HUT77195A

HUT77195A - Bolyhosodásra kevésbé hajlamos cellulóz textília előállítására szolgáló eljárás

Info

Publication number: HUT77195A
Application number: HU9701712A
Authority: HU
Inventors: Henrik Lund; Hanne Host Pedersen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1994-12-05
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 1998-03-02
Also published as: CN1168705A; WO1996017994A1; BR9509949A; JPH10509776A; DE69536052D1; MX9703931A; AU3979195A; TR199501537A2; MA23738A1; ATE460532T1; TW316930B; US5916798A; PL320746A1; EP0796365A1; CN1092265C; EP0796365B1

Description

mutatójú, cellulóz textília előállítására szolgáló eljárás, amelynek során a cellulóz szál tartalmú textíliát a szálfelület részleges hidrolízisének végrehajtására képes cellulóz enzimmel kezeljük a kezeletlen cellulóz textíliára számítva 2 w/w %-nál kevesebb tömegveszteség mellett.

A találmány szerinti eljárás céljára használható cellulóz enzimfajták előnyösen a Humicola insolens, DSM 1800, SEQ ID NO.Iáltal előállítható vagy abból származtatott olyan 43 kD-os endoglukanáz variánsok, melyek a 8, 55, 58, 62, 67, 132, 147, 162, 221, 222, 223, 280 helyek közül egy vagy több helyen egy vagy több aminosav gyök helyettesítésével módosítottak; továbbá a 213-as helyzettől kezdve bárhol tetszőlegesen végzett rövidítéssel, előnyösen genetikai rövidítéssel, módosítottak.

63.946/SZE • ·

•...... · · • · · • · · · · _Λ

S.B.G. Hí R, gSh,

Nemzetközi Szabadalmi Iroda

H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323

Bolyhosodásra kevésbé hajlamos cellulóz textília előállítására szolgáló eljárás

Novo Nordisk A/S, BAGSVAERD, DK

F< ;alálók: LUND Henrik, BAGf \ERD, DK

PEDERSEN Hanne Hőst, BZ /AERD, DK

A bejelentés napja: 1995. 12. 05.

Elsőbbsége: 1994. 12. 05. (1387/94) DK

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/DK95/00488

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/17994

A jelen találmány tárgya bolyhosodásra jelentősen csökkentett mértékben hajlamos cellulóz textília előállítására szolgáló eljárás. Még közelebbről a találmány olyan eljárásra vonatkozik, amelynek során a cellulóz textil kelmén lényeges tömegveszteség nélkül cellulóz enzimmel történő enzimatikus kezelést hajtunk végre.

Kikészítő anyagok alkalmazása nélkül a legtöbb pamut kelme és pamut keverék textília eléggé kemény és merev, rugalmatlan tapintású. A textília felülete sem sima, mert kis pihés mikro méretű rost szálacskák állnak ki belőle. Emellett viszonylag rövid ideig tartó viselést követően bolyhok jelennek meg a textília felületén ezáltal a ruhaneműnek kevésbé tetszetős, viseltes külsőt kölcsönözve.

Lágy és sima tapintású textília előállítására szolgáló ismert eljárás, amikor a cellulóz alapú textíliákon a gyártás, illetve feldolgozás során cellulolitikus enzimes kezelést hajtanak végre. Ez a kezelési eljárás Biosimítás-ként ismert (a leírás további részében azt mi is biosimításnak nevezzük), melyre vonatkozóan lásd az 1991. október 25-én a 58eme Congres de l'Association des Chimistes de /'Industrie Textilé” (Mulhouse, Franciaország) konferencián elhangzott Bazin J. and Sasserod,

S.: Enzymatic Bio-polishing of Cellulosic Fabric című előadásanyagot, amely a jelen találmányhoz tartozó technika állásának részét képezi.

A biosimítás a szálfelület kezelésére szolgáló speciális kezelési mód, amely a tapintás és a külső megjelenés tekintetében anélkül javítja a textília minőségét, hogy a textília veszítene nedvesíthetőségi tulajdonságából. A biosimítás termékre gyakorolt legfontosabb hatását kevesebb számú pihe- és bolyhképződéssel, fokozott fényességgel és lüszterrel (csillogás, ragyogás), javított textília tapintási tulajdonsággal, hosszabb ideig tartó puhasággal, lágysággal, valamint javított víz-abszorbciós képességgel lehet jellemezni.

A biosimításra általában a kötött és szövött textíliák gyártási, illetve feldolgozási folyamata nedves eljárási szakaszában kerül sor. A nedves eljárás olyan lépésekből áll, mint például az írtelenítés, mosás, fehérítés, tisztítás, színezés/nyomtatás és kikészítés. Ezen lépések mindegyike közben a textíliát mechanikai hatásoknak is ki lehet tenni.

Mindezek ellenére, mivel a cellulolitikus enzimek a cellulóz szálak felületének hidrolízisét katalizálják, az enzimes kezelés végső soron a szálak vagy textíliák súlyveszteségét eredményezik. Még ha a biosimítási eljárást oly módon hajtjuk is végre, hogy egy jól ellenőrzött, a szálak felületét érintő részleges hidrolízist kapjunk, mindezidáig a megfelelő simító hatást a textília erősségének nagy mértékű csökkenése nélkül csak a textília legalább 3-5 w/w % -os tömegvesztesége mellett tudtuk elérni. Az ilyen mértékű tömegveszteség nem kívánatos a textilipar számára és gazdaságossági szempontból a biosimítási eljárást kevésbé kívánatossá teszi.

Ennek megfelelően a jelen találmány célkitűzése, hogy lényeges tömegveszteséget nem okozó eljárást nyújtson a bolyhosodásra jelentősen csökkentett mértékben hajlamos cellulóz textil kelme előállítására.

Meglepő módon azt találtuk, hogy bolyhosodásra jelentősen csökkentett mértékben hajlamos cellulóz textil kelmét elő lehet állítani lényeges tömegveszteség nélkül is, ha a textílián egy - előnyösen monokomponensű -celluláz enzim felhasználásával végzett biosimítási eljárást hajtunk végre.

