x, Y177x, W347x,
donde x es elegida para modificar el enlace de H potencial y/o
interacción hidrofóbica con el sustrato.
La actividad de las presentes celulasas con
respecto a la eliminación de suciedad puede estar correlacionada a
métodos analíticos específicos.
En consecuencia, la presente invención además se
refiere a una celulasa que tiene alta actividad sobre celotriosa
ante una matriz detergente, alta acción de dispersión en negro
carbón, y alta actividad alcalina en celulosa hinchada con ácido a
pH 8.
Más específicamente, la actividad sobre
celotriosa (ver abajo) en presencia de una matriz detergente
corresponde a un k_{cat} aparente a pH 8 de preferiblemente al
menos 1 por seg; la acción de dispersión en negro carbón a pH 10
corresponde a un valor delta preferiblemente de al menos 0.20 medido
a 582 nm para 5 mg/l de celulasa (ver p. ej. ejemplo 2); y la
actividad alcalina en celulosa hinchada con ácido a pH 8 corresponde
a un k_{cat} aparente preferiblemente de al menos 10 por seg (ver
abajo).
EG I* (de Humicola insolens; ver Fig. 3)
tiene un peso molecular (PM) aparente de aproximadamente 50 kD
debido a la glicosilación de la molécula. Se cree que el PM
"real" es aproximadamente 46 kD. El pl de EG I* es al menos
aproximadamente 0.4 inferior a EG I, puesto que el pl de EG I* es
aproximadamente 5.1-5.3 mientras que el pl de EG I
es aproximadamente 5.5-6.2.
Las celulasas de la invención pueden ser
obtenidas del microorganismo en cuestión usando cualquier técnica
adecuada. Por ejemplo, una preparación de celulasa puede ser
obtenida por fermentación de un microorganismo y aislamiento
posterior de una preparación conteniendo la celulasa del caldo o
microorganismo fermentado por métodos conocidos en la técnica, pero
más preferiblemente usando técnicas de ADN recombinantes como las
conocidas en la técnica. Tal método normalmente comprende el cultivo
de una célula huésped transformada con un vector de ADN recombinante
capaz de expresar y llevar una secuencia de ADN que codifique el
componente de celulasa en cuestión, en un medio de cultivo bajo
condiciones que permitan la expresión de la enzima y recuperación de
la enzima del cultivo.
La secuencia de ADN que codifica una celulasa
madre puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que
produzca la celulasa en cuestión por varios métodos, bien conocidos
en la técnica. Primero debería construirse un ADN genómico y/o
genoteca de ADNc usando ADN o ARN mensajero cromosómicos del
organismo que produce la celulasa que debe ser estudiada. Luego, si
la secuencia de aminoácidos de la celulasa es conocida, se pueden
sintetizar y utilizar sondas de oligonucleótidos marcadas, homólogas
para identificar los clones de codificación de celulasa de una
genoteca genómica de ADN bacteriano, o de una genoteca de ADNc
fúngica. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada
conteniendo secuencias homólogas a la celulasa de otra cepa de
bacteria u hongo podría ser usada como sonda para la identificación
de los clones de indentificación de celulasa, usando hibridación y
condiciones de lavado de rigor inferior.
Aún otro método para la identificación de clones
de producción de celulasa implica insertar fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido,
transformar la bacteria negativa de celulasa con la biblioteca de
ADN genómico resultante, y luego depositar sobre placas las
bacterias transformadas sobre agar conteniendo un sustrato para
celulasa. Estas bacterias que contienen un plásmido de soporte de la
celulasa producirán colonias rodeadas por un halo de agar claro,
debido a la digestión del sustrato por la celulasa secretada.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos
estándares establecidos, p. ej. el método de la fosfoamidita
descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22,
1981, pp. 1859-1869, o el método descrito por
Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, págs.
801-805. Según el método de la fosforamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN
automático, purificados, emparejados, ligados y clonados en vectores
apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mixto genómico y sintético, mixto sintético y ADNc o mixto
genómico y ADNc preparado ligando fragmentos de origen sintético,
genómico o ADNc (según sea apropiado), correspondiendo los
fragmentos a varias partes de la secuencia de ADN entera, conforme a
técnicas estándares. La secuencia de ADN puede también ser preparada
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores
específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o R.K.
Saiki et al., Science 239, 1988, págs.
487-491.
Según la invención, una secuencia de
codificación de celulasa mutada producida por los métodos
anteriormente descritos, o cualquier método alternativo conocido en
la técnica, puede ser expresada, de forma enzimática, usando un
vector de expresión que normalmente incluya secuencias de control
que codifiquen un promotor, operador, sitio de enlace de ribosoma,
señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen
represor o varios genes activadores. Para permitir la secreción de
la proteína expresada, pueden insertarse nucleótidos que codifiquen
una "secuencia señal" antes de la secuencia de codificación de
la celulasa. Para la expresión bajo la dirección de secuencias de
control, un gen diana que debe ser tratado según la invención es
operativamente enlazado a las secuencias de control en el marco de
lectura apropiado. Las secuencias promotoras que pueden ser
incorporadas en vectores de plásmidos, y que pueden soportar la
transcripción del gen de celulasa mutante, incluyen pero no se
limitan al promotor \beta-lactamasa procariótica
(Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) y el promotor tac
(DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:21-25). Se pueden encontrar otras referencias en
"Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific
American, 1980, 242:74-94.
