NL8103787A

NL8103787A - Nucleoside oxydase, werkwijze ter bereiding daarvan alsmede de toepassing daarvan.

Info

Publication number: NL8103787A
Application number: NL8103787A
Authority: NL
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1980-08-12
Filing date: 1981-08-12
Publication date: 1982-03-01
Also published as: DE3153683C2; FR2488618A1; GB2087401B; US4385112A; DE3132121C2; FR2488618B1; CA1173767A; IT8123478A0; NL187273C; NL187273B; GB2087401A; DE3132121A1; IT1168159B

Description

-1- VO 22k0

Itucleoside oxydase, werkwijze ter bereiding daarvan alsmede de toepassing daarvan

De uitvinding beeft betrekking op een nieuw nucleoside oxydase, de werkwijze ter bereiding daarvan, een werkwijze ter bereiding van nucleoside-5'-carbonzuur gebaseerd op substraat specificiteit en enzymatische werking van nucleoside oxydase, alsmede een 5 nieuwe analysemethode ten opzichte van nucleosiden met behulp van-nucleoside oxydase, alsmede een combinatie of doos voor het analyseren van nucleosiden in monsters.

Gevonden is dat het microorganisme stam B-07Ö1 behorende tot het genus Pseudomonas geïsoleerd uit grondmonsters in Ono-shi, 10 Hycgok-n, Japan, in zijn bacteriële cellen een nieuw enzym produceert (nucleoside oxydase) met de volgende biochaaische eigenschappen ' uitgedrukt in substraat-specificiteit en enzymatische werking. Substraat-specificiteit: ten minste met substraat-specificiteit ten aanzien van nucleosiden en derivaten daarvan volgens formule 1 alsmede 15 volgens formules 1b en 1c van het formuleblad, waarin "base” kemzuur-baseresidu of de derivaten daarvan betekent.

Enzymatische werking: ten minste een katalytische activiteit ten opzichte van de enzymatische reacties volgens reactiescheaa's A-F van het formuleblad.

20 voor zowel substraat (1, 1b en 1c).

Het nieuwe enzym katalyseert de oxydatieve reactie ten * opzichte van de suikereenheid in een nucleoside als substraat, waarbij zuurstof wordt verbruikt en waterstofperoxyde gevormd, welk enzym is aangeduid als nucleoside oxydase.

2ρ De substraat-specificiteit, de enzymatische werking en de bepalingsmethode zijn als volgt: (1} Substraat-specificiteit:

Relatieve enzymatische activiteiten ten aanzien van verschillende soorten substraten (nucleoside, kemzuurbase, suiker en 30 nucleotide, elk in een concentratie van 1 mM) aangegeven in tabel A werden gemeten. Zoals uit tabel A blijkt reageert het enzym van de uitvinding met de suikereenheid en niet met een kemzuurbase en een 8103787 « * -2- enkele suiker. Tevens reageert het enzym met een nucleoside met ribose, deoxyribose en arabinose als suikereenheden terwijl de reactie niet beperkt is tot het type base-eenheid van het nucleoside. Er wordt geen reactie op nucleotiden waargenomen.

5 Derhalve heeft het enzym van de uitvinding ten minste een substraat-spècificiteit op een nucleoside of derivaat daarvan als weergegeven in de formules T, 1b, Tc.

...... _3_

TABEL A

Substraat Relatieve activiteit {%) adenosine 100 guanosine 97,1 5 thymidine »3 cytidine 65,7 φ inosine 91,^· tS .

·£ xanthosine 14 ,3 ,¾ uridine 9^,3 o T0 g arabinosylcytosine (1-3-D-arabincfuranosyleytosine) 8,1 arabinosyladenine (1-S-D-arabinylfuranosyladenine) 67,2 2'-deoxyadenosine 99,1 T5 hredinine X ^8,2 adenine 0 <ΰ § thymine 0

A

£} xanthxne 0 p g uracil 0 u 20 jg hyp ox ant nine 0 _ - —— D-ribose 0

•H

g a-D-ribose-1-fosfaat 0 5-AMP 0 5’-C-MP 0 25 5'-CM? 0 % 5'-IMP 0 g 5'-XMP 0 § 5‘-UMP 0 5 '-AD? 0 30 51-ATP 0 mengsel van adeinine en D-ribose 0 X 4-carbamoyl-i-3-D-ribofurancsylimidazolium-5-oleaat.

(2) Innymatische verhing: (A) Identificatie van het reactieprodukt.

«► o -U-

Een reactieaengsel (100 ml) "bestaande uit 0,2 M dimethyl-glutaraat-NaOH-buffer (pH 6,0) 10 ml, adenosine 500 mg, nucleoside-oxydase 180 U, catalase 15000 U en gedestilleerd water 90 ml, werd onder beluchting geroerd en de pH op 6 ingesteld (bij de reactie neemt 5 de pH af en indiceert de vorming van zure stoffen). Na 90 minuten bij 3T°C werd de pH ingesteld op 2,0 door toevoeging van HC1. Neergeslagen stoffen werden door centrifugeren verzameld en gewassen met waterig HC1 (pH 3). Gewassen materiaal werd opgelost door 1 N-NaOH toe te voegen en de pH op 8,5 in te stellen. Verder werd 10 HC1 toegevoegd cm de pïï op 3 in te stellen terwijl onoplosbaar materiaal werd verzameld.

Elementair analyse: C= 42,62$, H= 3,93$, N= 24,9$ en 0* 28,55$· Molecuulgewicht: 281 , moleculaire formule: C^qH^N^O^.

Het infraroodspectrum en het UV-spectrum waren identiek 15 met authentiek adenosine-5’-carbonzuur.

(B) Dunnelaagchrcmatografie van reactieprodukt bij voortgang van de reactie.

Het reactiaaengsel bestaande uit 0,2 M dimethylglutaraat-NaOH-buffer (pH 6,0) 10 ml, 10 mM adenosine 5 ml, nucleoside oxydase 20 U, 20 catalase 1000 ü en gedestilleerd water 45 ml werd bij 3T°C ge- incubeert. Het reacties engsel werd resp. na 0, 5, 10, 20 en 60 minuten verzameld. Elk monster werd' gedurende 2 minuten op 100°C verhit en aan ultrafiltratie onderworpen.