Ennek alapján a jelen találmány szerinti eljárás során a cellulóz szál tartalmú textíliát a szálfelület részleges hidrolízisének végrehajtására képes celluláz enzimmel kezeljük a kezeletlen cellulóz textíliára számítva 2 w/w %-nál kevesebb tömegveszteség mellett, illetve a celluláz enzimmel kezelt textília tömegvesztesége és a celluláz enzim nélkül kezelt textília tömegvesztesége (kezeletlen kontroll) különbségéből számítva és százalékban kifejezve kevesebb, mint körülbelül 2 tömeg % tömegveszteség mellett.

A textília

A jelen találmány szerinti megoldás ismertetésével összefüggésben a cellulóz textília és a cellulóz szál tartalmú textília elnevezések olyan típusú kelmék megjelölésére szolgálnak, főként kötött és szövött anyagok esetében, amelyeket cellulózt tartalmazó, cellulózból álló vagy cellulóz származékokat tartalmazó anyagból, például papírgyártási zúzalékból, cellulóz- vagy rostpépből, valamint gyapotból állítot4 ··· · · tünk elő. Szintén a jelen megoldással összefüggésben használt kelme fogalom körébe különböző ruhaanyagféleségeket és egyéb feldolgozott textíliákat kívánunk beleérteni. A cellulóz textíliák közé tartozik például a pamut; a viszkóz (műselyem); a lyocell, a lenvászon, a viszkóz, a pamut és a lyocell egyéb olyan szálakkal, mint például a poliészter, alkotott összes keveréke; a viszkóz/pamut keverékek, a lyocell/pamut keverékek, a viszkóz/gyapjú keverékek, a lyocell/gyapjú keverékek, a pamut/gyapjú keverékek; a lenvászon, a rami és egyéb cellulóz szálakon alapuló textíliák, beleértve a cellulóz szálak összes egyéb olyan szálakkal, mint a gyapjú, a poliamid, az akril és a poliészter, képezett elegyét, így például viszkóz/pamut/poliészter keverékek, gyapjú/pamut/poliészter keverékek, lenvászon/pamut keverékek stb.

A jelen találmány szerinti megoldás ismertetése során használt bolyhosodásra jelentősen csökkentett mértékű hajlam kifejezéssel azt kívánjuk jelezni, hogy a kezelt (biosimításnak kitett) textília felületén a bolyhképződéssel szemben egy állandó (és kiváló) ellenállóképesség alakul ki összehasonlítva azzal a kelmével, amelyen nem végezték el a jelen találmány szerinti eljárást. A bolyhosodási hajlamot az SN 198 525 számú svájci szabvány szerint vizsgálhatjuk, melyet 1990ben a Svájci Szabványügyi Egyesület (cím: Kirchenweg 4, Postfach CH-8032 Zürich, Svájc) tett közzé. A dokumentum leírja a textíliák bolyhosodással szembeni ellenállóság vizsgálati módszerét, amely viszont az SNV 95 150 számú svájci szabványon (Textilek - standard klimatizált körülmények és teszt körülmények a standard klimatikus körülmények között végzett fizikai mérésekhez), valamint az SN 198 529 számú svájci szabványon (Textilek vizsgálata - Scheuerfestigkeit - Martindale módszer) alapul. A mérési eredményeket bolyhosodási mutatók-ban fejezzük ki, amelyek az 1-es bolyhosodási mutatószámtól (erőteljes bolyhképződés) egy skála mentén égé• · · · ·

szén az 5-ös bolyhosodási mutatószámig (nincs vagy igen csekély bolyhképződés) változnak, megengedve az 1/2-edre végződő bolyhosodási mutatószámokat is.

A jelen találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint előállított textília SN 198 525 (1990) szabvány szerint mért bolyhosodási mutatója legalább 4-es, még előnyösebben legalább 4.5-es, speciálisan pedig 5-ös.

A jelen találmány szerinti megoldás egy másik előnyös megvalósítási módja szerint előállított textília mért bolyhosodási mutatója legalább 1-es, előnyösen legalább 2-es, még előnyösebben legalább 3-as, magasabb érték, mint a megfelelő kezeletlen kontroll textília esetében; az abszolút bolyhosodási mutatókat az SN 198 525 (1990) szabvány szerint mértük meg.

A jelen találmány szerinti eljárás értelmében a szálfelület részleges hidrolízise során a tömegveszteség kevesebb, mint körülbelül 2 w/w %, előnyösen a tömegveszteség kevesebb, mint körülbelül 1.8 w/w %, még előnyösebben pedig a tömegveszteség kevesebb, mint körülbelül 1.5 w/w %.

A tömegveszteséget ellenőrzött körülmények között határozzuk meg, azaz a fentiekben már hivatkozott SNV 95 150 számú svájci szabvány előírásainak megfelelően. A tömegveszteséget a celluláz enzimmel kezeit textília tömegvesztesége és a celluláz enzim nélkül kezelt textília tömegvesztesége (kezeletlen kontroll) különbségéből számítjuk ki és százalékban fejezzük ki.

Az eljárás

Ahogyan azt a fentiekben már említettük a textília celluláz enzimmel történő kezelését végrehajthatjuk egyéb textil feldolgozási eljárásokkal egyidejűleg, például az írtelenítéssel együtt, illetve a textília fehérítése után.

···: .··. —

·.:·^: ··. ♦ ·· ·· ··

Magától értetődően a találmány szerinti eljárás kivitelezhető bármely hagyományos nedves textil feldolgozási lépés során, előnyösen az írtelenítést vagy fehérítést követően vagy valamely hagyományos (a technika állásából jól ismert) lépéssel egyidejűleg vagy egy azt követő további eljárási lépésben. Az eljárást jellegzetes módon olyan nagy sebességgel keringő rendszerekben végezzük el, mint a fúvókástúlfolyó színező berendezések, nagy sebességű motollák (csörlők) és festőkádak. A célnak megfelelő nagy sebességű rendszerekre példaként említhetjük az olasz Biancalani cég által gyártott és forgalmazott Aero 1000-es berendezést. Alternatív módon az eljárás végrehajtható egy két lépéses biosimítási eljárás részeként, például ahogyan az a WO 93/20278 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetésre kerül, ahol az első lépés egy külön celluláz enzimes kezelés, amelyet lényegében mechanikai behatás nélkül hajtunk végre, és ezt követi egy második lépés, ahol a textíliát mechanikai kezelésnek vetjük alá. A celluláz enzimes kezelést végrehajthatjuk a kiegyenlítőben (fehérítésnél), fulárd-hengerben vagy fulárdfürdőben (textilipari festő- vagy impregnáló berendezések).