Según una forma de realización B.
subtilis es transformada por un vector de expresión que lleva el
ADN mutado. Si la expresión debe ser realizada en un microorganismo
de secreción tal como B. subtilis una secuencia señal puede
seguir la señal de iniciación de traducción y preceder la secuencia
de ADN de interés. La secuencia señal actúa para transportar el
producto de expresión a la pared celular donde es separada del
producto tras la secreción. El término "secuencias de control"
tal como se ha definido anteriormente se entiende que incluye una
secuencia señal, cuando está presente.
En un método habitualmente preferido para
producir variantes de celulasa de la invención, se usa un hongo
filamentoso como organismo huésped. El organismo huésped de hongo
filamentoso puede convenientemente ser uno que haya sido previamente
usado como huésped para producir proteínas recombinantes, p. ej. una
cepa de una especie de Aspergillus, tal como A. niger, A.
nidulans o A. oryzae. El uso de A. oryzae en la
producción de proteínas recombinantes está extensamente descrito en,
p. ej. EP 238 023.
Para la expresión de variantes de celulasa en
Aspergillus, la secuencia de ADN de codificación de la
variante de celulasa está precedida por un promotor. El promotor
puede ser cualquier secuencia de ADN que exhiba una actividad
transcripcional fuerte en Aspergillus y puede ser derivado de
un gen que codifique una proteína extracelular o intracelular tal
como una amilasa, una glucoamilasa, una proteasa, una lipasa, una
celulasa o una enzima glicolítica.
Ejemplos de promotores adecuados son los
derivados del gen de codificación de amilasa TAKA de A.
oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei,
\alpha-amilasa neutra de A. Niger,
\alpha-amilasa estable al ácido de A.
Niger, glucoamilasa de A. Niger, lipasa de Rhizomucor
miehei, proteasa alcalina de A. oryzae o isomerasa de
triosa fosfato de A. oryzae.
En particular cuando el organismo huésped es
A. oryzae, un promotor preferido para el uso en el proceso de
la presente invención es el promotor de la amilasa TAKA de A.
oryzae pues exhibe una actividad transcripcional fuerte en A.
oryzae. La secuencia del promotor de amilasa TAKA aparece en EP
238 023.
Las secuencias de terminación y de
poliadenilación pueden de manera adecuada derivar de las mismas
fuentes que el promotor.
Las técnicas usadas para transformar una célula
huésped fúngica puede de manera adecuada ser como las que se
describe en EP 238 023.
Para asegurar la secreción de la variante de
celulasa de la célula huésped, la secuencia de ADN que codifica la
variante de celulasa puede ser precedida por una secuencia señal que
puede ser una secuencia señal de origen natural o una parte
funcional de ésta o una secuencia sintética que proporcione
secreción de la proteína de la célula. En particular, la secuencia
señal puede ser derivada de un gen que codifique una amilasa o
glucoamilasa de esp. Aspergillus, un gen que codifique una
lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei, o un gen que
codifique una celulasa, xilanasa o lipasa de Humicola. La
secuencia señal es preferiblemente derivada del gen que codifica
amilasa TAKA de A oryzae, \alpha-amilasa
neutra de A. Niger, \alpha-amilasa estable
al ácido de A. Niger o glucoamilasa de A. Niger.
El medio usado para cultivar las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para el crecimiento de las células de Aspergillus.
Los transformantes son normalmente estables y pueden ser cultivados
en ausencia de presión de selección. No obstante, si se encuentra
que los transformantes son inestables, un marcador de selección
introducido en las células puede ser usado para la selección.
La proteína de celulasa madura secretada de las
células huésped puede convenientemente ser recuperada del medio de
cultivo por procedimientos bien conocidos que incluyen la separación
de las células del medio por centrifugado o filtración, y la
precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una
sal tal como sulfato de amonio, seguido de procedimientos
cromatográficos tal como cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad, o similar.
Según la invención, la endoglucanasa de la
invención puede normalmente ser un componente de una composición
detergente. Una celulasa como se describe aquí o una endoglucanasa
derivada de una cepa de Humicola insolens y teniendo la
secuencia enumerada en la Figura 1 y un peso molecular aparente de
aproximadamente 50 kD medido en SDS-PAGE puede
típicamente ser un componente de una composición detergente. Como
tal, ésta puede ser incluida en la composición detergente en forma
de un granulado no pulverulento, un líquido estabilizado, o una
enzima protegida. Los granulados no pulverulentos pueden ser
producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452
(ambos a nombre de Novo Industri A/S) y pueden opcionalmente ser
revestidos por métodos conocido en la técnica. Ejemplos de
materiales de revestimiento cerosos son productos de óxido de
poli(etileno) (polietilenoglicol, PEG) con pesos molares
principales de 1000 a 20000, nonilfenoles etoxilados teniendo de 16
a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados donde
el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay 15
a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos;
y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Se dan ejemplos de
materiales de revestimiento que forman una película adecuados para
la aplicación por técnicas de lecho fluidificado en la patente GB
1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo,
ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un
azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según
métodos establecidos. Otros estabilizadores enzimáticos son bien
conocidos en la técnica. Las enzimas protegidas pueden ser
preparadas según el método descrito en EP 238,216. En consecuencia,
la presente invención además se refiere a un aditivo detergente que
comprende una celulasa de la presente invención o una endoglucanasa
derivada de una cepa de Humicola insolens y teniendo la
secuencia de aminoácidos enumerada en la Figura 3 y un peso
molecular aparente de aproximadamente 50 kD medido en
SDS-PAGE.
