JPS58888A - 脂肪酸の分解に関与する酵素の製造法 - Google Patents
脂肪酸の分解に関与する酵素の製造法Info
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- JPS58888A JPS58888A JP9931481A JP9931481A JPS58888A JP S58888 A JPS58888 A JP S58888A JP 9931481 A JP9931481 A JP 9931481A JP 9931481 A JP9931481 A JP 9931481A JP S58888 A JPS58888 A JP S58888A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、脂肪酸の分解に関与するエノイル−ＣｏＡヒ
ドラターＶ （Ｅｎｏｙｌ Ｃ’ｏＡ ｈｙｄｒａｔａ
ｓｅ）活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲ
ナーゼ（３Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ ＣｏＡ ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性および３−ケトアＳ／ ルー
Ｃｏムチオラーゼ（Ｊ−ｋｅｔｏａｃｙｌ ＣｏＡｔ
ｈｉｏｌａａｅ ）活性の各活性を同−蛋白上に有して
なる酵素の製造法ｔこ関する。
ドラターＶ （Ｅｎｏｙｌ Ｃ’ｏＡ ｈｙｄｒａｔａ
ｓｅ）活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲ
ナーゼ（３Ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ ＣｏＡ ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性および３−ケトアＳ／ ルー
Ｃｏムチオラーゼ（Ｊ−ｋｅｔｏａｃｙｌ ＣｏＡｔ
ｈｉｏｌａａｅ ）活性の各活性を同−蛋白上に有して
なる酵素の製造法ｔこ関する。
脂肪酸は、一般的ｔこ、ＣｏＡ誘導体ｔこ変換され念後
、いわゆるβ酸化により代謝される。
、いわゆるβ酸化により代謝される。
このβ酸化は、下記に示すような各段階の反応を経て炭
素数２個の単位で分解する反応である。
素数２個の単位で分解する反応である。
・〔反応ＩニアシルーＣｏＡシンセターゼ（Ａｅｙｌ
−ＣｏＡ ５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ、 Ｅ＠Ｃ，ｌｓ＠
２−ム３〕・〔反応■ニアシルーＣｏＡデヒドロゲナー
ゼ、（ＡｃｙｌＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）
、Ｅ＊Ｃｅ／Ｊ＊タタ、３〕 （また・〔反応■：
エノイルーＣｏＡヒドラターゼ、Ｅ、Ｃ。
−ＣｏＡ ５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ、 Ｅ＠Ｃ，ｌｓ＠
２−ム３〕・〔反応■ニアシルーＣｏＡデヒドロゲナー
ゼ、（ＡｃｙｌＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）
、Ｅ＊Ｃｅ／Ｊ＊タタ、３〕 （また・〔反応■：
エノイルーＣｏＡヒドラターゼ、Ｅ、Ｃ。
≠・２・ｌ・／７）
・〔反応■：３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ テヒドク
ゲナーゼ、Ｅ、Ｃ，ハム１ａ３ｓ〕 ・〔反応ｖ：３−ケトアシルーＣｏＡチオラーゼ、Ｅ、
Ｃ，２Ｊ、／、／ Ａ ） Ｒ−Ｑ−ＣＨＩ−Ｃ−８−ＣｏＡ＋Ｃｏ５Ｈ、＝＝コこ
の反応■により生じた２個炭素数の少ないアシル−Ｃｏ
Ａは、さらｅこ反応■の系に移り、ひとつのサイクルを
形成する。このサイクルにより、例えば炭素数Ｉｆのパ
ルミチン酸は、完全ｔこ分解されたとき、タモルのアセ
チル−ＣｏＡを生成する０前記の酵素作用において、各
々単一の活性を月す酵素は、すで１こ単離、精製されて
いる。ま几大腸菌（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔ）の培養物から、前記の反応■、反応■、反応Ｖにて
表わされる酵素活性を同−蛋白上１こ有してなる酵素が
見い出されている（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、、 ｌＪ４ （，２） １１９２−ゲ
タ５ （／９７７））。
ゲナーゼ、Ｅ、Ｃ，ハム１ａ３ｓ〕 ・〔反応ｖ：３−ケトアシルーＣｏＡチオラーゼ、Ｅ、
Ｃ，２Ｊ、／、／ Ａ ） Ｒ−Ｑ−ＣＨＩ−Ｃ−８−ＣｏＡ＋Ｃｏ５Ｈ、＝＝コこ
の反応■により生じた２個炭素数の少ないアシル−Ｃｏ
Ａは、さらｅこ反応■の系に移り、ひとつのサイクルを
形成する。このサイクルにより、例えば炭素数Ｉｆのパ
ルミチン酸は、完全ｔこ分解されたとき、タモルのアセ
チル−ＣｏＡを生成する０前記の酵素作用において、各
々単一の活性を月す酵素は、すで１こ単離、精製されて
いる。ま几大腸菌（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｔ）の培養物から、前記の反応■、反応■、反応Ｖにて
表わされる酵素活性を同−蛋白上１こ有してなる酵素が
見い出されている（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、、 ｌＪ４ （，２） １１９２−ゲ
タ５ （／９７７））。
本発明者らは、山梨県北巨摩郡須玉町の梨畑の土壌より
分離し友シュードモナス（Ｐ ５ｅｕｄｏ ｍｏｎａ
ａ）鳥に属する細菌Ｂ、−０’７７、を株が、その培養
物に前記の反応■ｔこて示されるエノイル−ＣｏＡヒド
ラターゼ活性、反応■ｔこて示される３−ヒドロキシア
シル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および反応Ｖｔこ
て示される３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性の各
酵素活性を同−蛋白上ｔこ有してなる酵素（以下単に、
「複合活性酵素」と略す）を産生じていることを見い出
した。
分離し友シュードモナス（Ｐ ５ｅｕｄｏ ｍｏｎａ
ａ）鳥に属する細菌Ｂ、−０’７７、を株が、その培養
物に前記の反応■ｔこて示されるエノイル−ＣｏＡヒド
ラターゼ活性、反応■ｔこて示される３−ヒドロキシア
シル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、および反応Ｖｔこ
て示される３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性の各
酵素活性を同−蛋白上ｔこ有してなる酵素（以下単に、
「複合活性酵素」と略す）を産生じていることを見い出
した。
上記の細菌Ｂ−０７７ｉ株の肉眼的および顕微鏡的観察
などｅこ基く各種培地上をこおける培養の所見は、以下
ｔこ述べる通りである０ （ト）肉眼的特徴 （１）普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲はなめらかな集落を形成し半光沢で