TIC: silicagelplaat.

25 Ontwikkelaar: acetonitrile: 0,1$ waterig ammoniumchloride = T : 3 · Standaard autentiek monster: adenosine (afgekort als Ad) adenosine-5'-carbonzuur (Ad-A).

Zoals blijkt in fig. 1 werd een vlek die overeenkomt met een verbinding bij de 5 '-hydroxymethylgroep van adenosine tot de al-30 dehydegroep geoxydeerd bevestigd. Een verdere reactie leverde oxydatie .tot de 5 '-carbozygroep en adenosine-5 ’-carbonzuur werd als eindprodukt aangetoond.

(C) Bij de reactie verbruikte hoeveelheid zuurstof en gevormde hoeveelheid waterstofperaxyde.

35 Nucleoside oxydase (3 ü) werd toegevoegd aan het reactie- mengsel (1,0 ml) dat bestond uit 0,2 M dimethylglutaraat-NaOH-buffer (pH 6,0) 0,4 ml, 0,2$ N,N-diëthyl-m-toluIdine 0,1 ml, 0,3$ 4-amino-antipyrine 0,1 ml, peroxydase (50 U/ml) 0,1 ml, 1,0 mM adenosine 0,05 ml 8103787 * * ............ ----- en gedestilleerd water 0,25 al. De verbruikte hoeveelheid zuurstof (gemeten met zuur stof elektrode) en de gevoimde hoeveelheid waterstof-peroxyde (ooloriaetrische proef hij 5^5 sm) werden gemeten. Menosine (0,05 ^smol) verbruikte 0t09J jmol zuurstof en vormde 0,101 ƒ21101 5 waterstofperc&yde. Dit resultaat suggereert dat 1 mol adenosine 2 molen zuurstof verbruikt en 2 molen waterstof per cacyde vormt.

(D) Ammoniakvorming:

Er werd geen ammoniakvorming in de reactie waargenomen.

. Als bovenvermeld katalyseert het enzym van de uitvinding de 10 reactie van adenosine tot adenosine-5’-carbonzuur via adenosine-5’-aldehyde.

Het reactiescheaa wordt aangegeven door schema's G en H van het formuleblad.

Eet enzym van de uitvinding heeft een substraat-speeificiteit 15 ten aanzien van verschillende nucleosiden, zoals blijkt uit tabel A, en formules 1, 1b, 1c. Het enzym katalyseert tenminste ook de reacties van reactiescheaa’s A-P. Derhalve is het enzym een nieuw enzym dat een tot nu toe onbekende enzymatische werking en substraat-speeificiteit bezit.

20 De enzymatische reactie kan worden voorgesteld door de volgende algemene reactieschema's J, J en L van het formuleblad, resp. voor substraat 1, 1b en le, in welke schema’s ’’base” een kernzuurbase of derivaat is.

(3) Bepaling smethode.

25 ' Het reactiemengsel (0,5 ml) bestaande uit 0,2 M dimethyl- glutaraat-EaOE-buffer (pH 6,0) 0,2 ml, 0,2 w/w ïï,H-diêthyl-m-toluxdine 0,05 ml, 0,3 w/w % U-amino-antipyrine 0,05 al, 10 mM adenosine 0,05 ml en gedestilleerd water 0,10 ml werd gedurende 3 minuten bij 3T°C vocrgexncubeerd. Ha toevoeging van de enzymoplossing (20 ƒx1) 30 werd het mengsel gedurende 10 minuten bij 37°C gexncubeerd en werd 0,5 al van een ^ M ureuaoplossing, die 0,2/¾ ethylpyridiniun-chloride bevatte, teegeveegd cm de reactie tot staan te brengen.

De optische dichtheid bij 5^5 mM in een 1,0 cm cel werd binnen 5 minuten na de toevoeging van 2,0 ml gedestilleerd water geaeten.

35 De enzymoplossing werd vervangen door gedestilleerd water (20 ^il) als blanco (A^). Het verschil (As-A^) van de optische dichtheid van de enzymoplossing (As) en die van de blanco (A^) indiceert 8103787 ............. -6- .

* V

de enzumactiviteit. De enzymatische activiteit dient te worden gemeten binnen de waarde van As beneden 0,15·

Een eenheid (1 ü) enzymactiviteit wordt bepaald'door de hoeveelheid enzym waarmede in één minuut bij 37°C 1 yomol water-5 stofperoxyde wordt gevormd met adenosine als substraat; als voorgesteld door de volgende vergelijking.

Enzymactiviteit (U/ml) = 1,25 X (As-Ag) X verdunningsverhou- ding.

Het nieuwe enzym van de uitvinding heeft de volgende 10 fysisch-chemische en biochemische eigenschappen.

Km-waarde: lt,T x 10-¾ (voor adenosine).

Isoëlektrisch punt: pH U,5 (elektroforese onder toepassing van drager amfoliet), molecuulgewicht: ongeveer 2^0.000 (gelfiltratiemethode 15 onder toepassing van Sepharose CL-öB (handelsnaam), optimale pH: aangegeven in fig. 2; pH 5-6 gemeten door glycine-HCl-buf f er.

In de f iguur o-o: glycine-HCl-buffer (^-0 mM), •—·: dim.ethyIglutaraat-NaQH-bu.ffer (Uo mM), 20 Δ-Δ: fosfaatbuffer (It-OmM).

Het zuurstofverbruik werd gemeten met zuurstof elektroden. Optimale temperatuur: ^5-55°C als blijkt uit fig. 3.

De restactiviteit bij verschillende temperaturen werd volgens de proefmethode gemeten.

25 Warmtestabiliteit: stabiel bij 6o°C gedurende 10 minuten als blijkt uit fig, b.

De enzymactiviteit werd na 10 minuten incubatie in fosfaatbuffer (pH 6,0, bO mM) bepaald.

pH-stabiliteit: pH 8-9, als blijkt uit fig. 5» 30 'o—o: Britton-Robinson-buffer (150 mM), •—·: dimethyIglutaraat-NaOH-buffer (150 mM), Δ- Δ: fosfaatbuffer (150 mM), *-▲: tris-HCl-buffer (150 mM).