La composición detergente de la invención puede
estar en cualquier forma conveniente, como p. ej., polvo, gránulos,
pasta o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente
conteniendo hasta el 70% de agua y 0-30% de
solvente orgánico, o no acuoso.
La composición detergente comprende uno o más
agentes tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser, aniónico,
no iónico, catiónico, o zwitteriónico. El detergente normalmente
contendrá 0-50% de agente tensioactivo aniónico tal
como alquilobencenosulfonato lineal (LAS),
alfa-olefinsulfonato (AOS), sulfato de alquilo
(sulfato de alcohol graso) (AS), etoxisulfato de alcohol (AEOS o
AES), alcanosulfonatos secundarios (SAS),
alfa-sulfometilésteres de ácidos grasos, ácido
alquil- o alquenilsuccínico, o jabón. Puede también contener
0-40% de agente tensioactivo no iónico tal como
etoxilato de alcohol (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilado,
nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicósido, óxido de
alquildimetilamino, monoetanolamida de ácido graso etoxilado,
monoetanolamida de ácido graso, o amida de ácido graso de alquilo de
polihidroxi (p. ej. como se describe en WO 92/06154).
La composición detergente puede adicionalmente
comprender una o más de otras enzimas, tal como amilasa, lipasa,
cutinasa, proteasa, otras celulasas, peroxidasa, y oxidasa, p. ej.,
lacasa).
El detergente puede contener
1-65% de un adyuvante de detergente o agente de
complejación tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato,
citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido
etilenodiaminotetraacético (EDTA), ácido
dietilenotriaminopentaacético (DTMPA), ácido alquil- o
alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p.
ej. SKS-6 de Hoechst). El detergente puede también
puede ser no adyuvado, es decir esencialmente sin adyuvante de
detergente.
El detergente puede comprender uno o más
polímeros. Unos ejemplos son carboximetilcelulosa (CMC),
poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG),
alcohol polivinílico (PVA), policarboxilatos tal como poliacrilatos,
copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de
laurilmetacrilato/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema
blanqueante que puede comprender una Fuente de H_{2}O_{2} tal
como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador
del blanqueante formando perácido como tetraacetiletilenodiamina
(TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS). De forma alternativa,
el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos de tipo, p.
ej., amida, imida, o sulfona.
Las enzimas de la composición detergente de la
invención pueden ser estabilizadas usando agentes estabilizantes
convencionales, p. ej. un poliol tal como propilenoglicol o
glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido
bórico, o un ácido bórico derivado tal como, p. ej., un éster de
borato aromático, y la composición puede ser formulada como se
describe en, p. ej., WO 92/19709 y WO 92/19708.
El detergente puede también contener otros
ingredientes de detergente convencional tal como, p. ej.,
suavizantes de tejido incluyendo arcillas, reforzantes de espuma,
supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión
de la suciedad, agentes antirredeposición de la suciedad,
colorantes, bactericidas, blanqueadores ópticos o perfume.
El pH (medido en solución acuosa en
concentración de uso) será generalmente neutro o alcalino, p. ej. en
el rango de 7-11.
Formas particulares de composiciones detergentes
dentro del campo de la invención incluyen:
1) Composición detergente formulada como un
granulado teniendo una densidad en masa de al menos 600 g/l
comprendiendo
2) Composición detergente formulada
como un granulado teniendo una densidad en masa de al menos 600 g/l
comprendiendo
3) Composición detergente formulada
como un granulado teniendo una densidad en masa de al menos 600 g/l
comprendiendo
4) Composición detergente formulada
como un granulado teniendo una densidad en masa de al menos 600 g/l
comprendiendo
\newpage
5) Composición detergente líquida
acuosa
comprendiendo
6) Composición detergente líquida
estructurada acuosa
comprendiendo
7) Composición detergente formulada
como un granulado teniendo una densidad en masa de al menos 600 g/l
comprendiendo
8) Composición detergente formulada
como un granulado
comprendiendo
\vskip1.000000\baselineskip
9) Composición detergente formulada
como un granulado
comprendiendo
\vskip1.000000\baselineskip
10) Composición detergente líquida
acuosa
comprendiendo
\newpage
11) Composición detergente líquida
acuosa
comprendiendo
\vskip1.000000\baselineskip
12) Composición detergente
formulada como un granulado teniendo una densidad en masa de al
menos 600 g/l
comprendiendo
\vskip1.000000\baselineskip
13) Formulaciones detergentes como
se describe en 1) - 12) donde todo o parte del
alquilobencenosulfonato lineal es reemplazado por sulfato de alquilo
(C_{12}-C_{18}).
14) Composición detergente formulada como un
granulado teniendo una densidad en masa de al menos 600 g/l
comprendiendo
\newpage
15) Composición detergente
formulada como un granulado teniendo una densidad en masa de al
menos 600 g/l
comprendiendo
16) Formulaciones detergentes como
se describe en 1) - 15) conteniendo un perácido estabilizado o
encapsulado, bien como un componente adicional o como un substituto
para los sistemas blanqueantes ya
especificados.