A jelen találmány szerinti celluláz enzimes kezelés és az írtelentítés egymással összeegyeztethető eljárások és azok ugyanolyan körülmények között folytathatók le, azaz egyazon pH, hőmérséklet, adagolás/idő arány stb. paraméterek mellett. Ezeket az eljárásokat egyidejűleg végezve a teljes textil feldolgozási eljárás lerövidül. Az így elérhető idő megtakarítások a találmány szerinti eljárás egyik fő előnyét jelentik.

A felhasznált enzim mennyisége (dózisa) nagymértékben függ az enzim reakcióidejétől, azaz a viszonylag rövid enzimatikus reakcióidő viszonylag megnövelt enzim dózist tesz szükségessé és fordítva. Általánosságban, az alkalmazásra kerülő enzim mennyisége az elérhető reakcióidőnek megfelelően állapítható meg, illetve írható elő. Ily módon a textíliák jelen találmány szerinti celluláz enzimes kezelése

összhangba hozható például az írtelenítés körülményeivel, ha példának okáért ezt a két reakciólépést egyidejűleg hajtjuk végre.

Az alkalmazásra kerülő enzim dózis/idő arány hasonló ahhoz, amely a hagyományos biosimítási eljárásban alkalmazható. A találmány szerinti megoldásban felhasznált enzim dózis körülbelül 100 és körülbelül 100 000 ECU/kg textília közötti, még előnyösebben körülbelül 500 és körülbelül 20 000 ECU/kg textília közötti, különösen előnyösen pedig körülbelül 1000 és körülbelül 5 000 ECU/kg textília közötti.

Jellegzetes módon a találmány szerinti eljárás esetében a reakcióidő körülbelül 10 perc és körülbelül 4 óra közötti, előnyösen körülbelül 20 perc és körülbelül 2 óra közötti, de az alkalmazott reakcióberendezés speciális típusától függően a reakció végrehajtható körülbelül 1 perc és körülbelül 24 óra között bármilyen hosszú időintervallumon keresztül.

A találmány szerinti eljárás kivitelezhető bizonyos, a celluláz enzimhez adható egyéb adalékanyagok jelenlétében, azaz kiszerelt, illetve formázott celluláz enzim készítmények felhasználásával vagy attól a mosófolyadéktól elkülönítve, ahol az enzimes kezelésre sor került. Ezek közé az adalékanyagok közé tartoznak például a stabilizálószerek, a nedvesítőszerek, a pufferek és a diszpergálószerek. A stabilizálószer a cellulolitikus enzim stabilizálására szolgáló szer lehet.

A nedvesítőszer a szál nedvesíthetőségének javítására szolgál és ezáltal gyors és egyenletes írtelenítésre kerülhet sor. Az alkalmazott nedvesítőszer típusát tekintve előnyösen oxidatív körülmények között stabil kell, hogy legyen.

A találmány szerinti eljárás céljára a pufferek közül megfelelőek lehetnek a foszfát, a borát, a citrát, az acetát, az adipát, a trietanol-amin, a monoetanol-amin, a dietanol-amin, a karbonát (különösen alkálifém- vagy alkáliföldfém-karbonát, főként nátrium vagy kálium-karbonát vagy ammónium- és sósav sók), a diamin, különösen a diamino-etán, az imidazol vagy az aminosav pufferek. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható előnyös puffer a mono-, di- vagy trietanol-amin puffer.

A találmány szerinti megoldásban felhasználható diszpergálószerek lehetnek nem ionos, anionos, kationos, amfolitikus vagy amfoterionos felületaktív anyagok. Még közelebbről az alkalmazásra kerülő diszpergálószer kiválasztható a következők közül: karboximetilcellulóz, hidroxipropilcellulóz, alkil-aril-szulfonátok, hosszú szénláncú alkohol-szulfátok (primer és szekunder alkil-szulfátok), szulfonált olefinek, szulfátéit monogliceridek, szulfátéit éterek, szulfo-szukcinátok, szulfonált metiléterek, alkán-szulfonátok, foszfát-észterek, alkil-izotionátok, acil-szarkozidok, alkiltauridok, fluor-tartalmú felületaktív anyagok, zsíralkohol- és alkil-fenolkondenzátumok, zsírsav kondenzátumok, aminok etilén-oxidos kondenzációs termékei, amidok etilén-oxidos kondenzációs termékei, blokk polimerek (polietilén-glikol, polipropilén-glikol, etilén- vagy propilén-oxiddal kondenzáltatott etilén-diamin), szukróz észterek, szorbitán észterek, alkil-amidok, zsír-amin-oxidok, etoxilezett monoaminok, etoxilezett diaminok, etoxilezett poliaminok, etoxilezett amin polimerek és azok elegyei.

Előnyösen a felhasználásra kerülő diszpergálószer egy etoxilezett zsírsav észter vagy nonil-fenil-polietilénglikol éter.

Továbbá a találmány szerinti eljárást végrehajthatjuk valamely hagyományos, az ismételt leülepedést gátló szer jelenlétében, például olyan polimer szerek, mint a polivinil-piirolidon (PVP), karboximetil-cellulóz (CMC) és poliakrilátok hozzáadásával.

Az enzim

A jelen találmány szerinti megoldással összefüggésben használt celluláz enzim vagy cellulolitikus enzim elnevezés olyan enzimre vonatkozik, amely a glukóz, a cellobióz, a trióz és egyéb cellulóz oligoszacharidok degradációját katalizálja.

A jelen szövegösszefüggésben az enzim vagy celluláz enzim fogalmak alatt értjük az alap fehérjét vagy annak egy perkurzor formáját éppúgy, mint annak egy funkcionális fragmentumát, amely utóbbi lényegében a teljes hosszúságú enzim aktivitásával rendelkezik. Ezen túlmenően az enzim kifejezésbe beleértjük az aktuális enzimfajta homológjait vagy analógjait is. Ezek a homológok olyan aminosav szekvenciával rendelkeznek, amely legalább 60 %-os mértékű azonosságot mutat az eredeti (előd) enzim, azaz az eredeti (előd) celluláz aminosav szekvenciájával. Az azonosság foka a technika állásából ismert hagyományos eljárásokkal határozható meg, lásd például erre vonatkozóan Altshul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603 - 616, 1986, valamint Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 - 10919, 1992. irodalmi helyeket. Tömören összefoglalva, a két aminosav szekvenciát oly módon illeszthetjük és hasonlíthatjuk össze, hogy 10 aminosavból álló szakaszonként (gap) vetjük össze azokat, blosum 62-t használunk fel vagy a fentiekben hivatkozott Henikoff és Henikoff mátrixot alkalmazzuk és így optimalizáljuk az illesztés jóságát.