Ha gedurende 60 minuten incubatie bij 37°C werd het reactie-35 mengsel tot U0 maal verdund en werd 20 ^il voor de bepaling toegepast . Effect van metaalionen en anderen: tabel B.

8103787 s ·* ~~τ-

T A B E L B

metaalionen relatieve activiteit (%)

Controle 100 1, 2++ ,

Mg 10U

_ _ 2+ 5 Ba 100 n 2+

Ca 102 „2+

Ma. 110

Zn2+ 9U

π 2+

Co 10U

10 EDTA 98 PCMB 102

Effect van oppervlakte-actieve stof: Tabel C.

TABEL C

Relatieve activiteit (%) 15 geen 100 0,1 W/ % Triton X-1Q0X 104

W

" Bridge 35* 100 ” natriumdodecylsulf aat 66 " natriumlaurylbenzeensulfonaat 38 20 " natriumdesoxycholaat 102 " Kation FB-500X T0 " Kation m-20^ 60 ” cetyltrimethylamoniumchloride 78 n handelsnaam 25 De bacteriêie stam B-OT81 beeft de volgende taxonomische eigenschappen.

A. Microscopische waamaaing: 30°C gedurende 1S—2U uur kweek: (1) Ag ar voedingsbodem: 30 Groei lineair, bleek geelgrijs tot grijswit.

Geen oplosbare pignentvcrming.

(2) Agar voedingsbodeaplaat:

Ronde heuvelvormige kolonieën met een gladde rand, half- 8103787

* V

. — fluorescent, licht geelachtig grijs tot grijsachtig vit. Geen voiming van oploshaar pigment.

(3) Vloeistofkweek: 5 Sediment nadat het geheel troebel is geworden. Dunne vliegjes gevormd maar gemakkelijk vernietigd door licht schudden.

(b) Gelatine polylaagmedium:

Groei langs de grenslijn. Geen gelatine hydrolyse.

(5) BCP melk medium: 10 Zwakke base, geen peptonisering.

(6) Anaerobe groei:

Geen groei.

B. Microscopische waarneming:

Rechte of enigszins kromme staven en coccen. Enkele of dubbel 15 paren of korte ketens. Beweegbaar met polaire zweepstaarten, 0,5 x 0,1 - 1,5 ji.

Geen sporenvorming. Geen polymorfie.

C. Fysiologische en biochemische eigenschappen.

1) Gramverkieuring: 20 2) Zuurvaste verkleuring: 3) ,T0F”-proef 0 (oxydatieve ontleding) k) Catalasevorming: + 5) Oxydasevorming: + 6) Ureasevoming: SSR medium (Stuart, van Stratum & Rustigianmedici): - 25 Christens sen medium: + 7) Gelatinehydrolyse: 8) Zetmeelhydrolyse: - 9) Caselnehydrolyse: - 10) Esculinehydrolyse: 30 11) Cellulose hydrolyse: 12) Argininehydrolyse: + 13) poly-S-hydroxybutyraat-ophoping: 11+) Indoolvoiming: 35 15) H^S-vorming: +' 16) Acetoïnevorming: 17) Nitraatreductie: 18) Denitificeringsreactie: - 8103787 -9- - 19) Gebruik van citraat: + 20) GC-gehalte van DNA: 59% 21) Suurvorming uit suikers:

Suiker:_zuur:_gas:_ 5 adnitol L(+) arabinose (+) cellobiose (+) duleitol meso-erythritol 10 fructose - - fucose + gallactose f glucose + glycerine - 15 inositol inuline lactose (+) maltose mannitol — — 20 mannose + meleditose melibicse + - raffinose L(+) rhamnose (+) 25 salicine L(-) sorbose sorbitol zetmeel saccharose - 30 treharose xylose + 22) Groei pH: pH ^,5-9,0 23) Groeitemperatuur: 10-37°C.

2b) Verbruik van ammoniakstikstof: + 35 25) Verbruik van nitraat stikstof: +

De taxoncmische eigenschappen van de stam B-0781 werden vergeleken met die genoend in "Sergey's Mannuai of Deteiminative 8103787 η • - Bacteriology, 8e druk, 197V’ en "Identification of Medical Bacteriology, 197V.

* Vastgesteld werd dat de stam. B-O781 "behoorde tot Pseudomonas op "basis van de Gram-negatieve, positieve catalase en oxydasevorming, 5 oxydatieve ontleding van glucose, beweeg·-lijkheid door polaire coccen met zweepstaarten en goede groei op pH 7S0 voedingsagar (schuine cultuur). Een verdere gedetailleerde vergelijking onthult dat de stam B-07Ö1 identiek was met Pseudomonas nutida.

10 stam B-07Ö1 Pseudomonas nutida

Gat alas e.oxydas e-vorming: + + fluorescentiepigment-vorming (King B medium): + + g elat ine-zetmeel-caseine-hydr olys e: arginineontleding: + + 15 poly-S-hydroxybutyraatoplossing: - - indool-acetoïnevoiming: nitraatreductie: - d citraatverbruik: + + galactose (zuur): + + 20 glucose (zuur): + + mannose (zuur): + + xylose (zuur): + + L(+) arabinose (zuur): (+) d fructose (zuur): - d 25 glycerine (zuur): inositol (zuur): - d lactose: (+) mannitol: + - of (d) salicine: - (d) 30 saccharose: maltose: - (d) GC-gehalte van DNA: 59$ 60-63% d = verschillend.

8103787 -11-

Volgens de voomoeude taxoncmische gegevens wordt de stam B-08l aangeduid als Pseiidcmonas putida B-07Ö1 en is gedeponeerd "bij het Fermentation Institute, Agency of Industrial Technology and Science, M.I.T.I., Japan, als een permanente cultuur collectie 5 FERM-P Ho. 566k.

De uitvinding is gebaseerd op de als boven toegelichte kennis uitgevoerd.

Het is een hoofddoel van de uitvinding te voorzien in een nieuw enzym-nucleoside-axydase dat ten minste een substraatspecifici-10 teit ten opzichte van nucleoside volgens fig. I heeft en de reacties II en/of III katalyseert.