、灰白色〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生じない。
などｅこ基く各種培地上をこおける培養の所見は、以下
ｔこ述べる通りである０ （ト）肉眼的特徴 （１）普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲はなめらかな集落を形成し半光沢で
、灰白色〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生じない。
（２）普通寒天斜面培地
線状ｔこ良好に生育する。半光沢で、灰白色〜淡黄色を
呈す、Ａ０可溶性色素は産生じな（・。
呈す、Ａ０可溶性色素は産生じな（・。
（３）液体培地
一様１こ混濁し、沈澱も生ずる。菌膜は形成しない０
（Ｂ）顕微鏡的観察
まっすぐ、またはやや曲つ几桿菌で、単独または二連で
、たまｔこ長連鎖１こなる０大きさをよＯ≠〜Ｑ６ＸＯ
，５〜３．０μｍで、他系で運動する。芽胞をよ形成し
ない。
、たまｔこ長連鎖１こなる０大きさをよＯ≠〜Ｑ６ＸＯ
，５〜３．０μｍで、他系で運動する。芽胞をよ形成し
ない。
（Ｑ生理的・生化学的特徴
ダラム染色 −〇、Ｆテスト
Ｏカタラーゼ
＋オキシダーゼ
ルシチナーゼ −
ウレアーゼ ＳＳＲ培地 − クリステンゼン培地 ←）ゲラチンの加水
分解 −デンプンの加水分解
−カゼインの加水分解
−エスクリンの加水分解 −アル
ギニンの加水分解 十ホ駈β−ノ・イ
ドロキシブチレイト （ＰＨＢ）の蓄ａ−インドールの
産生 −硫化水素の産生
−アセトインの産生
−ＭＲテスト 硝酸塩の還元 クエン酸の利用 十糖より酸
の産生性 酸産生、ガス非産生：Ｌ（→アラビノース、セロビオー
ス、フラクトース、フコース、ガラクトース、クルコー
ス、グリセ１ノン、ラクトース、マルトース、マンノー
ス、メ１ノビオース、ラムノース、シュクロース、トレ
ノーロース、キシロース、酸非産生、ガス非産生：アド
ニトール、ヅルシトール、メソ−エリスリトール、イノ
シトールイヌリン、マンニトール、メレジトース、ラフ
ィノース、サリシン、ソルボース、ソルビトール、スタ
ーチ、 ｌ ＡＦの通り、１菌Ｂ−０７７１株は、ダラム陰性で
、他系で運動し、カタラーゼ、オキシダーゼ陽性であり
、さらにグルコースを酸化的に分解する杆菌性の細菌で
おる特徴を有していることからシュードモナス属に属す
る菌株と認められた。
Ｏカタラーゼ
＋オキシダーゼ
ルシチナーゼ −
ウレアーゼ ＳＳＲ培地 − クリステンゼン培地 ←）ゲラチンの加水
分解 −デンプンの加水分解
−カゼインの加水分解
−エスクリンの加水分解 −アル
ギニンの加水分解 十ホ駈β−ノ・イ
ドロキシブチレイト （ＰＨＢ）の蓄ａ−インドールの
産生 −硫化水素の産生
−アセトインの産生
−ＭＲテスト 硝酸塩の還元 クエン酸の利用 十糖より酸
の産生性 酸産生、ガス非産生：Ｌ（→アラビノース、セロビオー
ス、フラクトース、フコース、ガラクトース、クルコー
ス、グリセ１ノン、ラクトース、マルトース、マンノー
ス、メ１ノビオース、ラムノース、シュクロース、トレ
ノーロース、キシロース、酸非産生、ガス非産生：アド
ニトール、ヅルシトール、メソ−エリスリトール、イノ
シトールイヌリン、マンニトール、メレジトース、ラフ
ィノース、サリシン、ソルボース、ソルビトール、スタ
ーチ、 ｌ ＡＦの通り、１菌Ｂ−０７７１株は、ダラム陰性で
、他系で運動し、カタラーゼ、オキシダーゼ陽性であり
、さらにグルコースを酸化的に分解する杆菌性の細菌で
おる特徴を有していることからシュードモナス属に属す
る菌株と認められた。
さらに、ザ・ジャーナル・オプ・ジェネラル・ミクロバ
イオロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ） ２ ｊ、３７
ター４０１ （／り６１）に記載のシュードモナス・
フライ（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ ）
と対比し友結果、よく一致した。
イオロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ） ２ ｊ、３７
ター４０１ （／り６１）に記載のシュードモナス・
フライ（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ ）
と対比し友結果、よく一致した。
さらに重曹Ｒ”０７７／株を、標準性であるシュードモ
ナス串フラギ・ＡＴＣＣ４１！９７３株と比表 較実験を行なった。その結果、第１ａｔこ示す通りであ
った。
ナス串フラギ・ＡＴＣＣ４１！９７３株と比表 較実験を行なった。その結果、第１ａｔこ示す通りであ
った。
第 ｌ 表
以上の通り、重曹Ｂ−０７７／株は、標準性であるシュ
ードモナス轡フラギ・ＡＴＣＣ≠９７３株とよく一致し
た。よって本菌株をシュードモナス・フライ・Ｂ−０７
７ｔと命名した（微生物受託番号通知書、微生物受託番
号［微工研菌寄第ｊ’ｙｏｉ号、Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ＆５７
ｏ／ Ｊ）。
ードモナス轡フラギ・ＡＴＣＣ≠９７３株とよく一致し
た。よって本菌株をシュードモナス・フライ・Ｂ−０７
７ｔと命名した（微生物受託番号通知書、微生物受託番
号［微工研菌寄第ｊ’ｙｏｉ号、Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ＆５７
ｏ／ Ｊ）。
本発明は、上記の知見ｅこ基いて完成されたもの複
で、シュードモナス属ｔこ属する複合活性酵素生産菌を
培地に培養し、その培養物から該酵素を採取することを
特徴とする酵素の製造法である。
培地に培養し、その培養物から該酵素を採取することを
特徴とする酵素の製造法である。
本発明１こおける使用菌としては、−前記のシュードモ
ナス・７ラギ・Ｂ−０７７１株はその一例であって、型
閉だけでなく、シュードモナス属菌に属する複合活性酵
素生産菌はすべて本発明１こおいて使用することができ
る〇 本発明を実施する１こ当っては、シュードモナス属に属
する複合活性酵素生産菌を、酵素を生産する通常の方法
で培養する。培養の形態は液体培養でも固体培養でもよ
いが、工業的１こは複合活性酵素生産菌の細胞を生産用
培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利であ
る。
ナス・７ラギ・Ｂ−０７７１株はその一例であって、型
閉だけでなく、シュードモナス属菌に属する複合活性酵
素生産菌はすべて本発明１こおいて使用することができ
る〇 本発明を実施する１こ当っては、シュードモナス属に属
する複合活性酵素生産菌を、酵素を生産する通常の方法
で培養する。培養の形態は液体培養でも固体培養でもよ
いが、工業的１こは複合活性酵素生産菌の細胞を生産用
培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利であ
る。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭
素化合物であればよく、例えばグルコース、シュクロー
ス、ラクトース、スターチ、麦芽糖、デキスｂｖン、糖
蜜、廃糖蜜、グリセリンなどが使用されるρ窒素源と１