Alternatív módon az enzim homológja vagy analógja egy arra alkalmas nukleotid szekvencia vagy aminosav szekvencia alapján készített oligonukleotid mintával kódolható nukleotid szekvencia hibridizáció révén a következő körülmények között: 5 x SSC-vel előzőleg átnedvesítjük és 1 órán keresztül körülbelül 40 °C-os hőmérsékleten 20 tömeg %-os formamid oldatból, 5 x Denhardt-féle oldatból, 50 mmol nátrium-foszfátból (pH=6.8), valamint 50 mg denaturált szonikált borjú csecsemőmirigy DNS-ből álló elegyben előhibridizáljuk, és ezt követően kiegészítve 100 mmol ATP-vel ugyanabban az oldatban körülbelül 40 °C-os hőmérsékleten 18 órán keresztül hibridizáljuk, majd körülbelül 45 °C-os hőmérsékleten 0.4xSSC-vel történő mosás következik.

··

Azok a molekulák, amelyekkel ezek között a körülmények között az oligonukleotid minták hibridizálódnak, standard kimutatási eljárásokkal kerülnek azonosításra (pl.: Southern regiszter).

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott enzim homológjaiban egy vagy több aminosav egy másikkal helyettesített lehet, egy vagy több aminosav hiányozhat, illetve azokban több aminosav is lehet. Ezek az eltérések előnyösen csak minimális számban előforduló, a régi struktúrát fenntartó aminosav helyettesítések lehetnek, amelyek lényegesen nem befolyásolják a fehérje térszerkezetét vagy aktivitását, kisebb hiányok, jellegzetes módon körülbelül 30 aminosav közül egy, fordulhatnak elő; kisebb olyan amino- vagy karboxil végződés toldalékok/meghosszabbítások jöhetnek szóba, mint például az amino-végződéshez kapcsolt methionin gyök, egy legfeljebb körülbelül 20 - 25 gyökből álló kisebb polipeptid linker vagy olyan tisztítást lehetővé tevő toldalékok, mint a poli-hisztidin szakasz, valamely antigén epitope vagy egy kötőhely. Lásd az erre vonatkozó általános megközelítést a Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, irodalmi helyen. A régi struktúrát fenntartó helyettesítésekre példákat az alap aminosavak (így az arginin, a lizin, a hisztidin); a savas aminosavak (így a glutaminsav és az aszparaginsav); a poláros aminosavak (így a glutamin és az aszparagin); a hidrofób aminosavak (így a leucin, az izo-ieucin, a valin), az aromás aminosavak (így a glicin, az alanin, a szerin, a threonin, a methionin) csoportján belül említhetünk.

A technika állásában jártas szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az ilyen jellegű helyettesítések elvégezhetők a molekula funkció szempontjából kritikus régiókon kívül és azok még így is aktív enzimet eredményeznek. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott enzim aktivitása szempontjából elengedhetetlen és ezért előnyösen nem helyettesített aminosavak a technika állásából ismert olyan eljárásokkal azonosíthatók, mint a kötőhelyre irányuló mutagenesis vagy az alanin11 ;···· ·»»· · ·· ·· .. . .· ··<

scanning (letapogató) mutagenesis. (Lásd erre vonatkozóan Cunningham and Wells, Science 244: 1081 - 1085, 1989 publikációt.) Ez utóbbi módszer esetében azoknak az aminosav gyököknek az azonosítása céljából, amelyek a molekula aktivitása szempontjából kritikusak, a molekula minden ilyen gyökénél mutációkat vezetnek be és megvizsgálják az eljárás eredményeként kapott mutáns molekulák cellulolitikus aktivitását. Olyan műszeres technikákkal, mint az NMR (mágneses magrezonancia), krisztallográfia (kristálytani elemzés) vagy fényaffinitásos megjelölés (Photoaffinity labelling) a kristályszerkezet elemzésével a ligandum kötőhelyek és a receptorok kölcsönhatását is meghatározhatjuk. Lásd erre vonatkozóan például a következő irodalmi helyeket: de Vos et al., Science 255: 306 - 312, 1992; Smith et al., J. Mól. Bioi. 224: 899 - 904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64. 1992.

A homológ lehet egy allelomorph génes változat, azaz a génnek egy mutáción keresztül fellépett alternatív formájával kódolt enzim, illetve egy a mutáns gén által kódolt, módosított, de lényegében a jelen találmány szerinti eljárásban felhasznált enzimmel azonos aktivitással rendelkező enzim. Ennélfogva a mutáció lehet rejtett (azaz nem okoz változást a kódolt enzimben) vagy a kódolt enzimek módosított aminosav szekvenciával is rendelkezhetnek.

A jelen találmány szerinti enzim is lehet 'nem' vagy 'faj' homológ, azaz egy más fajból származtatott, hasonló aktivitással rendelkező enzim.

Az enzim homológját a kérdéses faj sejtje genom vagy cDNS klóntárának elkészítésével választhatjuk el, majd standard technikák végrehajtásával a szintetikus oligonukleotid mintákat használva fel magát a homológ enzimet teljes egészében vagy azt csak részben kódoló DNS szekvenciákat szűrjük ki, ahogyan azt Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 szakirodalom ismertetik, illetve specifikus polimereket felhasználva a polimeráz lánc reakció (PCR=polimerase chain *·· ·*«· * · • · »<

reaction) eszközével választjuk el, ahogyan azt a fentiekben hivatkozott Sambrook et al. publikációban azt leírják.

Előnyösen a találmány szerinti eljárásban alkalmazott cellulolitikus enzim egy monokomponens (rekombináns) celluláz, azaz egyéb proteinektől vagy cellulóz proteinektől lényegében mentes celluláz. A rekombináns cellulóz komponensek szakember által ismert, hagyományos standard technikák alkalmazásával klónozhatok és expresszáltathatók.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint az eljárásban felhasznált celluláz enzim egy endoglukanáz (EC 3.2.1.4), előnyösen egy monokomponens (rekombináns) endoglukanáz.