Het is een ander doel van de uitvinding te voorzien in een werkwijze ter bereiding van nucleoside oxydase waarbij een nucleoside oxydase producerend microörganisme dat behoort tot het 15 genus Pseudomonas in een voedingsmedium wordt gekweekt en het nucleoside-oxydase uit de geweekte cellen wordt geïsoleerd.

Het is een volgend doel van de uitvinding te voorzien in een bepalingsmethode van nucleoside in een monster door het meten van de verbruikte zuurstof of het gevormde waterstofperoxyde.

20 Het is een ander doel van de uitvinding te voorzien in een werkwijze ter bereiding van nucleoside-5'-carbonzuur.

Nog een ander doel van de uitvinding is te voorzien in een combinatie of doos voor het bepalen van nucleosiden.

Nucleoside-axydase volgens de uitvinding is een enzym met de 25 substraat-specificiteit en enzymwerking als hiervoor toegelicht, waarbij geringe verschillen, zoals in molecuulgewicht, Sm-waarde, effect van metaalionen en oppervlakteniddelen toegelaten zijn.

Als boven toegelicht kan nucleoside-5'-carbaxylaat worden gevormd door de inwerking van nucleoside-axydase volgens de uitvinding 30 op nucleosiden in aerobe toestand in een waterig medium.

Aangezien verder het enzym van de uitvinding inwerkt op de 5,-hydroxymetbyIgrcep van nucleoside in het monster op basis van de enzymatische werking en substraat-specificiteit r kan een bepaling van nucleoside of enzymatische activiteit in nucleosidesysteaen 35 worden verricht door de hoeveelheid verbruikte zuurstof of gevormde waterstofperoxyde te meten.

Het microorganisme volgens de uitvinding is niet beperkt tot 8103787

Λ. V

-12- het genus Pseudanonas als hiervoor toegelicht, zodat ook nucleoside-oxydase producerende microörganismen die tot Pseudomonas behoren, kunnen -worden toegepast. Natuurlijke en kunstmatige mutanten van het organisme kunnen worden toegepast. Genetische ontwikkelingstechnieken 5 voor de nucleoside-oxydaseproduktie, zoals de transformatie van het overeenkomstige gen van de huidige stam in andere cellen, kunnen tevens worden toegepast en het volgens deze technieken bereide nucleoside-axydase valt binnen het kader van de uitvinding.

Voor de bereiding wordt een nucleoside-axydase vormend 10 microörganisme, dat behoort tot het genus Pseudomonas. in een voor enzymproduktie gebruikelijk medium gekweekt. Men kan een vloeibare of vaste cultuur toepassen. Submerse beluchtingsculturen hebben voor industriële bereiding de voorkeur.

Er kan een gebruikelijke voedingsbodem worden toegepast.

15 Assimileerbare stikstofbronnen, zoals maisweekvloeistof, vleesextract, sojapoeder, caseïne, pepton, gistextract, ammoniumsulfaat of ammoniumchloride zijn bruikbaar. Assimileerbare koolstofbronnen, zoals hogere vetzuren, melassen, glucose, of zetmeelhydrolysaat kunnen tevens worden toegepast. Anorganische zouten, zoals NaCl, KC1, 20 magnesiumsulfaat, kaliumwaterstoffosfaat of kaliumdiwaterstoffosfaat kunnen tevens zo nodig aan het medium worden toegevoegd.

De bereiding van nucleoside-oxydase kan worden verbeterd door 0,5-1# hogere vetzuren, zoals oliezuur of palmitinezuur, toe te voegen.

25 De kweektemperatuur varieert afhankelijk van de groei van de organismen en is bij voorkeur 25-35°C. De kweektijd kan bij gewijzigde omstandigheden veranderen en is algemeen 15-50 uren.

De kweek, kan worden beëindigd bij de hoogste produktiviteit van nucleoside-axydase van het medium.

30 Nucleoside-axydase wordt opgehoopt in de cellen van micro- organismen. De extractie van het enzym uit de cellen kan als volgt worden toegelicht. Gekweekte cellen worden verzameld en de natte cellen worden gesuspendeerd in fosfaatbuffer of tris-HCl-buffer, die door gebruikelijke celontledingstechnieken, zoals lysozym-35 behandeling geluidstrillingen en persbehandelingen worden ontleed teneinde het ruwe nucleoside-oxydasesap te verkrijgen.

De ruwe enzymoplossing kan worden volgens gebruikelijke 8103787 - -13- zuiveringsaethoden van proteïne gezuiverd. Bij voorbeeld wordt een enzymbevattende vloeistof onderworpen aan aceton-, methanol-, ethanol- of isopropanolsedimentering, of wordt uitgezouten door ammoniumsulfaat, UaCl of aluminiumsulfaat en het enzym verzameld.

5 Het aldus verkregen poeder wordt gezuiverd tot het elektroforetisch een enkele band toont. Het gesedimenteerde enzym wordt bij voorbeeld gesuspendeerd in fosfaatbuffer en gechrcmatcgrafeerd door toepassing van een ionenuitwisselaar, zoals diëthylaminoëthyldextrangel, diëthylaminoëthyicellulose of triëthylaminoëthyldextrangel, en gel-10 filtratie, zoals dextrangel of polyaciylamide. Gezuiverd poeder van het enzym kan door vriesdrogen worden verkregen.

Nueleoside-51 -carbonzuur kan worden bereid door nuclecsiden met nucleoside-asydase in ruwe of gezuiverde vorm in reactie te brengen. Het enzym kan worden toegepast in de vorm van een oplossing 15 of in een geïmmobiliseerde vorm. Voorbeelden van nucleosiden zijn nueleosiden of derivaten daarvan met een 5'-hydroxymethylgroep, zoals adenosine, guanosine, thymidine, inosine, xanthosine, uridine, arabinosyl-cytosine, arabinosyladenine, 2’-deaxyadenosine of 2'-deaxy-guanosine.

20 Het waterige reactiemedium is een medium met een stabiel pH-gebied voor het nucleoside-cxydase, bij voorbeeld een waterig medium met een pH van 6-9, diëthylglutaraat-ïïaOH-buffer, fosfaatbuffer of tris HCl-buffer.

Men kan aerobe omstandigheden bereiken door zuurstof in 25 een waterig medium op te lossen of door in een medium voör te beluchten met lucht of zuurstof.