７では、利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコ
ーンースチープ・リカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテ
ン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、粉末酵母、カゼ
イン加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩、
硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリ
ウム、亜鉛、鉄、マンガンなどの塩類が必要に応じて使
用される。さらに複合活性酵素の生産性を改良せしめる
ために、炭素数ｇ〜２０の脂肪酸、例えばオレイン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸を１．培地中にＱ、 ／
−／％程度添加せしめることが好ましい。
ものが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭
素化合物であればよく、例えばグルコース、シュクロー
ス、ラクトース、スターチ、麦芽糖、デキスｂｖン、糖
蜜、廃糖蜜、グリセリンなどが使用されるρ窒素源と１
７では、利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコ
ーンースチープ・リカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテ
ン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、粉末酵母、カゼ
イン加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩、
硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリ
ウム、亜鉛、鉄、マンガンなどの塩類が必要に応じて使
用される。さらに複合活性酵素の生産性を改良せしめる
ために、炭素数ｇ〜２０の脂肪酸、例えばオレイン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸を１．培地中にＱ、 ／
−／％程度添加せしめることが好ましい。
培養温度は、菌が発育し複合活性酵素を生産する範囲内
で適゛宜変更し得るが、好ましくは２６〜３２℃、特ｔ
こ好ま一七−べ−は３０’Ｃ程度である。培養時間は、
条件によって多少異なるが、通常ｌＯ〜≠θ時間程度で
あって、複合活性酵素が最高力価に達する時期をみはか
らって適当な時期に培養を終了すればよい。
で適゛宜変更し得るが、好ましくは２６〜３２℃、特ｔ
こ好ま一七−べ−は３０’Ｃ程度である。培養時間は、
条件によって多少異なるが、通常ｌＯ〜≠θ時間程度で
あって、複合活性酵素が最高力価に達する時期をみはか
らって適当な時期に培養を終了すればよい。
このようにして得られた複合活性酵素生産菌の培養物に
おいて、複合活性酵素は主にその菌体内に含有される。
おいて、複合活性酵素は主にその菌体内に含有される。
次いでこのようｅこして得られた複合活性酵素生産菌の
培養物から複合活性酵素を採取するもので、例示すれば
、その培養物を濾過または遠心分離によりその菌体を回
収する。次いでこの菌体は、超音波処理、フ、レンチプ
レス処理、ガラスピーズ処理などの機械的破壊手段やリ
ゾチーム処理などの酵素的破壊手段１ごてその菌体を破
壊せしめればよく、さらにその際、必要１こ応じてトリ
トンＸ−１００（商品名）やアデカトールＳｏ−／≠５
（商品名）などの界面活性剤を用いてもよい。さらに
このよう１こして得られ次回溶化した複合活性酵素含有
液は、メタノール、エタノール、アセトンなどの親水性
有機溶媒を加えて析出せしめてもよく、または塩化アン
モニウムなどの可溶性塩類を加えて塩析せしめてもよく
、次いでこの析出物を回収して粗製物を得ればよい。さ
ら？ここの粗製物は、必要に応じて精製すればよく、例
えば、粗製物を溶解せしめた俵、半透性セルロースｔこ
て透析せしめ、またＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−
メチル−セファデックスなどのイオン交換樹脂によるク
ロマトグラフィーや、セファデックスＧ２００、セファ
ロースＣＬ−ＩＢ、七７アクリル５２００やトヨパール
ＨＷ−４ｏなどのゲル濾過剤ｔこよるクロマトグラフィ
ー（こて精製し、これを凍結乾燥して精製した酵素を得
ればよい。
培養物から複合活性酵素を採取するもので、例示すれば
、その培養物を濾過または遠心分離によりその菌体を回
収する。次いでこの菌体は、超音波処理、フ、レンチプ
レス処理、ガラスピーズ処理などの機械的破壊手段やリ
ゾチーム処理などの酵素的破壊手段１ごてその菌体を破
壊せしめればよく、さらにその際、必要１こ応じてトリ
トンＸ−１００（商品名）やアデカトールＳｏ−／≠５
（商品名）などの界面活性剤を用いてもよい。さらに
このよう１こして得られ次回溶化した複合活性酵素含有
液は、メタノール、エタノール、アセトンなどの親水性
有機溶媒を加えて析出せしめてもよく、または塩化アン
モニウムなどの可溶性塩類を加えて塩析せしめてもよく
、次いでこの析出物を回収して粗製物を得ればよい。さ
ら？ここの粗製物は、必要に応じて精製すればよく、例
えば、粗製物を溶解せしめた俵、半透性セルロースｔこ
て透析せしめ、またＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−
メチル−セファデックスなどのイオン交換樹脂によるク
ロマトグラフィーや、セファデックスＧ２００、セファ
ロースＣＬ−ＩＢ、七７アクリル５２００やトヨパール
ＨＷ−４ｏなどのゲル濾過剤ｔこよるクロマトグラフィ
ー（こて精製し、これを凍結乾燥して精製した酵素を得
ればよい。
次いでこのよう１こして得られた本発明の複合活性酵素
の活性測定法、その理化学的性質１３ついて述べる。
の活性測定法、その理化学的性質１３ついて述べる。
（１）活性測定法
（イ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性測定法０．２
Ｍ・トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９０） ０．≠
１／ Ｍ ＋ｌＫＣｌ
Ｑ、ｔ ｒｓｌｌｌｏ ｍ Ｍ 赤 Ｎ
Ａ Ｄ Ｏ，／
ｍ１７５ｍＭ＠パルミトエノイルＣｏＡ 、０．／
ｍｌ１％牛血清アルブミン ｏ、 ｏ
ｓ ｍ１０２ｓ％ニトロテトラゾリウムブルー 〇
、ｌ―３０ Ｕ／ｍｌ−ジアホラーゼ （東洋醸造社製
） Ｑ、／ａｔ／ ２５ Ｕ／ ｍｌ・３−ヒドロキ
シアンルーＣｏＡｆヒドロゲナーゼ （ベーリンガー社
製） Ｑ、 Ｑ ／ ｍｌ計 ／
、 ００ ｍｌ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液ＳＯμｅｔ加えて３７℃、１０分間反
応せ攬める。反応後これｔこ、０．５％ドデシル硫酸ナ
トリウム、！Ｏｄを加えて反応を停止せしめ、次いで波
長５５０ｎｍにて吸光度（△Ａ３５ｏ）を測定する。測
定において、１分間ｅこ１μｍｏｌｅのＮＡＤＨ迷を生