17) Composiciones detergentes como se describe
en 1), 3), 7), 9) y 12) donde el perborato es reemplazado por
percarbonato.
18) Composiciones detergentes como se describe
en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15) conteniendo adicionalmente un
catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p. ej.,
ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese
catalysts for low-temperature bleaching", Nature
369, 1994, págs. 637-639.
19) Composición detergente formulada como un
detergente líquido no acuoso que comprende un agente tensioactivo no
iónico tal como, p. ej., alcohol primario lineal alcoxilado, un
sistema adyuvante (p. ej. fosfato), enzima y alcali. El detergente
puede también comprender agente tensioactivo aniónico y/o un sistema
blanqueante.
La endoglucanasa de la invención puede ser
incorporada en concentraciones convencionalmente empleadas en
detergentes. Actualmente se ha contemplado que, en la composición
detergente de la invención, la endoglucanasa puede ser añadida en
una cantidad correspondiente a 0.00001-1 mg
(calculado como proteína enzimática pura) de endoglucanasa por litro
de solución de lavado.
En aún otro aspecto, las presentes
endoglucanasas pueden ser usadas en suavizantes, p. ej. como se
describe en Surfactant and Consumer Products, Ed. por J. Falbe,
1987, pp 295-296; Tenside Surfactants Detergents, 30
(1993), 6, pp 394-399; JAOCS, Vol. 61 (1984), 2, pp
367-376; EP 517 762; EP 123 400; WO 92/19714; WO
93/19147; US 5,082,578; EP 494 769; EP 544 493; EP 543 562; US
5,235,082; EP 568 297; EP 570 237.
La presente invención también se refiere a un
proceso de lavado donde se trata tejido sucio con una celulasa de la
invención o una endoglucanasa derivada de una cepa de Humicola
insolens y teniendo la secuencia de aminoácidos relacionada en
la figura 3 y un peso molecular aparente de aproximadamente 50 kD
medido en SDS-PAGE.
Se contempla que, dependiendo de la
especificidad de la celulasa modificada, ésta puede ser empleada
para una o posiblemente más de las aplicaciones anteriormente
mencionadas, es decir en la industria panificadora, en la industria
vinícola y del zumo, para alimentos para animales, y en el
tratamiento textil y de la pasta de papel. En una forma de
realización particular, la preparación enzimática de la invención
puede comprender una combinación de una o más celulasas modificadas
con enzimas seleccionadas del grupo consistente en amilasas
modificadas o inmodificadas, lipasas, proteasas, oxidorreductasas y
hemicelulasas.
En la industria elaboradora de pasta para hacer
papel, la celulasa y/o preparación enzimática con respecto a la
invención puede ser aplicada ventajosamente p. ej. como sigue:
- -
- Para el descortezado: el tratamiento previo con la celulasa y/o preparación enzimática según la invención puede degradar la capa de cámbium previamente al descortezado en tambores mecánicos dando como resultado ahorros de energía ventajosos.
- -
- Para el desfibrado: el tratamiento de un material conteniendo fibras celulósicas con la celulasa y/o preparación enzimática de la invención antes del refinado o batido puede suponer una reducción del consumo de energía debido al efecto hidrolizante de la celulasa en las superficies interfibrilares. El uso de la celulasa y/o preparación enzimática de la invención puede suponer ahorros de energía mejores en comparación con el uso de enzimas inmodificadas, pues se cree que la celulasa modificada puede poseer una mayor capacidad para penetrar en las paredes de la fibra.
- -
- Para la modificación de las fibras, es decir mejora de las propiedades de las fibras cuando se necesita la hidrólisis parcial a través de la pared de la fibra que requiere una penetración más profunda de las enzimas (p. ej. para hacer las fibras gruesas más flexibles). El tratamiento profundo de fibras no había sido posible hasta ahora para pastas de papel de alto rendimiento, p. ej. pastas de papel mecánicas o mezclas de pastas de papel reciclado. Esto ha sido atribuido a la naturaleza de la estructura de la pared de la fibra que impide el paso de moléculas enzimáticas debido a la restricción física de la matriz del poro de la pared de la fibra. Se contempla que las celulasas modificadas (es decir derivatizadas) de la invención son capaces de penetrar en la pared de las fibras.
- -
- Para mejorar el drenaje. La drenabilidad de las pastas de papel para fabricar papel puede ser mejorada tratando la pasta con enzimas de hidrolizado, p. ej. celulasas. El uso de la celulasa modificada y/o preparación enzimática según la invención puede ser más eficaz, p. ej. producir un mayor grado de aflojamiento de haces de microfibrillas muy hidratadas en la fracción de finos (consistente en fragmentos de fibra) que limita el nivel de drenaje bloqueando los espacios vacíos entre las fibras y en la malla metálica de la máquina de papel. El estándar canadiense de refinado (CSF del inglés Canadian Standard Freeness) aumenta y el índice de drenaje Schopper-Riegler se reduce cuando la pasta es sometida a tratamiento con celulasa, ver p. ej. Patente US 4,923,565; TAPPI T227, SCAN C19:65 que se incorporan aquí como referencia.