Aangezien twee molen zuurstof per mol nucleoside met een 5'-hydraxymethy2groep vereist zijn, dient bij de aerobe toestand ten minste meer dan twee mol overmaat zuurstof aanwezig te zijn.

30 De incubatietemperatuur dient een stabiele temperatuur voor het enzym te zijn en kan meestal kamertemperatuur zijn.

De hoeveelheid en de concentratie van nuclecside-oxydase of nucleosiden met een 5’-hydroxymethylgroep zijn niet kritisch.

De incubatietijd hangt af van de hoeveelheid en concentratie van 35 het enzym of substraten en andere reactiecmstandigheden, en is bij voorkeur niet groter dan 20 minuten. De reactie wordt beëindigd door de resterende substraten of de geproduceerde nucleöside-5'- 8103787

4 V

-ih- carbonzuren in een monster volgens dunnelaagchrcmatografietechnieken te controleren.

In de reactie wordt vaterstofperoxyde gevormd en bij voorkeur dient catalase van tevoren aan het reaction.edium te worden 5 toegevoegd om vaterstofperoxyde in de vorm van water en zuurstof-moleculen te verwijderen.

Het gevormde nucleoside-5’-carbonzuur kan uit hetreactie-mengsel worden geïsoleerd door waterige waterstof chloride of zwavel-' zuur toe te voegen onder instelling van de pïï op 2-3, waarbij het 10 nucleoside-5*-carbonzuur wordt neergeslagen. Voor een verdere zuivering kan adsorptiechromatcgrafie via ionenwisselaars of re-kristallisatie worden toegepast.

Volgens deze methoden kunnen nucleoside-5 ’-carbonzuren uit verschillende nucleosiden met 5 ’-hydroxymethylgroepen worden bereid.

15 De toepassing van het nucleoside-oxydase van de uitvinding op basis van zijn substraatspecificiteit en enzymverking voor een nieuwe analysemethode en combinatie voor analyseren van nucleosiden zal hierna worden toegelicht.

Te analyseren monsters bevatten ten minste een nucleoside 20 met.een 5'-hydroxymethylgroep volgens de formule 2 van het formuleblad, waarin R.^, en R^ waterstofatomen of een hydroxygroep zijn en "base" dezelfde betekenissen als voornoemd heeft.

Voorbeelden van het monster zijn als volgt: reactie-ccmponentmonster dat nucleosiden als eerder genoemd bevat; monster 25 voor het analyseren van de activiteit van ribonuclease of deoxyribonuclease, waarin RNA, DNA of de oligonucleosiden daarvan worden gehydrolyseerd door overeenkomstige hydrolasen, zoals ribonuclease of deoxyribonuclease onder vorming van nucleotiden die worden behandeld met nucleotidase of alkalifosfatase voor het vormen van 30 nucleosiden of voor het analyseren van het substraat MA of DNA daarvan; een monster voor het bepalen van de activiteit van nucleotidase, waarin een nucleotide zoals AMP wordt gehydrolyseerd door nucleotidase en nucleosiden vrijgemaakt, of voor het bepalen van het substraat AMP daarvan; een minster voor het bepalen van de activiteit 35 van het enzym dat nucleoside vrijmaakt, bij voorbeeld adenosinevorming door S-adenosyl-L-hcmocystelne, hydrolase of guanosine of decxy-guanosinevorming door guanosinefosforylase, of voor hét bepalen 8103787 . - “15- * i’ van het substraat daarvan; een monster voor het bepalen van de activiteit van enzymen die mcleosiden als substraat ontleden, bij voorbeeld hydrolyse van nucleosiden door nucleosidase; hydrolyse van xnosine door inosinase; hydrolyse van uridine door uridine-5 nucleosidase; ontleding van uridine door uridinefosforylase of ontleding van thymidine door thymidinefosforylase; een monster voor het bepalen van het enzym met de f osforylaat-5 '-hydrcacygroep van nucleoside als substraat, bij voorbeeld fosforylering van de 5'-hydroxygroeo van adenosine door adenosinekinase, fosforylering 10 van de 5'-hydrcacygroep van uridine door uridinekinase, fosforylering van de 5’ -hydrcacygroep van thymidine door thymidinekinase; en een monster voarhet kwantitatief bepalen van purine nucleoside in een reactiesysteem van nucleosidefosforylase of de enzymatische activiteit van purinenucleosidefosforylase.

15 De incubatietemperatuur van deze monsters en nucleoside- oxydase is in het algeaeen 37°C en de incubatietijd dient niet beperkt te zijn. De reactie verloopt volgens de reactieschema's A-S en/of F, G, H van het formuleblad, -waarbij de hoeveelheid verbruikte zuurstof of gevormd vaterstofpercacyde wordt gemeten voor 20 analyse. De zuurstof wordt bij voorkeur gemeten door een zuurstof-elektrode en het waterstofperoxyde wordt bepaald door elektrische middelen, zoals een waterstofperoxyde-elektrode of chsnische middelen, bij voorbeeld met behulp van een bekende reactieccmponent voor de kwantitatieve bepaling van waterstofperoxyde, zoals een ccmbinatie 25 van fenol, U-aminoantipyrine en peroxydase, een ccmbinatie van fenol, k-aminofenazol en peroxydase, of een ccmbinatie van ίί,N'-diëthyl-m-toluidine, lj-aminoantipyrine en peroxydase.

Aldus kan de hoeveelheid nucleoside in een monster worden bepaald volgens de eigenschap dat twee molen zuurstof cf twee 30 molen waterstofperoxyde per mol nucleoside worden verbruikt.