成する酵素量をｌ単位（ｌＵ）とする。また酵素活性は
、次式１こ従う。
Ｍ・トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９０） ０．≠
１／ Ｍ ＋ｌＫＣｌ
Ｑ、ｔ ｒｓｌｌｌｏ ｍ Ｍ 赤 Ｎ
Ａ Ｄ Ｏ，／
ｍ１７５ｍＭ＠パルミトエノイルＣｏＡ 、０．／
ｍｌ１％牛血清アルブミン ｏ、 ｏ
ｓ ｍ１０２ｓ％ニトロテトラゾリウムブルー 〇
、ｌ―３０ Ｕ／ｍｌ−ジアホラーゼ （東洋醸造社製
） Ｑ、／ａｔ／ ２５ Ｕ／ ｍｌ・３−ヒドロキ
シアンルーＣｏＡｆヒドロゲナーゼ （ベーリンガー社
製） Ｑ、 Ｑ ／ ｍｌ計 ／
、 ００ ｍｌ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液ＳＯμｅｔ加えて３７℃、１０分間反
応せ攬める。反応後これｔこ、０．５％ドデシル硫酸ナ
トリウム、！Ｏｄを加えて反応を停止せしめ、次いで波
長５５０ｎｍにて吸光度（△Ａ３５ｏ）を測定する。測
定において、１分間ｅこ１μｍｏｌｅのＮＡＤＨ迷を生
成する酵素量をｌ単位（ｌＵ）とする。また酵素活性は
、次式１こ従う。
／ ／ＱＱＱ ／
酵素活性（Ｕ／ＩＩＩ／）＝△Ａ、５５０ Ｘ ７−×
、ツー×万（４） ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒ
ドロゲナーゼ活性測定法 ０．２Ｍ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨどり ０．ｓｍ
ｔｌＭ−ＫＣｅ ｏｏｊＩＩ
ＩｌｌｌｏｍＭ−ＮＡＤ Ｑ、
ｔｍｌ／ＳｍＭ・３−ヒドロキシパルミトイｋ ＣｏＡ
Ｑ、 ／ ｍ１７％牛血清アルブミン
。０５ ｍ１０、２５ ％ニトロテトラゾリウムブ
ルー Ｑ、 ／ ｍｌ計 ／、 ００ ｍｌ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液５０μ４を加えて３７℃、１０分間反
応せしめる。反応後これ１こ、ｏｓ係ドデシル硫酸ナト
リウム２θｍｌをヵＶえて反応を汲 停止せしめ、次いで摩長！ ３０ ｎｍにて吸光度（を △Ａｓ５ｏ）％測定する。測定において、１分間ｔこ１
μｍｏ ｌ ｅ のＮＡＤＨ，を生成する酵素量をｌ
単位（ｌＵ） とする。また酵素活性は、次式ｔこ従
う。
、ツー×万（４） ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒ
ドロゲナーゼ活性測定法 ０．２Ｍ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨどり ０．ｓｍ
ｔｌＭ−ＫＣｅ ｏｏｊＩＩ
ＩｌｌｌｏｍＭ−ＮＡＤ Ｑ、
ｔｍｌ／ＳｍＭ・３−ヒドロキシパルミトイｋ ＣｏＡ
Ｑ、 ／ ｍ１７％牛血清アルブミン
。０５ ｍ１０、２５ ％ニトロテトラゾリウムブ
ルー Ｑ、 ／ ｍｌ計 ／、 ００ ｍｌ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液５０μ４を加えて３７℃、１０分間反
応せしめる。反応後これ１こ、ｏｓ係ドデシル硫酸ナト
リウム２θｍｌをヵＶえて反応を汲 停止せしめ、次いで摩長！ ３０ ｎｍにて吸光度（を △Ａｓ５ｏ）％測定する。測定において、１分間ｔこ１
μｍｏ ｌ ｅ のＮＡＤＨ，を生成する酵素量をｌ
単位（ｌＵ） とする。また酵素活性は、次式ｔこ従
う。
／ １００ ／
酵素活性（Ｕ ７ｍ１ ） ＝ΔＡ ５５０ Ｘ Ｘ
Ｘ−≠ ｓｏ ｔ。
Ｘ−≠ ｓｏ ｔ。
（３）３−ケトアシル−ＣＱＡチオラーゼ活性測定法、
ｆＺ’、、２Ｍ−）リス塩酸緩衝液（’ｐＨＪ’０）
’０．２ｒｎｌ：Ｉ Ｏｍ Ｍ ＣｏＡ Ｓ Ｈ０
，０３ｍ１０．２ｍＭ・３−ケトバルミトイルＱ）Ａ
Ｑ、／ ｍｌ／ ００ ｍ Ｍ ＠Ｍｇ Ｃ
％ （７，／ ｍｌ／ｍＭ・ジ
チオスライトール （７，ｔ ｍｌ蒸留水
０．≠５ｍ７！計
／、 ００ ｍｌ 上記の組成を有する反応液を／、 Ｏｍｌ容石英セルに
加えて３７℃とし、これｔこ酵素液２０μβを加えて３
７℃にて反応せしめ、反応ｔこよって消費さ、れる３−
ケトバルミトイルＯ）Ａの減少を波長３０ｊｎｍ に
て経時的に吸光度（ＯＤ、。１）測定する。測定１こお
いて、１分間ｔこ１μｍｏｌｅの３−ケトバルミトイル
ＣｏＡを消費する酵素量７を単位（ｌＵ）とする。ま之
酵素活性は、次式ｔこ従う。
ｆＺ’、、２Ｍ−）リス塩酸緩衝液（’ｐＨＪ’０）
’０．２ｒｎｌ：Ｉ Ｏｍ Ｍ ＣｏＡ Ｓ Ｈ０
，０３ｍ１０．２ｍＭ・３−ケトバルミトイルＱ）Ａ
Ｑ、／ ｍｌ／ ００ ｍ Ｍ ＠Ｍｇ Ｃ
％ （７，／ ｍｌ／ｍＭ・ジ
チオスライトール （７，ｔ ｍｌ蒸留水
０．≠５ｍ７！計
／、 ００ ｍｌ 上記の組成を有する反応液を／、 Ｏｍｌ容石英セルに
加えて３７℃とし、これｔこ酵素液２０μβを加えて３
７℃にて反応せしめ、反応ｔこよって消費さ、れる３−
ケトバルミトイルＯ）Ａの減少を波長３０ｊｎｍ に
て経時的に吸光度（ＯＤ、。１）測定する。測定１こお
いて、１分間ｔこ１μｍｏｌｅの３−ケトバルミトイル
ＣｏＡを消費する酵素量７を単位（ｌＵ）とする。ま之
酵素活性は、次式ｔこ従う。
（２）酵素作用
反応１［ｔこて表わされるエノイル−ＣｏＡヒドラター
ゼ活性、反応バにて表わされる３−ヒドロキシアシル−
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性および反応■ｅこて表わさ
れる３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーシー、 シュードモナス・フライ・Ｂ−０７７１株の培養物から
の菌体より得られた粗酵素から、数段の精製工程にて精
製酵素を得るもので（後述実施例３参照）、この工程ｔ
こおいて三種類の酵素活性を前記の活性測定法に基いて
測定した。その結果第、！表ｔこ示す通りであった。
ゼ活性、反応バにて表わされる３−ヒドロキシアシル−
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性および反応■ｅこて表わさ
れる３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーシー、 シュードモナス・フライ・Ｂ−０７７１株の培養物から
の菌体より得られた粗酵素から、数段の精製工程にて精
製酵素を得るもので（後述実施例３参照）、この工程ｔ
こおいて三種類の酵素活性を前記の活性測定法に基いて
測定した。その結果第、！表ｔこ示す通りであった。
（なお、酵素活性測定値は、その酵素含有液中の蛋白量
を求めて換算しに値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの各精製工程
での活性の比率にてよく一致しているもので、かつ精製
された酵素もその三種の酵素活性を有していることから
、この三種の酵素活性は同−蛋白上をこあるものと認め
られる。
を求めて換算しに値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの各精製工程
での活性の比率にてよく一致しているもので、かつ精製
された酵素もその三種の酵素活性を有していることから
、この三種の酵素活性は同−蛋白上をこあるものと認め
られる。