- -
- Para la adherencia entre las fibras. Las enzimas hidrolíticas son aplicadas en la producción de pastas de papel para la fabricación de papel para mejorar la adherencia entre las fibras. Las enzimas lavan las superficies de fibra de impurezas p. ej. fragmentos celulósicos, aumentando así el área de celulosa expuesta con fijación a la pared de la fibra, mejorando así la capacidad enlazante del hidrógeno fibra a fibra. Este proceso es también denominado desqueratinización. El papel y cartón producido con una celulasa que contiene preparación enzimática según la invención puede tener una resistencia mejorada o un reducido gramaje, una superficie más lisa y una mejorada capacidad de impresión. Se cree que estas mejoras son el resultado de la penetrabilidad mejorada de la(s) enzima(s) derivatizada(s) modificada(s).
- -
- Para el desentintado enzimático. Se sabe que la hidrólisis parcial de papel reciclado durante o tras la reducción a pasta usando enzimas de hidrolización tal como celulasas facilita la eliminación y aglomeración de partículas de tinta. El uso de una celulasa modificada y/o preparación enzimática según la invención puede dar una liberación más eficaz de tinta de la estructura superficial debido a una mejor penetración de las moléculas de enzima en la matriz fibrilar de la pared de la fibra, reblandeciendo así la superficie con lo cual las partículas de tinta son eficazmente liberadas. También se mejora la aglomeración de partículas de tinta liberadas debido a una hidrólisis más eficaz de los fragmentos celulósicos que se encuentran fijados a las partículas de tinta por las fibras.
El tratamiento de pasta lignocelulósica puede,
p. ej., ser realizada como se describe en WO 91/14819, WO 91/14822,
WO 92/17573 y WO 92/18688.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere al uso de la endoglucanasa según la invención
en el proceso de biopulido. El biopulido es un tratamiento
específico de la superficie de los hilos que mejora la calidad del
tejido con respecto a su manipulación y apariencia sin pérdida de
humectabilidad del tejido. Los efectos más importantes del biopulido
pueden estar caracterizados por menos formación de pelusa y de
bolitas, mayor brillo/lustre, mejor manipulación del tejido, mayor
durabilidad de la suavidad y absorbancia de agua alterada. El
biopulido normalmente se desarrolla en el tratamiento húmedo de la
producción de géneros tejidos y de punto. El tratamiento húmedo
comprende fases tales como p. ej. desencolado, descrudado, blanqueo,
lavado, tintado/estampado y acabado. Durante cada una de estas
fases, el tejido es sometido en menor o mayor medida a acción
mecánica. En general, después de que las telas hayan sido hechas o
tejidas, el tejido pasa a una fase de desencolado, seguido de una
fase de descrudado, etc. El desencolado es el acto de eliminar el
apresto de los tejidos. Antes de tejerlos en telares mecánicos, los
hilos de urdimbre suelen ser revestidos con almidón de apresto o
derivados de almidón para aumentar su fuerza de tracción. Después
del tejido, el revestimiento de apresto debe ser eliminado antes de
procesar ulteriomente el tejido para asegurar un resultado homogéneo
y a prueba de lavados. Se sabe que para conseguir los efectos del
biopulido se requiere una combinación de acción celulolítica y
mecánica. También se sabe que se puede conseguir una
"supersuavidad" cuando el tratamiento con celulasa es combinado
con un tratamiento convencional con agentes suavizantes. Se
contempla que el uso de la celulasa modificada y/o preparación
enzimática de la invención para el biopulido de tejidos celulósicos
es ventajoso, p. ej. se puede conseguir un pulido más a fondo. El
biopulido puede ser obtenido aplicando el método descrito p. ej. en
WO 93/20278.
En aún otra forma de realización, la presente
invención se refiere al uso de una endoglucanasa según la invención
para degradar material vegetal p. ej. membranas celulares.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se contempla que la celulasa modificada y/o
preparación enzimática de la invención es útil en la preparación de
vino, zumo de verduras o frutas para aumentar el rendimiento. Las
celulasas según la invención pueden también ser aplicadas para la
hidrólisis enzimática de varios materiales de desecho o materias
derivadas de la membrana celular vegetal o, p. ej. residuos
agrícolas tal como paja de trigo, zuro de maíz, plantas enteras de
maíz, cáscaras de frutos secos, césped, vainas vegetales, vainas de
leguminosas, desechos de granos, pulpa de remolacha azucarera, y
similares. El material vegetal puede ser degradado para mejorar
diferentes tipos de tratamiento, facilitar la purificación o
extracción de otros componentes tales como purificación de
beta-glucano u oligómeros de
beta-glucano de cereales, mejorar el valor
alimenticio, reducir la capacidad enlazadora de agua, mejorar la
degradabilidad en plantas de aguas residuales, mejorar la conversión
de p. ej. césped y maíz en ensilaje, etc.
Según la invención, la celulasa es una
endoglucanasa. La actividad celulolítica de la endoglucanasa es
determinada según un estándar analítico y puede ser expresada en
unidades ECU.
Las enzimas celulolíticas hidrolizan CMC,
diminuyendo así la viscosidad de la mezcla de incubación. La
reducción resultante en viscosidad puede ser determinada por un
viscosímetro por vibración (p. ej. MIVI 3000 de Sofraser,
Francia).
La determinación de la actividad celulolítica,
medida en ECU, puede ser determinada según el método de análisis AF
301.1 que se puede conseguir del Solicitante bajo pedido.