Előnyösen az alkalmazott celluláz valamely mikrobiális eredetű celluláz, még előnyösebben baktérium vagy gomba celluláz. A bakteriális eredetű celluláz enzimek közül példaként a Pseudomonas-bó\ vagy Bacillus lautus-bó\ álló nemzetség csoportba tartozó baktériumok által előállítható vagy azokból származtatott celluláz enzimeket említhetjük.

A celluláz vagy endoglukanáz lehet savas, semleges vagy alkálikus/lúgos celluláz vagy endoglukanáz, azaz maximális cellulolitikus aktivitást savban, semleges közegben vagy bázikus tartományban mutató.

Ennek megfelelően a találmány céljára alkalmas celluláz enzim egy olyan savas celluláz enzim, előnyösen egy gomba eredetű savas celluláz enzim, még előnyösebben egy savas körülmények között jelentős cellulolitikus aktivitással rendelkező gomba eredetű savas celluláz enzim, amely Trichoderma-bó\, Actinomyces-bő\, Myrothecium-bő\, Aspergillus-bó\ és Botrytis-bö\ álló nemzetség csoportba tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott előnyös savas celluláz enzim a Trichoderma viride-bő\, Trichoderma reese/'-ből, Trichoderma longibrachiatum-bó\, • ·

Myrothecium verrucaria-ból, Aspergillus niger-ből, Aspergillus oryzae-böl és Botrytis cinerea-ból álló fajok csoportjába tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.

A találmány tárgyát képező eljárás során alkalmazott egyéb celluláz vagy endoglukanáz enzimek semleges vagy lúgos cellulázok, előnyösen gomba eredetű semleges vagy lúgos cellulázok, még előnyösebben egy lúgos körülmények között jelentős cellulolitikus aktivitással rendelkező gomba eredetű lúgos celluláz vagy endoglukanáz enzimek, amelyek az Aspergillus-ból, Penicillium-ból, Myceliophthoraból, Humicola-ból, az Irpex-ből, a Fusarium-ból, a Stachybotrys-ból, Scopulariopsisből, Chaetomium-ból, Mycogone-bö\, Verticillium-ból és Myrothecium-ból, Papulospora-bó\, Gliocladium-ból, Cephalosporium-ból és Acremonium-ból álló nemzetség csoportba tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.

A találmány tárgyát képező eljárás során alkalmazott előnyös lúgos celluláz enzim a Humicola insolens-ből, a Fusarium oxysporum-bó\, a Myceliopthora thermophile álló fajok csoportjába tartozó gombák vagy Cephalosporium sp. gombák által előállítható vagy azokból származtatott, előnyösen a Humicola insolens-ből, DSM 1800, Fusarium oxysporum-ból, DSM 2672, Myceliopthora thermophile-bő\, CBS 117.65, álló faj csoportba tartozó gombák vagy a Cephalosporium sp., RYM202 gombák által előállítható vagy azokból származtatott.

Az eredeti természetes vagy előd celluláz enzimek közül előnyös például az olyan lúgos endoglukanáz, amely a Humicola insolens-bő\, DSM 1800, származtatott nagy tisztaságú '43 kD-os endoglukanázzal szemben termelt antitesttel immunológiailag reaktív, illetve amelyik a '43 kD-os endoglukanáz celluláz aktivitást mutató származéka. (kDa: SDS-PAGE-el meghatározott látszólagos molekulatömeg). Az egyik előnyös endoglukanáz komponens aminosav szekvenciáját a SEQ ID No. 1 szám alatt mutatjuk be, amely már SEQ ID#2 szám alatt a WO 91/17243 közzétételi ···· «.

számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben is bemutatásra került, amely bejelentés a jelen találmányhoz tartozó technika állásának részét képezi. Egy másik előnyös endoglukanáz komponens tulajdonképpen egy a SEQ ID No 1 szám alatt megadott aminosav szekvenciával azonos, de abból csak az 1 - 213 helyzetek közötti aminosav szekvenciával rendelkező, azaz a 213-as helyzetben megrövidített szekvenciájú, mag enzim. Megfontolás tárgyát képezheti, hogy egyéb alkalmas endoglukanázok közé tartoznak még azok az enzimek, amelyek a SEQ ID No 1 szám alatt megadott aminosav szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkeznek, de amelyek meg vannak rövidítve, előnyösen genetikailag meg vannak rövidítve a SEQ ID No 1 szám alatt megadott szekvencia 213-as helyzete és a 247-es helyzete közötti helyzetek bármelyikénél, azaz a 213 és 247 helyzetek közötti aminosav maradékokból álló aminosav szekvenciával rendelkeznek.

A találmány szerinti megoldás céljára alkalmas cellulázok - az eredeti cellulázhoz hasonlóan - gomba eredetű cellulóz variánsok, például a Humicola, a Trichoderma vagy a Fusarium gomba nemzetségek törzsének egyikéből származtatható cellulóz enzimek. Például az eredeti cellulóz a H. lens, a Trichoderma reesei vagy az F. oxysporum gomba fajok egyik törzséből származtatható lehet, előnyösen a Humicola insolens-bő\, DSM 1800, származtatott '43 kD-os endoglukanáz vagy az említett eredeti cellulóz enzimek funkcionális analógja, amely

i) az eredeti cellulóz enzim aminosav szekvenciájával legalább 60 %-ban homológ aminosav szekvenciát tartalmaz;

ii) az eredeti cellulóz enzimmel szemben termelt antitesttel reakcióba lép;

iii) olyan DNS szekvencia kódolja, amelyik ugyanazzal a mintával hibridizálódik, mint az eredeti cellulóz enzimet kódoló DNS szekvencia.

Az analóg i)-edik tulajdonságával az eredeti cellulóz enzim és az analóg enzim közötti azonosság fokát szándékozunk bemutatni jelezve az első szekvencia máso15 • · · · « · · · · óikból történő származtatását. Különösen, egy polipeptidet az eredeti celluláz enzimmel akkor tekintünk homológnak, ha azok saját aminosav szekvenciáját a másikéval összehasonlítva az derül ki, hogy közöttük körülbelül 60 %-osnál nagyobb, így 70 %, 80 %, 90 %, sőt 95 %-os fölötti mértékű az azonosság. A szekvencia összehasonlítás olyan ismert algoritmus segítségével hajtható végre, mint amelyet Lipman és Pearson (1985) ismertetnek.