さらｔこ後述実施例３のトヨパールＨＷ−６０カラム
文クロマトグラフィーｅごて得られた精製酵素２０■を
、キャリア・アンホライトを用いる等電点電気泳動ｔこ
かけ友後三種の酵素活性を、その活性測定法に基いて測
定し几結果、ｐＨＩＡりのフラクション１こ三種の酵素
活性とも単一ピーク上Ｑこ検出された。
、キャリア・アンホライトを用いる等電点電気泳動ｔこ
かけ友後三種の酵素活性を、その活性測定法に基いて測
定し几結果、ｐＨＩＡりのフラクション１こ三種の酵素
活性とも単一ピーク上Ｑこ検出された。
（４）基質特異性
下記の種々の炭素数を有する３−ヒドロキシアシルＣｏ
Ａ ｔ 基質として用い、３−ヒドロキシアンルーＣｏ
Ａデヒドロゲナーゼ活性測定法ｅこ従ってその活性を測
定し友。
Ａ ｔ 基質として用い、３−ヒドロキシアンルーＣｏ
Ａデヒドロゲナーゼ活性測定法ｅこ従ってその活性を測
定し友。
基 質 相対活性（チ）３−ヒ
ドロキシカプロイル ３ｌ上。ロキシ力ブリリルＣｏＡ
ｇ ｇ． ／３−ヒドロキシカプリル（ＥｏＡ
９ ９０３−ヒドロキシラウリルＣｏＡ
１００．０３−ヒドロキシアシル・
トイルＣｏＡ ９ ｇ． ０３−ヒ
ドロキシバルミトイルＣｏＡ ７！；
、５３−ヒドロキシステアリルＣｏＡ
３ ０． ５３−ヒドロキシラウリルＣｏＡ
９．５３−ヒドロキシオレイルＣｏＡ
５ ７ ｊ３−ヒドロキシリルニ
ルＣｏＡ ９ ９． ０性を有する
。
ドロキシカプロイル ３ｌ上。ロキシ力ブリリルＣｏＡ
ｇ ｇ． ／３−ヒドロキシカプリル（ＥｏＡ
９ ９０３−ヒドロキシラウリルＣｏＡ
１００．０３−ヒドロキシアシル・
トイルＣｏＡ ９ ｇ． ０３−ヒ
ドロキシバルミトイルＣｏＡ ７！；
、５３−ヒドロキシステアリルＣｏＡ
３ ０． ５３−ヒドロキシラウリルＣｏＡ
９．５３−ヒドロキシオレイルＣｏＡ
５ ７ ｊ３−ヒドロキシリルニ
ルＣｏＡ ９ ９． ０性を有する
。
（５）至適ｐＩ（
Ｊｕｌして３−ヒドロキシノくルミトイルＣｏＡを用い
、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性
測定法ｔこおけるｐＨをトリス−塩酸緩衝液ｐ Ｈ ７
５ − ９ ３にて変化せしめて活性を求め友、午の
結果、第１図１こ示す通り、その至適ｐＨはｐＨり付近
であつ几。
、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性
測定法ｔこおけるｐＨをトリス−塩酸緩衝液ｐ Ｈ ７
５ − ９ ３にて変化せしめて活性を求め友、午の
結果、第１図１こ示す通り、その至適ｐＨはｐＨり付近
であつ几。
（６） ｐ Ｈ安定性
１０ｍＭの各種緩衝液（ｐＨ４’〜７：ジメチルグルグ
ル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ ７． ５〜り
ニドリス塩酸緩衝液）ｔこ溶解しｆｃ＃素液（１５Ｕ／
ＩＩ／）を３７℃、６０分間放置した後その残存活性を
、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ テヒドロゲナーゼ活
性測定法ｔこ基いて測定した。
ル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐ Ｈ ７． ５〜り
ニドリス塩酸緩衝液）ｔこ溶解しｆｃ＃素液（１５Ｕ／
ＩＩ／）を３７℃、６０分間放置した後その残存活性を
、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ テヒドロゲナーゼ活
性測定法ｔこ基いて測定した。
その結果、第２図に示す通りで、ｐＨ５〜ｇの範囲で安
定であった。
定であった。
（７）熱安定性
’ｉ ０ｍＭジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐ Ｈ７ ０） ｋこ溶解しｆｃ＃素液（１５Ｕ
／ ｍｌ ）を各温度で１０分間処理した後その残存活
性を３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒト°ロゲナーゼ
活性測定法１こ基いて測定した。
衝液（ｐ Ｈ７ ０） ｋこ溶解しｆｃ＃素液（１５Ｕ
／ ｍｌ ）を各温度で１０分間処理した後その残存活
性を３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒト°ロゲナーゼ
活性測定法１こ基いて測定した。
その結果、第３図ｔこ示す通りで、はぼ５０℃までの温
度ｔこ対して安定であった０ キヤリア・アンホライトを用しまた焦点採気泳動法によ
り測定した結果、等電点はｐｌ（≠りをこあつたＯ （９）金属イオンの影−醤 ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性Ｖ
こついてその影響を測定した。
度ｔこ対して安定であった０ キヤリア・アンホライトを用しまた焦点採気泳動法によ
り測定した結果、等電点はｐｌ（≠りをこあつたＯ （９）金属イオンの影−醤 ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性Ｖ
こついてその影響を測定した。
（ｊ［）界面活性剤の影響
３−ヒドロキシアンルーＣｏＡｆヒドロゲナーゼ以上の
通り、本発明の複合酵慎は、反応ｍｙごて表わされるエ
ノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、反応■１こで表わさ
れる３−ヒドロキシアシル−１ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
活性、および反応Ｖにて表わされる３−ケトアンルーＣ
ｏＡチオラーゼ活性を同−蛋白上ｅこ有する脂肪酸の分
解に関与する酵素であるＯ さらｔこ本発明の複合活性酵素は、その脂肪酸の分解に
関与する活性に基いて脂肪酸やトリグリセライドの分解
経路の関与する一種々の成分の測定ｔこ利用できる。例
えば血中遊離脂肪酸の定量ｔこおい−て、遊離脂肪酸ｅ
こ・前記反応Ｉｔこて表わされるアシル−Ｃ８Ａシ／セ
ターゼを作用せしめ、次いでその生成物にアシル−Ｃｏ
Ａオキシダーゼまたはアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
ゲ作甲せしめ、その結果生成したエノイルＣｏＡ ｆこ
複合活性酵素を作用せしめてその３種の酵素作用を行な
わせしめてβ酸化分解Ｑこよる２個炭素数の少ないアシ
ルＣｏＡを生成せしめ、さらｔここのアシルＣｏＡをア
シル−ＣｏＡオキシダーゼまたはアシル−ＣｏＡデヒド
ロゲナーゼおよび複合活性酵素の作用ｔこてサイクル反
応を行なわせしめることｅこより、多量のＮ Ａ Ｄ
ＨＬを生成せしめるもので、このＮＡＤＨＩを常法ｔこ
より定量してなるもので、極めて高感度をこて遊離脂肪
酸を定量し得るものである。さらに上記反応において一
定量の脂肪酸を用いることにより、その反応系３こ用い
られるアシル−ＣｏＡシンセターゼ活性測定法やアシル
−ＣｏＡオキシダーゼ活性測定法、アシル−ＣｏＡデヒ
ドロゲナーゼ活性測定法としても利用できる。さらｔこ
また脂肪酸を遊離する系であるトリグリセライドやジグ
リセライドとリパーゼまたはリポプロティンリパーゼと
の組合せ系とこの遊離された脂肪酸を前記の遊離脂肪酸
の定量系と組合せることｅこよりトリグリセライド°ド