De uitvoeringsvorm voor het bepalen van nucleosiden in het monster is zodanig, dat een aliquot monster opgelost in een buffer wordt toegeveegd aan een oplossing van nucleoside-oxydase 1-20 U, bij 37 C gelncubeerd en de verbruikte zuurstof wordt gemeten door een 35 zuurstof elektrode of het gevormde waterstofperoxyde wordt bepaald door een waterstofperoxyde-elektrode. Evenzo gevormd waterstof-psrcxyds wordt bepaald door N,N-diëthyl-m-toluidine, 1-aminoantipyrine 8103787 <*·'> - r -16- en peroxydase toe te voegen en het mengsel hij 3T°C te incuheren en daarna een colorimetrische meting hij 5^-5 nm uit te voeren. Een verdere uitvoeringsvorm van de bepaling op enzymatische activiteit is die na een enzymatische reactie gedurende een geschikte tijds-5 periode, waarbij het verbruikte of gevormde nucleoside wordt geanalyseerd volgens eerder toegelichte procedures. Menosinekinase kan worden bepaald door de hoeveelheid verbruikte adenosine na incuberen van het mengsel van adenosinekinase, ATP en adenosine te meten. Nucleotidase kan worden bepaald door de hoeveelheid verbruikte 10 zuurstof of het gevormde waterstofperoxyde in de reactie met nucleoside-axydase en adenosine, die door enzymatische werking op een substraat ATP is gevormd, te meten. Voor het RNA-gehalte of de ribonuclease-activiteit in het monster wordt RNA in reactie gebracht met ribo-nuclease onder vorming van een nucleotide dat wordt cmgezet in 15 nucleoside door de werking van nucleotidase of alkalifosfatase, waarna genoemd nucleoside kwantitatief wordt gsaeten door nucleoside-oxydase, waardoor het RNA-gehalte of de ribonuclease-aetiviteit wordt vastgesteld.

Als eerder toegelicht kan het nieuwe enzym nucleoside-oxydase 20 met voordeel worden toegepast voor de kwantitatieve analyse van verschillende nucleosiden, de analyse van de enzymatische activiteit op nucleoside als substraat, de analyse van de enzymatische activiteit waardoor een nucleoside of substraat daarvan worden gevormd.

De volgende voorbeelden geven een illustratie van de 25 uitvinding maar zijn daartoe niet beperkt.

Voorbeeld I

In een medium (100 ml, pH 7,0) bestaande uit pepton 1,0 w/w #, caseïne 1,’ w/w#, oliezuur 1,0 w/w#, gistextractpoeder 0,5 w/w#, KOI 0,2 s: w/w#, KgHPOj^ 0,1 v/wK, MgSO^.ÏHgO 0,05 w/w#, gesteriliseerd bij 30 120°C gedurende 20 minuten, werd in een Erlenmeyer-kolf Pseudcmonas put id a B-0781 FERM-P No. 566U geënt en het medium gedurende 1 dag bij 30°C gekweekt. Deze entcultuur was geïnoculeerd in'hetzelfde medium als bovengenoemd (20 1, dat Desfoam BC- 51Y (handelsnaam, 0,1# bevatte) in een 30 1 kolf-fermentator en gekweekt onder ge-35 steriliseerde beluchting bij 30°C gedurende b2 uur bij 350 tpn, beluchting 20 1/min.

De gekweekte cellen werden gedurende 10 minuten centrifugaal .

8103787 « « -17- - verzameld bij 5000 tpm. De verzamelde cellen werden gewassen met water (7 l) en opnieuw verzameld bij de voomoemde toestand.

Aan de in 20 mM fosfaatbuffer (pH 7,0, 5 l) gesuspendeerde cellen, die 10 mM 33DTA bevatte, weid. lysozym (eind iysozymconcentratie: 5 0,5 mg/ml) toegevoegd en er werd gedurende 5 uur bij 37°C geroerd voor het vernietigen van de cellen. De bovenstaande laag (4,2 lit. 2,86 U/ml) werd verkregen door. gedurende 10 minuten centrifugeren bij 5000 tpn. Koude aceton (-20°C, 2,5 lit.) werd aan de bovenstaande laag toegevoegd en deze werd centrifugaal gesedimen-10 teerd bij 5000 tpn per minuut gedurende 10 minuten, waarbij een verdere bovenlaag werd verkregen (11150 U). Daarna werd koud aceton (2,5 1) aan deze bovenlaag toegevoegd, en er werd bij 5000 tpm gedurende 10 minuten gecentrifugeerd cm het gesedimenteerde materiaal, te verkrijgen. Het neerslag werd opgelost in 20 mM fosfaatbuffer (pH 7,0, 15 1,0 lit.), en gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 5000 tpm om het onoplosbare materiaal af te scheiden. De bovenlaag (9700 U) werd gedurende 20 minuten bij 50°C behandeld en het door verhitting gedenatureerde proteïne door sedimentering bij 5000 tpm gedurende 10 minuten afgescheiden, waarbij een verdere bovenlaag werd verkregen 20 (9400 U). Anmoniumsulfaat (319 g) werd aan deze bovenlaag tot 0,42 verzadigd toegevoegd en het geheel bij 15000 tpm gedurende 10 minuten behandeld cm het neerslag af te scheiden, waarna aramoniumsulfaat (140 g) werd toegevoegd cm het neerslag te verkrijgen.

Het neerslag opgelost in 20 mM fosfaatbuffer (pH 7,5, 50 ml) werd 25 bij 150C0 tpn gedurende 10 minuten gecentrifugeerd cm het onoplosbare materiaal af te scheiden. De bovenstaande oplossing (7800 U) werd gedurende de nacht gedialyseerd in een cellofaanbuis tegen 20 mM fosfaatbuffer. De gedialyseerde oplossing werd in een kolcm van DEAE-cellulose (produkt van Selver Co.) geladen (2,6 x 60 cm), 30 in evenwicht gebracht met 20 mM tris-HCl-buffer (pH 7,5) en ge- elueerd met een lineaire gradiënt van 0-0,5 M KC1 in 20 mM tris-HCl-buffer (pH 7,5), waarbij de geëlueerde fractie bij 0,17-0,25 M KCl-concentratie (57o0 ü) werd verzameld en geconcentreerd door een Aaicon PM-10 membraan (handelsnaam). Het genoen.de concentraat 35 werd in een kolom van Sephacryl S-200 (produkt van Pharmacia Co.) geladen (2,6 x 90 cm). Actieve fracties gecontroleerd cp enzymactiviteit bij 2δθ nm absorptie werden verzameld en gevriesdroogd waarbij 8103787 J \ -18- het gezuiverde nucleoside-axydasepoeder werd verkregen (51,0 mg, 3765 U).