Az eredeti celluláz enzim analógjának további ii) és iii) tulajdonságait a következőképpen állapítottuk meg:

Az ii) tulajdonság, azaz az immunológiai kereszt reaktivitás az eredeti celluláz enzimmel szemben termelt antitest alkalmazásával vagy az eredeti celluláz enzimnek legalább egy epitopjával való reaktivitás vizsgálatával állapítható meg. Az antitest, amely vagy monoklonális vagy poliklonális lehet, a technika állásából ismert eljárásokkal állítható elő, például ahogyan azt Hudson et al., 1989-ben leírták. Az immunológiai kereszt reaktivitás ugyancsak a technika állásából önmagában ismert vizsgálatok alkalmazásával állapítható meg, például Western-Blotting vagy radiális immunodiffúziós vizsgálatokkal, amint azt Hudson et al., is ismerteti.

A fentiekben definiált iii) tulajdonsággal kapcsolatban az analóg jellemzésére használt oligonukleotid minta megfelelő módon az eredeti celluláz enzim teljes nukleotidja, a nukleotidjának egy részlete vagy aminosav szekvenciája alapján állítható elő. A hibridizáció bármely megfelelő, a DNS szekvenciák hibridizációját lehetővé tevő körülmények között végrehajtható. Ilyen hibridizációs körülményekre példaként említhetjük az olyan speciális eljárási lépéseket és paramétereket, mint például: előnedvesítés 5xSSC-ben, előhibridizáció 6.8-es pH-jú, 20 %-os formamidból, 5 x Denhardt-féle oldatból és 50 mmol nátrium-foszfátból álló oldat és 50 mg denaturált szonikált borjú csecsemőmirigy DNS elegyében 1 órán keresztül 40 °C-os hőmérsékleten, ezt követően hibridizáció ugyanabban, de 100 mmol ATP-vel kiegészített ol16 datban 18 órán keresztül körülbelül 40 °C-os hőmérsékleten vagy lásd még az egyéb, például a Sambrook et al., 1989 irodalmi helyen ismertetett eljárásokat.

A találmány szerinti eljárás céljára használható cellulóz enzimfajták például a Humicola insolens, DSM 1800, SEQ ID NO:1 által előállítható vagy abból származtatott olyan 43 kD-os endoglukanáz variánsok, melyek a 8, 55, 58, 62, 67, 132, 147, 162, 221, 222, 223, 280 helyek közül egy vagy több helyen egy vagy több aminosav gyök helyettesítésével módosítottak; továbbá a 213-as helyzettől kezdve bárhol tetszőlegesen végzett rövidítéssel, előnyösen genetikai rövidítéssel, módosítottak.

A találmány szempontjából előnyös cellulóz enzimfajták a Humicola insolens által előállítható vagy abból származtatott 43 kD-os endoglukanáz variánsok, DSM 1800, SEQ ID NO:1, melyek egy vagy több aminosav gyök helyettesítésével az alábbiak szerint kerültek módosításra;

Y8F

S55E/D

D58A/S/N

W62E

D67R/N

F13A/D/E/G

Y147S

A162P

V221S

N222S

Q223T

Y280F.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az olyan lúgos endoglukanáz enzim, mint a 43 kD-os77. insolens, DSM 1800, endoglukanáz vagy annak említett módosított vari17 ánsai alkalmazása esetén előnyös lehet a jelen találmány szerinti eljárást körülbelül 9-es vagy az alatti pH értéken, előnyösen 6 alatti pH értéken, még előnyösebben körülbelül 4.5 és körülbelül 5.5 közötti pH értéken, különösen pedig körülbelül 5.0 pH értéken végrehajtani.

A jelen találmány szerinti megoldással összefüggésben a celluláz enzim aktivitást ECU-ban fejezzük ki. A cellulolitikus enzimek hidrolizálják a CMC-t, ezáltal növelik az inkubációs elegy viszkozitását. Az elegy viszkozitásában beállt csökkenést vibrációs viszkoziméterrel határozhatjuk meg (például a Sofraser cég, Franciaország MIVI 300 típusú készülékével).

Az ECU-ban mért cellulolitikus aktivitást a következő analitikai módszerrel (vizsgálattal) határozhatjuk meg: A vizsgálat ECU-ban kifejezve számszerűsíti a mintában jelenlévő enzim katalitikus aktivitását mérve a minta karboximetilcellulóz oldat viszkozitás csökkentő képességét. A vizsgálatot a CMC (karboximetilcellulóz Hercules 7 LFD) szubsztrátum viszkozitásának csökkentésére szolgáló valamely rokon enzim standardot és 7.5-es pH-jú, 0.5 mólos foszfát puffért alkalmazva 40 °C-os hőmérsékleten 30 percen keresztül végezzük; az enzim koncentráció megközelítőleg 0.15 ECU/ml. A fő standardot 8200 ECU/gramm értéken definiáltuk.

Jóllehet a jelen találmány szerinti eljárásban az arra alkalmas celluláz enzim, mint olyan felhasználható, előnyös lehet, ha az valamely megfelelő készítményként formázásra, illetve kiszerelésre kerül. Ennek megfelelően az alkalmazott celluláz enzim felhasználásra kerülhet granulátum, előnyösen nem porló granulátum, folyadék, főként stabilizált folyadék, zagy alakjában vagy valamely védett formában. Porlódás mentes granulátumokat például a 4 106 991 lajstromszámú és a 4 661 452 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban (mindkettő Novo Nordisk A/S szabadalom) ismertetett eljárásokkal lehet előállítani, majd azok felületén kívánt esetben önmagukban ismert eljárásokkal bevonó réteg alakítható ki.

• · · · · • · · ·

Folyékony halmazállapotú enzim készítmények már korábban kidolgozott eljárásokkal, például olyan poliolok, mint a propilén-glikol, a cukor vagy a cukoralkohol vagy ecetsav hozzáadásával stabilizálhatok. Természetesen a technika állásából ismert egyéb enzim stabilizálószerek is felhasználhatók. Védőcsoportokkal ellátott enzimeket többek között a 238 216 lajstromszámú európai szabadalmi leírásban ismertetett módon lehet előállítani.