El Ensayo de ECU cuantifica la cantidad de
actividad catalítica presente en la muestra midiendo la capacidad de
la muestra para reducir la viscosidad de una solución de
carboximetilcelulosa (CMC). El ensayo se realiza a 40ºC, pH 7.5
usando un estándar de enzima relativa para reducir la viscosidad del
sustrato de CMC.
La actividad celulasa sobre celotriosa, en
términos de k_{cat}\cdot s^{-1}, fue determinado por un ensayo
acoplado:
- \quad
- Celotriosa \rightarrow Glucosa\ +\ Celobiosa\ (cat.:\ celulasa)
- \quad
- Glucosa\ +\ O_{2}\ +\ H_{2}O \rightarrow Gluconato\ +\ H_{2}O_{2}\ (cat.:\ Glucosaoxidasa)
- \quad
- H_{2}O_{2}\ +\ ABTS^{R} \rightarrow ABTS^{Ox}\ (cat.:\ Peroxidasa)
que es seguido espectrofotométricamente a 418 nm
(máxima absorbencia de ABTS^{Ox} a 418 nm).
Se usó el kit de ensayo
GOD-Perid (accesible de Boehringer Mannheim, art.
124 036). El tampón-solución enzimática en el kit de
ensayo fue disuelto en 500 ml de agua milli Q. El pH de la solución
fue ajustado a 8.5 (NaOH).
Se disolvió 80 mg de ABTS^{R} (disponible de
Boehringer Mannheim, art. 756 407) en 10 ml de
GOD-Perid correspondiente a una concentración total
de ABTS^{R} de 10 mg/ml.
Se preparó una solución sustrato de 5 mmol (2.52
mg/ml) de celotriosa (accesible de Merck art. 24741) en agua. Se
prepararon soluciones diluidas en agua correspondientes a 1000
\mumol, 500 \mumol, 376 \mumol, 250 \mumol, 100 \mumol y
60 \mumol.
La mezcla reactiva fue preparada mediante la
mezcla de 1 parte de solución patrón concentrada de sustrato con 1
parte de GOD-Perid.
Se preparó una solución de la enzima celulasa
para ser determinada en una concentración de 1.0 - 3.0 \mumol.
Se mezcló 50 \mul de solución enzimática y 450
\mul de mezcla reactiva.
Las mediciones fueron realizadas en un
Espectrofotómetro Diode-Array HP 8452A
termostatizado a 40ºC, cubeta de 1 cm, a una longitud de onda de 418
nm. La reacción fue seguida midiendo la oxidación a ABTS cada 20 seg
durante 600 seg en total.
La actividad celulasa sobre celotriosa, en
términos de k_{cat}\cdots^{-1}, fue calculada a partir de un
gráfico de Lineweaver-Burk (un gráfico de 1/V contra
1/[S]): la inclinación y la intersección fueron determinadas por
análisis de regresión lineal.
Se usaron las siguientes constantes para los
cálculos:
- Celulasa: \varepsilon = 66,310 M^{-1} \cdot cm^{-1}
- ABTS^{Ox}: \varepsilon = 0.0323 \mumol^{-1} \cdot cm^{-1}.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para EG I' de Fusarium oxysporum (Figura
4), la actividad catalítica sobre celotriosa a pH 8.5 y 40ºC fue
calculada a 5.5 K_{cat} pr. seg. K_{m} fue 0.5 mM.
Determinación de actividad de celulasa alcalina
en celulosa amorfa.
Preparación de sustrato: se centrifugó 20 gramos
de AVICEL® hinchada con ácido, solución madre concentrada (ver abajo
para una preparación que puede ser almacenada durante un mes)
durante 20 min. a 5000 rpm., el sobrenadante fue apartado, y el
sedimento fue resuspendido en 30 ml de tampón. Tras el centrifugado
durante 20 min. a 5000 rpm, el sobrenadante fue retirado, y el
sedimento fue resuspendido en tampón hasta un total de 30 g. Esto
corresponde a una concentración de sustrato de 10 g
AVICEL/Litro.
Tampón: 0.1M Barbital a pH 8.5 o 0.1M Glicina a
pH 10.0.
Las enzimas fueron diluidas hasta una actividad
de 0.5 S-CEVU/ml a pH 8.5 o 0.75
S-CEVU/ml a pH 10.0.
NaOH al 2%, reactivo PHBAH: Se disolvió 1.5 g de
hidracidad de ácido benzoico de p-hidroxi y 5.0 g de
tartrato sódico en 100 ml de NaOH al 2%.
El sustrato, el tampón y la solución enzimática
fueron mezclados como sigue:
La solución substrato/tampón fue precalentada
durante 5 min a 40ºC. Luego se añadió la solución enzimática y la
solución fue mezclada haciéndola girar durante 5 seg., seguida de
incubación durante 20 min. a 40ºC. La reacción fue detenida
añadiendo 500 \mul de solución NaOH al 2%, mezclándola después
haciéndola girar durante 5 seg. Las muestras fueron centrifugadas
durante 20 min. a 5000 rpm.
Se transfirió 1000 \mul de sobrenadante de los
tubos de ensayo a tubos de ensayo nuevos, y se añadió 500 \mul de
reactivo PHBAH, seguido de ebullición durante 10 min.
Los tubos de ensayo fueron enfriados en agua
helada.
La absorbencia de las muestras fueron medidas en
un espectrofotómetro a 410 nm.