Voorbeeld II

Een mengsel van adenosine (500 mg), nucleoside-oxydase 5 (180 U), catalase (15000 U) en gedestilleerd water (90 ml) werd toegevoegd aan 0,2 M dimethylglutaraat-NaQH-buffer (pH 6,0, 10 ml) en onder roeren bij 150 tpm geincubeerd, bij 37°C belucht. met 20 ml/min gedurende 90 minuten (de pH van het incubatiemengsel werd geregeld). Na de incubatie werd de pH ingesteld op 2,0 door 10 toevoeging van 0,1 N HC1 voor het sedimenteren van de materialen.

Het neerslag werd door centrifugeren verzameld (15000 tpa, 1.0 min), gewassen met waterige HC1 (pH 3), opgelost;in 1 N NaOH en opnieuw neergeslagen onder instelling van de pH op 3 door toevoeging van HC1 ter verzameling van kristallen (1)-65 mg). Het produkt werd ge-15 identificeerd met authentiek adenosine-5'-carbonzuur volgens elementair analyse, molecuulgewicht, IE-spectrum, UV-spectrum en dunne-laagchromatograf ie.

Voorbeeld III

In voorbeeld II werd adenosine vervangen door guanosine, 20 thymidine, cytidine, inosine, xanthosine, uridine, arabinosylcytosine, arabinosyladenine, 2'-deaxyadenosine en 2'-deoxyguanosine (elk 300 mg) waarbij als volgt 5'-carbonzuur werd verkregen.

Substraat Produkt guanosine guanosine-5' -carbonzuur (268 mg) 25 thymidine thymidine-5 '-carbonzuur (21)-5 mg) inosine inosine-5’-carbonzuur (25b mg) xanthosine xanthosine-5'-carbonzuur (265 mg) uridine uridine-5'-carbonzuur (258 mg) arabinosylcytosine araginosylcytosine-5'-carbonzuur (220 mg) 30 arabinosyladenine araginosyladenine-5'-carbonzuur (267 mg) 2 * -deoxyadenosine 2'—deoxyadenosine-5 ’ -carbonzuur (270 mg) 2'-deoxyguanosine 2'-deoxyguanosine-5'-carbonzuur (2ββ mg) 8103787 -19-

Voorbeeld IV

Een mengsel (0,95 ml) bestaande uit de volgende componenten werd voorgeïncubeerd bij 3T°C.

0,2 M dimethylgInt ar aat-NaDH-buffer (ρΗβ,Ο) 0,¼ ml 5 0,2 w/w# N,Iï-diëthyl-m-toluïdine 0,1 ml 0,3 w/w# U-aninoantipyrine 0,1 ml peroxydase (50 U/ml) 0,1 ml nucleoside-Gxydase 10 ü . gedestilleerd water 0,25 sil 10 Totaal 0,95 ml

Aan dit oplosmiddel werden verschillende concentraties adenosineoplossing (0,05 ml) en gedestilleerd water (2,0 ml) toegevoegd en een colorimetrische meting bij 5^5 mi uitgevoerd.

Zoals blijkt uit fig. 6 kon het adenosinegehalte eenvoudig met 15 grote nauwkeurigheid worden geanalyseerd.

Voorbeeld V

Een mengsel (0,95 ml) volgens voorbeeld IV werd voorge-incubeerd bij 3T°C. Verschillende concentraties adenosine-aonster-oplossingen (0,05 ml) werden tcegevoegd, er werd geïncubeerd 20 gedurende 20 minuten bij 37°C en de verbruikte zuurstof werd door een zuurst of elektrode gemeten (produkt van Ishikawa Mfg. Co.).

Als blijkt uit fig. 7 was het resultaat goed en nauwkeurig met een kwantitatieve analyse van adenosine.

Voorbeelden VT-XII

25 Adenosineoplossing in voorbeeld IV werd vervangen door ver schillende concentraties guanosine, thymidine, inosine, uridine, 2f-deozyadenosine, arabinosyladenine of bredinine (^-carbamoyl-3-D-ribofuranosy 1-imidasolium-5-oleaat), waarbij de reaetiecmstandigheden dezelfde waren als van voorbeelden IV of V.

30 De resultaten worden weergegeven in fig. 8 (guanosine), fig. 9 (thymidine), fig. 10 (inosine), fig. 11 (uridine), fig. 12 fë'-deoxyadencsine), fig. 13 (arabinosyl-adenine) en fig. 1b (bredinine (zuurstofelektrcdemethode)) met goede nauwkeurigheid.

8103787 J -- -20-

Voorbéeld XIII

0,2 M dimethy Iglutaraat-NaQH-buffer (pH 6,0) 0,1+ ml 0,2 w/wl N,N-diëthyl-m-toluïdine 0,1 ml 0,3 w/w$ b-aminoantipyrine 0,1 ml 5 peroxydase (50 U/ml) 0,1 ml nucleoside-oxydase - 5 U ' gedestilleerd water 0,25 ml totaal 0,95 ml

Een mengsel uit de bcrvengenoeade componenten werd bereid, 10 Adenosinekinaseoplos sing (0,1 ml) .bereid volgens de methode in

J. Biol. Chen. 193, 1+81-1+95 (1951 ) werd toegevoegd in 0,2 M dimethyl-glutaraat-NaOH-buffer (pH 6,0) (die ATP 5 mM, adenosine 5 mM en MgClg 10 mM. bevatte) (0,1+ ml) en bij 3T°C geïncubeerd. Ha 0, 5 en 10 minuten werd het reactiemengsel (0,02 ml) verzameld, op 70°C 15 verhit en toegevoegd aan het genoemde reactiemengsel, dat gedurende 20 minuten bij 37°C werd geïncubeerd, waarna een colorimetrische meting bij 5^5 nm volgde. Het resultaat wordt aangegeven in fig. 15. Voorbeeld XIV

0,2 M dimethylglutaraat-NaOE-buffer (pH 6,0) 0,1+ ml 20 0,2 w/w$ N,N-diëthyl-m-toluïdine 0,1 ml 0,3 w/wf l+-aminoantipyrine 0,1 ml peroxydase (50 U/ml) 0,1 ml 20 mM AMP 0,05 ml

nucleoside-oxydase 10 U

25 gedestilleerd water 0,2 ml totaal 0,95 ml

Het reactiemengsel (0,95 ml) van de voornoemde ccmponenten werd voorgeïncubeerd bij 37°C. Bucleotidaseoplossing (produkt van Sigma Co.) (0,05 ml) werd toegevoegd, het mengsel werd geïncubeerd 30 bij 37°C gedurende 20 minuten en colorimetrisch gemeten bij 5l+5 rm.