Az alkalmazásra kerülő enzimek teljesítménye nagymértékben függ az alkalmazott olyan eljárási paraméterektől, mint a pH és a hőmérséklet. A jelen találmány szerinti eljárás teljessé tétele érdekében a cellulolitikus enzim fajta kiválasztásakor természetesen az olyan tényezőket, mint a pH-függő enzim teljesítmény és hőstabilitás, meg kell fontolni. Egyéb olyan reakció körülmények, mint például nedvesítőszerek hozzáadása stb., ugyancsak függ a végrehajtásra kerülő teljes folyamattól éppúgy, mint az alkalmazott enzimtől.

A találmány tárgyát képező megoldást az oltalmi kör korlátozásának szándéka nélkül a továbbiakban kiviteli példákkal szemléltetjük.

Kiviteli példák

Készülék:

A vizsgálatot Atlas LP2 típusú mosásállóságmérő készülékben (Launder-O-Meter) hajtottuk végre főzőpoharanként 2 kis szövetmintát használva fel.

Textília:

Fehérített egymásba hurkolásos technikával készült 100 %-os pamut kötött kelme, 205 g/m². A textíliát 14x12 cm-es méretű darabokra vágtuk (egyenként körülbelül 3.5 gramm tömegűek), majd egy éjszakán keresztül 20 °C-os hőmérsékleten 65 %-os relatív páratartalmú térben állandó körülmények között kondicionáltuk.

• · · · • · · · · ·

Enzimek:

A: Referencia (Cellusoft L, egy kereskedelemben kapható savas celluláz készítmény, előállítja és forgalmazza a Novo Nordisk A/S, DK-2880 Bagsvaerd, Dánia).

B: Humicola insolensböl származtatott 43 kD-os endoglukanáz, DSM 1800.

C: B (D58A helyettesítésű) variánsa

D: B (F132D helyettesítésű) variánsa

E: B (Y280F helyettesítésű) variánsa

F: B (D67R helyettesítésű) variánsa

G: B (Y147S helyettesítésű) variánsa

Η: B (S55E helyettesítésű) variánsa

J: B (Y8F, W62E, A162P, V221S, N222S és Q223T helyettesítésű) variánsa

K: B (Y147N helyettesítésű) variánsa.

Kísérleti körülmények:

(Mosásállóságmérő készülékben [Launder-O-Meter] végrehajtott biosimítás) 4 főzőpoharat (8 szövetmintát) használtunk fel minden méréshez.

Folyadék arány Folyadék térfogat Koptató/csiszoló anyag pH

Puffer

Idő

Hőmérséklet : 20

140 ml db acél golyó (d = 14 mm, 11 gramm)

5.0 g/l acetát perc °C

Inaktiválás:

Minden mérés végén az enzimatikus folyamatot úgy állítottuk le, hogy az öszszes szövetmintát egy AEG Öko-Lavamat 665 típusú standard európai háztartási mosógépben 70 °C-os hőmérsékleten kimostunk és háromszor kiöblítettünk.

Szárítás:

A szövetmintákat levegőn szárítottuk és egy éjszakán keresztül 20 °C-os hőmérsékleten 65 %-os relatív páratartalmú térben kondicionáltuk.

Mérések:

Az A jelű, kereskedelemben kapható enzim készítményt 4 dózisban, a textília tömegére számítva 0 - 4.0 w/w % közötti mennyiségben teszteltük.

Az összes többi B - K enzimkészítményt pedig 4 dózisban, 0 - 5.0 ECU/gramm textília közötti mennyiségben teszteltük.

Eredmények:

A következő paramétereket mértük, illetve számítottuk ki:

* Tömegveszteség, százalékban kifejezve, a celluláz enzimmel kezelt textil kelme tömegvesztesége, valamint a celluláz nélkül kezelt (fehérített) textil kelme tömegvesztesége.

* Bolyhosodási mutató (PN = pilling note), amelyet minden esetben az SN 198 525 (1990-es) szabvány szerint, Martindale-féle Bolyhosodás Mérő készülékben 500-as felbontásnál határoztunk meg.

A kezeletlen textília bolyhosodási mutatója éppúgy, mint a celluláz enzim nélkül kezelt (kontroll) textíliáé 1 volt.

Az alábbi táblázatban mutatjuk be a celluláz enzimekkel kezelt, 4.5-es bolyhosdási mutatójú textíliák esetében mért tömegveszteség értékeket.

Táblázat

Enzim	Tömegveszteség (D%)
A (ref.)	5.6
B	2.0
C	1.3
D	1.3
E	2.0
F	1.7
G	1.2
H	1.0
J	1.2
K	1.5

DD

• · · · ·

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BEJELENTŐ: NOVO NORDISK A/S (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Bolyhosodásra kevésbé hajlamos cellulóz textília előállítására szolgáló eljárás (iii) A SZEKVENCIA SZÁMA: 1 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍM: NOVO NORDISK A/S Corporate Patents (B) UTCA: Novo Allé (C) VÁROS: Bagsvaerd (E) ORSZÁG: DENMARK (F) KÓD: DK-2880 (v) SZÁMÍTÓGÉPPEL OLVASHATÓ FORMA:

(A) ADATHORDOZÓ TÍPUS: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP TÍPUS: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verziószám #1.25 (2) SEQ ID NO: 1-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 305 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje • · · · · · • · ······ (iv) EREDETI FORRÁS:

(A) ÉLŐ ORGANIZMUS: Humicola insolens (B) TÖRZS: DSM 1800 (xi) SZEKVENCIA ISMERTETÉS: SEQ ID NO:1:

Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Alá Val Val Alá Alá Leu Pro

-21 -20 -15 -15

Val Leu Alá Leu Alá Alá Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

-5 1 5 10

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Alá Lys Lys Alá Pro Val Asn Gin Pro 15 20 25

Val Phe Ser Cys Asn Alá Asn Phe Gin Arg Ile Thr Asp Phe Asp Alá

35 40

Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Alá Tyr Ser Cys Alá Asp Gin

50 55

Thr Pro Trp Alá Val Asn Asp Asp Phe Alá Leu Gly Phe Alá Alá Thr

65 70 75

Ser Ile Alá Gly Ser Asn Glu Alá Gly Trp Cys Cys Alá Cys Tyr Glu

85 90

Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Alá Gly Lys Lys Met Val Val Gin

100 105

Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn

110 115 120

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe

125 130 135

Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu

140

145

150

155

Cys Asp Arg Phe Pro Asp Alá Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe

160 165 170

Asp Trp Phe Lys Asn Alá Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gin Val

175 180 185

Gin Cys Pro Alá Glu Leu Val Alá Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp

190 195 200

Asp Gly Asn Phe Pro Alá Val Gin Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser

205 210 215

Pro Val Asn Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr

220 225 230 235

Ser Ser Pro Pro Val Gin Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Alá Glu

240 245 250

Arg Trp Alá Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys

255 260 265

Val Alá Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gin Cys

270 275 280

Leu

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Bolyhosodásra jelentősen csökkentett mértékben hajlamos cellulóz textília előállítására szolgáló eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás során a cellulóz szál tartalmú textíliát a szálfelület részleges hidrolízisének végrehajtására képes celluláz enzimmel (cellulolitikus enzimmel) kezeljük a kezeletlen cellulóz textíliára számítva 2 w/w %-nál kevesebb tömegveszteség mellett.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a textília bolyhosodási mutatója legalább 4-es, még előnyösebben legalább 4.5-es.
3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cellulóz szálat tartalmazó textíliák közé tartozik a pamut; a viszkóz (műselyem); a lyocell; a viszkóz összes keveréke, a pamut vagy a lyocell egyéb olyan szálakkal, mint például a poliészter; a viszkóz/pamut keverékek, a lyocell/pamut keverékek, a viszkóz/gyapjú keverékek, a lyocell/gyapjú keverékek, a pamut/gyapjú keverékek; a lenvászon, a rami és egyéb cellulóz szálakon alapuló textíliák, beleértve a cellulóz szálak összes egyéb olyan szálakkal, mint a gyapjú, a poliamid, az akril és a poliészter, képezett elegyét, így például viszkóz/pamut/poliészter keverékek, gyapjú/pamut/poliészter keverékek, lenvászon/pamut keverékek.
4. Az 1 - 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a celluláz enzim egy monokomponensű celluláz enzim, előnyösen valamely endoglukanáz (EC 3.2.1.4.).
5. A 3. vagy 4. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a celluláz enzim mikrobiális eredetű, előnyösen bakteriális vagy gomba eredetű celluláz, még előnyösebben gomba eredetű celluláz.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a celluláz enzim savas celluláz, előnyösen gomba eredetű savas celluláz, még előnyösebben savas körülmények között jelentős cellulolitikus aktivitással rendelkező gomba eredetű savas celluláz enzim, amely Trichoderma-bó\, Actinomyces-bő\, Myrothecium-bő\, Aspergillus-bó\ és Botrytis-bö\ álló nemzetség csoportba tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a celluláz enzim a Trichoderma viride-bő\, Trichoderma reese/'-ből, Trichoderma longibrachiatum-bó\, Myrothecium verrucaria-bó\, Aspergillus n/ger-ből, Aspergillus oryzae-bő\ és Botrytis cinerea-ból álló fajok csoportjába tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a celluláz enzim semleges vagy lúgos celluláz, előnyösen gomba eredetű semleges vagy lúgos celluláz, még előnyösebben egy lúgos körülmények között jelentős cellulolitikus aktivitással rendelkező gomba eredetű lúgos celluláz enzim, amely az Aspergillus-ból, Penicillium-bó\, Myceliophthora-bó\, Humicola-bói, az /rpex-ből, a Fusarium-bó\, a Stachybotrys-bó\, Scopulariopsis-bő\, Chaetomium-bó\, Mycogone-bő\, Verticilliumból és Myrothecium-bó\, Papulospora-bó\, Gliocladium-bó\, Cephalosporium-bó\ és Acremonium-bó\ álló nemzetség csoportba tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lúgos cellulóz enzim a Humicola insolens-bő\, a Fusarium oxysporum-bó\, a Myceliopthora thermophile-bő\ vagy a Cephalosporium sp.-ből álló fajok csoportjába tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cellulóz enzim a Humicola insolens-bö\, DSM 1800, Fusarium oxysporum-bói, DSM 2672, Myceliopthora thermophile-bő\, CBS 117.65 vagy a Cephalosporium sp., RYM-202 álló faj csoportba tartozó gombák által előállítható vagy azokból származtatott.
11. A 8 -10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést körülbelül 9 alatti pH értéken, előnyösen 6 alatti pH értéken, még előnyösebben 4.5 és 5.5 közötti pH értéken, különösen pedig körülbelül 5.0 pH értéken hajtjuk végre.
12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cellulóz enzim Humicola insolens, DSM 1800, SEQ ID NO:1 által előállított vagy abból származtatott 43 kD-os endoglukanáz enzim vagy ennek az említett cellulóz enzimnek olyan funkcionális analógja, amely

i) az eredeti cellulóz enzim aminosav szekvenciájával legalább 60 %-ban homológ aminosav szekvenciát tartalmaz;

ii) az eredeti cellulóz enzimmel szemben termelt antitesttel reakcióba lép;

iii) olyan DNS szekvencia kódolja, amelyik ugyanazzal a mintával hibridizálódik, mint az eredeti cellulóz enzimet kódoló DNS szekvencia.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Humicola insolens, DSM 1800, SEQ ID NO:1 által előállítható vagy abból származtatott 43 kD28 os endoglukanáz variáns, amely a 8, 55, 58, 62, 67, 132, 147, 162, 221, 222, 223, 280 helyek közül egy vagy több helyen egy vagy több aminosav gyök helyettesítésével módosított; vagy a 213-as helyzettől kezdve bárhol végzett rövidítéssel, előnyösen genetikai rövidítéssel, módosított.
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egy vagy több aminosav gyök az alábbiak szerint került helyettesítésre:

Y8F

S55E/D

D58A/S/N

W62E

D67R/N

F132A/D/E/G

Y147/S

A162P

V221S

N222S

Q223T

Y280F
15. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakteriális eredetű celluláz enzim a Pseudomonas-bó\ vagy Bacillus lautus-bó\ álló nemzetség csoportba tartozó baktériumok által előállítható vagy azokból származtatott.
16. Az 1 - 15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést bármely hagyományos nedves textil feldolgozási lépés során végrehajthatjuk.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést olyan nagy sebességgel keringő rendszerekben végezzük el, mint a fúvókás-túlfolyó színező berendezések, nagy sebességű motollák (csörlők) és festőkádak.
18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést két lépéses biosimítási eljárás keretében a kiegyenlítőben (fehérítésnél), fulárdhengerben vagy fulárd-fürdőben hajtjuk végre.

A meghatalmazott ifj.Szentpéteri Ádám