の高感度定量法やリパーゼｔｅはリポプロティンリパー
ゼの活性測定法として利用できる。そのほかアシルＱＡ
の定量やアシルＣｏＡを遊離する系などの種々定量に利
用できるものである。
通り、本発明の複合酵慎は、反応ｍｙごて表わされるエ
ノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性、反応■１こで表わさ
れる３−ヒドロキシアシル−１ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
活性、および反応Ｖにて表わされる３−ケトアンルーＣ
ｏＡチオラーゼ活性を同−蛋白上ｅこ有する脂肪酸の分
解に関与する酵素であるＯ さらｔこ本発明の複合活性酵素は、その脂肪酸の分解に
関与する活性に基いて脂肪酸やトリグリセライドの分解
経路の関与する一種々の成分の測定ｔこ利用できる。例
えば血中遊離脂肪酸の定量ｔこおい−て、遊離脂肪酸ｅ
こ・前記反応Ｉｔこて表わされるアシル−Ｃ８Ａシ／セ
ターゼを作用せしめ、次いでその生成物にアシル−Ｃｏ
Ａオキシダーゼまたはアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
ゲ作甲せしめ、その結果生成したエノイルＣｏＡ ｆこ
複合活性酵素を作用せしめてその３種の酵素作用を行な
わせしめてβ酸化分解Ｑこよる２個炭素数の少ないアシ
ルＣｏＡを生成せしめ、さらｔここのアシルＣｏＡをア
シル−ＣｏＡオキシダーゼまたはアシル−ＣｏＡデヒド
ロゲナーゼおよび複合活性酵素の作用ｔこてサイクル反
応を行なわせしめることｅこより、多量のＮ Ａ Ｄ
ＨＬを生成せしめるもので、このＮＡＤＨＩを常法ｔこ
より定量してなるもので、極めて高感度をこて遊離脂肪
酸を定量し得るものである。さらに上記反応において一
定量の脂肪酸を用いることにより、その反応系３こ用い
られるアシル−ＣｏＡシンセターゼ活性測定法やアシル
−ＣｏＡオキシダーゼ活性測定法、アシル−ＣｏＡデヒ
ドロゲナーゼ活性測定法としても利用できる。さらｔこ
また脂肪酸を遊離する系であるトリグリセライドやジグ
リセライドとリパーゼまたはリポプロティンリパーゼと
の組合せ系とこの遊離された脂肪酸を前記の遊離脂肪酸
の定量系と組合せることｅこよりトリグリセライド°ド
の高感度定量法やリパーゼｔｅはリポプロティンリパー
ゼの活性測定法として利用できる。そのほかアシルＱＡ
の定量やアシルＣｏＡを遊離する系などの種々定量に利
用できるものである。
次いで本発明の実施例を挙げて具体的ｅこ述ぺるが、本
発明はこれｅこよって何んら限定されるものではない。
発明はこれｅこよって何んら限定されるものではない。
実施例１
５００ ｍｌ容三角フラスコに１００ｍ１の培地（培地
組成：ペプトン／ｊ％、粉末酵母エキス０５％、ＫＣｌ
０．２ ％、 Ｎａ Ｃ（１０，／％、ＫｊＨＰＯ４０
，／チ、Ｍｇ５Ｏ与 Ｏ，ＯＳ％、オレイン酸０．７５
％、ｐＨ７０：Ｉｓ本分）を入れ、１２０℃で加圧滅菌
し＊後３０℃にて、シュードモナス・フライ・Ｂ−０７
７を株 （ＦＥＲＭ−Ｐ扁ｊｙｏｔ） を接種し、ロ
ータリーシェーカーｔこて２θ時間培養した０次いでこ
の培養物を併合し、ＳＯＯＯｒｐｍ、２０分間遠心分離
して培養菌体を得た。さら１こ得られり菌体を１５０■
リゾチ一ム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ’７０）３
６０ｍｌｅこ加えて可溶性の粗製の複合活性酵素含有液
（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性
にて、その比活性は３、θＵ／〜であった）３グＱｍｌ
を得た。
組成：ペプトン／ｊ％、粉末酵母エキス０５％、ＫＣｌ
０．２ ％、 Ｎａ Ｃ（１０，／％、ＫｊＨＰＯ４０
，／チ、Ｍｇ５Ｏ与 Ｏ，ＯＳ％、オレイン酸０．７５
％、ｐＨ７０：Ｉｓ本分）を入れ、１２０℃で加圧滅菌
し＊後３０℃にて、シュードモナス・フライ・Ｂ−０７
７を株 （ＦＥＲＭ−Ｐ扁ｊｙｏｔ） を接種し、ロ
ータリーシェーカーｔこて２θ時間培養した０次いでこ
の培養物を併合し、ＳＯＯＯｒｐｍ、２０分間遠心分離
して培養菌体を得た。さら１こ得られり菌体を１５０■
リゾチ一ム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ’７０）３
６０ｍｌｅこ加えて可溶性の粗製の複合活性酵素含有液
（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性
にて、その比活性は３、θＵ／〜であった）３グＱｍｌ
を得た。
本複合活性酵素含有液は、後述実施例コ、実施例３の如
くして単離、精製すればよい。
くして単離、精製すればよい。
実施例２
実施例１で得た粗製の複合活性酵素２９０ｍ１を水槽中
で冷却後、予め一２０℃に冷却したアセトン２９０ｍ１
を添加し、生じた沈澱物を回収し、これを／ＭＫＣ１含
有１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７５）ｆこ溶解し
、さらｔｃＩ２０００ｒｐｍ、７０分間遠心分離して不
溶物を除去した。得られた上清液の≠５畔を分取し、こ
れに２２．５ ｍｌの飽和硫安溶液（ｐ Ｈ７，０）を
添加し、生じた沈澱物を／２０θθｒｐｍ、ｔｏ分間遠
心分離にて除去した。
で冷却後、予め一２０℃に冷却したアセトン２９０ｍ１
を添加し、生じた沈澱物を回収し、これを／ＭＫＣ１含
有１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７５）ｆこ溶解し
、さらｔｃＩ２０００ｒｐｍ、７０分間遠心分離して不
溶物を除去した。得られた上清液の≠５畔を分取し、こ
れに２２．５ ｍｌの飽和硫安溶液（ｐ Ｈ７，０）を
添加し、生じた沈澱物を／２０θθｒｐｍ、ｔｏ分間遠
心分離にて除去した。
次いで得られた上清液５７ ｍｌに、さらに飽和硫安溶
液２どｍｌを加えて沈澱せしめた。この沈澱物を回収し
友後、／ＭＫＣ６含有１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７５）のｌＱｍｌ＜溶解し、１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７５）２．０１ｆこ対して≠℃で２０時間セ
ルロースチューブｔこて透析脱塩し、次いでこれを凍結
乾燥して、複合活性酵素粉末（３−ヒドロキンアシル−
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性はｌ♂２
Ｕ／■であった）７７■を得友。
液２どｍｌを加えて沈澱せしめた。この沈澱物を回収し
友後、／ＭＫＣ６含有１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７５）のｌＱｍｌ＜溶解し、１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７５）２．０１ｆこ対して≠℃で２０時間セ
ルロースチューブｔこて透析脱塩し、次いでこれを凍結
乾燥して、複合活性酵素粉末（３−ヒドロキンアシル−
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性はｌ♂２
Ｕ／■であった）７７■を得友。