Het resultaat wordt aangegeven in fig. 16. Nucleotidase werd met goede nauwkeurigheid kwantitatief geanalyseerd.

Voorbeeld XV

Een reactiaaengsel (0,95 ml) dat EBA en nucleotidasè bevatte, 35 werd met een ribcnuclease-oplossirg (0,05 ml) bij 37°C gedurende 8103787 : » -21- 30 minuten geincubeerd. 0,05 ml daarvan werd verhit tot 80°C en toegevoegd aan het reaetiemengsel (0,95 ml), gelijk aan dat van voorbeeld IV. Het reaetiemengsel werd gedurende 20 minuten geïneubeerd bij 3T°C en colorimetrisch gemeten bij 5^5 nm.

5 Het resultaat wordt aangegeven in fig. 17. Ribonuclease kan met goede nauwkeurigheid worden geanalyseerd.

8103787

Claims

1. Nucleoside-cxydase met ten minste als biochsnische eigen schappen de volgende substraatspecificiteit en enzymatische werking: substraatspecificiteit: ten minste de substraatspecificiteit ten opzichte van nucleosiden 5 of derivaten daarvan volgens formule 1, waarin "base” kern- zuurbaseresidu of derivaten daarvan betekent; enzymatische werking: ten minste katalytische activiteit ten opzichte van de volgende enzymatische schema's A en B.

2. Nucleoside-oxydase volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit ten minste de volgende Km-waarde, isoëlektrisch punt, molecuulgewicht, optimale pH, optimale temperatuur, wamtestabiliteit en pH-stabiliteit bezit: Km-waarde: U,T x 10”^ (voor adenosine), 15 isoëlektrisch punt: ongeveer pH U,5 (elektroforese onder toepassing van drager amfoliet), molecuulgewicht: Ongeveer 2^0.000, optimale pH: pH 5-6, optimale temperatuur: ^5-55°C, 20 wamtestabiliteit: stabiel beneden 60°C gedurende 10 minuten, pïï-stabiliteit·: stabiel tot pïï 8-9.

3. Werkwijze ter bereiding van nucleoside-oxydase, met het kenmerk, dat nucleoside-oxydase producerende microörganismen die behoren tot het genus Pseudomonas worden gekweekt in een voedings-25 medium dat verbruikbare koolstofbronnen, verbruikbare stikstof-bronnen en een anorganisch zout bevat, en het aldus gevormde nucleoside-oxydase uit de gekweekte cellen wordt geïsoleerd. 1+. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het nucleoside-oxydase producerende microörganisme Pseudcmonas put i da 30 B-0781 FERM-P No. 566h is.

5. Werkwijze ter bereiding van nucleoside-5r-carbonzuur, met het kenmerk, dat het nucleoside-oxydase in een waterig medium onder aerobe omstandigheden wordt geïncubeerd met een nucleoside met een 5 '-hydrcxymethylgroep, waarna het aldus gevormde nucleoside-5’-35 csrbonzuur wordt geïsoleerd. 8103787 -23-

6. Werkwijze volgens conclusie 5» met het kenmerk, dat het nucleoside met de 5’-hydroxymethylgroep adenosine, guanosine, thymidine, cytidine, inosine, xanthosine, uridine, arabinosylcytosine, arabinosyladenine, 2’-deoxyadenosine of 2’-deoyyguanosine is. 5 7· Analysemethode ten aanzien van nucleosiden in een vloei baar monster, met het kermerk, dat het monster wordt geïncubeerd met nucleosi&e-oxydase, dat zuurstof verbruikt en waterstofperoxyde en nucleoside-5’-carbonzuur vormt door inwerking op het nucleoside, waarbij de verbruikte zuurstof of het gevormde waterstofperoxyde 10 kwantitatief worden bepaald.

8. Analysemethode volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het nucleoside-oxydase ten minste de volgende biochemische eigenschappen van substraatspecificiteit en enzymatische werking bezit: Substraatspecificiteit: tenminste een substraatspecificiteit ten 15 opzichte van een nucleoside volgens formule 1 of een derivaat daarvan, waarin "base" kemzuurbaseresidu of derivaat daarvan betekent; enzymatische werking: ten minste met katalytische activiteit ten opzichte van de enzymatische reactieschema’s A en B.

9. Analysemethode volgens conclusie 7» met het kenmerk, dat 20 het vloeibare monster een nucleoside of een nucleoside-vormend systeem bevat.

10. Analysemethode volgens conclusie 9» tiet het kenmerk, dat het vloeibare monster dat een nucleoside-vormend systeem bevat ten minste een nucleoside bevat vrijgemaakt door de inwerking van nucleotidase 25 op nucleotiden.

11. Analysemethode volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat het vloeibare monster dat een nucleoside-vormend systeem bevat, ten minste een' nucleoside bevat vrijgemaakt door de inwerking van ribonuclease of deoxyribonuclease en nucleotidase of fosfatase.

12. Combinatie voor nucleoside-aaalyse, met het kenmerk, dat deze ten minste nucleoside-axydase dat zuurstof verbruikt en waterstofperoxyde alsmede nucleoside-5’-carbonzuur vormt door de inwerking op het nucleoside, bevat.

13. Combinatie volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat deze 35 ten minste een nucleoside-axydase en een reactieccmponent voor het meten van de hoeveelheid gevormd waterstofperoxyde bevat. ik. Combinatie volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het 8 113 3 7 8 7 i V -2k- genoemde reactieuiddel (voor het meten van de hoeveelheid gevormd vaterstofperaxyde) een samenstelling is die reageerbaar is met vaterstofperaxyde en deze in een detecteerbare stof cmzet.

15, Ccmbinatie volgens conclusie 1U, met het kenmerk» dat de 5 samenstelling een chraaogeen is, dat ten minste per oxydase bevat. 8103787