Una solución madre concentrada conteniendo 300
mg/l fue diluida a 5, 10, 15 y 25 mg/l.
1000 \mul de los estándares diluidos fueron
mezclados con 500 \mul de reactivo PHBAH, y fueron tratados como
las otras muestras, véase arriba.
La liberación de glucosa de reducción
equivalente fue calculada usando la curva estándar.
La concentración enzimática fue calculada usando
la absorbencia molar de 66310 (\varepsilon) para la endoglucanasa
EG I. El K_{m}, V_{ma}x y Kcat fue calculado a partir de un
gráfico de Lineweaver-Burk usando concentraciones de
sustrato diferentes.
La absorbencia molar de las variantes de
celulasa teniendo tirosinas sustituidas y triptofanos fue ajustada
en consecuencia usando un valor de absorbencia para triptófano de
5690 (\varepsilon) y para tirosina de 1280 (\varepsilon) y
cisteína 120 (\varepsilon).
\newpage
\global\parskip0.970000\baselineskip
Los coeficientes de extinción (\varepsilon)
están descritos en Gill, S.C. and Hippel, P.H.: Calculation of
protein extinction coefficients from amino acid sequence data;
Analytical Biochemistry vol 182, (319-326),
(1989).
Cada una de las celulasas evaluadas fue
purificada hasta obtener alta homogeneidad dando una única banda en
Análisis de SDS-PAGE (la proporción
A_{280}/A_{260} fue controlada como aquella superior a 1.5).
5 g Avicel®. (Art. 2331 Merck)
150 ml Ácido orto-fosfórico al
85%. (Art. 573 Merck)
400 ml Acetona. (Art. 14 Merck)
1.3 l Agua desionizada (Milli Q)
Vaso de precipitados de cristal de 1 l
Embudo de cristal con filtro de 1 l
Matraz de succión de 2 l
Homogeneizador Ultra Turrax.
Se enfrió sobre hielo la acetona y el ácido
fosfórico.
Los 5 g. de Avicel®, fueron humedecidos con
agua, luego se añadió 150 ml de ácido orto-fosfórico
enfriado con hielo al 85%, y la mezcla fue colocada sobre un baño de
hielo con agitación débil durante 1 h. Se añadió 100 ml de acetona
enfriada con hielo con agitación, seguido de transferencia de la
mezcla a un embudo de cristal con filtro, seguido de lavado con 3 x
100 ml de acetona enfriada con hielo y succión en seco después de
cada lavado.
La torta de la filtración fue lavada con 2 x 500
ml agua y aspirada hasta quedar lo más seca posible después de cada
lavado.
La torta de la filtración fue resuspendida hasta
un volumen total de 300 ml y mezclada hasta la homogeneidad (usando
el Homogeneizador Ultra Turrax).
El producto resultante fue almacenado en un
refrigerador.
Se obtuvo el resultado siguiente
EG I* de Humicola insolens (Figura
3):
- k_{cat} a 8.5: 16 por seg
- k_{cat} a 10: 12 por seg.
El coeficiente de extinción fue 66310.
EGI-Fus de Fusarium
oxysporum (Figura 4):
- k_{cat} a 8.5, 40ºC: 16 por seg (km 8 g/l)
- k_{cat} a 10, 40ºC: 4 por seg (km 8 g/l).
El coeficiente de extinción molar fue 58180,
calculado en base a la composición de aminoácido.
Ejemplo
1
El ejemplo ilustra los efectos de la eliminación
de suciedad superior de EG I* (EG I truncada, 402 aminoácidos, ver
Figura 3) contra EG I (415 aminoácidos, WO 91/17244 Fig.
14A-E). En el ejemplo EMPA se han usado 101 pañuelos
como trazadores de la eliminación de suciedad (negro carbón/aceite
de oliva).
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se usó la siguiente composición detergente:
La prueba se basó en una prueba de lavado de 2
ciclos en un Tergometer usando la composición detergente
anteriormente descrita en una solución al 0.3% con 1 mM Ca++.
El resultado de eliminación de suciedad es dado
como remisión R Delta (tratado con enzimas contra ciego) medido a
420 nm con un aparato Elrepho (DataColor).
- Enzima
- R (8.D.) Delta R
- Sin enzimas
- 41.99 (0.41) 0
- EG I, 4 ECU/I
- 42.00 (0.28) 0.01
- EG I, 8 ECU/I
- 41.24 (0.45)-0.75
- EG I, 12 ECU/I
- 42.69 (0.32) 0.71
- EG I, 20 ECU/I
- 43.05 (0.32) 1.06
- EG I*, 4 ECU/I
- 41.61 (0.37)-0.38
- EG I*, 8 ECU/I
- 43.41 (0.39) 1.42
- EG I*, 12 ECU/I
- 44.29 (0.35) 2.30
- EG I*, 20 ECU/I
- 44.34 (0.47) 2.35.
Ejemplo
2
Se supone que el efecto de eliminación de
partículas de suciedad de las endoglucanasas se debe en parte a la
separación de enlaces glicosídicos en la matriz de celulosa, pero
hasta cierto punto la enzima puede también proporcionar un mayor
efecto de limpieza no específico, por ejemplo, mejorando la
dispersabilidad de las partículas de suciedad. En esta prueba se
muestra que la EG I* (EG I truncada, 402 aminoácidos, ver Figura 3)
difiere de EG I (415 aminoácidos, WO 91/17244 Fig.