木複合活性酵素粉末は、さらに実施例３の如くして精製
してもよい。
してもよい。
実施例３
実施例２で得た複合活性酵素粉末（３−ヒドロキシアシ
ル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は／
、Ｓ’、、２Ｕ／■であった）７７■をλ０ｒｎｌの水
に溶解し、これを、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
’７５）で平衝化し几ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４
Ｂ（ファルマシア社製）のカラ着 ム （３×１ｌｃｒｎ）ニチャージして吸植せしめ、同
上緩衝液１こてカラムを洗浄した。次いで３００ ｒＩ
＋１の同上緩衝液と０グＭＫＣＩを含んだ同上緩衝液！
； ００ ＴＲＩにて作製し友直線濃度勾配法による溶
出を行なつｆｃｏ５２Ｒ１／時間の流速で、ｑｒｎｌづ
つ分増し、各分画の酵素活性を測定し、その活性画分（
Ａ７ ／ −ｇ Ｏ） ９０ｍｌを得友（３−ヒドロ
キシアンルーＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性ｔこて、その
比活性は３０．ＯＵ１ｍ９であった）。さらにこの活性
画分を、／ Ｏｍ Ｍ ！Ｊ−ン酸緩衝液＋ｐ）（’７
５）２１に対して透析し几後、ハイドロキシアパタイト
ゲルを充填したカラム （，２Ｘ ／ Ｏｃｍ） ｆこ
チャージして吸着せしめたｏ３００ｍｌの１０ｍＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ７５）と３００ｍ１の０．５ Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７５＞ と（こて作製した直線濃度勾
配法ｔこより溶出を行なった。３３ｍ１／時間の流速で
５ｍｌづつ分取し、各分画の酵素活性を測定し、活性画
分（Ａｇ ６〜６２）ｇ ５ｍｌを得＊（３−ヒ）”ｏ
＊シアアシーＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その比
活性は／ Ｏｊ Ｕ／１ｎ９であった）０次いでこの活
性画分を、限外濾過膜（アミコン社製ＸＭ−５０）を用
いて濃縮後、これを、トヨパールＨＷ−１，，０（東洋
曹達社製）を充填したカラム（／、／×り０ｍ）にチャ
ージしてゲル濾過した （溶媒：１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ７５，０，５ＭＫＣｌ’）。
ル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は／
、Ｓ’、、２Ｕ／■であった）７７■をλ０ｒｎｌの水
に溶解し、これを、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
’７５）で平衝化し几ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４
Ｂ（ファルマシア社製）のカラ着 ム （３×１ｌｃｒｎ）ニチャージして吸植せしめ、同
上緩衝液１こてカラムを洗浄した。次いで３００ ｒＩ
＋１の同上緩衝液と０グＭＫＣＩを含んだ同上緩衝液！
； ００ ＴＲＩにて作製し友直線濃度勾配法による溶
出を行なつｆｃｏ５２Ｒ１／時間の流速で、ｑｒｎｌづ
つ分増し、各分画の酵素活性を測定し、その活性画分（
Ａ７ ／ −ｇ Ｏ） ９０ｍｌを得友（３−ヒドロ
キシアンルーＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性ｔこて、その
比活性は３０．ＯＵ１ｍ９であった）。さらにこの活性
画分を、／ Ｏｍ Ｍ ！Ｊ−ン酸緩衝液＋ｐ）（’７
５）２１に対して透析し几後、ハイドロキシアパタイト
ゲルを充填したカラム （，２Ｘ ／ Ｏｃｍ） ｆこ
チャージして吸着せしめたｏ３００ｍｌの１０ｍＭＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ７５）と３００ｍ１の０．５ Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７５＞ と（こて作製した直線濃度勾
配法ｔこより溶出を行なった。３３ｍ１／時間の流速で
５ｍｌづつ分取し、各分画の酵素活性を測定し、活性画
分（Ａｇ ６〜６２）ｇ ５ｍｌを得＊（３−ヒ）”ｏ
＊シアアシーＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その比
活性は／ Ｏｊ Ｕ／１ｎ９であった）０次いでこの活
性画分を、限外濾過膜（アミコン社製ＸＭ−５０）を用
いて濃縮後、これを、トヨパールＨＷ−１，，０（東洋
曹達社製）を充填したカラム（／、／×り０ｍ）にチャ
ージしてゲル濾過した （溶媒：１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ７５，０，５ＭＫＣｌ’）。
３５ｍ／づつ分取し、活性画分（Ａ２３〜２７）１７、
ｊ ｍｌを得、これを凍結乾燥して精製され几複合活
性酵素を得几（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロ
ゲナーゼ活性１こて、その比活性は１ｌＯＵ／Ｉｌｖで
あった。収量２０〜）。
ｊ ｍｌを得、これを凍結乾燥して精製され几複合活
性酵素を得几（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロ
ゲナーゼ活性１こて、その比活性は１ｌＯＵ／Ｉｌｖで
あった。収量２０〜）。
実施例Ｖ
実施例１と同一組成の培地（友だし消泡剤シリコンＫＭ
−７２：信越化学社製０．２チ添加）２０１を３θβ容
ジャー春ファーメンタ−に入れ、１２０℃、２０分間加
圧滅菌後、同一組成の培地で培養し友シュードモナス・
フライ・Ｂ−０７７／株（ＦＥＲＭ−Ｐ＆５７ｏｔ ）
の培養液５００ ｍｌを種菌として加えた。−次いで３
００ｒｐｍ、３０℃、２ｏ１１／分の通気の条件下で１
７時間培養した。さらにこの培養物を遠心分離し、その
培養菌体を得、これを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
ｆＺ’）６１中にてリゾチーム （３ｇ）処理し、可溶
化せしめて複合活性酵素含有数的６１を得た（３−ヒド
ロキンアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その
活性は／ Ｊ：４ Ｕ／ｄであつｆｃ） 。
−７２：信越化学社製０．２チ添加）２０１を３θβ容
ジャー春ファーメンタ−に入れ、１２０℃、２０分間加
圧滅菌後、同一組成の培地で培養し友シュードモナス・
フライ・Ｂ−０７７／株（ＦＥＲＭ−Ｐ＆５７ｏｔ ）
の培養液５００ ｍｌを種菌として加えた。−次いで３
００ｒｐｍ、３０℃、２ｏ１１／分の通気の条件下で１
７時間培養した。さらにこの培養物を遠心分離し、その
培養菌体を得、これを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
ｆＺ’）６１中にてリゾチーム （３ｇ）処理し、可溶
化せしめて複合活性酵素含有数的６１を得た（３−ヒド
ロキンアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性にて、その
活性は／ Ｊ：４ Ｕ／ｄであつｆｃ） 。
第１図は本発明の複合活性酵素の至適ｐＨ曲線を示し、
第２図は本発明の複合活性酵素のｐＨ安定性曲線を示し
、第３図は本発明の複合活性酵素の熱安定性曲線を示す
０ 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第 １ 図 ７．、’） ８Ｂ、５ ９０．５ ｎ＋＋ 第２図
第２図は本発明の複合活性酵素のｐＨ安定性曲線を示し
、第３図は本発明の複合活性酵素の熱安定性曲線を示す
０ 特許出願人 東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第 １ 図 ７．、’） ８Ｂ、５ ９０．５ ｎ＋＋ 第２図
Claims (3)
- （１）シュードモナス属に属するエノイル−ＣｏＡヒド
ラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ テヒド
ロゲナーゼ活性およびトケトアシルーＣｏＡチオラーゼ
活性を有す′る酵素生産菌を培地に培養し、その培養物
から該酵素を採取することを特徴とする酵素の製造法。 - （２）シュードモナス属ｔこ属するエノイル−ＣｏＡヒ
ドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒド
ロゲナーゼ活性および３−ケトアシル−Ｑ）Ａチオラー
ゼ活性を有する酵素生産菌が、シュードモナス・フライ
１こ属する菌株である特許請求の範囲第１項記載の酵素
の製造法。 - （３）シュードモナス・フライに属する菌株が、シュー
ドモナス・フライ・Ｂ−０’７７を株である特許請求の
範囲第２項記載の酵素の製造法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9931481A JPS58888A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 脂肪酸の分解に関与する酵素の製造法 |
| FR8211073A FR2508487B1 (fr) | 1981-06-25 | 1982-06-24 | Procede de dosage pour composant apparente aux lipides, composition pour dosage et procede de production d'enzyme utilisee a cet effet |
| CA000405920A CA1215903A (en) | 1981-06-25 | 1982-06-24 | Assay method for component relating to lipids, composition for assay and process for production of enzyme used therefor |
| IT22048/82A IT1157281B (it) | 1981-06-25 | 1982-06-24 | Metodo di saggio per un componente relativo ai lipidi, composizione per il saggio e procedimento per la produzione dell'enzima utilizzato allo scopo |
| DE3249973A DE3249973C2 (ja) | 1981-06-25 | 1982-06-25 | |
| DE19823223874 DE3223874A1 (de) | 1981-06-25 | 1982-06-25 | Analysenverfahren fuer lipidkomponenten, mittel zur durchfuehrung der analyse und verfahren zur herstellung eines dafuer verwendeten enzyms |
| CH3917/82A CH664631A5 (it) | 1981-06-25 | 1982-06-25 | Procedimento per effettuare il saggio di un componente relativo ai lipidi, composizione per il saggio e procedimento per la produzione di tale composizione. |
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| US06/392,010 US4491631A (en) | 1981-06-25 | 1982-06-25 | Assay method for lipid component, assay composition, and process for production of enzyme used therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9931481A JPS58888A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 脂肪酸の分解に関与する酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58888A true JPS58888A (ja) | 1983-01-06 |
| JPH0127716B2 JPH0127716B2 (ja) | 1989-05-30 |
Family
ID=14244172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9931481A Granted JPS58888A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 脂肪酸の分解に関与する酵素の製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58888A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963781A (en) * | 1987-11-26 | 1990-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Ultrasonic motor |
-
1981
- 1981-06-25 JP JP9931481A patent/JPS58888A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963781A (en) * | 1987-11-26 | 1990-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Ultrasonic motor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0127716B2 (ja) | 1989-05-30 |
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