14A-E) respecto a su capacidad para dispersar carbón
activo.
Cantidades diferentes de EG I y EG I*
purificadas fueron añadidas en 10 ml de un 1 g/l suspensión de
carbono activo (Norit) en 10 mM de Tampón de fosfato, pH 10.
Las mezclas fueron incubadas durante 30 minutos
a 55ºC y 150 rpm.
Tras la incubación las muestras fueron dejadas
enfriar a temperatura ambiente y se dejó que el carbono no
dispersado se asentara (sin centrifugación) durante 15 minutos. Se
valoró la cantidad de carbono que fue dispersado midiendo la
OD_{582\ nm} del sobrenadante (a 582 nm se encontró un valor
máximo muy probablemente como resultado de la dispersión). Debido a
la naturaleza del experimento (soluciones no homogéneas, dependencia
del tiempo etc), los niveles absolutos de OD_{582\ nm} pueden
variar entre las pruebas realizadas, mientras que pueden mantenerse
normalmente los niveles relativos.
La tabla abajo muestra los resultados obtenidos
en la prueba:
Los resultados muestran que EG I* difiere
significativamente de EG I en cuanto a su capacidad de dispersión de
carbón - a 5 mg/l nivel de \DeltaOD (582\ nm) obtenido con EG I*
es cuatro veces superior al obtenido con EG I. También debe
observarse que el efecto de EG I* es realmente muy amplio - el nivel
aparente de detergencia es aumentado en aproximadamente 70% ante 10
mg/l de EG I*.
Ejemplo
3
Las celulasas usadas para la eliminación de
suciedad en detergentes suelen producir un mayor desgaste del
tejido. Esto puede observarse por la menor fuerza de tracción del
tejido.
En el presente ejemplo se comparan tres
celulasas: Celluzyme® (una preparación con celulasa comercial
conocida), EG I* de H. insolens (Figura 3) y EG
I-Fus de Fusarium (Figura 4) (ambas celulasas
de la presente invención).
Celluzyme® es un producto multicomplejo de
celulasa de Humicola insolens usado en detergentes para la
eliminación de suciedad y clarificación del color.
Experimento:
Se obtuvieron los siguientes resultados:
De los resultados se puede concluir que EG I* de
H. insolens y EGI Fus de Fusarium oxysporum son
eficaces para la eliminación de la suciedad sin que su uso suponga
una pérdida significante de la fuerza de tracción en el tejido.
Claims (15)
1. Endoglucanasa que es derivable de una cepa de
Humicola insolens, donde dicha endoglucanas comprende 402
residuos de aminoácidos como se relaciona en la Figura 3 y
opcionalmente un enlace C-terminal que consiste en
10 aminoácidos como mucho, o una variante de dicha endoglucanasa
teniendo una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95%
idéntica a dicha secuencia relacionada en la Figura 3 y donde dicha
variante tiene uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos
sustituidos: N89Q; N89Q+N247Q; H123N; T385N; Q399N; E202A;
S37W+P39W; M142E; K217A; K218T; K217A+K218T, R245G; I310D; E150Q;
E334K; M198L.
2. Endoglucanasa según la reivindicación 1,
donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos dentro de
5 \ring{A} de la celobiosa enlazada son sustituidos; R106x; Y145x,
S345x, D34x, W51x, S104x, A143x, Y171x, D173x, Q175x, Y177x, W347x,
donde x es elegido para modificar la interacción hidrofóbica y/o
potencial del enlace de H con el sustrato, y la numeración se
refiere a la numeración de la endoglucanasa EG1 de Fusarium
oxysporum.
3. Composición detergente que comprende una
endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 y un tensioactivo.
4. Composición detergente según la
reivindicación 3, donde la endoglucanasa se deriva de una cepa de
Humicola insolens y que tiene la secuencia de aminoácidos
relacionada en la Figura 3 y un peso molecular aparente de
aproximadamente 50 kD medido en SDS-PAGE.
5. Composición detergente según la
reivindicación 3 ó 4, que además comprende una o más de otras
enzimas, en particular amilasas, lipasas, proteasas, componentes de
celulasa, peroxidasas, y/u oxidasas.
6. Proceso de lavado donde el tejido sucio es
tratado con una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2.
7. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 en composiciones detergentes o en composiciones
de suavizante en una cantidad que es eficaz para la eliminación de
suciedad.
8. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para la clarificación del color de tejidos
textiles (eliminación de pelusas y bolitas).
9. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para evitar la redeposición en el lavado de
tejido.
10. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para la eliminación de la suciedad en
tejidos.
11. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para el biopulido de tejidos.
12. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para el desentintado de papel usado.
13. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para mejorar el drenaje de la pasta de
papel.
14. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para el desfibrado de pasta de papel.
15. Uso de una endoglucanasa según la
reivindicación 1 ó 2 para el descortezado para pasta de papel.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK270/94 | 1994-03-08 | ||
| DK27094 | 1994-03-08 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2360529T3 true ES2360529T3 (es) | 2011-06-06 |
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ID=44050758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05109384T Expired - Lifetime ES2360529T3 (es) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | Nuevas celulasas alcalinas. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2360529T3 (es) |
-
1995
- 1995-03-08 ES ES05109384T patent/ES2360529T3/es not_active Expired - Lifetime
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